一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽及其应用
阅读：773发布：2023-03-04
专利汇可以提供一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的 信号 肽及其应用。所述信号肽的 氨 基酸序列如(a)或(b)所示：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白活性的由(a)衍生的 蛋白质 。本发明首次公开了以乳杆菌阿魏酸酯酶的N端序列作为引导肽，可以将与N端序列连接的目的基因在大肠杆菌中表达并分泌至胞外，从而实现降低目的蛋白纯化的成本，有利于蛋白产物的规模化生产利用。，下面是一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽及其应用专利的具体信息内容。
1.一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽，其特征在于，氨基酸序列如(a)或(b)所示：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的信号肽，其特征在于，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.2所示；
优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.3所示；
优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.4所示；
优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述的信号肽，其特征在于，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.6所示；
优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.7所示；
优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.8所示。
4.一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如(i)或(ii)所示：
(i)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
(ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且编码具有诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白活性的蛋白质的DNA分子。
5.如权利要求1所述的信号肽的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.10所示；
优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.11所示；
优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.12所示；
优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.13所示。
6.如权利要求1所述的信号肽的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.14所示；
优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.15所示；
优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.16所示。
7.一种大肠杆菌重组表达载体，由权利要求4诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因连接目的蛋白编码基因克隆到大肠杆菌表达载体中获得。
8.如权利要求7所述的大肠杆菌重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET-22b；
优选的，所述目的蛋白为来源于人参土地类芽孢杆菌的CBM蛋白、木聚糖酶Xyn11、纤维素酶Cel5或纤维素酶Cel9。
9.权利要求4所述诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因在制备胞外分泌目的蛋白的大肠杆菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌菌株为Escherichia coli BL21(DE3)。
一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 大肠杆菌因其清楚的基因背景和完善的蛋白表达调控工具，已被作为细胞工厂来生产多种酶以及医用蛋白。但是由于其具有内外双层膜结构，使得蛋白的分泌表达成为一个难题，具有信号肽的蛋白也多是被转运至内外双层膜之间的周质空间。因此大肠杆菌所表达蛋白通常位于胞内，获得目的产物常常需要复杂的纯化过程。因此在利用大肠杆菌表达某些目的蛋白产物时，其生产工艺达不到工业化规模水平，无法实际应用于各相关领域。
[0003] 大肠杆菌中蛋白分泌系统包括Type I、Type II、Type III、Type V和Tat型分泌途径，但是其分布具有菌株特异性，Type III、Type V以及完整的Type I分泌途径存在于病原性大肠杆菌中，而且其底物蛋白不经过周至空间直接被分泌至胞外。Type II蛋白分泌途径能够分泌多数胞外蛋白，它包括两个步骤：引导蛋白将待转运蛋白结合到secA上，secA将待转运蛋白送入secYEG转运通道中，进入周质空间，通过sec通路被转运蛋白的信号肽序列，在转运到周至空间后一般会被切除。待转运蛋白经由多个蛋白形成的复合体，通过蛋白D的C-末端形成的β-桶结构跨越外膜，分泌至细胞外。大肠杆菌中已知的利用TypeII分泌途径的胞外蛋白具有复杂的C端识别序列。
[0004] 日本专利文献JP61152297A(申请号JP59279585)公开了一种生产蛋白质的方法，包括：(1)提供包含所需外源蛋白的结构基因的基因；(2)提供载体，该载体包括编码能够连接desi的结构基因的信号肽的基因(A)红色外源蛋白，在基因(A)的下游侧末端之后立即到达所述基因，并且在预定宿主细胞中可增殖；(3)利用具有所需外源prot的结构基因的基因制备可在预定宿主细胞中增殖的重组DNA；(4)利用重组DNA对宿主细胞进行转化，制备转化子；(5)培养转化子并回收所需的外源蛋白。由于信号肽，宿主细胞内产生的外源蛋白或外源蛋白从细胞排出。
发明内容
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽及其应用。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽，氨基酸序列如(a)或(b)所示：
[0008] (a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0011] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.2所示。
[0012] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列来源于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0013] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.3所示。
[0014] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列来源于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0015] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.4所示。
[0016] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列来源于噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0017] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.5所示。
[0018] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列来源于瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0019] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.6所示。
[0020] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列来源于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0021] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.7所示。
[0022] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列来源于格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0023] 根据本发明优选的，所述氨基酸序列(b)如SEQ ID NO.8所示。
[0024] 所述氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列。
[0025] 一种诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因，核苷酸序列如(i)或(ii)所示：
[0026] (i)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
[0027] (ii)在严格条件下与(i)限定的DNA序列杂交且编码具有诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白活性的蛋白质的DNA分子。
[0028] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0029] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.10所示。
[0030] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列来源于香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0031] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.11所示。
[0032] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列来源于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0033] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.12所示。
[0034] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列来源于噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0035] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.13所示。
[0036] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列来源于瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0037] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.14所示。
[0038] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列来源于约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0039] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.15所示。
[0040] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列来源于格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0041] 根据本发明优选的，所述核苷酸序列(ii)如SEQ ID NO.16所示。
[0042] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)中的阿魏酸酯酶的N端20个氨基酸序列的编码基因。
[0043] 一种大肠杆菌重组表达载体，由上述诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因连接目的蛋白编码基因克隆到大肠杆菌表达载体中获得。
[0045] 上述诱导大肠杆菌胞外分泌外源蛋白的信号肽的编码基因在制备胞外分泌目的蛋白的大肠杆菌中的应用。
[0046] 根据本发明优选的，所述大肠杆菌菌株为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0047] 有益效果
[0048] 本发明首次公开了以乳杆菌阿魏酸酯酶的N端序列作为引导肽，可以将与N端序列连接的目的基因在大肠杆菌中表达并分泌至胞外，从而实现降低目的蛋白纯化的成本，有利于蛋白产物的规模化生产利用。附图说明
[0049] 图1：发酵乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白CBM的分泌表达的检测结果；
[0050] 图2：香肠乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白CBM的分泌表达的检测结果；
[0051] 图3：嗜酸乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Xyn11的分泌表达的检测结果；
[0052] 图4：噬淀粉乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Xyn11的分泌表达的检测结果；
[0053] 图5：瑞士乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Cel5的分泌表达的检测结果；
[0054] 图6：约氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Cel5的分泌表达的检测结果；
[0055] 图7：格氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Cel9的分泌表达的检测结果；
[0056] 图8：罗伊氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列作为引导肽对异源蛋白Cel9的分泌表达的检测结果。
具体实施方式
[0058] 生物材料来源
[0059] 发酵乳杆菌所使用为标准菌CCTCC AB2010204，购自中国典型培养物保藏中心，普通市售产品。
[0060] 香肠乳杆菌所使用为标准菌CCTCC AB2016237，购自中国典型培养物保藏中心，普通市售产品。
[0061] 嗜酸乳杆菌所使用为标准菌CCTCC AB2010208，购自中国典型培养物保藏中心，普通市售产品。
[0062] 噬淀粉乳杆菌所使用为标准菌CGMCC 11056，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0063] 瑞士乳杆菌所使用为标准菌CGMCC 1.9090，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0064] 约氏乳杆菌所使用为标准菌CGMCC 1.3260，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0065] 格氏乳杆菌所使用为标准菌CGMCC 1.3396，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0066] 罗伊氏乳杆菌所使用为标准菌CGMCC 1.2838，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0067] 人参土地类芽孢杆菌所使用为菌株ACCC 02989，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，普通市售产品。
[0068] 实施例1：乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因的克隆
[0069] 分别取1～3ml过夜培养的发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌菌液，6000转/min离心3min收集菌体。重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，添加25μL 50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h。加入30μL 10％(质量百分比)SDS、3μL 20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴处理1h。再加入100μL 5M NaCl、80μL CTAB/NaCl溶液(10％(质量百分比)CTAB，0.7mol/L NaCl)，65℃水浴处理10min。加入等体积的氯仿异戊醇(24：1)抽提，12000转/min离心5min，保留上清。加入终浓度100μg/mL的RNase A溶液，37℃水浴处理30min。再用等体积的酚氯仿异戊醇(体积比25：24：1)和氯仿异戊醇(体积比24：1)各抽提一次。最后加入等体积异丙醇-20℃沉淀30min。12000转/min离心10min，收集DNA。用70％(体积百分比)乙醇洗涤2次，42℃培养箱干燥，加40μL无菌水溶解。
[0070] 根据NCBI数据库中已公布的全基因组序列，设计扩增阿魏酸酯酶N端20个氨基酸的基因引物，分别如下：
[0071] 发酵乳杆菌：
[0072] Forward1：5`-TATACATATGGAAGTTGCAATCAAGAG-3`
[0073] Reverse1：5`-ATAGGATCCGTCGCTCCCCTCGAGCAGCC-3`
[0074] 香肠乳杆菌：
[0075] Forward2：5`-TATACATATGAAAGTAGAAATTAAACG-3`
[0076] Reverse2：5`-ATAGGATCCTTTTGGTTTAACAAAATCTC-3`
[0077] 嗜酸乳杆菌：
[0078] Forward3：5`-TATACATATGTCTCGCATTACAATTGA-3`
[0079] Reverse3：5`-ATAGGATCCAGGTTCTTCACGATCGCCTA-3`
[0080] 噬淀粉乳杆菌：
[0081] Forward4：5`-TATACATATGTCCCGCATTACAATTGA-3`
[0082] Reverse4：5`-ATAGGATCCAGGCTCTTCACGATCTCCTA-3`
[0083] 瑞士乳杆菌
[0084] Forward5：5`-TATACATATGTCCCGCATTACGATTG-3`
[0085] Reverse5：5`-ATAGGATCCTGGTTCTTCACGGTCACC-3`
[0086] 约氏乳杆菌
[0087] Forward6：5`-TATACATATGGCAACAATTACACTTG-3`
[0088] Reverse6：5`-ATAGGATCCAGGTTCTTCTCGAGTTCC-3`
[0089] 格氏乳杆菌
[0090] Forward7：5`-TATACATATGGCAACAATTACAATTG-3`
[0091] Reverse7：5`-ATAGGATCCAGGTTCTTCACGAGTTCC-3`
[0092] 罗伊氏乳杆菌
[0093] Forward8：5`-TATACATATGGAAATAACAATCAAAC-3`
[0094] Reverse8：5`-ATAGGATCCCGTTGTTCCTTCAAGAAG-3`
[0095] 分别以提取发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR结束后胶回收后，使用NdeI和BamHI双酶切，并进行产物纯化。
[0096] PCR扩增条件：
[0097]
[0098] PCR扩增程序：
[0099] 94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸10s，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。
[0100] 提取质粒pET-22b，并用NdeI和BamHI双酶切，酶切产物进行胶回收。将酶切过的阿魏酸酯酶N端序列编码基因与载体以1:5的摩尔比混匀，使用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，之后将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行热激反应转化。将恢复培养好的菌液浓缩后在LB(Amp抗性)平板上涂布，37度过夜培养。挑取转化子，酶切验证。
[0101] 经测序，发酵乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.1所示；香肠乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.2所示；嗜酸乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.3所示；噬淀粉乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.4所示；瑞士乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.5所示；约氏乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.6所示；格氏乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.7所示；罗伊氏乳杆菌的PCR扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，表达的N端序列如SEQ ID NO.8所示。
[0102] 实施例2：发酵乳杆菌和香肠乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因连接CBM基因重组大肠杆菌表达菌株的构建
[0103] 参考实施例1中的基因组提取方法，提取人参土地类芽孢杆菌杆菌的基因组序列。根据NCBI数据库中的人参土地类芽孢杆菌的全基因组序列，设计扩增CBM的基因引物Forward9：5`-ATAGGATCCACACTTACGATTGGAGGCAG-3`和Reverse9：5`-
ATATCTCGAGATGGATGTCCAAATAGTC-3`。以提取人参土地类芽孢杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR结束后胶回收后进行产物纯化。PCR结束后胶回收后，使用BamHI和XhoI双酶切，并进行产物纯化。
ATATCTCGAGATGGATGTCCAAATAGTC-3`。以提取人参土地类芽孢杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。PCR结束后胶回收后进行产物纯化。PCR结束后胶回收后，使用BamHI和XhoI双酶切，并进行产物纯化。
[0104] PCR扩增条件：
[0105]
[0106] PCR扩增程序：
[0107] 94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。
[0108] 分别提取已经连接发酵乳杆菌和香肠乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因的pET-22b载体，并用BamHI和XhoI双酶切，酶切产物进行胶回收。将酶切过的CBM基因与载体以1:5的摩尔比混匀，使用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，之后将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行热激反应转化。将恢复培养好的菌液浓缩后在LB(Amp抗性)平板上涂布，37度过夜培养。挑取转化子，酶切验证。将验证成功的DH5α转化子提取质粒后，转入E.coli BL21(DE3)中，LB(Amp抗性)平板筛选出BL21(DE3)转化子。转化子表达目的蛋白CBM大小约为16KDa。
[0109] 实施例3：嗜酸乳杆菌和噬淀粉乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因连接木聚糖酶Xyn11基因重组大肠杆菌表达菌株的构建
[0110] 参考实施例2中的方法，以人参土地类芽孢杆菌杆菌的基因组序列为模板，设计扩增木聚糖酶Xyn11的基因引物Forward10：5`-ATAGGATCCGCAACGACGATTACGTCCAATG-3`和Reverse10：5`-ATATCTCGAGATGGATGTCCAAATAGTC-3`。分别连接包含嗜酸乳杆菌和噬淀粉乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因的pET-22b载体，获得转化子，转化子表达目的蛋白Xyn11大小约为39KDa。
[0111] 其中PCR扩增程序：
[0112] 94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。
[0113] 实施例4：瑞士乳杆菌和约氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因连接纤维素酶Cel5基因重组大肠杆菌表达菌株的构建
[0114] 参考实施例2中的方法，以人参土地类芽孢杆菌杆菌的基因组序列为模板，设计扩增木聚糖酶Cel5的基因引物Forward11：5`-ATAGGATCCGCAGGAATCAGGCCGTGAGGG-3`和Reverse11：5`-ATACTCGAGTTAAGGCTGTGATTGGCCTG-3`。分别连接包含瑞士乳杆菌和约氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因的pET-22b载体，获得转化子，转化子表达目的蛋白Cel5大小约为64KDa。
[0115] 其中PCR扩增程序：
[0116] 94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。
[0117] 实施例5：格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因连接纤维素酶Cel9基因重组大肠杆菌表达菌株的构建
[0118] 参考实施例2中的方法，以人参土地类芽孢杆菌杆菌的基因组序列为模板，设计扩增木聚糖酶Cel9的基因引物Forward12：5`-ATAGGATCCGCTCCTACAGATTACAATTAC-3`和Reverse12：5`-ATACTCGAGTTAATCCAGCTCCGTTCCCC-3`。分别连接包含格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌阿魏酸酯酶N端序列基因的pET-22b载体，获得转化子，转化子表达目的蛋白Cel5大小约为97KDa。
[0119] 其中PCR扩增程序：
[0120] 94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃终延伸5min，16℃保存。
[0121] 实施例6：诱导大肠杆菌基因工程菌株分泌表达异源蛋白
[0122] 挑取BL21(DE3)转化子到5mL含有Amp抗生素的LB中，过夜培养后以2％(体积百分比)转接至100mL LB培养基中，37℃培养至OD值0.6左右时，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续培养24h诱导蛋白表达。大肠杆菌培养12h后，13000rpm离心10min，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，为胞外组分；等体积的PBS缓冲液重悬菌体，匀质仪破碎，13000rpm离心10min，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，为胞内组分。获得的各组分使用western-blot检测其中是否存在目的蛋白。
[0123] Western-blot检测方法如下：SDS-PAGE电泳分离目的样品；剪取适当大小的PVDF膜和2张相应大小的滤纸。PVDF膜预先在甲醇中浸泡活化5min，后将PVDF膜、滤纸、海绵以及蛋白胶都放于转膜缓冲液中；按照黑板-海绵-滤纸-蛋白胶-PVDF膜-滤纸-海绵-红板的顺序放置，一定要避免气泡的产生；200mA恒流，冰水浴条件下转膜，时间根据蛋白大小确定；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将PVDF膜放入15mL封闭缓冲液中，摇动孵育封闭1h；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将anti-His单克隆抗体按照体积比1:1000比例加入封闭液中，放入PVDF膜，4°C过夜孵育；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将辣根过氧化物酶偶联的二抗按照体积比1:300比例加入封闭液，放入PVDF膜，摇动孵育1h；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；使用辣根过氧化物酶法显色，结束后放入蒸馏水中终止反应。结果如图1-8所示，分别为发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌N端序列对目的蛋白分泌表达。
[0124] 其中，转膜缓冲液：39mM甘氨酸，48mM Tris，20％甲醇；TBST：20mM Tris-HCl，150mM氯化钠，0.05％Tween 20；封闭液：含5％脱脂奶粉的TBST溶液；显色剂：DAB，NiCl，过氧化氢。
[0125] 实施例7：分泌表达异源蛋白的定量分析和纯化制备
[0126] 利用考马斯亮蓝测定胞外分泌的总蛋白浓度，进一步对胞外蛋白进行SDS-PAGE电泳，并使用成像软件对目标蛋白进行定量分析。结果测得的发酵乳杆菌、香肠乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、格氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌N端序列对目的蛋白的分泌量分别为215.8、234.7、198.6、212.3、267.1、219.6、107.6和111.5mg/L。
[0127] 利用pET系统上所带的组氨酸标签，使用镍柱亲和层析对发酵液中的木聚糖酶进行纯化。方法如下：13000rpm，4℃下离心15min，收集上清，使用0.22μm过滤；用5倍柱体积的超纯水过Histrap柱，速度为1mL/min；用5倍柱体积的Binging Buffer过柱子；样品过柱子；10倍柱体积的Binding Buffer过柱子；10倍柱体积的Washing Buffer过柱子，洗掉未结合的蛋白组分；5倍柱体积的Elution Buffer过柱子，收集的液体中包含目的蛋白；目的蛋白加入透析袋中，放到PBS缓冲液中，4℃下过夜透析除去咪唑。
[0128] 其中，Binging Buffer为20mM磷酸盐，500mM氯化钠，25mM咪唑，调节pH为7.4；Washing Buffer为20mM磷酸盐，500mM氯化钠，50mM咪唑，调节pH为7.4；Elution Buffer为
20mM磷酸盐，500mM氯化钠，500mM咪唑，调节pH为7.4。
20mM磷酸盐，500mM氯化钠，500mM咪唑，调节pH为7.4。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 过表达单一MicroRNA成熟体序列的新方法 | 2020-05-12 | 72 |
| 用于提高表达的细菌前导序列 | 2020-05-13 | 773 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签E组 | 2020-05-11 | 628 |
| 增强有用基因表达的核酸序列和方法 | 2020-05-13 | 844 |
| 一种肝脏高效表达调控序列及其应用 | 2020-05-13 | 215 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签A组 | 2020-05-12 | 178 |
| 牛表皮生长因子的核酸序列和蛋白质序列 | 2020-05-12 | 557 |
| 用于新表位呈递的序列排列和序列 | 2020-05-11 | 771 |
| 一种滚道和球表面具有织构序列的滚动轴承 | 2020-05-12 | 763 |
| 以不同颜色表示特定时间序列的时间表示装置 | 2020-05-12 | 926 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈