增强表达的内含子序列及其用途
阅读：905发布：2020-05-12
专利汇可以提供增强表达的内含子序列及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种增强表达的内含子及其用途，所述内含子的核苷酸序列包括如下序列：（a）具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有增强基因表达特性的由（a）衍生的核苷酸序列；或（c）在严格条件下与（a）或（b）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明增强表达的内含子iOs4与启动子组合能够在不同发育时期的各组织中不同程度的增强启动子的表达特性；所述内含子还可以与外源基因组合，以最佳的表达方式实现外源基因的表达，为获得复合性状的转基因作物奠定 基础 。，下面是增强表达的内含子序列及其用途专利的具体信息内容。
1.一种内含子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下序列：
（a）具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
（b）在（a）中的核苷酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有增强基因表达特性的由（a）衍生的核苷酸序列；或
（c）在严格条件下与（a）或（b）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.一种嵌合启动子，其特征在于，包括至少一个权利要求1所述内含子，所述内含子有效连接至少一个任意启动子。
3.根据权利要求2所述的嵌合启动子，其特征在于，所述启动子来源于植物或病毒。
4.根据权利要求3所述的嵌合启动子，其特征在于，所述启动子可以为Ubi基因启动子。
5.根据权利要求4所述的嵌合启动子，其特征在于，所述Ubi基因启动子可以为玉米Ubi基因启动子。
6.根据权利要求5所述的嵌合启动子，其特征在于，所述Ubi基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求6所述的嵌合启动子，其特征在于，所述嵌合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
8.一种表达盒，其特征在于，包括权利要求2-7任一项所述嵌合启动子和核酸序列，所述核酸序列有效连接所述嵌合启动子。
9.根据权利要求8所述表达盒，其特征在于，所述核酸序列编码蛋白质、有义RNA、反义RNA或双链RNA序列。
10.根据权利要求9所述表达盒，其特征在于，所述蛋白质为选择标记蛋白质、筛选标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质或影响植物农艺性状的蛋白质。
11.一种DNA构建体，其特征在于，包括至少一个权利要求8-10任一项所述表达盒。
12.一种包含权利要求11所述DNA构建体的重组载体。
13.一种在植物中表达核酸序列的方法，其特征在于，包括将权利要求11所述DNA构建体引入植物细胞。
14.一种在植物中增强核酸序列表达特性的方法，其特征在于，包括将权利要求11所述DNA构建体引入植物细胞。
15.根据权利要求13所述在植物中表达核酸序列的方法或权利要求14所述在植物中增强核酸序列表达活性的方法，其特征在于，所述核酸序列编码蛋白质、有义RNA、反义RNA或双链RNA序列。
16.根据权利要求15所述方法，其特征在于，所述蛋白质为选择标记蛋白质、筛选标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质或影响植物农艺性状的蛋白质。
17.一种权利要求1所述内含子或权利要求11所述DNA构建体在培育转基因植物中的用途。
增强表达的内含子序列及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 植物遗传工程的最新进展为改善植物性状的工程打开了新的大门，如植物抗病性、昆虫抗性、除草剂耐受性、提高产量、改善植物可食用部分的营养质量和增强从植物中获得的终端消费产品的保质期或稳定性。因此，具有分子功能的目的基因可以被适当的整合入植物的基因组以传递不同或者改善性状或质量。适宜的基因表达速率在得到所需要的表型中发挥重要作用。基因表达速率主要受到特定基因的启动子、位于5’非转录区和5’非翻译区内的额外DNA序列及终止子序列的调节。启动子是位于基因5’末端的部分DNA序列，其含有RNA聚合酶启动转录以至于蛋白质合成随后可以继续进行的信号。位于5’非转录区内的调节性DNA序列调节应答特定生物性刺激（例如病原体感染）或非生物刺激（例如盐胁迫、热胁迫、干旱胁迫）的基因表达。此外，已经鉴定了以不依赖位置和方向的方式提高位于附近基因的表达水平的其它所谓“增强子”序列。
[0003] 除了位于基因非转录区内的元件（例如启动子、增强子）以外，已报道了类型广泛的生物（例如线虫、昆虫、哺乳动物和植物）中的一些内含子具有增强基因表达的特性。在植物中，相对于缺少内含子的构建体而言，在基因构建体内包含一些内含子导致增加mRNA和蛋白质累积。这种效应被称作基因表达的“内含子介导性增强（IME）”。已知在植物中刺激表达的内含子已经在玉米基因和水稻基因中得到鉴定。类似地，已经发现来自双子叶植物基因的内含子可以提高基因的表达速率，如来自矮牵牛、马铃薯和拟南芥的内含子。且已经证实在内含子剪接位点内的缺失或突变降低基因的表达，表明剪接作用可能是IME所需要的。
[0004] 通过内含子增强基因的表达不是普遍现象，因为向重组表达盒插入一些内含子未能增强表达，例如来自双子叶植物基因的内含子（来自豌豆的rbcS基因、来自菜豆的菜豆蛋白基因和来自马铃薯的stls-1基因）和来自玉米基因的内含子（adh1基因第9内含子、hsp81基因第1内含子）。因此并非每一内含子都可以在转基因植物中操纵外源基因或内源基因的基因表达水平。内含子序列内必须存在何种特征性或特异性序列特点以增强给定基因表达在现有技术中是未知的，并且从现有技术中不可能预测给定的植物内含子在使用时是否将引起IME。
[0005] 将外来基因导入新的植物宿主并不总是导致引入基因高表达。此外，若处理复杂性状，有时候需要以时间差异表达方式或空间差异表达方式调节数个基因。例如，玉米Ubi1启动子表达量很高，容易导致外源蛋白大量积累而影响作物生长；水稻Actin1启动子在玉米的生殖组织中表达量比较高，而在营养组织中表达偏低。内含子原则上可以对此进行调节。为了解决上述缺陷，以便产生更好的具有复合性状的转基因作物，需要获得更多具有增强表达特性的内含子用于构建适宜的重组DNA构建体。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种增强表达的内含子序列及其用途，即新的分离自水稻（Oryza sativa）的MBF1（Multiprotein bridging factor1）转录因子的内含子，所述内含子与其它启动子组合后，使异源核苷酸序列能够在植物组织中高效表达。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种内含子，其核苷酸序列包括如下序列：
[0008] （a）具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0009] （b）在（a）中的核苷酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有增强基因表达特性的由（a）衍生的核苷酸序列；或
[0010] （c）在严格条件下与（a）或（b）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
[0012] 为实现上述目的，本发明还提供了一种嵌合启动子，包括至少一个所述内含子，所述内含子有效连接至少一个任意启动子。
[0013] 在上述技术方案的基础上，所述启动子来源于植物或病毒。
[0014] 进一步地，所述启动子可以为Ubi基因启动子。所述Ubi基因启动子可以为玉米Ubi基因启动子
[0015] 更进一步地，所述Ubi基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0016] 优选地，所述嵌合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0017] 为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包括所述嵌合启动子和核酸序列，所述核酸序列有效连接所述嵌合启动子。
[0018] 进一步地，所述核酸序列编码蛋白质、有义RNA、反义RNA或双链RNA序列。
[0020] 为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA构建体，包括至少一个所述表达盒。
[0021] 为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述DNA构建体的重组载体。
[0022] 为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达核酸序列的方法，包括将所述DNA构建体引入植物细胞。
[0024] 进一步地，所述核酸序列编码蛋白质、有义RNA、反义RNA或双链RNA序列。
[0025] 优选地，所述蛋白质为选择标记蛋白质、筛选标记蛋白质、合成活性蛋白质、分解活性蛋白质、抗生物胁迫蛋白质、抗非生物胁迫蛋白质、雄性不育蛋白质或影响植物农艺性状的蛋白质。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种所述内含子或所述DNA构建体在培育转基因植物中的用途。
[0027] 本发明中术语“核酸（序列）”或“多核苷酸（序列）”指基因组来源或合成来源的单链或双链DNA或RNA，即分别是从5’（上游）端读到3’（下游）端的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的聚合物。核酸可以代表有义链或互补（反义）链。
[0028] 本发明中术语“有义”是指具有与靶序列（例如与剪接体的蛋白质因子结合的序列）同源或完全相同序列的核酸。
[0029] 本发明中术语“反义”是指具有与靶序列（例如信使RNA）互补序列的核酸。
[0030] “天然的”指天然出现的（“野生型”）核酸序列。
[0031] 假如两种核酸序列的布置使得第一种核酸序列影响第二种核酸序列的功能，那么所述第一种核酸序列就与所述第二种核酸序列“有效连接”。优选这两种序列是单一连续核酸分子的组成部分，或者更优选是临近的。例如，假如一种启动子调节或介导一种基因在细胞中的转录，那么所述启动子就与所述基因有效连接。
[0032] “重组”核酸是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。
[0033] “转基因”指已经引入外源核酸（如重组构建体）的细胞、组织、器官或生物。所引入的核酸最好整合入受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA，以便所引入的核酸通过随后的后代遗传。“转基因”细胞或生物还包括所述细胞或生物的后代，以及由使用所述“转基因”植物作为杂交亲本的育种程序产生、并表现由于重组构建体或构建体的存在而引起的表型改变的后代。
[0034] 本发明中术语“基因”指染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA或其它编码肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及在编码序列两侧参与表达调节的区。一些基因可以转录成为mRNA并翻译成为多肽（结构基因）；而其它基因可以转录成为mRNA（如rRNA、tRNA）；其它类型基因作为表达调节物起作用（调节基因）。
[0035] 基因“表达”指基因转录产生对应mRNA并且该mRNA翻译产生对应基因产物，即肽、多肽或蛋白。调节元件控制或调整基因表达，所述调节元件包括5’调节元件如启动子。
[0036] 本发明中术语“载体”是指能够在宿主细胞内复制的DNA分子。质粒和粘粒是示例性载体。此外，术语“载体”和“媒介”可互换使用以指将DNA片段从一种细胞转移至另一种细胞的核酸分子，因此细胞不必要属于相同的生物（例如将DNA片段从农杆菌细胞转移至植物细胞）。
[0037] 本发明中术语“表达载体”是指含有所需要的编码序列和在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所需要的适宜核酸序列的重组DNA分子。
[0038] 本发明中术语“重组DNA构建体”、“重组构建体”、“表达构建体”或“表达盒”指来自任何来源、能够整合入基因组或自主复制的任何因子如质粒、粘粒、病毒、BAC（细菌人工染色体）、自主复制型序列、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，包括其中一种或多种DNA序列使用众所周知的重组DNA技术以功能性可操作方式连接的DNA分子。
[0039] “同源性”指核酸序列或氨基酸序列分别按照核苷酸或氨基酸位置同一性百分率而言的相似性水平（即序列相似性或同一性）。同源性也指在不同核酸或蛋白之间相似功能特性的概念。
[0040] “异源的”序列指源自外来来源或物种的序列，或者当来自同一来源时指由其原始形式受到修饰的序列。
[0041] 增强基因表达特性、基因表达增强效应或内含子介导性基因表达增强（IME）：当涉及内含子序列时指内含子的能力，所述能力定量地增强作为重组/转基因DNA表达盒中部分的核酸序列（例如基因）的表达水平，在不改变其它条件下与只缺少内含子而其它完全相同的表达构建体相比，其测量以已转录RNA、mRNA、蛋白质的量或蛋白质活性为基础。增强基因表达的特性在植物中涉及这样的内含子，其在不改变其它条件下与只缺少内含子而其它完全相同的表达构建体相比，能够定量地增强植物衍生性核酸序列在植物或植物细胞中的表达水平并增强非植物衍生性核酸在植物或植物细胞中的基因表达速率。在本发明中，将表达增强效应理解为在不改变其它条件下与只缺少内含子而其它完全相同的表达构建体相比，RNA的稳定状态水平、蛋白质的稳定状态水平或核酸序列或相应蛋白质的蛋白质活性（例如报告基因或蛋白质）增加至少50%、或至少100%、或至少200%、300%、400%或至少500%、600%、700%、800%、900%或至少1000%、或多于1000%。
[0042] 在杂交技术中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段（如基因组文库或cDNA文库）群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核32
苷酸，可以被可探测的基团如 P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法为本领域己知并公开于Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York）。
苷酸，可以被可探测的基团如 P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法为本领域己知并公开于Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York）。
[0043] 序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交（如至少2倍于背景）的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列（同源探测）。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性（异源探测）。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。
[0044] 典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01至1.0M Na离子浓度（或其它盐类），温度对短探针（如10至50个核苷酸）至少大约30℃，对长探针（如超过50个核苷酸）至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低度严格条件，例如，包括在30-35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS（十二烷基磺酸钠）的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC（20×SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠）中
50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS的缓冲溶液中
37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1%至1%的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。
50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS的缓冲溶液中
37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1%至1%的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。
[0045] 特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl（1984）Anal.Biochem.138:267-284的方程估算：Tm=81.5℃+16.6（logM）+0.41（%GC）-0.61（%form）-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，%form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50%互补靶序列与完全配对探针杂交的温度（在规定的离子强度和pH下）。每1%的错配需Tm降低大约1℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90%的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度（Tm）大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度（Tm）1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度（Tm）6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度（Tm）11、12、13、14、15或
20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格程度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen（1993）生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章（Elsevier，New York）；和Ausubel等人编辑（1995）分子生物学现代方法第
2章（Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York）。见Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York）。
20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格程度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen（1993）生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章（Elsevier，New York）；和Ausubel等人编辑（1995）分子生物学现代方法第
2章（Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York）。见Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York）。
[0046] 本发明中术语“内含子”是指基因中这样的DNA部分（间插序列），该DNA部分不编码此基因所产生蛋白质的部分并且从该基因所转录的并从细胞核中输出之前的mRNA内剪接下来。内含子序列指内含子的核酸序列。因此内含子是DNA序列中的如此区域，它们随编码序列（外显子）一起转录但在成熟的mRNA形成期间被去除。内含子可以位于实际的编码区内或在前mRNA（未剪接的mRNA）的5’或3’非翻译前导序列内。初级转录物中的内含子可以被剪除并且编码序列同时而精确地连接以形成成熟mRNA。内含子与外显子的汇合处形成剪接位点。
[0047] IME内含子或内含子介导性增强（IME）内含子：当涉及内含子序列时，是指具有在植物中增强基因表达特性的内含子。
[0048] “分离的”核酸序列是与所述核酸天然出现的生物细胞中其通常结合的其它核酸序列（即其它染色体DNA或染色体外DNA）基本分离或纯化出来的。该术语包括经过生物化学纯化以便基本去除污染的核酸和其它细胞成份的核酸。该术语还包括重组核酸和化学合成的核酸。
[0049] 本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
[0050] 本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列己经确定，从本发明具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组成型的表达，即在植物的大体上所有组织和所有生长发育阶段都能够表达。
[0051] 具体地，所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织（可通过常规RNA试验进行测定），如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因（pinⅠ和pinⅡ）和玉米蛋白酶抑制基因（MPI）的启动子。
[0052] 表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因（如编码新霉素磷酸转移酶II（NPT））和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯（2，4-D）。
[0053] 表达盒包括沿5’-3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，嵌合基因包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。
[0054] 终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶（NOS）终止区。
[0055] 在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。
[0056] 本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA二级结构。
[0057] 在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎5’非编码区）；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒（TEV）前导序列、玉米矮小花叶病毒（MDMV）前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA（AMV RNA4）的非翻译前导序列；烟草花叶病毒（TMV）前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒（MCMV）前导序列。
[0058] 转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0059] 已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。
[0060] 本发明提供了一种增强表达的内含子序列及其用途，所述内含子与启动子组合能够不同程度的增强启动子的表达特性；所述内含子还可以与外源基因组合，以最佳的表达方式实现外源基因的表达，为获得复合性状的转基因作物奠定基础。
附图说明
[0062] 图1为本发明增强表达的内含子序列及其用途的RT-PCR验证效果图；
[0063] 图2为本发明增强表达的内含子序列及其用途的重组克隆载体pT-iOs4构建流程图；
[0064] 图3为本发明增强表达的内含子序列及其用途的重组表达载体pA0080构建流程图；
[0065] 图4为本发明增强表达的内含子序列及其用途的转基因玉米愈伤组织的瞬时转化表达量图；
[0066] 图5为本发明增强表达的内含子序列及其用途的转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米植株中报告基因表达量图；
[0067] 图6为本发明增强表达的内含子序列及其用途的转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米植株与转入prZmUbi1启动子序列的玉米植株的报告基因表达量比值关系图。
具体实施方式
[0068] 下面通过具体实施例进一步说明本发明增强表达的内含子序列及其用途的技术方案。
[0069] 第一实施例、高表达基因中IME内含子的鉴定和表征
[0070] 1、鉴定强烈表达的候选水稻基因
[0071] 在 Plant Expression Datebase（http://www.plexdb.org//modules/PD_general/atlas.php）中下载玉米和水稻全生育期的芯片表达数据。玉米以ZmUbi1（如序列表中SEQ ID NO:11所示）为对照，水稻以OsUbq2（如序列表中SEQ ID NO:4所示）为对照，分别筛选与对照表达量相当或更高的基因，作为筛选内含子的候选基因。获得候选基因-水稻的MBF1（Multiprotein bridging factor1）转录因子。
[0072] 2、RT-PCR验证MBF1转录因子体内表达量
[0073] 以水稻（日本晴）的茎、叶、叶鞘、颖壳、胚乳等组织的cDNA为模板，RT-PCR验证芯片筛选后的MBF1转录因子在体内的表达量。RT-PCR结果如图1所示，MBF1转录因子在水稻的各组织中的表达量均与对照相当或更强。
[0074] 3、基因内含子分析
[0075] 经过RT-PCR验证的MBF1转录因子，选择启动子区或靠近基因编码序列（CDS）5’端的内含子作为分析对象，在IMEter网站（http://korflab.ucdavis.edu/cgi-bin/web-imeter.pl）分析内含子增强外源基因表达的效应值（参考文献：Rose A,Elfersi T,Parra G,Korf I(2008)Promoter-Proximal Introns in Arabidopsis thaliana Are Enriched in Dispersed Signals that Enhance Gene Expression.Plant Cell20:543-551）。选择增强效应值与CK（iZmUbi1，SEQ ID NO:5）相当或高于CK的内含子作为后续测试的候选内含子，获得iOs4内含子，如序列表中SEQ ID NO:1所示；内含子的特征分析如表1所示。
[0076] 表1、内含子特征分析表
[0077]
[0078] 4、合成嵌合启动子序列
[0079] 获得本发明嵌合启动子prZmUbi1-iOs4，如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列（如序列表中SEQ ID NO:3所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列（SEQ ID NO:3）的5’端还连接有KpnI酶切位点，所述prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列（SEQ ID NO:3）的3’端还连接有BsaI酶切位点。
[0080] 同时合成启动子prZmUbi1（带内含子iZmUbi1），如序列表中SEQ ID NO:2所示；合成的所述prZmUbi1启动子序列（SEQ ID NO:2）的5’端还连接有BamHI酶切位点，所述prZmUbi1启动子序列（SEQ ID NO:2）的3’端还连接有HindIII酶切位点。
[0081] 同时合成启动子prZmUbi1-No（不带内含子iZmUbi1），如序列表中SEQ ID NO:6所示；合成的所述prZmUbi1-No启动子序列（SEQ ID NO:6）的5’端还连接有KpnI酶切位点，所述prZmUbi1-No启动子序列（SEQ ID NO:6）的3’端还连接有BsaI酶切位点。
[0082] 第二实施例、含有iOs4内含子序列的重组表达载体pA0080的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0083] 1、构建含有iOs4内含子序列的重组克隆载体pT-iOs4
[0084] 将iOs4内含子序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pT-iOs4，其构建流程如图2所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶内含子；T7为T7RNA聚合酶内含子；prZmUbi1-iOs4为prZmUbi1-iOs4嵌合启动子（SEQ ID NO:3）；MCS为多克隆位点）。
[0085] 然后将重组克隆载体pT-iOs4用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体pT-iOs4），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100mg/L）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入150μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（4M醋酸钾，2M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速
12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入
30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度
37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。
12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入
30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度
37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。
[0086] 提取的质粒经KpnI和BsaI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-iOs4中插入的prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0087] 按照上述构建重组克隆载体pT-iOs4的方法，将合成的所述prZmUbi1启动子序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体pT-iZmUbi1，其中，prZmUbi1为prZmUbi1启动子序列（SEQ ID NO:2）。酶切和测序验证重组克隆载体pT-iZmUbi1中所述prZmUbi1启动子序列正确插入。
[0088] 按照上述构建重组克隆载体pT-iOs4的方法，将合成的所述prZmUbi1-No启动子序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体pT-iNo，其中，prZmUbi1-No为prZmUbi1-No启动子序列（SEQ ID NO:6）。酶切和测序验证重组克隆载体pT-iNo中所述prZmUbi1-No启动子序列正确插入。
[0089] 2、构建含有iOs4内含子序列的重组表达载体pA0080
[0090] 用限制性内切酶KpnI和BsaI分别酶切重组克隆载体pT-iOs4和表达载体pA0000，将切下的prZmUbi1-iOs4嵌合启动子片段插到pA0000的KpnI和BsaI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体pA0080，其构建流程如图3所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prZmUbi1-iOs4：prZmUbi1-iOs4嵌合启动子（SEQ ID NO:3）；LUC：萤火虫荧光素酶（Luciferase）基因（SEQ ID NO:7）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID NO:8）；prZmUbi1：玉米Ubiquitin1（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:2）；REN：海肾荧光素酶（Renilla luciferase）基因（SEQ ID NO:9）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID NO:10）；LB：左边界）。
[0091] 将重组表达载体pA0080用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体p90040），42℃水浴30秒；
37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至
7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶KpnI和BsaI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体pA0080在KpnI和BsaI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，即prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列。
37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至
7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶KpnI和BsaI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体pA0080在KpnI和BsaI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，即prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列。
[0092] 按照上述构建重组表达载体pA0080的方法，将BamHI和HindIII酶切重组克隆载体pT-iZmUbi1切下的所述prZmUbi1启动子序列插入表达载体pA0000，得到重组表达载体pA0001。酶切和测序验证重组表达载体pA0001中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，即prZmUbi1启动子序列。
[0093] 按照上述构建重组表达载体pA0080的方法，将KpnI和BsaI酶切重组克隆载体pT-iNo切下的所述prZmUbi1-No启动子序列插入表达载体pA0000，得到重组表达载体pA0072。酶切和测序验证重组表达载体pA0072中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，即prZmUbi1-No启动子序列。
[0094] 3、重组表达载体转化农杆菌
[0095] 对己经构建正确的重组表达载体pA0080、pA0001和pA0072用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶KpnI和BsaI、BamHI和HindIII酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体pA0080、pA0001和pA0072结构完全正确。
[0096] 第三实施例、重组表达载体在玉米愈伤组织中的瞬时转化
[0097] 玉米幼胚的剥取：剥取玉米品种综31（Z31）的幼胚，在诱导培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.5mg/L、硝酸银0.85mg/L、2-吗啉乙磺酸（MES）0.5g/L）上进行愈伤组织的诱导，诱导时间为2周。将诱导后的愈伤组织转移到预培养培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、硝酸银0.85mg/L、2-吗啉乙磺酸（MES）0.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.5mg/L）上进行预培养，预培养的时间为4-7天。
[0098] 农杆菌菌液的制备：分别挑取含有pA0080、pA0001和pA0072的农杆菌单菌落，用枪头在加有壮观霉素（Spectinomycin）的固体YP培养板（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g、壮观霉素50mg/L）上划线，在28℃黑暗条件下培养2-3天。刮取YP培养板上的菌斑，在新的YP培养板上再培养1天，刮取培养3-4天的菌落，悬浮在5ml的侵染液（即侵染培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、Selwet L-770.02%（v/v），pH5.3））中，将农杆菌菌液混匀，将其浓度调整为OD660=0.4-0.6。
[0099] 农杆菌侵染玉米愈伤组织：在50ml的离心管中加入5ml预培养后的玉米愈伤组织，同时加入2-3ml侵染液，然后在45℃的水浴锅中加热5分钟，再将离心管置于冰上放置2分钟，接着将侵染液吸出后再加入5ml农杆菌菌液，涡旋震荡3分钟后将离心管平放5分钟；侵染结束后将农杆菌菌液吸出，用无菌吸头将农杆菌彻底洗净；将侵染后的愈伤组织从离心管中倒出，置于空培养皿的三层滤纸上，然后在愈伤组织的上面同样放三层滤纸，将愈伤组织上残存的农杆菌菌液彻底吸干。
[0100] 农杆菌与玉米愈伤组织共培养：将吸干农杆菌菌液的愈伤组织转移到共培养培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.5mg/L、L-脯氨酸0.7g/L、硝酸银0.85mg/L、L-半胱氨酸
0.3g/L、二硫苏糖醇0.4g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，愈伤组织与农杆菌共培养3天。获得转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米愈伤组织、转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米愈伤组织。
0.3g/L、二硫苏糖醇0.4g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，愈伤组织与农杆菌共培养3天。获得转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米愈伤组织、转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米愈伤组织。
[0101] 第四实施例、iOs4内含子序列的瞬时表达量测定（报告基因表达量）[0102] 分别取转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米愈伤组织、转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米愈伤组织各10个，加入400ul被动裂解液（PLB）破碎细胞，离心，取上清，根据Promega的Dual-Luciferase Reporter Assay System操作手册，对LUC和REN报告基因进行定量测定。具体操作步骤为：离心管中加入100ul LARII，加入20ul提取液，室温混匀，仪器读取LUC的表达量；加入100ul stop&Glo试剂，室温混匀，仪器读取REN的表达量。其中，LUC反映的是候选启动子（prZmUbi1-iOs4嵌合启动子、prZmUbi1启动子和prZmUbi1-No启动子）的表达量，REN反映的是对照启动子（prZmUbi1启动子）的表达量。结果以LUC/REN的形式呈现，表示候选启动子占对照启动子表达量的百分比。
[0103] 瞬时表达量的结果如图4所示。从图4中可以看出，转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米愈伤组织在瞬时转化中的表达量是转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织的1.13%。而在prZmUbi1-No启动子后加入不同的内含子，增强基因表达的效果不一样，转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米愈伤组织表达量增加27倍，达到转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织的27.42%。
[0104] 第五实施例、转入iOs4内含子序列的玉米植株的获得
[0105] 将第三实施例中获得的转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米愈伤组织、转入prZmUbi1启动子序列的玉米愈伤组织和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米愈伤组织按照下述步骤再生成植物。
[0106] 玉米愈伤组织的恢复：将共培养后的愈伤组织转移到恢复培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.5mg/L、硝酸银0.85mg/L、2-吗啉乙磺酸（MES）0.5g/L、头孢霉素0.25g/L、琼脂8g/L）上，恢复7天，以消除农杆菌并为愈伤组织提供恢复期。
[0107] 玉米愈伤组织的筛选：恢复期结束后，将愈伤组织转移到筛选培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、蔗糖5g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.5mg/L、硝酸银0.85mg/L、2-吗啉乙磺酸0.5g/L、头孢霉素0.25g/L、甘露糖12.5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，导致转化的愈伤组织选择性生长。筛选分两个阶段，每个阶段2周，筛选后获得抗性愈伤组织。
[0108] 玉米愈伤组织再生成植物：将抗性愈伤组织转移到MS分化培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、蔗糖30g/L、呋喃甲基腺嘌呤2mg/L、头孢霉素0.25g/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化1个月；分化出来的小苗转移到MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时，可以获得转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米植株、转入prZmUbi1启动子序列的玉米植株和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米植株各15个单拷贝植株。
[0109] 第六实施例、iOs4内含子序列的活性测定（报告基因表达量）
[0110] 分别取转入prZmUbi1-iOs4嵌合启动子序列的玉米植株、转入prZmUbi1启动子序列的玉米植株和转入prZmUbi1-No启动子序列的玉米植株的三叶苗期第3片叶、六叶苗期第六片叶、八叶期第7片叶、八叶期第8片叶（叶片12mg）、授粉后苞叶（20mg）、授粉后根（100mg）作为样品，参照第四实施例中的方法测定报告基因的表达量（LUC/REN）。
[0111] 转基因玉米植株报告基因表达量的结果如图5和6所示。从图5中的表达量可以看出，prZmUbi1-iOs4嵌合启动子是一个组成型表达的启动子，在图示的各组织部位都有较高的表达量。图6为prZmUbi1-iOs4嵌合启动子与prZmUbi1启动子的表达量比值关系。prZmUbi1启动子是已知的组成型高表达启动子，但它在玉米不同的组织中表达量不均一，所以prZmUbi1-iOs4嵌合启动子与prZmUbi1启动子的比值呈现变化趋势。从图6可以看出，与prZmUbi1启动子相比（LUC/REN），prZmUbi1-iOs4嵌合启动子在幼嫩组织中的表达量较低（三叶苗期、根），在成熟组织中的表达量较高（八叶期叶片、授粉后苞叶）；与prZmUbi1-No启动子相比，在图示的各组织部位的表达量均有显著增强。
[0112] 上述结果表明，本发明增强表达的内含子iOs4与prZmUbi1-No启动子组合成的prZmUbi1-iOs4嵌合启动子与prZmUbi1-No启动子相比能够增强启动子的表达特性；且prZmUbi1-iOs4嵌合启动子属组成型启动子，在植物各组织中普遍存在活性，尤以在成熟组织中的表达量较高。
[0113] 综上所述，本发明增强表达的内含子iOs4与启动子组合能够不同程度的增强启动子的表达特性；所述内含子还可以与外源基因组合，以最佳的表达方式实现外源基因的表达，为获得复合性状的转基因作物奠定基础。
[0114] 最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
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