受植物激素调控的启动子及其应用
阅读：847发布：2023-03-05
专利汇可以提供受植物激素调控的启动子及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了受 植物 激素 调控的启动子及其应用。本发明所提供的受油菜素内酯调控的启动子，是下述a)或b)或c)的DNA 片段 ：a)3′端至少含有 序列表 中SEQ ID No.1的第1557‑2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第1557位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为710至2266bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。，下面是受植物激素调控的启动子及其应用专利的具体信息内容。
1.DNA分子，是3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第1557位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为710至2266bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的最后一位核苷酸是SEQ ID No.1的第2266位。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是下述A1)-A3)中的任一种DNA片段：
A1)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第783位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1484至2266bp的任意一个DNA片段；
A2)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第458位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1809至2266bp的任意一个DNA片段；
A3)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第358位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1909至2266bp的任意一个DNA片段。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为下述1)-5)中任意一种：
1)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸所示的DNA分子；
2)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸所示的DNA分子；
3)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第1-2266位核苷酸所示的DNA分子；
4)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸所示的DNA分子；
5)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸所示的DNA分子。
5.含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
6.权利要求1-4中任一所述DNA分子作为启动子的应用。
7.调控植物生长的成套试剂，由DNA分子与植物激素组成；所述DNA分子是核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第358位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1909至2266bp的任意一个DNA片段。
8.调控植物生长的成套试剂，由权利要求5所述生物材料与植物激素组成；权利要求5所述生物材料中的所述DNA分子是核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第
358-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第358位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1909至2266bp的任意一个DNA片段。
9.下述任一应用：
M1、权利要求1-4中任一所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用；
M2、权利要求5所述生物材料在植物中启动目的基因表达中的应用；
M3、权利要求7或8所述成套试剂在植物中启动目的基因表达中的应用。
10.下述任一应用：
N1、权利要求1-5中任一所述DNA分子在培育转基因植物中的应用；
N2、权利要求5所述生物材料在培育转基因植物中的应用；
N3、权利要求8所述成套试剂在培育转基因植物中的应用。
受植物激素调控的启动子及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 启动子是一段能使基因进行转录的DNA序列，转录的RNA通过进一步的翻译和修饰形成功能蛋白质。根据启动子作用的方式及功能不同，可以大致分为4类：组成型启动子、诱导型启动子、组织或发育阶段特异型启动子和合成型启动子。外源基因在组织或发育阶段特异型启动子的调控下，能够在某些特定的组织器官中表达。
[0003] 生长素(auxin)是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，英文简称IAA。除吲哚乙酸外，4-氯-IAA、5-羟-IAA、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸等为类生长素。1872年波兰园艺学家谢连斯基对根尖控制根伸长区生长作了研究；后来达尔文父子对草的胚芽鞘向光性进行了研究。1928年温特证实了胚芽的尖端确实产生了某种物质，能够控制胚芽生长。1934年，凯格等人从一些植物中分离出了这种物质并命名它为吲哚乙酸，因而习惯上常把吲哚乙酸作为生长素的同义词。
[0004] 生长素在植物的生长和发育过程中发挥重要的作用，这些作用包括生长素可促进细胞伸长和茎干生长、诱导形成层及组织培养中的细胞分裂、木质部和韧皮部等维管组织的分化及根的发生和分化、介导重力和光的向性反应、维持顶端优势、延缓叶片衰老和果实成熟、抑制叶片和果实脱落、诱导座果与生长、增加同化活动向生长素源的分配、促进雌雄异株花的雌性化和凤梨科植物的开花。此外，生长素还影响早期胚胎发育中的胚轴形成，影响原基发育以及协调植物的形态发生。
[0005] 油菜素内酯(Brassinolide，BR)是一种生长调节物质，从1970s被发现以来，之后的数十年的研究表明油菜素内酯同动物的固醇类激素相似，都能够促进细胞的延伸和分裂，调控植物的衰老、花粉的发育、果实的成熟和植物对各种环境信号的响应。油菜素内酯合成途径的阐明和1990s在拟南芥和其他几种作物中油菜素内酯缺陷型、不敏感型突变体的发现证实了同我们所熟知的包括生长素、细胞分裂素和赤霉素在内的其他激素一样对植物的正常的生长发育起着关键的作用。
[0006] 同生长素和细胞分裂素一样，BR不仅参与了简单的细胞伸长，而且调控复杂生物学过程中细胞的增殖和分化，进而影响着细胞周期和分生组织的大小。BR的存在保证了叶绿体的正常发育和植物的正常开花。BR参与了花药和花粉的发育以及花器官和心皮边缘分生组织的形成。BR可以通过修饰包括过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶和非酶的抗氧化剂，从而有助于超氧自由基、过氧化氢以及羟基的清除，减小氧胁迫对植物的伤害。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种受植物激素BR和IAA诱导的启动子。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为Pbhlh7的DNA分子，该DNA分子具有启动子功能，可以启动目的基因表达。
[0009] 本发明所提供的DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段：
[0010] a)3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第1557位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为710至2266bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；
[0011] b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；
[0012] c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
[0013] 其中，SEQ ID No.1由2266个核苷酸组成。
[0014] 上述DNA分子中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。
[0015] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。
[0016] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的DNA分子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0017] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0018] 上述DNA分子中，所述DNA分子的最后一位核苷酸是SEQ ID No.1的第2266位。
[0019] 上述DNA分子中，所述DNA分子是下述A1)-A3)中的任一种DNA片段：
[0020] A1)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第783位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1484至2266bp的任意一个DNA片段；
[0021] A2)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第458位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1809至2266bp的任意一个DNA片段；
[0022] A3)核苷酸序列的3′端至少含有序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸序列，并且从SEQ ID No.1的第358位开始、按照SEQ ID No.1的核苷酸序列向SEQ ID No.1的5′端延长，得到长度为1909至2266bp的任意一个DNA片段。
[0023] 上述DNA分子中，所述DNA分子为下述1)-5)中任意一种：
[0024] 1)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第358-2266位核苷酸所示的DNA分子；
[0025] 2)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第783-2266位核苷酸所示的DNA分子；
[0026] 3)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第1-2266位核苷酸所示的DNA分子；
[0027] 4)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第1557-2266位核苷酸所示的DNA分子；
[0028] 5)核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第458-2266位核苷酸所示的DNA分子。
[0029] 为解决上述技术问题，本发明还提供了含有所述DNA分子的生物材料。
[0030] 本发明所提供的含有所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B19)中的任一种：
[0031] B1)含有所述DNA分子的表达盒；
[0032] B2)含有所述DNA分子的重组载体；
[0033] B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
[0034] B4)含有所述DNA分子的重组微生物；
[0035] B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
[0036] B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
[0037] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0038] B8)含有所述DNA分子的转基因植物细胞系；
[0039] B9)含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0040] B10)含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0041] B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0042] B12)含有所述DNA分子的转基因植物组织；
[0043] B13)含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；
[0044] B14)含有B2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0045] B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0046] B16)含有所述DNA分子的转基因植物器官；
[0047] B17)含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；
[0048] B18)含有B2)所述重组载体的转基因植物器官；
[0049] B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
[0050] 上述生物材料中，所述表达盒可由所述DNA分子、所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。在本发明的另一个实施例中，所述目的基因具体为绿色萤光蛋白(GFP)基因。
[0051] 所述重组载体中，由所述DNA分子启动目的基因的表达。
[0052] 在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pIG46载体的多克隆位点插入所述启动子得到的重组质粒pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS。所述多克隆位点具体为限制性内切酶识别位点ClaI和PstI。所述目的基因具体为β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。
[0053] 在本发明的另一个实施例中，所述重组载体具体为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中所述启动子启动的目的基因替换为绿色萤光蛋白(GFP)基因得到的重组质粒pIG46-Pbhlh7-GFP。
[0054] 上述表达盒或重组载体可以通过农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法、微注射法、电穿孔法和微束激光打孔法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因动物细胞或组织或器官。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述DNA分子作为启动子的应用。
[0056] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1或P2的成套试剂：
[0057] P1、调控植物生长的成套试剂，由所述DNA分子与植物激素组成；
[0058] P2、调控植物生长的成套试剂，由所述生物材料与所述植物激素组成。
[0059] 上述成套试剂中，所述植物激素具体可为油菜素内酯或IAA。所述油菜素内酯可为油菜素内酯溶液或油菜素内酯水溶液。所述油菜素内酯溶液的由溶质和溶剂组成，所述溶质为油菜素内酯，所述溶剂为W5溶液，所述油菜素内酯溶液中油菜素内酯的浓度可为0.1-10μM，如1μM和0.5μM。所述W5溶液可为由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为0.154mol/L NaCl、0.125mol/L CaCl2、5mmol/L KCl和2mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)。
[0060] 所述油菜素内酯水溶液为向水中加入油菜素内酯得到的溶液，所述油菜素内酯水溶液中油菜素内酯的浓度可为0.1-100μM，如1μM和10μM。
[0061] 所述IAA可为IAA溶液或IAA水溶液。所述IAA溶液的由溶质和溶剂组成，所述溶质为IAA，所述溶剂为W5溶液，所述IAA溶液中油IAA的浓度可为0.1-10μM，如0.5μM、1μM和5μM。
[0062] 上述成套试剂中，所述DNA分子可为所述A3)。所述DNA分子具体可为所述1)。
[0063] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0064] M1、所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用；
[0065] M2、所述生物材料在植物中启动目的基因表达中的应用；
[0066] M3、所述成套试剂在植物中启动目的基因表达中的应用。
[0067] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0068] N1、所述DNA分子在培育转基因植物中的应用；
[0069] N2、所述生物材料在培育转基因植物中的应用；
[0070] N3、所述成套试剂在培育转基因植物中的应用。
[0071] 本发明中，所述植物可为陆生植物。所述陆生植物具体可为单子叶植物。所述单子叶植物可为玉米。所述玉米可为玉米自交系齐319。
[0072] 实验证明，本发明的DNA分子——Pbhlh7具有启动子活性，可以启动目的基因的表达：Pbhlh7可以启动目的基因GUS的表达，含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS(pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中，Pbhlh7与目的基因GUS相连接)的原生质体中GUS蛋白的相对酶活是含有pIG46空载载体的原生质体中GUS蛋白的相对酶活的53.6倍；Pbhlh7还可以启动目的基因GFP的表达。
[0073] 实验证明，本发明的DNA分子——Pbhlh7的启动子活性受植物激素的诱导，并且Pbhlh7的启动子活性随植物激素浓度与诱导时间的变化而变化：0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别为0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生质体的5.36、6.81、3.69、0.93和1.28倍；0.5μM BR处理0小时、0.25小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别是0μM BR各相应处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活的1.03、3.34、4.51、2.80、1.47、1.32、0.76倍。在稳定转化体系中，0.1μM、1μM、10μM和100μM BR处理的转基因植株的GUS酶活分别为0μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活的5.68、3.31、3.40和1.02倍；0.1μM BR处理0小时、0.25小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时的转基因植株中的GUS酶活分别是0μM BR各相应处理时间的转基因植株中的GUS酶活的1.04、1.26、1.70、5.03、3.28、1.14、0.86倍。0.1μM、
0.5μM、1μM、5μM和10μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为0μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活的1.66、1.47、1.89、1.48、1.16倍。1μM IAA处理0小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别是0μM IAA各相应处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活的0.96、1.61、1.75、1.42、1.75、1.55、1.32、0.93倍。
0.5μM、1μM、5μM和10μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为0μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活的1.66、1.47、1.89、1.48、1.16倍。1μM IAA处理0小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别是0μM IAA各相应处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活的0.96、1.61、1.75、1.42、1.75、1.55、1.32、0.93倍。
[0074] 实验证明，本发明的DNA分子——Pbhlh7的不同截短片段也具有启动子活性，并且部分截短片段的启动子活性也受植物激素的诱导：0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别为0μM BR处理的含有pIG46空载体的原生质体中GUS蛋白的酶活的148.5、165.86、134.9、1.34倍，说明Pbhlh7的截短片段(Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710)均具有启动子活性。0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的酶活分别为0μM BR处理的含有各相应重组载体原生质体中的GUS酶活的5.96、5.20、1.21、1.41、1.01倍，说明Pbhlh7的截短片段(Pbhlh7-1909)的启动子活性受BR的诱导。在稳定转化体系中，1μM IAA处理的转基因植株的GUS酶活为0μM IAA处理的转基因植株中的GUS酶活的1.76倍。
[0075] 实验证明，本发明的DNA分子——Pbhlh7及其不同的片段具有启动子活性，并且本发明的DNA分子——Pbhlh7及其部分片段受到植物激素的诱导，可以利用本发明的DNA分子——Pbhlh7及其部分片段培育转基因植物，如受植物激素(如油菜素内酯或IAA)诱导的转基因植物。附图说明
[0076] 图1为重组载体pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的构建过程。
[0077] 图2为重组载体pIG46-Pbhlh7-GFP的构建过程。
[0078] 图3为Pbhlh7的功能验证结果。其中，A为培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS和pIG46的原生质体中GUS蛋白的相对酶活，Pbhlh7:GUS表示培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体，pIG46表示培养后的含有pIG46的原生质体；B为培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP和pIG46的原生质体中GFP表达情况，a为培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体中绿色荧光蛋白发光情况，b为白光下的培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体，c为培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体中叶绿体的自发荧光，d为a、b和c的叠加。
[0079] 图4为瞬时转化体系中油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导作用。其中，A为不同浓度的BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活，NT表示0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活；B为油菜素内酯的处理时间对Pbhlh7启动子活性的影响。
[0080] 图5为稳定转化体系中油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导作用。其中，A为不同浓度的BR处理的转基因植株中GUS蛋白的酶活，NT表示0μM BR处理的转基因植株GUS蛋白的酶活；B为油菜素内酯的处理时间对Pbhlh7启动子活性的影响。
[0081] 图6为瞬时转化体系中Pbhlh7的不同截短片段的启动子活性及油菜素内酯对Pbhlh7的不同截短片段启动子活性的诱导作用。其中，A为Pbhlh7的不同截短片段的启动子活性，NT表示0.5μM BR处理的含有pIG46的原生质体中GUS蛋白的相对酶活；B为油菜素内酯对Pbhlh7的不同截短片段启动子活性的诱导作用。
[0082] 图7为瞬时转化体系中生长素对Pbhlh7启动子活性的诱导作用。其中，A为不同浓度的IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活，NT表示0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活；B为IAA的处理时间对Pbhlh7启动子活性的影响。
[0083] 图8为稳定转化体系中IAA对Pbhlh7启动子活性诱导作用的检测结果。其中，control为0μM IAA处理的转基因植株中的GUS酶活。
[0084] 图9为pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS的构建过程。
具体实施方式
[0085] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0086] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0087] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0088] 下述实施例中的玉米自交系齐319(王艳丽等，玉米自交系齐319在种质改良中的应用，农业科技通讯2013(8))公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0089] 下述实施例中的载体pIG46(Ono A et al.,The rab16B promoter of rice contains two distinct abscisic acid responsive elements,Plant physiology,1996Oct；112(2):483-491.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0090] 下述实施例中的载体pCAMBIA3301(Liu et al.,Identification and characterization of promoters specifically and strongly expressed in maize embryos,Plant Biotechnology Journal(2014)12,pp.1286–1296)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0091] 下述实施例中的Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒为Promega公司产品,货号为E4030。
[0092] 下述实施例中的酶解液为向去离子水中加入纤维素酶(Cellulase R10)、离析酶(Macerozyme R10)、甘露醇、KCl、CaCl2和BSA得到的溶液，酶解液中，纤维素酶(Cellulase R10)、离析酶(Macerozyme R10)、甘露醇、KCl、CaCl2和BSA的浓度分别为0.15g/10ml、0.04g/10ml、0.4mol/L、2mM、10mM和0.01g/10ml。
[0093] 下述实施例中的W5溶液溶液为由溶质和溶剂组成的溶液，其中，溶剂为水，溶质及其浓度分别为0.154mol/L NaCl、0.125mol/L CaCl2、5mmol/L KCl和2mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)。
[0094] 实施例1、Pbhlh7启动子的克隆及功能验证
[0095] 1、Pbhlh7启动子的克隆及重组载体的构建
[0096] 以提取得到的玉米自交系齐319叶片的基因组DNA为模板，用引物F：5′-ATCGATGTTCGCTTTCATGTAATCGTTGTGC-3′(下划线处为ClaI的识别序列)和引物R：5′-CTGCAGTGAAAGAGAGAAAGGC-3′(下划线处为PstI的识别序列)进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：
[0097]
[0098] PCR扩增的反应体系PCR扩增程序为：94℃2min；94℃20s，56℃20s，72℃70s，33个循环；72℃5min。
[0099] 将PCR扩增产物和载体pIG46分别用ClaI和PstI进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，经筛选后挑取单克隆测序，将经测序后表明含有序列表中SEQ ID No.1所示DNA片段(Pbhlh7)的重组载体命名为pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的构建过程如图1所示。SEQ ID No.1由2266个核苷酸组成，为启动子Pbhlh7的核苷酸序列。
[0100] 将SEQ ID No.2所示的DNA片段和pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS分别用PstI和EcoRI进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，经筛选后挑取单克隆测序，将经测序后表明含有序列表中SEQ ID No.2所示DNA片段(SEQ ID No.2所示DNA片段含有GFP的编码基因和终止子Tnos)的重组载体命名为pIG46-Pbhlh7-GFP，pIG46-Pbhlh7-GFP的构建过程如图2所示。
[0101] 其中，SEQ ID No.2的第1-6位为PstI的识别序列，SEQ ID No.2的第987-992位为EcoRI的识别序列，SEQ ID No.2的第7-723位为GFP的编码基因，SEQ ID No.2的第734-986位为终止子Tnos的序列。
[0102] 2、Pbhlh7启动子的功能鉴定
[0103] 选取黑暗条件下生长至二叶一心的玉米自交系齐319的第一片真叶，将该真叶中部5-6cm部分沿垂直于叶脉的方向切成宽为1mm左右的细丝，将细丝置于10ml酶解液中，避光酶解5小时，酶解过程始终保持40r/min持续震荡，酶解结束后得到玉米叶肉原生质体。
[0104] 参考文献(Yoo SD,Cho YH,Sheen J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nature Protocols,2007,2:1565-1572)中的PEG诱导叶肉细胞原生质体瞬时转化法，对该PEG诱导叶肉细胞原生质体瞬时转化法进行以下的改动：①在洗去酶解液后，用W5溶液轻柔重悬收集到的原生质体，冰上放置40min，以达到彻底沉降原生质体的目的；②完成原生质体沉降后，50g离心1min，避免过高的离心力导致细胞间压力过大，减小对原生质体的伤害；③加入
220μl 30％的PEG-Ga2+溶液后，室温诱导10min，分别将pIG46、步骤1的pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-GFP导入玉米叶肉原生质体中，分别得到含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体。
220μl 30％的PEG-Ga2+溶液后，室温诱导10min，分别将pIG46、步骤1的pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-GFP导入玉米叶肉原生质体中，分别得到含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体。
[0105] 将含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体分别在弱光下在W5溶液中过夜培养16小时分别得到培养后的含有pIG46的原生质体、培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体。
[0106] GUS相对酶活的测定：利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒分别测定培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中的GUS和LUC酶活，将组成型表达的LUC酶活作为内参，得到培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活(图3中A)。
[0107] 按照上述方法，将培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体替换为培养后的含有pIG46的原生质体，其他步骤均不变，得到培养后的含有pIG46的原生质体中GUS蛋白的相对酶活(图3中A)。
[0108] 结果显示，培养后的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活是培养后的含有pIG46的原生质体中GUS蛋白的相对酶活的53.6倍，表明Pbhlh7具有启动子活性，可以驱动GUS基因的表达。
[0109] 在激光共聚焦显微镜下，观察培养后的含有pIG46的原生质体和培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体中的GFP基因的表达情况，结果如图3中B所示。结果显示，培养后的含有pIG46-Pbhlh7-GFP的原生质体的细胞核、叶绿体、细胞质基质中可见绿色荧光，表明Pbhlh7具有启动子活性，可以驱动GFP基因的表达。
[0110] 实施例2、Pbhlh7的启动子活性受油菜素内酯的诱导
[0111] 实验重复四次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0112] 1、瞬时转化体系中油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导
[0113] 1.1不同浓度的油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0114] 将实施例1步骤2的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生质体在弱光下在0.5μM BR溶液(0.5μM BR溶液为向W5溶液中添加油菜素内酯(BR)得到的BR浓度为0.5μM的溶液)中培养1小时，得到0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0115] 按照上述方法，将0.5μM分别替换为0μM、0.1μM、1μM、5μM和10μM，其他步骤均不变，得到0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0116] 按照实施例1步骤2中GUS相对酶活的测定方法，分别测定上述0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活(图4中A)，将0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定义为1。
[0117] 结果显示，将0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定为1(图4中A)，0.1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为
5.36、6.81、3.69、0.93、1.28(图4中A)。表明，油菜素内酯可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随油菜素内酯的浓度变化，油菜素内酯的浓度为0.5μM时Pbhlh7的启动子活性最高。
5.36、6.81、3.69、0.93、1.28(图4中A)。表明，油菜素内酯可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随油菜素内酯的浓度变化，油菜素内酯的浓度为0.5μM时Pbhlh7的启动子活性最高。
[0118] 1.2油菜素内酯处理时间对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0119] 将实施例1步骤2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体在弱光下在步骤1.1的0.5μM BR溶液中培养1小时，得到0.5μM BR处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体；将0μM BR溶液(即W5溶液)作为对照，得到0μM BR处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0120] 按照上述方法，将1小时分别替换为0小时、0.25小时、0.5小时、3小时、6小时和12小时，其他步骤均不变，得到0.5μM与0μM BR处理0小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM BR处理0.25小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM BR处理0.5小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM BR处理3小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM BR处理6小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM BR处理12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0121] 按照实施例1步骤2中GUS相对酶活的测定方法，分别测定上述各原生质体中GUS蛋白的相对酶活(图4中B)。
[0122] 结果显示，分别将0μM BR各处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定义为1，0.5μM BR处理0小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理0.25小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理0.5小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理3小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理6小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活相对于0μM BR各相应处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为1.03、3.34、4.51、2.80、1.47、1.32、0.76(图4中B)。表明，油菜素内酯可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随油菜素内酯的处理时间变化，油菜素内酯处理0.5小时时Pbhlh7的启动子活性最高。
[0123] 2、稳定转化体系中油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导
[0124] 将实施例1步骤1得到的PCR扩增产物和载体pCAMBIA3301分别用EcoRI和NcoI进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，经筛选后挑取单克隆测序，将经测序后表明含有序列表中SEQ ID No.1所示DNA片段(Pbhlh7)的重组载体命名为pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS，pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS的构建过程如图9所示。SEQ ID No.1由2266个核苷酸组成，为启动子Pbhlh7的核苷酸序列。
[0125] 按照文献(Frame BR et al.,Agrobacterium tumefaciens-Medicated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector system,Plant Physiology,2002May；129(1):13-22.)中玉米的遗传转化方法利用pCAMBIA3301-Pbhlh7-Intron-GUS转化玉米自交系齐319，得到转基因植株。
[0126] 用鉴定BAR抗性的转基因植株，具体方法如下：取转基因植株的幼苗叶片于2ml离心管中，加入约400μl去离子水，用玻璃棒研磨，得到叶片研磨液，然后将试纸条(试纸条为AGDIA公司产品，货号为STX14200/0012)插入叶片研磨液中，当试纸条中出现2条紫色条带时为阳性转基因植株，1条带时为阴性转基因植株，即非转基因植株。
[0127] 2.1不同浓度的油菜素内酯对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0128] 用不同浓度的油菜素内酯处理上述阳性转基因植株，每个浓度10株，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0129] 用0.1μM的BR溶液(0.1μM的BR溶液的配制方法为：称取48毫克的油菜素内酯用少量酒精溶解后定容至10ml，得到油菜素内酯浓度为10mmol/L的母液，将母液用水稀释100000倍，得到0.1μM的BR溶液)喷洒两叶一心时的阳性转基因植株，在喷洒1小时后得到
0.1μM BR处理的转基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒测定0.1μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活(图5中A)。
0.1μM BR处理的转基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒测定0.1μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活(图5中A)。
[0130] 按照上述方法，将0.1μM分别替换为0μM、1μM、10μM和100μM，其他步骤均不变，分别得到0μM、1μM、10μM和100μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活(图5中A)。
[0131] 上述0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活测定均在相同总蛋白浓度下测定的。总蛋白浓度的测定为利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司产品，货号为PC0020)进行的。
[0132] 结果显示，将0μM BR处理的转基因植株中的GUS酶活定义为1，0.1μM、1μM、10μM和100μM BR处理的转基因植株的GUS相对酶活分别为5.68、3.31、3.40和1.02，表明，BR可以诱导转基因玉米中Pbhlh7的启动子活性，Pbhlh7的启动子活性随BR浓度变化而变化，其中0.1μM诱导的Pbhlh7的启动子活性最高。
[0133] 2.2油菜素内酯处理时间对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0134] 用上述步骤2.1中的0.1μM的BR溶液喷洒两叶一心时的阳性转基因植株，在喷洒1小时时得到0.1μM BR处理1小时的转基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒测定得到0.1μM BR处理1小时的转基因植株中的GUS酶活，共10个重复；将0μM BR溶液(即水)作为对照，得到0μM BR处理1小时的转基因植株中的GUS酶活，共10个重复。
[0135] 按照上述方法，将1小时分别替换为0小时、0.25小时、0.5小时、3小时、6小时和12小时，其他步骤均不变，分别得到0.1μM与0μM BR处理0小时的转基因植株中的GUS酶活、0.1μM与0μM BR处理0.25小时的转基因植株中的GUS酶活、0.1μM与0μM BR处理0.5小时的转基因植株中的GUS酶活、0.1μM与0μM BR处理3小时的转基因植株中的GUS酶活、0.1μM与0μM BR处理6小时的转基因植株中的GUS酶活、0.1μM与0μM BR处理12小时的转基因植株中的GUS酶活的转基因植株中的GUS酶活(图6中B)。
[0136] 上述各GUS酶活测定均在相同总蛋白浓度下测定的。总蛋白浓度的测定为利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司产品，货号为PC0020)进行的。
[0137] 结果显示，分别将0μM BR处理不同时间的转基因植株中GUS酶活定义为1，0.1μM BR处理0小时的转基因植株、0.1μM BR处理0.25小时的转基因植株、0.1μM BR处理0.5小时的转基因植株、0.1μM BR处理1小时的转基因植株、0.1μM BR处理3小时的转基因植株、0.1μM BR处理6小时的转基因植株、0.1μM BR处理12小时的转基因植株中的GUS酶活相对于0μM BR各相应处理时间的转基因植株中的GUS酶活的相对酶活分别为1.04、1.26、1.70、5.03、3.28、1.14、0.86(图5中B)。表明，在转基因玉米中，油菜素内酯可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随油菜素内酯的处理时间变化；在转基因玉米中，油菜素内酯处理1小时时Pbhlh7的启动子活性最高。
[0138] 实施例3、Pbhlh7的不同截短片段的启动子活性及油菜素内酯对其诱导作用[0139] 1、含有Pbhlh7启动子不同截断片段的重组载体的构建
[0140] 在Pbhlh7的5′端将Pbhlh7进行截短，获得的5个DNA片段分别为Pbhlh7-1909(SEQ ID No.1的第358-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-1809(SEQ ID No.1的第458-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-1484(SEQ ID No.1的第783-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-710(SEQ ID No.1的第1557-2266位所示的DNA片段)、Pbhlh7-74(SEQ ID No.1的第2195-2266位所示的DNA片段)。
[0141] 将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.1的第358-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1909)，其他核苷酸均不变，得到重组载体pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS与pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差别仅在于：pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-357位所示的DNA片段删除得到的重组载体。
[0142] 将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.1的第458-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1809)，其他核苷酸均不变，得到重组载体pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS与pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差别仅在于：pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-457位所示的DNA片段删除得到的重组载体。
[0143] 将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.1的第783-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-1484)，其他核苷酸均不变，得到重组载体pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS与pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差别仅在于：pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-782位所示的DNA片段删除得到的重组载体。
[0144] 将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.1的第1557-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-710)，其他核苷酸均不变，得到重组载体pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS与pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差别仅在于：pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-1556位所示的DNA片段删除得到的重组载体。
[0145] 将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的ClaI和PstI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.1的第2195-2266位所示的DNA片段(Pbhlh7-74)，其他核苷酸均不变，得到重组载体pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS，pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS与pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的差别仅在于：pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS为将pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS中SEQ ID No.1的第1-2194位所示的DNA片段删除得到的重组载体。
[0146] 按照实施例1步骤2的方法，分别将pIG46、pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS、pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS和pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS导入实施例1步骤2的玉米叶肉原生质体中，分别得到含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-710-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体。
[0147] 2、油菜素内酯对Pbhlh7的不同截短片段启动子活性的诱导作用
[0148] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0149] 将实施例1步骤2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体在弱光下在0.5μM BR溶液(0.5μM BR溶液为向W5溶液中添加BR得到的BR浓度为0.5μM的溶液)中培养1小时溶液，得到0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0150] 按照上述方法，将含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体分别替换为含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体，其他步骤均不变，分别得到0.5μM BR处理的含有pIG46的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体。
[0151] 按照上述方法，将0.5μM BR溶液替换为0μM BR溶液，其他步骤均不变，得到0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0152] 按照上述方法，将0.5μM BR溶液替换为0μM BR溶液，并将含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体分别替换为含有pIG46的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体，其他步骤均不变，分别得到0μM BR处理的含有pIG46的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体。
[0153] 按照实施例1步骤2中GUS相对酶活的测定方法，分别测定0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活。
[0154] 2.1Pbhlh7的不同截短片段的启动子活性
[0155] 将0μM BR处理的含有pIG46的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定义为1，结果显示(图6中A)，0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体和0μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-74-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为148.5、165.86、134.9、1.34。表明，Pbhlh7、Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710均具有启动子活性，而Pbhlh7-74没有启动子活性。
[0156] 2.2油菜素内酯对Pbhlh7的不同截短片段启动子活性的诱导作用
[0157] 分别将0μM BR处理的含有各重组载体原生质体中GUS的相对酶活定义为1，结果显示(图6中B)，0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1909-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1809-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-1484-Intron-GUS的原生质体、0.5μM BR处理的含有pIG46-Pbhlh7-710-Intron-GUS的原生质体bhlh7中GUS蛋白的相对酶活相对于0μM BR处理的含有各相应重组载体原生质体中的GUS酶活的相对酶活分别为5.96、5.20、1.21、1.41、1.01。表明，油菜素内酯可以诱导Pbhlh7和Pbhlh7-1909的启动子活性，油菜素内酯不能诱导Pbhlh7-1809、Pbhlh7-1484和Pbhlh7-710的启动子活性。
[0158] 实施例4、IAA对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0159] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0160] 1、IAA可以诱导Pbhlh7的启动子活性
[0161] 将实施例1步骤2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体在弱光下在0.5μM IAA溶液(0.5μM IAA溶液为向W5溶液溶液中添加IAA得到的IAA浓度为0.5μM的溶液)中培养1小时溶液，得到0.5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-GUS的原生质体。
[0162] 按照上述方法，将0.5μM分别替换为0μM、0.1μM、1μM、5μM和10μM，其他步骤均不变，得到0μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0163] 按照实施例1步骤2中GUS相对酶活的测定方法，分别测定0.5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活。
[0164] 将0μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定义为1，结果显示(图7中A)，0.1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、1μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、5μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体和10μM IAA处理的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为1.66、1.47、1.89、1.48、1.16。表明，IAA可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随IAA的浓度变化，IAA的浓度为1μM时Pbhlh7的启动子活性最高。
[0165] 2.生长素处理时间对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0166] 将实施例1步骤2的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体在弱光下在步骤1的0.5μM IAA溶液中培养1小时，得到0.5μM IAA处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体；将0μM IAA溶液(即W5溶液)作为对照，得到0μM IAA处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0167] 按照上述方法，将1小时分别替换为0小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、3小时、6小时和12小时，其他步骤均不变，得到0.5μM与0μM IAA处理0小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理0.1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理0.25小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理0.5小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理3小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理6小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM与0μM IAA处理12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体。
[0168] 按照实施例1步骤2中GUS相对酶活的测定方法，分别测定上述各原生质体中GUS蛋白的相对酶活(图7中B)。
[0169] 结果显示，分别将0μM IAA各处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活定义为1，0.5μM IAA处理0小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理0.1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理0.25小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理0.5小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理1小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理3小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理6小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体、0.5μM IAA处理12小时的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活相对于0μM IAA各相应处理时间的含有pIG46-Pbhlh7-Intron-GUS的原生质体中GUS蛋白的相对酶活分别为0.96、1.61、1.75、1.42、1.75、1.55、1.32、0.93(图7中B)。表明，生长素可以诱导Pbhlh7的启动子活性，并且Pbhlh7的启动子活性随生长素的处理时间变化，生长素处理0.25小时和1小时后Pbhlh7的启动子活性最高。
[0170] 3、IAA在稳定转化体系中对Pbhlh7启动子活性的诱导作用
[0171] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0172] 用不同浓度的IAA处理实施例2步骤2的阳性转基因植株，每个浓度10株，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0173] 用1μM的IAA溶液(1μM的IAA溶液的配制方法为：称取17.5毫克的吲哚乙酸用少量酒精溶解后定容至10ml，得到吲哚乙酸浓度为10mmol/L的母液，将该母液用水稀释10000倍，得到1μM的IAA溶液)喷洒两叶一心时的阳性转基因植株，在喷洒1小时后得到1μM的IAA处理的转基因植株，利用Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer试剂盒测定1μM的IAA处理的转基因植株中的GUS酶活(图8)。
[0174] 按照上述方法，将1μM替换为0μM，其他步骤均不变，得到0μM IAA处理的转基因植株中的GUS酶活(图8)。
[0175] 上述各GUS酶活测定均在相同总蛋白浓度下测定的。总蛋白浓度的测定为利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司产品，货号为PC0020)进行的。
[0176] 结果显示，将0μM IAA处理的转基因植株中的GUS酶活定义为1，1μM IAA处理的转基因植株的GUS相对酶活为1.76，表明，IAA可以在转基因玉米中诱导Pbhlh7的启动子活性。
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