干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途
阅读：348发布：2020-05-12
专利汇可以提供干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途，属于 生物 医药领域。涉及两对siRNA序列，具体为干扰卵巢癌细胞中PRKCE基因表达的siRNA序列，两对siRNA转入卵巢癌细胞中都能够通过沉默PRKCE基因从而抑制细胞的迁移和侵润。本发明的siRNA和PRKCE基因将有望成为临床上卵巢癌患者 基因 治疗 的靶向药物和靶点基因。，下面是干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途专利的具体信息内容。
干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，在所有妇科肿瘤当中其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。其死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢深居盆腔，早期症状很不明显，患者难以察觉，同时又缺乏有效的筛检方法，所以大多数患者确诊时已为晚期。即使经过有效的治疗，仍有近75％患者在病情缓解后复发，严重影响了女性的生命健康。大量研究发现卵巢癌的高发病率和高死亡率的主要原因是恶性肿瘤的侵润和转移。癌细胞的迁移和侵润是两个不同的病理过程，侵润是迁移的前提。肿瘤细胞的侵袭与转移是肿瘤发生和发展的重要阶段。因此找到抑制癌细胞迁移与侵润的有效方法，有效地杀伤癌细胞是提高患者生存率的关键。
[0003] PRKCE(Protein Kinase C,epsilon)是一个蛋白编码基因。PKC(Protein Kinase C)即蛋白激酶C，是存在于哺乳动物细胞内脂质依赖性丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的信号转导分子，可被钙离子和第二信使甘油二酯激活。PKC是调控细胞功能的重要分子，能够中介多种神经体液因子。而PRKCE已被证明是参与在许多不同的细胞功能，如神经元通道的激活，细胞凋亡，心肌缺血，热休克反应，以及胰岛素胞吐作用。小鼠基因敲除的研究表明，这种激酶对脂多糖(LPS)是重要的介导激活的巨噬细胞信号也可以控制焦虑样行为发挥作用。总之，PRKCE就是磷酸化使其下游的信号分子中丝苏氨酸残基磷酸化，被PRKCE磷酸化后的信号分子继续把信号传递到细胞内的不同靶区，从而产生特定的生物学效应。在所有的PKC家族中，PRKCE是唯一一种具有原癌基因功能的蛋白激酶，通过Ras/Raf/ERK及Akt途径，PRKCE可以调节细胞的增生及凋亡。PRKCE-siRNA影响细胞增殖、侵袭、转移等一系列复杂功能变化及相关蛋白表达变化的分子生物学机制可能为：PRKCE-siRNA降低ME180细胞中的PRKCE蛋白表达后，MAPK信号通路的转录活性明显降低，可能进而选择性影响了cyclinD1蛋白和MMP-2蛋白的表达，从而使细胞的增殖、侵袭和转移能力受到明显影响。
[0004] 针对PRKCE的研究逐渐增多，PRKCE是PKC家族中与肿瘤的发生发展密切相关的重要亚型之一，PRKCE表达水平与乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤相关。一般认为其可能通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等信号通路来影响肿瘤细胞的迁移和侵润等生物学过程，其有望成为包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的基因治疗靶点。但是目前还没有关于利用siRNA序列来干扰PRKCE基因的表达达到卵巢癌细胞迁移侵润效果的专利发表。
[0005] 本发明涉及了两对针对PRKCE基因的siRNA序列，它们能够有效的干扰PRKCE基因的表达，从而抑制卵巢癌细胞的迁移侵润。因此，本发明涉及的两对有效的siRNA序列可能在卵巢癌治疗方面发挥治疗作用，而且迄今为止尚未见有国内外的相关报道。
发明内容
[0006] 本发明的目的是通过沉默PRKCE基因验证其对卵巢癌细胞迁移侵润的影响，判断沉默PRKCE基因的siRNA序列的特异性和PRKCE基因对卵巢癌细胞迁移侵润的影响；提供两种干扰PRKCE基因表达的siRNA序列及其抑制卵巢癌细胞迁移和侵润的用途。
[0007] 干扰PRKCE基因表达的siRNA序列，是该序列为下列两对序列中的任意一种或两种：
[0008] PE1：5′-GAACACUACCAUGGUCGGGUU-3′/5′-CCCGACCAUGGUAGUGUUCUU-3′[0009] PE2：5′-ACACAUGAAUAUGAUGGGCUU-3′/5′-GCCCAUCAUAUUCAUGUGUUU-3′[0010] 上述干扰PRKCE基因表达的siRNA序列用途，所述的小分子干扰RNA可以沉默卵巢癌细胞中的PRKCE基因，从而显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵润能力。
[0011] 上述干扰PRKCE基因表达的siRNA序列用途，可以制备抑制卵巢癌细胞转移药物。
[0012] 本发明的有益效果为：本发明针对PRKCE基因设计了一系列siRNA序列，并筛选出两对siRNA序列可以抑制PRKCE基因的表达。通过脂质体将合成的siRNA转入A2780和SKOV3卵巢癌细胞中，并设立对照组。用实时定量PCR验证siRNA对PRKCE基因表达的抑制作用，通过细胞划痕实验，迁移和侵润实验检验siRNA对A2780和SKOV3细胞迁移和侵润能力的影响。结果表明：细胞划痕和迁移实验证实，两种siRNA都能抑制A2780、SKOV3细胞的迁移；细胞侵润实验证实，两种siRNA都能抑制SKOV3细胞的侵润。本发明提供的两种siRNA序列在未来卵巢癌治疗中具有非常大的潜在价值。
附图说明
附图说明
[0013] 图1.对照组和试验组中PRKCE基因的表达水平，与对照组相比，试验组中PE1和PE2显示出显著抑制PRKCE基因的表达(P<0.01)。
[0014] 图2.A2780细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在0h，24h，48h，72h，96h以及120h这些时间点采集图片，对比分析检测siRNA沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞A2780的影响。
[0015] 图3.A2780细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在0h，24h，48h，72h，96h以及120h这些时间点，将各组的迁移距离进行统计，经过三次独立的实验后统计汇总分析得到沉默PRKCE基因对A2780细胞划痕实验迁移速率的影响折线图。
[0016] 图4.SKOV3细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在0h，6h，12h，24h，30h以及36h这些时间点采集图片，对比分析检测siRNA沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞SKOV-3的影响。
[0017] 图5.SKOV3细胞各组经过划痕实验的处理后，分别在0h，6h，12h，24h，30h以及36h这些时间点，将各组的迁移距离进行统计，经过三次独立的试验后统计汇总分析得到沉默PRKCE基因对SKOV3细胞划痕实验迁移速率的影响折线图。
[0018] 图6.对于卵巢癌A2780细胞，将Transwell小室下室进行拍照，经过三次独立实验后，选取最好的实验结果进行对比分析，结果提示：可以明显看出沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用显著。
[0019] 图7.对于卵巢癌A2780细胞，将Transwell小室下室进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析，其差距具有统计学意义(P<0.001)。结果提示：可以明显得出沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用显著，其差距具有统计学意义(P<0.001)。
[0020] 图8.对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行拍照，经过三次独立实验后，选取最好的实验结果进行对比分析，结果提示：可以明显看出沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用显著。
[0021] 图9.对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析。结果提示：可以明显得出沉默PRKCE基因对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用显著，其差距具有统计学意义(P<0.001)。
[0022] 图10.对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行拍照，经过三次独立实验后，选取效果最好的结果进行对比分析，结果提示：这表示沉默PRKCE对卵巢癌SKOV3细胞的侵润能力有较强的抑制效果。
[0023] 图11.对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)侵润的细胞数进行百分比对比分析，结果提示：数据显示沉默PRKCE对卵巢癌SKOV3细胞的侵润能力有较强的抑制效果，其差距具有统计学意义(P<0.001)。
具体实施方式
[0024] 本发明最初通过Thermo Fisher Scientific的BLOCK-iTTM RNAi Designer设计获得了6种siRNA序列，如表1所示，通过实时定量PCR技术，检测到各组细胞PRKCE mRNA的表达水平与对照组进行对比，筛选最后得到两种能够有效的干扰PRKCE基因表达的siRNA序列[PRKCE1(PE1)和PRKCE2(PE2)]，本发明首先利用设计得到的6种siRNA序列去干扰卵巢癌A2780和SKOV3细胞中的PRKCE基因的表达，发现PE1和PE2序列使得卵巢癌A2780和SKOV3细胞中PRKCE表达水平显著降低，由此确定两种有效的siRNA序列，PE1和PE2。
[0025] 表1.siRNA的序列
[0026]名称 序列1(5′-3′) 序列2(5′-3′)
PE1 GAACACUACCAUGGUCGGGUU CCCGACCAUGGUAGUGUUCUU
PE2 ACACAUGAAUAUGAUGGGCUU GCCCAUCAUAUUCAUGUGUUU
PE3 CCACUUCGAGGACUGGAUUUU AAUCCAGUCCUCGAAGUGGUU
PE4 CCCAUUGCAGAGACUUCAUUU AUGAAGUCUCUGCAAUGGGUU
PE5 GCAGGGUUUGCAGUGUAAAUU UUUACACUGCAAACCCUGCUU
PE6 GCAGGGAUACCAGUGUCAAUU UUGACACUGGUAUCCCUGCUU
PE1 GAACACUACCAUGGUCGGGUU CCCGACCAUGGUAGUGUUCUU
PE2 ACACAUGAAUAUGAUGGGCUU GCCCAUCAUAUUCAUGUGUUU
PE3 CCACUUCGAGGACUGGAUUUU AAUCCAGUCCUCGAAGUGGUU
PE4 CCCAUUGCAGAGACUUCAUUU AUGAAGUCUCUGCAAUGGGUU
PE5 GCAGGGUUUGCAGUGUAAAUU UUUACACUGCAAACCCUGCUU
PE6 GCAGGGAUACCAGUGUCAAUU UUGACACUGGUAUCCCUGCUU
[0027] 通过细胞划痕实验表明，利用筛选得到的两种siRNA序列干扰PRKCE基因的表达可抑制卵巢癌A2780和SKOV3细胞的迁移能力；细胞迁移实验表明利用siRNA序列干扰PRKCE基因的表达可抑制卵巢癌A2780和SKOV-3细胞的迁移能力；细胞侵润实验表明通过siRNA干扰PRKCE基因的表达可抑制SKOV3细胞的侵润能力。从而证明利用设计筛选的两种siRNA抑制PRKCE基因的表达对卵巢癌细胞迁移侵润具有显著影响。这些结果都证明了PRKCE基因的小干扰RNA(siRNA)在今后的卵巢癌治疗研究中的具有潜在应用价值。
[0029] 表2.PCR引物序列.
[0030]引物 引物名称 序列(5′-3′)
上游引物 PRKCE-F caggatgatgacgtggactg
下游引物 PRKCE-R ctgcagcatagaaccgtgaa
上游引物 PRKCE-F caggatgatgacgtggactg
下游引物 PRKCE-R ctgcagcatagaaccgtgaa
[0031] 实施例1.细胞的培养和传代、细胞的逆转染以及实时定量PCR技术
[0032] A2780细胞和SKOV3细胞(American type culture collection)体外分别培养于含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(Life Technologies公司，美国)培养基和含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的RMPI-1640培养基中，需要每天定期观察细胞生长状态，细胞长满培养瓶时要及时传代(一般在贴壁细胞表面积占80％及以上时传代)。当细胞培养和传代效果良好时进行下一步实验。
[0033] 细胞逆转染实验，首先对照组的药物配制，配制PLK1-mix，取一新EP管，往其中加入15μl Opti-MEM(减血清培养液)(Life Technologies公司，美国)，及5μl,2μM的PLK1(Polo-like Kinase 1)(吉玛基因，中国)，吹打混匀；其次试验组药物配制方法和对照组步骤一样，分别配置总体积都是20μl含有PRKCE1(PE1)、PRKCE2(PE2)、PRKCE3(PE3)、PRKCE4(PE4)、PRKCE5(PE5)、PRKCE6(PE6)(吉玛基因，中国)的PE1-mix、PE2-mix、PE3-mix、PE4-mix、PE5-mix、PE6-mix；然后再取一新EP管，配制Lipo-mix，往其中加入134.4μl Opti-MEM，及5.6μl Lipofectamine 2000(Lipo)(Life Technologies公司，美国)手持弹、甩EP管，使其混匀。每管轻弹、甩混匀后，分7次从Lipo-mix中取20μl分别到PLK1-mix，PE1-mix，PE2-mix，PE3-mix，PE4-mix，PE5-mix，PE6-mix管中，弹甩混匀；再取20μl Opti-MEM到Lipo-mix中，弹甩混匀。药物配好后进行实验。先准备T25培养瓶的细胞，弃原培养液，用2ml PBS清洗和0.5ml胰酶消化，加2ml含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，146g离心5min，弃上清，加2ml含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取0.5ml到EP管，用枪吸取10μl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种4000个细胞。按10个孔、每孔需10μl的siRNA-Lipo混合液与90μl细胞悬液计算，根据数得细胞数计算后取(900-A)μl培养基，A μl细胞悬液(取前需再次吹打混匀)，于v形槽内混匀。分别将细胞种到96孔板中，然后在96孔板中相应孔加前面配好的药物10μl(分别含有PLK1、PE1、PE2)及细胞悬液(每孔90μl)，在实验孔附近的孔加100μl PBS以放在边缘效应。最后标记96孔板，阳性对照组为PLK1，试验组为PE1、PE2、PE3、PE4、PE5、PE6，并将其放入5％CO2 37℃细胞培养箱中培养。在培养期间每天观察一次96孔板，观察试验组跟对照组中细胞生长情况，包括形态和数量(细胞密度)的差异，以及细胞逆转染实验成功与否，可以进行实时定量PCR实验验证。
[0034] 用Trizol法使总RNA从细胞中分离出来，及第一链DNA是用Invitrogen逆转录试剂盒合成的。然后，从每孔中取20μl反应物并使用ABI7300实时PCR检测系统(BioRad公司，美国)进行检测，检测对照组和试验组中PRKCE基因的表达量。PCR反应体系为：95℃预变性2分钟；40个循环，95℃30秒，58℃30秒；72℃延伸1分钟，在PCR反应的循环延伸末端收集荧光信号。最后使用 法测定表达水平。
[0035] 实验结果显示(如图1)：与对照组相比，试验组PE1、PE2、PE3、PE4、PE5、PE6中PRKCE的表达量分别是23.6％、32.4％、73.5％、69.1％、89.6％、84.3％，其中PE1和PE2对于PRKCE基因的表达水平的抑制效果非常显著。
[0036] 实施例2.细胞划痕实验
[0037] 第一天：种板。T25瓶A2780和SKOV3细胞培养和传代良好后，弃原培养液，用2ml PBS清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，146g离心5min，弃上清，加含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，取0.5ml到EP管，用枪吸取10μl于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。每孔种4000个细胞。按10个孔、每孔90μl计算，根据数得细胞数计算后取(900-A)μl培养基，Aμl细胞悬液(取前需再次吹打混匀)，于v形槽内混匀。然后分别将细胞种到24孔板中，之后和实施例1中加的药物配制方法一样，根据筛选出的结果，试验组加药含有为PE1和PE2，分别为对照组(加了PLK1)、试验组(加了Lipo、PE1、PE2)。
[0038] 第二天：划痕。用10μl白色tip枪头尽量垂直于孔表面划直线，划两条直线呈十字状。划完就开始(0h)拍照，以后每过6h就拍一次照，直至划痕愈合为止。最后采集图片，统计分析。
[0039] 实验结果显示：A2780细胞进过上面的一系列处理后，分别在0h，24h，48h，72h，96h以及120h这些时间点采集图片，经过三次独立的实验之后，将各组的迁移距离进行统计分析。如图2和图3，实验结果提示：可以看出试验组中PE1和PE2抑制PRKCE基因的表达从而显著的抑制了卵巢癌细胞A2780的迁移。SKOV3细胞经过上面的一系列处理后，分别在0h，6h，12h，24h，30h以及36h这些时间点采集图片，经过三次独立的实验之后，将各组的迁移距离进行统计分析。如图4和图5，实验结果提示：不同的siRNA沉默PRKCE基因可不同程度上抑制卵巢癌细胞SKOV3的迁移，其中PE1和PE2抑制卵巢癌细胞SKOV3迁移的效果更显著。
[0040] 实施例3.细胞迁移实验
[0041] 迁移实验：制备A2780和SKOV3细胞悬液：PBS(国药集团化学试剂有限公司，中国)清洗细胞、吸走PBS，加胰酶(Sigma-Aldrich公司，美国)消化、用含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基吹打混匀，终止消化、离心吸走上清液、分别用无胎牛血清含青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基重悬细胞、稀释相应倍数之后使用血球计数板对细胞进行计数、调整细胞的密度至2×105个/ml。接种细胞：将调整好后的细胞悬液吹打混匀几次后，各取200μl分别加入和实施例1一样配制过程的含PE1、PE2、Lipo、PLK1的EP管中再次吹打混匀，依次取200μl混合液加入到Transwell小室中；最后在小室底部即24孔板里加500μl含10％胎牛血清及青霉素-链霉素的DMEM(或RMPI-1640)培养基(Life Technologies公司，美国)(下层培养液和小室间常有气泡产生，一旦产生气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放入培养板)。按照正常细胞培养规则培养定期观察(具体时间随细胞株种类而定)。结果统计：用镊子夹出小室，用棉签轻轻擦去剩余在上室内的贴壁细胞。再用0.1％结晶紫(国药集团化学试剂有限公司)染色15-20min，用清水或者PBS洗3遍以上(染色前要将膜风干，否则很容易染不上)。然后取一干净载玻片，表面滴一滴清水，将Transwell小室(Corning公司，美国)放在清水上就可清楚看到小室底膜下室侧附着的细胞，用显微镜观察和拍照，随机选5到10个视野拍照。最后收集图片，统计分析。
[0042] 实验结果显示：对于卵巢癌A2780细胞，将Transwell小室下室进行拍照之后进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析，其差距具有统计学意义(P＝0.000)。如图6和图7，结果提示：可以明显看出试验组中PE1和PE2抑制PRKCE基因的表达水平从而对卵巢癌细胞A2780的迁移抑制作用非常显著。同样地，对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行拍照之后进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析，其差距具有统计学意义(P＝0.000)。如图8和图9，结果提示：可以明显看出试验组中PE1和PE2抑制PRKCE基因的表达水平从而对卵巢癌细胞SKOV3的迁移抑制作用非常显著。
[0043] 实施例4.细胞侵润实验
[0044] 侵润实验：第一天，傍晚，将-20℃冰箱中的ECM胶(Sigma-Aldrich公司，美国)移至4℃冰箱，过夜解冻；第二天，预冷待用24孔板，Tip枪头及transwell小室，用预冷过的无胎牛血清及含青霉素-链霉素的培养基与ECM胶1：8混合稀释(在预冷过的EP管中)，稀释好后在transwell小室中各加入40μl的ECM稀释液，过后放入5％CO2 37℃细胞培养箱过夜；第三天，在小室中种入SKOV3细胞，此后与transwell迁移实验一致。
[0045] 实验结果显示：对于卵巢癌SKOV3细胞，将Transwell小室下室进行拍照之后进行计数，经过三次独立实验后，我们将对照组及试验组(Lipo、PE1、PE2)迁移的细胞数进行百分比对比分析，其差距具有统计学意义(P＝0.000)。如图10和图11，结果提示：可以看出试验组中PE1和PE2对于抑制PRKCE基因的表达从而对卵巢癌SKOV3细胞的侵润能力有较强的抑制效果。
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