用于诱导抗肿瘤免疫的表达肿瘤相关抗原的多表位的病毒介体
阅读：786发布：2022-11-12
专利汇可以提供用于诱导抗肿瘤免疫的表达肿瘤相关抗原的多表位的病毒介体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了多核苷酸和病毒介体，特别是甲病毒介体例如辛德毕斯病毒介体，其编码至少一种 肿瘤 相关 抗原 的多个，例如两个或更多个表位，其中每个表位通过处理或酶切割位点分开。由所述多核苷酸和病毒介体编码的两种或更多种肿瘤相关抗原的多个表位可以相同或不同。本申请提供了 治疗 具有表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤的 哺乳动物 受试者的方法，其中编码多个表位的病毒介体以及其他免疫刺激或免疫调节成分产生抗癌或抗肿瘤免疫应答，其中高 水 平的效应T细胞增加荷瘤哺乳动物受试者的存活率并导致表位扩散，因而提供免疫应答的进一步增强。，下面是用于诱导抗肿瘤免疫的表达肿瘤相关抗原的多表位的病毒介体专利的具体信息内容。
1.一种多核苷酸，其编码甲病毒蛋白或其片段，和一种或多种肿瘤相关抗原的两个或多个表位，其中每个表位被酶切位点分开。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述甲病毒蛋白或其片段是辛德毕斯病毒蛋白或其片段。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位包含5至30个氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述肿瘤相关抗原在癌症或肿瘤细胞的表面上表达或在癌症或肿瘤细胞的胞质溶胶中表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位包含表1至28中任一个列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位是一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个位表，所述肿瘤相关抗原是选自激肽释放酶4、乳头瘤病毒结合因子(PBF)、优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)、威尔姆氏肿瘤-1(WT1)、羟基类固醇脱氢酶样1(HSDL1)、间皮素、癌症睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌胚抗原(CEA)、p53、人类表皮生长因子受体
2/神经受体酪氨酸激酶(Her2/Neu)、癌症相关上皮细胞粘附分子(EpCAM)、卵巢和子宫癌抗原(CA125)、叶酸受体α、精子蛋白17、肿瘤相关差异表达基因-12(TADG-12)、粘蛋白-16(MUC-16)，L1细胞粘附分子(L1CAM)、甘露聚糖-MUC-1、人类内源性逆转录病毒K(HERV-K-MEL)、Kita-kyushu肺癌抗原-1(KK-LC-1)、人类癌症/睾丸抗原(KM-HN-1)、癌症睾丸抗原(LAGE-1)、黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、精子表面透明带结合蛋白(Sp17)、滑膜肉瘤，X断裂点4(SSX-4)、瞬时轴突糖蛋白-1(TAG-1)、瞬时轴突糖蛋白-2(TAG-2)、激活同源物(ENAH)、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、乳腺癌抗原、(BAGE-1)、B黑素瘤抗原、黑素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、黑素瘤抗原-A2(MAGE-A2)、粘蛋白k、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX-2)、紫杉醇抗性相关基因-3(TRAG-3)、禽类细胞瘤病病毒致癌基因(c-myc)、细胞周期蛋白B1、粘蛋白1(MUC1)、p62、生存素、淋巴细胞共同抗原(CD45)、地可夫WNT信号通路抑制剂1(DKK1)、端粒酶、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)、G250、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胱天蛋白酶5(CASP-5)、细胞色素C氧化酶组装因子1同源体(COA-1)、O-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)、骨肉瘤扩增9、内质网凝集素(OS-9)、转化生长因子β受体2(TGF-βRII)、鼠白血病糖蛋白70(gp70)、降钙素相关多肽α(CALCA)、程序性细胞死亡1配体1(CD274)、小鼠双分钟2同源物(mdm-2)、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、苹果酶1(ME1)、核转录因子Y亚基C(NFYC)、G抗原1,3(GAGE-1,3)、黑素瘤抗原-A6(MAGE-A6)、癌症睾丸抗原XAGE-1b、前列腺1的六种跨膜上皮抗原(STEAP1)、PAP、前列腺特异性抗原(PSA)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、热休克蛋白hsp70-2、黑素瘤抗原-A9(MAGE-A9)，Arg特异性ADP-核糖基转移酶家族C(ARTC1)，B-Raf原癌基因(B-RAF)、丝氨酸/苏氨酸激酶、β-连环蛋白，细胞分裂周期27同源物(Cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)、酪蛋白激酶1α1(CSNK1A1)、纤连蛋白1(FN1)，特异性生长抑制因子7(GAS7)、糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B(GPNMB)、HAUS类Augmin复合亚基3(HAUS3)，LDLR-岩藻糖基，T细胞识别黑色素瘤抗原2(MART2)，肌肉生长抑制素(MSTN)、黑色素瘤相关抗原(突变的)1(MUM-1-2-3)、Poly(A)聚合酶γ(neo-PAP)、肌球蛋白I类、蛋白磷酸酶1调节亚基3B(PPP1R3B)、过氧化物还原酶-5(PRDX5)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶κ(PTPRK)、转化蛋白N-Ras(N-ras)的、视网膜母细胞瘤相关因子600(RBAF600)、沉默调节蛋白-2(SIRT2)、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、眼白化病的1型蛋白(OA1)、成员RAS癌基因家族(RAB38)、酪氨酸酶相关蛋白1-2(TRP-1-2)、黑色素瘤抗原gp75(gp75)、酪氨酸酶、黑素-A(MART-1)、糖蛋白100黑色素瘤抗原(GP100)、N-乙酰葡糖胺基转移V基因(GnTVf)、淋巴细胞抗原6复合基因座K(LY6K)、黑色素瘤抗原-A10(MAGE-A10)、黑色素瘤抗原-A12(MAGE-A12)、黑色素瘤抗原-C2(MAGE-C2)、黑色素瘤抗原NA88-A、紫杉醇抗性相关蛋白3(TRAG-3)、PDZ结合激酶(pbk)、半胱天冬酶8(CASP-8)、肉瘤抗原1(SAGE)、断裂簇区域-Abelson致癌基因(BCR-ABL)、白血病融合蛋白、dek-can、含延伸因子Tu GTP结合域2(EFTUD2)、ETS变异基因6/急性髓样白血病融合蛋白(ETV6-AML1)、类FMS酪氨酸激酶-3内部串联重复(FLT3-ITD)、细胞周期蛋白A1、含纤连蛋白III型结构域3B(FDNC3B)、早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α融合蛋白(pml-RARα)、黑素瘤抗原-C1(MAGE-C1)、膜蛋白选择性剪接同种型(D393-CD20)、黑素瘤抗原-A4(MAGE-A4)或黑素瘤抗原-A3(MAGE-A3)。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位中的至少一者衍生自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1。
8.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位中的至少一者衍生自所述肿瘤相关抗原MAGE-A3。
9.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原pbk。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列LLMWITQCF(SEQ ID NO：1)，并且来自所述肿瘤相关抗原pbk的表位包含氨基酸序列GSPFPAAVI(SEQ ID NO：2)。
11.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原生存素。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，并且来自所述肿瘤相关抗原生存素的表位包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述三个或更多个表位是相同的肿瘤相关抗原。
15.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述三个或更多个表位来自至少一种不同的肿瘤相关抗原。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的八个或更多个表位。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多核苷酸，其中所述表位是表达在癌症细胞的表面上的肿瘤相关抗原的表位，所述癌症细胞来自卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤，胚胎癌、肾母细胞瘤，子宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤，血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述表位是在卵巢癌细胞、乳癌细胞、结肠癌细胞或宫颈癌细胞的表面上表达的肿瘤相关抗原的表位。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所述酶切割位点是蛋白酶切割位点。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述酶切割位点是丝氨酸蛋白酶切割位点。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中所述丝氨酸蛋白酶切割位点被选自弗林蛋白酶、PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4、PC7或其组合的蛋白质切割。
22.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中所述丝氨酸蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的多核苷酸，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列XRSKRX(SEQ ID NO：5)，其中X表示疏水性氨基酸。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的多核苷酸，其中所述酶切割位点包含氨基酸序列(R/K)Xn(R/K)(SEQ ID NO：6)，其中X代表氨基酸，和n是0到6的整数。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含5'内质网信号序列。
26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中所述5'内质网信号序列衍生自甲病毒、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-68或组织纤溶酶原激活物肽。
27.根据权利要求1至26中任一项所的多核苷酸，其包含编码选自热休克蛋白70、
IgG1Fc结构域、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助蛋白T(Th)表位、或大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的免疫原性蛋白质的3'序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8，IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-
14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20至IL-36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)的免疫刺激蛋白。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的多核苷酸，其中所述一种或多种免疫刺激蛋白是IL-12。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的多核苷酸，包含一个或多个自杀基因。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其中所述一种或多种自杀基因能够将惰性前药转化为细胞毒性代谢物。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸，其中所述惰性前药选自由下列各者所组成群组：
更昔洛韦、阿昔洛韦、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和5-氟胞嘧啶。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的多核苷酸，其中所述一种或多种自杀基因编码胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶。
34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述胸苷激酶衍生自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含RNA或DNA。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含单链RNA。
37.一种病毒颗粒，包含根据权利要求1至36中任一项所述的多核苷酸。
38.一种病毒介体，包含根据权利要求1至36中任一项所述的多核苷酸。
39.根据权利要求38所述的病毒介体，其中所述病毒介体选自甲病毒、慢病毒或逆转录病毒。
40.根据权利要求39所述的病毒介体，其中所述病毒介体衍生自辛德毕斯病毒。
41.根据权利要求39所述的病毒介体，其中所述病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化。
42.根据权利要求41所述的病毒介体，其中所述一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白包含辛德毕斯-ZZE2蛋白。
43.根据权利要求39所述的病毒介体，其中所述病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒。
44.根据权利要求39所述的病毒介体，其中所述病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的病毒介体，其中所述病毒介体是复制缺陷型病毒介体或具有复制能力的病毒介体。
46.根据权利要求38至45中任一项所述的病毒介体，其中所述病毒介体是非整合型病毒介体。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的病毒介体，其中所述病毒介体能够在给药于受试者后引发针对表达一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。
48.根据权利要求47所述的病毒介体，其中所述受试者是人类患者。
49.一种辛德毕斯病毒介体，包含编码肿瘤相关抗原的两个或更多个包含5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位被弗林蛋白酶切割位点分开。
50.一种用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的病毒介体，其中所述病毒介体包含编码肿瘤相关抗原的两个或多个包含5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位被弗林蛋白酶切割位点分开。
51.根据权利要求49或50所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。
52.根据权利要求51所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位是选自由下列各者所组成群组中的一种或多种肿瘤相关抗原：激肽释放酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧基酯酶、α-胎儿蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、PPP1R3B、PRDX 5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-
1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4和MAGE-A3。
53.根据权利要求52所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位中的至少一者来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且所述两个或更多个表位中的至少一者来自所述肿瘤相关抗原生存素。
54.根据权利要求52所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原pbk。
55.根据权利要求52所述的病毒介体，其中来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列LLMWITQCF(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，并且来自所述肿瘤相关抗原pbk的表位包含氨基酸序列GSPFPAAVI(SEQ ID NO：2)。
56.根据权利要求52所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且所述两个或更多个表位中的一个来自所述肿瘤相关抗原生存素。
57.根据权利要求52所述的病毒介体，其中来自所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，并且来自所述肿瘤相关抗原生物素的表位包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的病毒介体，其中所述多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位。
59.根据权利要求49至57中任一项所述的病毒介体，其中所述多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的八个或更多个表位。
60.根据权利要求49至59中任一项所述的病毒介体，其中所述表位是表达在癌症或肿瘤细胞的表面上或胞质溶胶中的肿瘤相关抗原的表位，所述癌症或肿瘤细胞来自卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤，胚胎癌、肾母细胞瘤，子宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤，血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤。
61.根据权利要求49至60中任一项所述的病毒介体，其中所述介体包含5'内质网信号序列。
62.根据权利要求61所述的病毒介体，其中所述5'内质网信号序列衍生自甲病毒、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-68或组织纤溶酶原激活物肽。
63.根据权利要求49至62中任一项所述的病毒介体，包含编码免疫原性蛋白质的3'序列，所述免疫原性蛋白质选自热休克蛋白70、IgG1Fc结构域、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助蛋白T(Th)表位或大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基。
64.根据权利要求49至63中任一项所述的病毒介体，其中所述多核苷酸编码一种或多种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6I、L-7、IL-8，IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20至IL-36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)的免疫刺激蛋白。
65.根据权利要求49至64中任一项所述的病毒介体，包含一种或多种自杀基因。
66.根据权利要求65所述的病毒介体，其中所述一种或多种自杀基因能够将惰性前药转化为细胞毒性代谢物。
67.根据权利要求66所述的病毒介体，其中所述惰性前药选自由下列各者所组成群组：
更昔洛韦、阿昔洛韦、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷以及5-氟胞嘧啶。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的病毒介体，其中所述一种或多种自杀基因编码胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶。
69.根据权利要求68所述的病毒介体，其中所述胸苷激酶衍生自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)。
70.根据权利要求49至69中任一项所述的病毒介体，其中所述病毒介体能够在给药于受试者后引发针对表达所述一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。
71.根据权利要求70所述的病毒介体，其中所述受试者是人。
72.一种用一种或多种基因工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒介体，所述慢病毒介体包含根据权利要求1至36中任一项所述的多核苷酸。
73.一种用一种或多种基因工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒介体，所述慢病毒介体包含权利要求1至35中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自NY-ESO-1、MAGE-A3、pbk、生存素或其组合的一种或多种肿瘤相关抗原的表位。
74.一种病毒颗粒，包含根据权利要求38至71中任一项所述的病毒介体。
75.一种病毒颗粒，包含根据权利要求72或73所述的慢病毒介体。
76.一种细胞，包含根据权利要求1至36中任一项所述的多核苷酸。
77.一种细胞，包含根据权利要求38至71中任一项所述的病毒介体或根据权利要求72或73所述的慢病毒介体。
78.一种细胞，包含根据权利要求37、74或75中任一项所述的病毒颗粒。
79.一种药物组合物，包含根据权利要求1至35中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求37、74或75中任一项所述的病毒颗粒；根据权利要求38至71、72或73中任一项所述的病毒介体，以及药学上可接受的溶媒、载体或稀释剂。
80.根据权利要求79所述的药物组合物，其中所述药物组合物是液体剂型。
81.一种诱导针对表达两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个表位的癌症或肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括使所述癌症或肿瘤细胞与有效量的根据权利要求1至
36中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求37、74或75中任一项所述的病毒颗粒；根据权利要求38至71、72或73中任一项所述的病毒介体；根据权利要求79或80所述的药物组合物接触，以诱导针对所述癌症或肿瘤细胞的免疫应答。
82.一种治疗患有癌症或肿瘤生成或有癌症或肿瘤生成的风险的受试者的癌症的方法，所述方法包括给药所述受试者治疗有效量的根据权利要求1至36中任一项的多核苷酸；
根据权利要求37、74或75中任一项所述的病毒颗粒；根据权利要求38至71、72或73中任一项所述的病毒介体；根据权利要求79或80所述的药物组合物，以治疗受试者中的癌症。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述受试者是人类患者。
84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤选自卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤或视网膜母细胞瘤中的一种或多种。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、子宫颈癌、乳癌或结肠癌中的一种或多种。
86.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1、p53、sp17、生存素、pbk、CEA、CA125或WT1中的一种或多种的两个或更多个表位。
87.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物通过胃肠外或作为预防剂给药。
88.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，所述方法还包括用化疗或放射治疗所述受试者。
89.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，所述方法还包括在通过测定所述受试者的效应T细胞的水平而评估所述受试者的免疫应答下降之后，向所述受试者给药加强剂。
90.根据权利要求81至89中任一项所述的方法，其中所述加强剂是包含复制缺陷型腺病毒介体的异源加强剂。
91.根据权利要求90的方法，其中所述复制缺陷型腺病毒介体包含编码两种或多种肿瘤相关抗原的一个或多个表位的多核苷酸，其中每个表位被酶切位点分开。
92.根据权利要求91的方法，其中所述一个或多个表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。
93.根据权利要求92的方法，其中所述一个或多个表位是两种或更多种肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原是选自下列各者所组成群组：激肽释放酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧基酯酶、α-胎儿蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-
1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4和MAGE-A3。
94.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中在给药多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物后至少一天至至少两周向所述受试者给药加强剂。
95.根据权利要求82至94中任一项所述的方法，其中所述给药导致表位在所述受试者中扩散。
96.根据权利要求1至36中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求37、74或75中任一项所述的病毒颗粒；根据权利要求38至71、72或73中任一项所述的病毒介体，还包含编码用于诱导CD4+T细胞应答的氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO：7)的核酸序列。
97.一种用一种或多种甲病毒包膜蛋白假型化的病毒介体，其中所述病毒介体包含编码肿瘤相关抗原的两个或更多个包含5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位被酶切割位点分开。
98.根据权利要求97所述的病毒介体，其中所述两个或更多个表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。
99.根据权利要求98的病毒介体，其中所述两个或更多个表位是一种或多种肿瘤相关抗原的表位，所述肿瘤相关抗原是选自由下列各者所组成群组：激肽释放酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧基酯酶、α-胎儿蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4和MAGE-A3。
100.根据权利要求97至99中任一项所述的病毒介体，其中所述酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。
101.根据权利要求1所述的多核苷酸、根据权利要求37所述的病毒颗粒、或根据权利要求38或97所述的病毒介体，其中所述甲病毒蛋白或其片段衍生自巴马森林病毒、巴马森林病毒复合体、东部马脑炎病毒(EEEV)、东部马脑炎病毒复合体、米德尔堡病毒、米德尔堡病毒复合体、恩杜姆病毒、恩杜姆病毒复合体、塞姆利基森林病毒、塞姆利基森林病毒复合物体、贝巴鲁病毒、基孔肯尼亚病毒、马亚罗病毒、亚型乌纳病毒、奥-奈氏病毒、亚型伊博-奥拉病毒、罗斯河病毒、亚型木屐病毒、亚型贝巴鲁病毒、亚型鹭山病毒、亚型米酛病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、VEEV复合体，卡巴斯欧病毒、大沼泽地病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、巴拉马那病毒、那皮舒纳病毒、西部马脑炎病毒(WEEV)、里奥内格罗病毒、特罗卡拉病毒、亚型比朱桥病毒、西部马脑炎病毒复合体、奥拉病毒、巴班肯病毒、孜拉加奇病毒、辛德毕斯病毒、奥克尔布病毒、瓦塔罗阿病毒、博吉河病毒、摩根堡病毒、高地J病毒、埃拉特病毒、鲑鱼胰腺病毒(SPDV)、南象海豹病毒(SESV)、泰森林病毒以及托莱特病毒。
用于诱导抗肿瘤免疫的表达肿瘤相关抗原的多表位的病毒
介体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2016年3月4日申请的美国临时申请案第62/303,923号的权益，其全部内容通过引用方式并入本文。
背景技术
[0004] 包括保护性免疫在内的抗癌免疫被认为是基于免疫应答的量级和记忆免疫应答的表型，包括T中枢记忆细胞(Tcm)和T效应记忆细胞(Tem)。Tcm的特征在于CD62L+CD127+表型，而Tem由CD62L-CD127+表型定义。Tem通过非淋巴组织运输并在外周发挥立即效应功能，而Tcm定位于次级淋巴器官(其中该等器官通过在遇到树突细胞呈递的抗原时大量扩张而
构成次要防御线)。T细胞记忆免疫应答的诱导取决于多种因素，例如细胞因子环境、抗原刺激的长度和抗原的剂量。CD8+T细胞记忆膨胀的特征在于高频功能性Ag特异性CD8+T细胞库
的积累，该高频功能性Ag特异性CD8+T细胞库具有效应记忆表型和在外周器官富集。对于针对癌症生长和复发的有效免疫应答，这种类型的应答更加有力且令人满意。
构成次要防御线)。T细胞记忆免疫应答的诱导取决于多种因素，例如细胞因子环境、抗原刺激的长度和抗原的剂量。CD8+T细胞记忆膨胀的特征在于高频功能性Ag特异性CD8+T细胞库
的积累，该高频功能性Ag特异性CD8+T细胞库具有效应记忆表型和在外周器官富集。对于针对癌症生长和复发的有效免疫应答，这种类型的应答更加有力且令人满意。
[0005] 辛德毕斯病毒(SV)是一种溶瘤性甲病毒，具有正链RNA基因组，能够通过细胞凋亡杀死肿瘤细胞。迄今为止，使用溶瘤病毒的癌症治疗方法通常不会导致完全癌症或肿瘤缓
解。此外，迄今为止，一些肿瘤细胞可能无法被癌症治疗中使用的病毒有效靶向，因此强调了开发新疗法和增强抗癌治疗的其他方法的需要。鉴于目前治疗和预防多种类型癌症存在
许多障碍，因此迫切需要新的和改进的抗癌治疗剂，尤其是那些引发针对肿瘤和癌细胞的
免疫应答的抗癌治疗剂，以及用于给药此类药剂以增强哺乳动物中肿瘤和癌症的治疗和根
除中的免疫应答的方法。
发明内容
解。此外，迄今为止，一些肿瘤细胞可能无法被癌症治疗中使用的病毒有效靶向，因此强调了开发新疗法和增强抗癌治疗的其他方法的需要。鉴于目前治疗和预防多种类型癌症存在
许多障碍，因此迫切需要新的和改进的抗癌治疗剂，尤其是那些引发针对肿瘤和癌细胞的
免疫应答的抗癌治疗剂，以及用于给药此类药剂以增强哺乳动物中肿瘤和癌症的治疗和根
除中的免疫应答的方法。
发明内容
[0006] 本发明的特征在于编码甲病毒蛋白或其片段的多核苷酸，以及一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个(例如，两个或更多个)表位，其中每个表位被酶切割位点分开，以及作为病毒介体、病毒颗粒和包含该多核苷酸的药物组合物，以增强针对多种肿瘤相关抗原、肿瘤逃逸变体和由不同HLA单倍型呈递的抗原的效应T细胞应答的刺激，从而诱导抗肿瘤(抗
癌症)免疫力。在一个具体实施例中，甲病毒蛋白质或其片段是辛德毕斯病毒蛋白质或其片段。在具体实施例中，多核苷酸还可以编码一种或多种细胞因子、免疫刺激分子或细胞信号分子或其表位。
癌症)免疫力。在一个具体实施例中，甲病毒蛋白质或其片段是辛德毕斯病毒蛋白质或其片段。在具体实施例中，多核苷酸还可以编码一种或多种细胞因子、免疫刺激分子或细胞信号分子或其表位。
[0007] 本发明的特征还在于病毒介体或病毒颗粒，其包含编码一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个(例如，两个或更多个)表位的多核苷酸，其中每个表位被酶切割位点分开。在一个具体实施例中，病毒介体是甲病毒介体或假型甲病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体是辛德毕斯病毒介体。在其他具体实施例中，病毒介体是用一种或多种甲病毒包膜蛋
白(例如E1、E2或E3)假型化的逆转录病毒或慢病毒。在其他具体实施例中，病毒介体是用辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒或慢病毒，例如E1-E3或ZZ E2。在一个具体实施
例中，肿瘤相关抗原的表位包含5至50个氨基酸。在其他具体实施例中，肿瘤相关抗原的表位包含5至30个氨基酸，5至25个氨基酸，5至20个氨基酸，7至25个氨基酸，7至20或7至14个氨基酸。在一个具体实施例中，酶切割位点包含被如下所述酶识别的序列。
白(例如E1、E2或E3)假型化的逆转录病毒或慢病毒。在其他具体实施例中，病毒介体是用辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒或慢病毒，例如E1-E3或ZZ E2。在一个具体实施
例中，肿瘤相关抗原的表位包含5至50个氨基酸。在其他具体实施例中，肿瘤相关抗原的表位包含5至30个氨基酸，5至25个氨基酸，5至20个氨基酸，7至25个氨基酸，7至20或7至14个氨基酸。在一个具体实施例中，酶切割位点包含被如下所述酶识别的序列。
[0008] 载一方面，本发明提供了编码一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的两个或更多个表位的多核苷酸，其中每个表位被酶切位点分开。在实施方案中，多核苷酸包含DNA或RNA，其可以是单链(ss)RNA。在一个具体实施例中，多核苷酸如下文所述携带在病毒载体或病毒颗粒中。在一个具体实施例中，多核苷酸包含两个或更多个包含5至50个氨基酸的表位。在一个具体实施例中，多核苷酸包含两个或更多个包含5至30个氨基酸的表位。在一个实施方案中，一种或多种肿瘤相关抗原在癌症或肿瘤细胞的表面上表达(例如，细胞外)或在癌症或
肿瘤细胞内表达。在一个具体实施例中，由多核苷酸编码的两个或更多个表位包含表1-28
中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。在具体实施例中，一种或多种下列肿瘤相
关抗原的两个或更多个表位可由本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒编码：激肽释放
酶4、乳头瘤病毒结合因子(PBF)、优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)、威尔姆氏肿瘤-1(WT1)、羟基类固醇脱氢酶样1(HSDL1)、间皮素、癌症睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌胚抗原(CEA)、p53、人类表皮生长因子受体2/神经受体酪氨酸激酶(Her2/Neu)、癌症相关上皮细胞粘附分子
(EpCAM)、卵巢和子宫癌抗原(CA125)、叶酸受体α、精子蛋白17、肿瘤相关差异表达基因-12(TADG-12)、粘蛋白-16(MUC-16)，L1细胞粘附分子(L1CAM)、甘露聚糖-MUC-1、人类内源性逆转录病毒K(HERV-K-MEL)、Kita-kyushu肺癌抗原-1(KK-LC-1)、人类癌症/睾丸抗原(KM-HN-
1)、癌症睾丸抗原(LAGE-1)、黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、精子表面透明带结合蛋白
(Sp17)、滑膜肉瘤，X断裂点4(SSX-4)、瞬时轴突糖蛋白-1(TAG-1)、瞬时轴突糖蛋白-2(TAG-
2)、启用同源物(ENAH)、乳腺球蛋白--A、NY-BR-1、乳腺癌抗原、(BAGE-1)、B黑素瘤抗原、黑素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、黑素瘤抗原-A2(MAGE-A2)、粘蛋白k、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX-2)、紫杉醇抗性相关基因-3(TRAG-3)、禽类细胞瘤病病毒致癌基因(c-myc)、细胞周期蛋白B1、粘蛋白1(MUC1)、p62、生存素、淋巴细胞共同抗原(CD45)、地可夫WNT信号通路抑制剂1
(DKK1)、端粒酶、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)、G250、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胱天蛋白酶5(CASP-5)、细胞色素C氧化酶组装因子1同源体(COA-1)、O-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)、骨肉瘤扩增9、内质网凝集素(OS-9)、转化生长因子β受体2(TGF-βRII)、鼠白血病糖蛋白70
(gp70)、降钙素相关多肽α(CALCA)、程序性细胞死亡1配体1(CD274)、小鼠双分钟2同源物(mdm-2)、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、苹果酶1(ME1)、核转录因子Y亚基C(NFYC)、G抗原1,3(GAGE-1,3)、黑素瘤抗原-A6(MAGE-A6)、癌症睾丸抗原XAGE-1b、前列腺1的六种跨膜上皮抗原(STEAP1)、PAP、前列腺特异性抗原(PSA)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、热休克蛋白
hsp70-2、黑素瘤抗原-A9(MAGE-A9)，Arg特异性ADP-核糖基转移酶家族C(ARTC1)，B-Raf原癌基因(B-RAF)、丝氨酸/苏氨酸激酶、β-连环蛋白，细胞分裂周期27同源物(Cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、细胞周期蛋白依赖性激
酶抑制剂2A(CDKN2A)、酪蛋白激酶1α1(CSNK1A1)、纤连蛋白1(FN1)，特异性生长抑制因子7(GAS7)、糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B(GPNMB)、HAUS类Augmin复合亚基3(HAUS3)，LDLR-岩藻糖基，黑色素瘤抗原识别由T细胞2(MART2)，肌肉生长抑制素(MSTN)、黑色素瘤相关抗原(突变的)1(MUM-1-2-3)、Poly(A)聚合酶γ(neo-PAP)、肌球蛋白I类、蛋白磷酸酶1调节亚基
3B(PPP1R3B)、过氧化物还原酶-5(PRDX5)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶卡帕(PTPRK)、转化蛋白N-Ras(N-ras)的、视网膜母细胞瘤相关因子600(RBAF600)、沉默调节蛋白-2(SIRT2)、
SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、眼白化病的1型蛋白(OA1)、成员RAS癌基因家族(RAB38)、酪氨酸酶相关蛋白1-2(TRP-1-2)、黑色素瘤抗原gp75(gp75)、酪氨酸酶、黑素-A(MART-1)、糖蛋白
100黑色素瘤抗原(GP100)、N-乙酰葡糖胺基转移V基因(GnTVf)、淋巴细胞抗原6复合基因座K(LY6K)、黑色素瘤抗原-A10(MAGE-A10)、黑色素瘤抗原-A12(MAGE-A12)、黑色素瘤抗原-C2(MAGE-C2)、黑色素瘤抗原NA88-A、紫杉醇抗性相关蛋白3(TRAG-3)、PDZ结合激酶(pbk)、半胱天冬酶8(CASP-8)、肉瘤抗原1(SAGE)、断裂簇区域-Abelson致癌基因(BCR-ABL)、白血病融合蛋白、dek-can、含2的延伸因子Tu GTP结合域(EFTUD2)、ETS变异基因6/急性髓样白血病融合蛋白(ETV6-AML1)、类FMS酪氨酸激酶-3内部串联重复(FLT3-ITD)、细胞周期蛋白A1、含3B的纤连蛋白III型结构域(FDNC3B)、早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α融合蛋白(pml-
RARα)、黑素瘤抗原-C1(MAGE-C1)、膜蛋白选择性剪接同种型(D393-CD20)、黑素瘤抗原-A4(MAGE-A4)或黑素瘤抗原-A3(MAGE-A3)。
肿瘤细胞内表达。在一个具体实施例中，由多核苷酸编码的两个或更多个表位包含表1-28
中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。在具体实施例中，一种或多种下列肿瘤相
关抗原的两个或更多个表位可由本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒编码：激肽释放
酶4、乳头瘤病毒结合因子(PBF)、优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)、威尔姆氏肿瘤-1(WT1)、羟基类固醇脱氢酶样1(HSDL1)、间皮素、癌症睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌胚抗原(CEA)、p53、人类表皮生长因子受体2/神经受体酪氨酸激酶(Her2/Neu)、癌症相关上皮细胞粘附分子
(EpCAM)、卵巢和子宫癌抗原(CA125)、叶酸受体α、精子蛋白17、肿瘤相关差异表达基因-12(TADG-12)、粘蛋白-16(MUC-16)，L1细胞粘附分子(L1CAM)、甘露聚糖-MUC-1、人类内源性逆转录病毒K(HERV-K-MEL)、Kita-kyushu肺癌抗原-1(KK-LC-1)、人类癌症/睾丸抗原(KM-HN-
1)、癌症睾丸抗原(LAGE-1)、黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、精子表面透明带结合蛋白
(Sp17)、滑膜肉瘤，X断裂点4(SSX-4)、瞬时轴突糖蛋白-1(TAG-1)、瞬时轴突糖蛋白-2(TAG-
2)、启用同源物(ENAH)、乳腺球蛋白--A、NY-BR-1、乳腺癌抗原、(BAGE-1)、B黑素瘤抗原、黑素瘤抗原-A1(MAGE-A1)、黑素瘤抗原-A2(MAGE-A2)、粘蛋白k、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX-2)、紫杉醇抗性相关基因-3(TRAG-3)、禽类细胞瘤病病毒致癌基因(c-myc)、细胞周期蛋白B1、粘蛋白1(MUC1)、p62、生存素、淋巴细胞共同抗原(CD45)、地可夫WNT信号通路抑制剂1
(DKK1)、端粒酶、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)、G250、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胱天蛋白酶5(CASP-5)、细胞色素C氧化酶组装因子1同源体(COA-1)、O-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)、骨肉瘤扩增9、内质网凝集素(OS-9)、转化生长因子β受体2(TGF-βRII)、鼠白血病糖蛋白70
(gp70)、降钙素相关多肽α(CALCA)、程序性细胞死亡1配体1(CD274)、小鼠双分钟2同源物(mdm-2)、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、苹果酶1(ME1)、核转录因子Y亚基C(NFYC)、G抗原1,3(GAGE-1,3)、黑素瘤抗原-A6(MAGE-A6)、癌症睾丸抗原XAGE-1b、前列腺1的六种跨膜上皮抗原(STEAP1)、PAP、前列腺特异性抗原(PSA)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、热休克蛋白
hsp70-2、黑素瘤抗原-A9(MAGE-A9)，Arg特异性ADP-核糖基转移酶家族C(ARTC1)，B-Raf原癌基因(B-RAF)、丝氨酸/苏氨酸激酶、β-连环蛋白，细胞分裂周期27同源物(Cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)、细胞周期蛋白依赖性激
酶抑制剂2A(CDKN2A)、酪蛋白激酶1α1(CSNK1A1)、纤连蛋白1(FN1)，特异性生长抑制因子7(GAS7)、糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B(GPNMB)、HAUS类Augmin复合亚基3(HAUS3)，LDLR-岩藻糖基，黑色素瘤抗原识别由T细胞2(MART2)，肌肉生长抑制素(MSTN)、黑色素瘤相关抗原(突变的)1(MUM-1-2-3)、Poly(A)聚合酶γ(neo-PAP)、肌球蛋白I类、蛋白磷酸酶1调节亚基
3B(PPP1R3B)、过氧化物还原酶-5(PRDX5)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶卡帕(PTPRK)、转化蛋白N-Ras(N-ras)的、视网膜母细胞瘤相关因子600(RBAF600)、沉默调节蛋白-2(SIRT2)、
SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、眼白化病的1型蛋白(OA1)、成员RAS癌基因家族(RAB38)、酪氨酸酶相关蛋白1-2(TRP-1-2)、黑色素瘤抗原gp75(gp75)、酪氨酸酶、黑素-A(MART-1)、糖蛋白
100黑色素瘤抗原(GP100)、N-乙酰葡糖胺基转移V基因(GnTVf)、淋巴细胞抗原6复合基因座K(LY6K)、黑色素瘤抗原-A10(MAGE-A10)、黑色素瘤抗原-A12(MAGE-A12)、黑色素瘤抗原-C2(MAGE-C2)、黑色素瘤抗原NA88-A、紫杉醇抗性相关蛋白3(TRAG-3)、PDZ结合激酶(pbk)、半胱天冬酶8(CASP-8)、肉瘤抗原1(SAGE)、断裂簇区域-Abelson致癌基因(BCR-ABL)、白血病融合蛋白、dek-can、含2的延伸因子Tu GTP结合域(EFTUD2)、ETS变异基因6/急性髓样白血病融合蛋白(ETV6-AML1)、类FMS酪氨酸激酶-3内部串联重复(FLT3-ITD)、细胞周期蛋白A1、含3B的纤连蛋白III型结构域(FDNC3B)、早幼粒细胞白血病/视黄酸受体α融合蛋白(pml-
RARα)、黑素瘤抗原-C1(MAGE-C1)、膜蛋白选择性剪接同种型(D393-CD20)、黑素瘤抗原-A4(MAGE-A4)或黑素瘤抗原-A3(MAGE-A3)。
[0009] 在一些具体实施例中，由多核苷酸编码的两个或更多个表位中的至少一者来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1、肿瘤相关抗原MAGE-A3及/或肿瘤相关抗原pbk。在一个特别具体实施例中，多核苷酸编码来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位(其包含氨基酸序列LLMWITQCF(SEQ ID NO：1))和来自肿瘤相关抗原pbk的表位(其包含氨基酸序列GSPFPAAVI(SEQ ID NO：2))。
在一个具体实施例中，由多核苷酸编码的两个或更多个表位之一来自肿瘤相关抗原NY-
ESO-1，并且两个或更多个表位中的一个来自肿瘤相关抗原生存素。在一个特别具体实施例中，多核苷酸编码来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位(其包含氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ
ID NO：3))和来自肿瘤相关抗原生存素的表位(其包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：
4))。在一个具体实施例中，多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位。
在某些具体实施例中，三个或更多个表位是相同的肿瘤相关抗原。在其他具体实施例中，三个或更多个表位来自至少一种不同的肿瘤相关抗原。在某些具体实施例中，多核苷酸编码
一种或多种肿瘤相关抗原的八个或更多个表位。在具体实施例中，所述多肽编码在癌症或
肿瘤细胞表面或在癌症或肿瘤细胞的胞质溶胶中表达的肿瘤相关抗原的表位，特别是两个
或更多个表位，所述癌症或肿瘤细胞来自卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤，胚胎癌、肾母细胞瘤，子宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤，血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤。
在一个具体实施例中，由多核苷酸编码的两个或更多个表位之一来自肿瘤相关抗原NY-
ESO-1，并且两个或更多个表位中的一个来自肿瘤相关抗原生存素。在一个特别具体实施例中，多核苷酸编码来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位(其包含氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ
ID NO：3))和来自肿瘤相关抗原生存素的表位(其包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：
4))。在一个具体实施例中，多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位。
在某些具体实施例中，三个或更多个表位是相同的肿瘤相关抗原。在其他具体实施例中，三个或更多个表位来自至少一种不同的肿瘤相关抗原。在某些具体实施例中，多核苷酸编码
一种或多种肿瘤相关抗原的八个或更多个表位。在具体实施例中，所述多肽编码在癌症或
肿瘤细胞表面或在癌症或肿瘤细胞的胞质溶胶中表达的肿瘤相关抗原的表位，特别是两个
或更多个表位，所述癌症或肿瘤细胞来自卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤，胚胎癌、肾母细胞瘤，子宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤，血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤。
[0010] 在一些具体实施例中，多核苷酸进一步编码处理位点或酶切割位点(其是蛋白酶切割位点)。在一个具体实施例中，酶切割位点是丝氨酸蛋白酶切割位点。在一个具体实施例中，丝氨酸蛋白酶切割位点被选自弗林蛋白酶、PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4、PC7或其组合的蛋白质切割。在另一个特别具体实施例中，丝氨酸蛋白酶切割位点被弗林蛋白酶切割。在一个具体实施例中，由多核苷酸编码的酶切割位点包含氨基酸序列XRSKRX(SEQ ID NO：5)，其中X代表疏水性氨基酸。在另一个具体实施例中，由多核苷酸编码的酶切割位点包含氨基酸序列(R/K)Xn(R/K)(SEQ ID NO：6)，其中X代表氨基酸，n是0的整数。在一个具体实施例中，多核苷酸包含5'内质网信号序列。在某些具体实施例中，多核苷酸包含衍生自甲病毒、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-68或组织纤溶酶原激活物肽的5'内质网信号序列。在一个具体实
施例中，多核苷酸包含编码免疫原性蛋白质的3'序列，所述免疫原性蛋白质选自热休克蛋
白70、IgG1Fc结构域、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助T(Th)表位或大肠杆菌热不稳定的肠毒素B亚基。在另一个具体实施例中，多核苷酸编码一种或多种免疫刺激蛋白。举例来说，此类蛋白质包括，但不限于，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19，IL-20至IL-
36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)中的一种或多种。在一个特别具体实施例中，多核苷酸编码免疫刺激蛋白IL-12。在另一个特别具体实施例中，多核苷酸还包含一个或多个自杀基因，其能够转化惰性前药细
胞毒性代谢物，所述惰性前药例如，但不限于，更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦
(acyclovir)、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷或5-氟胞嘧啶。在一个具体实施例中，可以源自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)的一种或多种自杀基因编码胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶。如本领域技术
人员所理解的，衍生自指衍生自、源自或产生自多核苷酸，多肽或来自一种来源(例如病毒、细菌、微生物或生物来源)的肽的全部或一部分(通常是功能性或活性部分)。
施例中，多核苷酸包含编码免疫原性蛋白质的3'序列，所述免疫原性蛋白质选自热休克蛋
白70、IgG1Fc结构域、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助T(Th)表位或大肠杆菌热不稳定的肠毒素B亚基。在另一个具体实施例中，多核苷酸编码一种或多种免疫刺激蛋白。举例来说，此类蛋白质包括，但不限于，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19，IL-20至IL-
36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)中的一种或多种。在一个特别具体实施例中，多核苷酸编码免疫刺激蛋白IL-12。在另一个特别具体实施例中，多核苷酸还包含一个或多个自杀基因，其能够转化惰性前药细
胞毒性代谢物，所述惰性前药例如，但不限于，更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦
(acyclovir)、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷或5-氟胞嘧啶。在一个具体实施例中，可以源自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)的一种或多种自杀基因编码胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶。如本领域技术
人员所理解的，衍生自指衍生自、源自或产生自多核苷酸，多肽或来自一种来源(例如病毒、细菌、微生物或生物来源)的肽的全部或一部分(通常是功能性或活性部分)。
[0011] 在其另一方面，本发明涉及包含如上文和下文所述多核苷酸的病毒介体。在具体实施例中，病毒介体选自甲病毒、慢病毒或逆转录病毒。在一个具体实施例中，病毒介体用一种或多种甲病毒属病毒包膜蛋白假型化。在一个具体实施例中，病毒介体用甲病毒E1蛋
白、E2蛋白、E1和E2蛋白或其片段假型化。在一个优选具体实施例中，病毒介体是辛德毕斯病毒介体或衍生自辛德毕斯病毒。在一个具体实施例中，病毒介体用一种或多种辛德毕斯
病毒包膜蛋白假型化。在一个具体实施例中，用辛德毕斯-ZZ E2蛋白或其片段对病毒介体
进行假型化。在一个特别具体实施例中，病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白
假型化的慢病毒，其可包括辛德毕斯-ZZ E2蛋白。在一个具体实施例中，病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒，其可包括辛德毕斯-ZZ E2蛋白。在一
个具体实施例中，病毒介体是复制缺陷型病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体是具有复制能力的病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体是非整合型病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体能够在给药于受试者(优选患有癌症或肿瘤的人受试者或患者)后，引发
针对表达一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。在一个
具体实施例中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。在所有上述具体实施例中，病毒介体含有上文和下文所述多核苷酸(也称为小基因)，其编码的产物在病毒介体与细胞体外和体内接触后在细胞中表达。
白、E2蛋白、E1和E2蛋白或其片段假型化。在一个优选具体实施例中，病毒介体是辛德毕斯病毒介体或衍生自辛德毕斯病毒。在一个具体实施例中，病毒介体用一种或多种辛德毕斯
病毒包膜蛋白假型化。在一个具体实施例中，用辛德毕斯-ZZ E2蛋白或其片段对病毒介体
进行假型化。在一个特别具体实施例中，病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白
假型化的慢病毒，其可包括辛德毕斯-ZZ E2蛋白。在一个具体实施例中，病毒介体是用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒，其可包括辛德毕斯-ZZ E2蛋白。在一
个具体实施例中，病毒介体是复制缺陷型病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体是具有复制能力的病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体是非整合型病毒介体。在一个具体实施例中，病毒介体能够在给药于受试者(优选患有癌症或肿瘤的人受试者或患者)后，引发
针对表达一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。在一个
具体实施例中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。在所有上述具体实施例中，病毒介体含有上文和下文所述多核苷酸(也称为小基因)，其编码的产物在病毒介体与细胞体外和体内接触后在细胞中表达。
[0012] 在一个特别方面，提供了辛德毕斯病毒介体，其包含编码两个或更多个包含肿瘤相关抗原的5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位被弗林蛋白酶切割位点分开。
在另一个特别方面，提供了用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的病毒介体，其中
病毒介体包含编码两个或更多个包含肿瘤相关抗原的5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，
其中每个表位由弗林蛋白酶切割位点分开。在具体实施例中，上述病毒介体的两个或更多
个表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。在一个具体实施例中，两个或更多个表位是一种或多种肿瘤相关抗原，其选自由以下各者所组成群组:激肽释放
酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧基酯酶、α-胎儿蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子
2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-
3、neo-PAP、肌球蛋白I类、PPP1R3B、PRDX 5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4和MAGE-A3。在一个特别具体实施例中，两个或更多个表位中的至少一者来自肿瘤
相关抗原NY-ESO-1，并且两个或更多个表位中的至少一者来自肿瘤相关抗原生存素或pbk。
在一个特别具体实施例中，来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列LLMWITQCF
(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，来自肿瘤相关抗原生存素的表位包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)，来自肿瘤相关抗原pbk的表位包含氨基酸序列
GSPFPAAVI(SEQ ID NO：2)。在另一个具体实施例中，两个或更多个表位中的一个来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且由病毒介体编码的两个或更多个表位的一个来自肿瘤相关抗原生
存素。在另一个具体实施例中，来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列
RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，并且来自肿瘤相关抗原生存素的表位包含氨基酸序列
AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)。在一个具体实施例中，病毒介体中包含的多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位或八个或更多个表位。在具体实施例中，病毒介体
编码在癌症或肿瘤细胞表面或在卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤的癌症或肿瘤细胞的胞质溶胶中表达的肿瘤相关
抗原的表位，特别是两个或更多个表位。在一个具体实施例中，上述辛德毕斯或假型化病毒介体包含5'内质网信号序列，其序列任选地衍生自甲病毒、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-
68或组织纤溶酶原激活肽。在一个具体实施例中，病毒介体包含编码选自热休克蛋白70、
IgG1Fc结构域，溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助T(Th)表位或大肠杆菌的热不稳定肠毒素B亚基的免疫原性蛋白质的3'序列。在具体实施例中，病毒介体中包含的多核苷酸编码一种或多种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6I、L-7、IL-8，IL-9、IL-10、IL-
11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20至IL-36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)的免疫刺激蛋白。在一个具体实施例中，病毒介体包含一个或多个自杀基因，其能够将惰性前药转化为细胞毒性代谢物。举例来说，惰性前药可以是更昔洛韦、阿昔洛韦、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷或5-氟胞嘧啶的免疫刺激蛋
白。在一个具体实施例中，所述一种或多种自杀基因编码胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶，其任选地衍生自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)。在一个具体实施例中，所述病毒介体能够在向受试者(优选患有癌症或肿瘤的人或患者)给药后，引发针对表达所述一
种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。在一个具体实施例
中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。在所有上述具体实施例中，辛德毕斯病毒介体或假型化病毒介体含有上文和下文所述
多核苷酸(也称为小基因)，其编码的产物在体外和体内与病毒介体接触后在细胞中表达。
在另一个特别方面，提供了用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的病毒介体，其中
病毒介体包含编码两个或更多个包含肿瘤相关抗原的5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，
其中每个表位由弗林蛋白酶切割位点分开。在具体实施例中，上述病毒介体的两个或更多
个表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列。在一个具体实施例中，两个或更多个表位是一种或多种肿瘤相关抗原，其选自由以下各者所组成群组:激肽释放
酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧基酯酶、α-胎儿蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子
2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-
3、neo-PAP、肌球蛋白I类、PPP1R3B、PRDX 5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4和MAGE-A3。在一个特别具体实施例中，两个或更多个表位中的至少一者来自肿瘤
相关抗原NY-ESO-1，并且两个或更多个表位中的至少一者来自肿瘤相关抗原生存素或pbk。
在一个特别具体实施例中，来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列LLMWITQCF
(SEQ ID NO：1)或氨基酸序列RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，来自肿瘤相关抗原生存素的表位包含氨基酸序列AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)，来自肿瘤相关抗原pbk的表位包含氨基酸序列
GSPFPAAVI(SEQ ID NO：2)。在另一个具体实施例中，两个或更多个表位中的一个来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1，并且由病毒介体编码的两个或更多个表位的一个来自肿瘤相关抗原生
存素。在另一个具体实施例中，来自肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位包含氨基酸序列
RGPESRLLE(SEQ ID NO：3)，并且来自肿瘤相关抗原生存素的表位包含氨基酸序列
AFLTVKKQM(SEQ ID NO：4)。在一个具体实施例中，病毒介体中包含的多核苷酸编码一种或多种肿瘤相关抗原的三个或更多个表位或八个或更多个表位。在具体实施例中，病毒介体
编码在癌症或肿瘤细胞表面或在卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、或视网膜母细胞瘤的癌症或肿瘤细胞的胞质溶胶中表达的肿瘤相关
抗原的表位，特别是两个或更多个表位。在一个具体实施例中，上述辛德毕斯或假型化病毒介体包含5'内质网信号序列，其序列任选地衍生自甲病毒、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-
68或组织纤溶酶原激活肽。在一个具体实施例中，病毒介体包含编码选自热休克蛋白70、
IgG1Fc结构域，溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素通用辅助T(Th)表位或大肠杆菌的热不稳定肠毒素B亚基的免疫原性蛋白质的3'序列。在具体实施例中，病毒介体中包含的多核苷酸编码一种或多种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6I、L-7、IL-8，IL-9、IL-10、IL-
11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20至IL-36、趋化因子CCL1至CCL27、CC趋化因子CXCL1至CXCL13、CXC趋化因子、C趋化因子、CX3C趋化因子、细胞因子或趋化因子受体、可溶性受体、转化生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)的免疫刺激蛋白。在一个具体实施例中，病毒介体包含一个或多个自杀基因，其能够将惰性前药转化为细胞毒性代谢物。举例来说，惰性前药可以是更昔洛韦、阿昔洛韦、1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU)、6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷或5-氟胞嘧啶的免疫刺激蛋
白。在一个具体实施例中，所述一种或多种自杀基因编码胞嘧啶脱氨酶或胸苷激酶，其任选地衍生自单纯疱疹病毒(HSVtk)或水痘带状疱疹病毒(VZV-tk)。在一个具体实施例中，所述病毒介体能够在向受试者(优选患有癌症或肿瘤的人或患者)给药后，引发针对表达所述一
种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的肿瘤或癌症的免疫应答。在一个具体实施例
中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。在所有上述具体实施例中，辛德毕斯病毒介体或假型化病毒介体含有上文和下文所述
多核苷酸(也称为小基因)，其编码的产物在体外和体内与病毒介体接触后在细胞中表达。
[0013] 本发明的另一方面提供了用一种或多种基因工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒介体，其中慢病毒介体包含如上文和下文所述多核苷酸。本发明还提供了用一
种或多种基因工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒介体，所述慢病毒介体包含如
上文和下文所述多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自NY-ESO-1、MAGE-A3、pbk、生存素或其组合的一种或多种肿瘤相关抗原的表位。
种或多种基因工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的慢病毒介体，所述慢病毒介体包含如
上文和下文所述多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自NY-ESO-1、MAGE-A3、pbk、生存素或其组合的一种或多种肿瘤相关抗原的表位。
[0014] 另一方面，本发明提供了病毒颗粒，其包含病毒介体，如上文和下文所述辛德毕斯病毒介体或假型化病毒介体。另一方面，本发明提供了病毒颗粒，其包含如上文和下文所述甲病毒介体、慢病毒介体、逆转录病毒介体或其假型化介体。
[0015] 另一方面，本发明提供了包含如上文和下文所述多核苷酸的细胞。在其他方面，本发明进一步提供了包含如上文和下文所述病毒介体或慢病毒介体的细胞。一方面，本发明提供了包含如上文和下文所述病毒颗粒的细胞。
[0016] 在另一个方面，提供了药物组合物，其包含如上文和下文所述多核苷酸、病毒颗粒及/或病毒介体、以及药学上可接受的溶媒、载体或稀释剂。在一个具体实施例中，药物组合物是液体剂型。
[0017] 在另一个方面，提供了诱导针对表达两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个表位的癌症或肿瘤细胞的免疫应答的方法，其中该方法包括使癌症或肿瘤细胞与有效量的如
上文和下文所述多核苷酸病毒颗粒、病毒介体及/或药物组合物接触，以诱导针对癌症或肿瘤细胞的免疫应答。在一个具体实施例中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。另一方面，提供了治疗有癌症或肿瘤生成或有
癌症或肿瘤生成风险或正有癌症或肿瘤生成的受试者的癌症的方法，其中该方法包括给药
受试者治疗有效量的多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体及/或如上文和下文所述药物组合物，以治疗受试者中的癌症。在该方法的一个具体实施例中，受试者优选是有癌症或肿瘤或有
患癌症或肿瘤风险的人类患者，所述癌症或肿瘤选自卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤或视网膜母细胞瘤中的一种或多种。在该方法的一个具体实施例中，受试者的癌症是卵巢癌、宫颈癌、乳癌或结肠癌中的一种或多种。在所述方法的具体实施例中，多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物编码一种或多种肿瘤相关抗原NY-ESO-1、p53、sp17、生存素、pbk、CEA、CA125或WT1的两个或更多个表位。在该方法的一个具体实施例中，多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物通过肠胃外给药或作为预防剂给药。在所述方法的具体实施例中，所述受试者进一步用化疗或放射
治疗。在所述方法的一个具体实施例中，在通过测定受试者效应T细胞的水平来评估受试者免疫应答下降后，给药受试者加强剂。在一个具体实施例中，加强剂是异源加强剂，其包含复制缺陷型腺病毒介体，例如腺病毒或腺相关病毒。在一个具体实施例中，腺病毒加强剂介体包含编码两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个表位的多核苷酸，其中每个表位被处
理位点分开，例如酶切位点。在一个具体实施例中，表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列，说明性地，激肽释放酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧酸酯酶、甲胎蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白类I、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4或MAGE-A3。在一个具体实施例中，在给药多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物后至少一天至至少两周向受试者给药加强
剂。在所述方法的一个具体实施例中，如果使用给药如上文和下文所述多核苷酸、病毒颗
粒、病毒介体或药物组合物，或加强剂，则引起受试者中的表位扩散。在具体实施例中，如上文和下文所述病毒颗粒或病毒介体的多核苷酸还包含编码氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ
ID NO：7)的核酸序列，用于诱导CD4+T细胞应答。
上文和下文所述多核苷酸病毒颗粒、病毒介体及/或药物组合物接触，以诱导针对癌症或肿瘤细胞的免疫应答。在一个具体实施例中，免疫应答产生细胞毒性T细胞，其特异性地杀死表达肿瘤相关抗原表位的癌症或肿瘤细胞。另一方面，提供了治疗有癌症或肿瘤生成或有
癌症或肿瘤生成风险或正有癌症或肿瘤生成的受试者的癌症的方法，其中该方法包括给药
受试者治疗有效量的多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体及/或如上文和下文所述药物组合物，以治疗受试者中的癌症。在该方法的一个具体实施例中，受试者优选是有癌症或肿瘤或有
患癌症或肿瘤风险的人类患者，所述癌症或肿瘤选自卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤或视网膜母细胞瘤中的一种或多种。在该方法的一个具体实施例中，受试者的癌症是卵巢癌、宫颈癌、乳癌或结肠癌中的一种或多种。在所述方法的具体实施例中，多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物编码一种或多种肿瘤相关抗原NY-ESO-1、p53、sp17、生存素、pbk、CEA、CA125或WT1的两个或更多个表位。在该方法的一个具体实施例中，多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物通过肠胃外给药或作为预防剂给药。在所述方法的具体实施例中，所述受试者进一步用化疗或放射
治疗。在所述方法的一个具体实施例中，在通过测定受试者效应T细胞的水平来评估受试者免疫应答下降后，给药受试者加强剂。在一个具体实施例中，加强剂是异源加强剂，其包含复制缺陷型腺病毒介体，例如腺病毒或腺相关病毒。在一个具体实施例中，腺病毒加强剂介体包含编码两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个表位的多核苷酸，其中每个表位被处
理位点分开，例如酶切位点。在一个具体实施例中，表位包含表1至28中任一个中列出的肿瘤相关抗原的氨基酸序列，说明性地，激肽释放酶4、PBF、PRAME、WT1、HSDL1、间皮素、NY-ESO-1、CEA、p53、Her2/Neu、EpCAM、CA125、叶酸受体α、精子蛋白17、TADG-12、MUC-16、L1CAM、甘露聚糖-MUC-1、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A4、Sp17、SSX-4、TAG-1、TAG-2、ENAH、乳腺球蛋白-A、NY-BR-1、BAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、mucink、SSX-2、TRAG-3、c-myc、细胞周期蛋白B1、MUC1、p62、生存素、CD45、DKK1、RU2AS、端粒酶、K-ras、G250、丝氨酸蛋白酶、肠道羧酸酯酶、甲胎蛋白、M-CSF、PSMA、CASP-5、COA-1、OGT、OS-9、TGF-βRII、gp70、CALCA、CD274、mdm-2、α-辅肌动蛋白-4、延伸因子2、ME1、NFYC、GAGE-1、MAGE-A6、XAGE-1b、PSMA、STEAP1、PAP、PSA、GAGE3、FGF5、丝氨酸蛋白酶、hsp70-2、MAGE-A9、ARTC1、B-RAF、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLLP、CSNK1A1、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、LDLR-岩藻糖基转移酶、MART2、MATN、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白类I、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、磷酸丙糖异构酶、OA1、RAB38、TRP-1、gp75、TRP2、酪氨酸酶、MART-1、gp100、GnTVf、LY6K、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-C2、NA88-A、TRAG-3、TRP2-INT2g、pbk、CASP-8、SAGE、BCR-ABL、dek-can、EFTUD2、ETV6-AML1、FLT3-ITD、细胞周期蛋白-A1、FDNC3B、pml-RARα、MAGE-C1、D393-CD20、MAGE-A4或MAGE-A3。在一个具体实施例中，在给药多核苷酸、病毒颗粒、病毒介体或药物组合物后至少一天至至少两周向受试者给药加强
剂。在所述方法的一个具体实施例中，如果使用给药如上文和下文所述多核苷酸、病毒颗
粒、病毒介体或药物组合物，或加强剂，则引起受试者中的表位扩散。在具体实施例中，如上文和下文所述病毒颗粒或病毒介体的多核苷酸还包含编码氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ
ID NO：7)的核酸序列，用于诱导CD4+T细胞应答。
[0018] 本发明提供了使用如上文和下文所述多核苷酸、病毒介体、病毒颗粒和药物组合物对哺乳动物癌症或肿瘤的治疗性、预防性或组合性治疗性和预防性治疗。
[0019] 本发明的一个特别具体方面提供了一种非整合型甲病毒介体(例如，辛德毕斯病毒介体)，其分子工程化以含有编码一种或多种肿瘤相关抗原的两个或多个包含例如5至50
个氨基酸或5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位序列被处理位点分开，例如酶切割位点(例如弗林蛋白酶切割位点)，以用于肿瘤相关抗原表位多肽和肽产物的细胞内处
理的再现性。在一些具体实施例中，病毒介体还含有一种或多种核酸序列，其编码一种或多种新抗原、细胞因子、趋化因子、抗体、突变的癌基因或过度表达的癌基因，以用于增强和改善本文所述病毒介体和病毒颗粒引发的针对肿瘤相关抗原表位的免疫应答以及其治疗及/
或预防用途。一方面，如本文所述辛德毕斯病毒介体引发针对肿瘤相关抗原的多个表位的
强T细胞应答，包括CD8+T细胞应答。
个氨基酸或5至30个氨基酸的表位的多核苷酸，其中每个表位序列被处理位点分开，例如酶切割位点(例如弗林蛋白酶切割位点)，以用于肿瘤相关抗原表位多肽和肽产物的细胞内处
理的再现性。在一些具体实施例中，病毒介体还含有一种或多种核酸序列，其编码一种或多种新抗原、细胞因子、趋化因子、抗体、突变的癌基因或过度表达的癌基因，以用于增强和改善本文所述病毒介体和病毒颗粒引发的针对肿瘤相关抗原表位的免疫应答以及其治疗及/
或预防用途。一方面，如本文所述辛德毕斯病毒介体引发针对肿瘤相关抗原的多个表位的
强T细胞应答，包括CD8+T细胞应答。
[0020] 另一方面，如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒的甲病毒蛋白或其片段衍生自巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、巴马森林病毒复合体、东部马脑炎病毒
(Eastern equine encephalis virus，EEEV)、东部马脑炎病毒复合体、脑炎病毒复合体、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、米德尔堡病毒复合体、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、恩杜姆病毒复合体、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、塞姆利基森林病毒复合物体、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、基孔肯尼亚病毒(Chikungunya virus)、马亚罗病毒(Mayaro virus)、亚型乌纳病毒(Subtype Una virus)、奥-奈氏病毒(O’Nyong Nyong)、亚型伊博-奥拉病毒(Igbo-Ora virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、亚型木屐病毒(Subtype
Getahvirus)、亚型贝巴鲁病毒、亚型鹭山病毒(Subtype Sagiyamavirus)、亚型米酛病毒
(Subtype Me Trivirus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis
virus，VEEV)、VEEV复合体，卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、大沼泽地病毒(Everglades virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedrasvirus)、穆坎博病毒(Mucambovirus)、巴拉马那病毒(Paramana virus)、那皮舒纳病毒(Pixunavirus)、西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、特罗卡拉病毒(Trocaravirus)、亚型比朱桥病毒(Bijou virus)、西部马脑炎病毒复合体、奥拉病毒
(Auravirus)、巴班肯病毒(Babank virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、辛德毕斯病毒、奥克尔布病毒(Ockelbovirus)、瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、高地J病毒(Highlands Jvirus)、埃拉特病毒(Eilat virus)、鲑鱼胰腺病毒病毒(Salmon pancreatic disease virus，SPDV)、南象海豹病毒(Southern elephase seal virus，SESV)、泰森林病毒(Thai Forest virus)或托莱特病毒(Tonate virus)中的一种或多种。
(Eastern equine encephalis virus，EEEV)、东部马脑炎病毒复合体、脑炎病毒复合体、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、米德尔堡病毒复合体、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、恩杜姆病毒复合体、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、塞姆利基森林病毒复合物体、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、基孔肯尼亚病毒(Chikungunya virus)、马亚罗病毒(Mayaro virus)、亚型乌纳病毒(Subtype Una virus)、奥-奈氏病毒(O’Nyong Nyong)、亚型伊博-奥拉病毒(Igbo-Ora virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、亚型木屐病毒(Subtype
Getahvirus)、亚型贝巴鲁病毒、亚型鹭山病毒(Subtype Sagiyamavirus)、亚型米酛病毒
(Subtype Me Trivirus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis
virus，VEEV)、VEEV复合体，卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、大沼泽地病毒(Everglades virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedrasvirus)、穆坎博病毒(Mucambovirus)、巴拉马那病毒(Paramana virus)、那皮舒纳病毒(Pixunavirus)、西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、特罗卡拉病毒(Trocaravirus)、亚型比朱桥病毒(Bijou virus)、西部马脑炎病毒复合体、奥拉病毒
(Auravirus)、巴班肯病毒(Babank virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、辛德毕斯病毒、奥克尔布病毒(Ockelbovirus)、瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、高地J病毒(Highlands Jvirus)、埃拉特病毒(Eilat virus)、鲑鱼胰腺病毒病毒(Salmon pancreatic disease virus，SPDV)、南象海豹病毒(Southern elephase seal virus，SESV)、泰森林病毒(Thai Forest virus)或托莱特病毒(Tonate virus)中的一种或多种。
[0021] 定义
[0022] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的
一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2
版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988)；
The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991)；以及
Hale&Marham,The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有下面赋予它们的含义。
一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2
版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988)；
The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991)；以及
Hale&Marham,The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有下面赋予它们的含义。
[0023] 所谓“试剂”是指肽、多肽、核酸分子或小分子化合物、抗体或其片段。
[0024] 所谓“改变”是指通过标准技术已知方法(如那些本文所述者)侦测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文所用，改变包括表达水平的10％变化、25％的变化、40％的变化、或50％或更高的表达水平变化。“
[0025] 所谓“改善(ameliorate)”和“改善(amelioration)”是指减少、抑制、减弱、消减，阻止或稳定疾病的发展或进展。
[0026] 所谓“类似物”或“衍生物”是指不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相应的天然存在的多肽的生物活性，同时具有相对于天然存在的多肽增强类似物功能的某些生物化学修饰。这种生物化学修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、膜渗
透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。
透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。
[0027] 如本文所用，术语“抗原”是指能够引发体液或细胞介导的免疫应答的物质。抗原可能能够例如通过激活T细胞受体诱导抗体的产生或刺激T细胞活性。抗原通常是蛋白质或多醣，并且可以是细菌、病毒和其他微生物的组分(例如，包衣、胶囊、细胞壁、衣壳、鞭毛和毒素)。本文使用的术语包括可被适应性和先天性免疫系统以及体外或体内抗体或抗体片
段识别的所有物质。
段识别的所有物质。
[0029] 如本文所用，术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒，其可与其一起给药组合物或药物组合物，例如包含多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒。药学上和药学上可接受的载体包括无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源所具者，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液可用作载体，特别是用于可注射溶液。载体还可包括固体剂型，其包括，但不限于，粘合剂(用于压缩丸)、助流剂、包封剂、食用香料和着色剂中的一种或多种。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。
[0030] 在本揭示内容中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以表示“包括(includes)”，“包括(including)”等；“基本上由......组成(consisting essentially of)”或“基本上由...组成(consists essentially of)”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在多于那些所述者，只要所述基本或新颖特征是不会由超过所述者的存在而
改变，但不包括先前技术实施例。
改变，但不包括先前技术实施例。
[0031] “侦测”是指识别待侦测的分子、化合物或试剂的存在、不存在或量。
[0032] “可侦测标记”是指当与感兴趣的分子连接时，通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法使后者可侦测的组合物。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)，生物素，洋地黄毒苷或半抗原。
[0033] “疾病”是指对细胞、组织、器官或身体的一部分的正常功能产生不利影响、损害或干扰的任何病况或病症(例如癌症或肿瘤生成)。
[0034] “有效量”是指相对于未治疗的患者改善疾病症状所需的量。用于实施本发明治疗疾病的活性化合物的有效量根据给药方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。该金额称为“有效”金额。在一个具体实施例中，有效量是降低或稳定癌细胞增殖速率所需的本发明的剂的量。在另一个具体实施例中，有效量是降低癌细胞存活所需的本发明的剂的量。在另一个具体实施例中，有效量是诱导癌细胞死亡所需的本发明的剂的量。
[0036] 如本文所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指与配体、抗体或T细胞受体能够结合(例如，在诱导免疫应答期间)的抗原(例如，肿瘤相关抗原)上的位点，例如氨基酸序列，所述表位或抗原决定簇可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠在空间上接近的不连续氨基酸形成。其他表位由四级结构形成，例如通过几个多肽的组装形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级或四级折叠形成的表位通常在用变性溶
剂处理时损失。表位可包括例如可能存在于独特的空间构象的3至30个氨基酸残基，或5至
30个或5至25个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。确定表位的空间构象的方法是本领域已知的，包括例如X射线晶体学和二维核磁共振(NMR)。这些方法详细描述于例如Morris,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,(1996)。
剂处理时损失。表位可包括例如可能存在于独特的空间构象的3至30个氨基酸残基，或5至
30个或5至25个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。确定表位的空间构象的方法是本领域已知的，包括例如X射线晶体学和二维核磁共振(NMR)。这些方法详细描述于例如Morris,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,(1996)。
[0037] 如本文所用，术语“表位扩散”(也称为“抗原扩散”)是指来自针对自身或外来抗原或蛋白质的初始聚焦的表位特异性免疫应答(例如，通过细胞毒性T细胞)至蛋白质上的亚优势及/或隐蔽的、或突变的表位(分子内扩散)或其他蛋白质(分子间扩散)的表位特异性
的多样化。表位扩散可以使患者的免疫系统对免疫系统的细胞(例如，细胞毒性T细胞)最初识别的其他表位产生免疫应答，同时降低肿瘤群体中逃避变体的可能性，并且因此可以减
弱疾病(癌症)进展。在一个具体实施例中，在用本文所述介体接种后，产生响应于原始疫苗制剂中不存在的肿瘤相关抗原的T细胞，表明用衍生自肿瘤细胞的抗原已发生了第二轮T细
胞预备(priming)。
的多样化。表位扩散可以使患者的免疫系统对免疫系统的细胞(例如，细胞毒性T细胞)最初识别的其他表位产生免疫应答，同时降低肿瘤群体中逃避变体的可能性，并且因此可以减
弱疾病(癌症)进展。在一个具体实施例中，在用本文所述介体接种后，产生响应于原始疫苗制剂中不存在的肿瘤相关抗原的T细胞，表明用衍生自肿瘤细胞的抗原已发生了第二轮T细
胞预备(priming)。
[0038] 如本文所用，术语“外源的”是指在特定生物体(例如人)中或在特定生物体(例如，器官、组织或细胞，例如人类细胞)内的特定位置(例如，多肽、肽核酸或辅因子)中未发现的分子。外源物质包括那些从外部来源提供给生物体或从其提取的培养物质的材料。
[0039] 所谓“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。所述部分含有参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
[0040] 如本文所用，术语“免疫应答”是指受试者的免疫系统对被免疫系统识别为外来的或异源的一种或多种抗原(例如，免疫原性蛋白质或肽)及/或抗原的表位的应答或反应。免疫应答包括细胞介导的免疫应答(即，效应T细胞介导的应答，如抗原特异性或非特异性T细胞，如CD8+T细胞、Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞)以及体液免疫应答(即，以B细胞活化和抗原特异性抗体的产生为特征的应答)。术语“免疫应答”包括对抗原或免疫原(例如，肿瘤相关抗原及/或其相关表位)的先天免疫应答以及获得性免疫的结果的记忆应答，并且可涉及B细胞或T细胞，或两者兼而有之。
[0041] 术语“单离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指在其天然状态下发现的通常伴随或与其相关的组分不同程度地自由的材料。“单离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示高于单离的分离程度。“纯化的”或“生物学上纯的”蛋白质充分地不含其他材料，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学性质或引起其他不利后果。也就是说，如果核酸或肽在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品，则纯化核酸或肽。纯度和均匀性通常使用分
析化学技术测定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以表示在电泳凝胶中基本上产生一条带的核酸、蛋白质或肽。对于可以进行修饰的蛋白质，例如磷酸化或糖基化，不同的修饰可以产生不同的单离蛋白质，其可以单独纯化。
析化学技术测定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以表示在电泳凝胶中基本上产生一条带的核酸、蛋白质或肽。对于可以进行修饰的蛋白质，例如磷酸化或糖基化，不同的修饰可以产生不同的单离蛋白质，其可以单独纯化。
[0042] 所谓“单离的多核苷酸”是指不含基因的核酸(例如DNA)，所述基因在本发明的核酸分子衍生的生物体的天然存在的基因组中位于基因的侧翼。因此，所述术语包括，例如，并入介体中的重组DNA；并入自主复制的质粒或病毒；或并入原核生物或真核生物的基因组DNA；或者作为与其他序列无关的单独的分子存在(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，所述术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
[0043] “单离的多肽”是指已经与天然伴随的组分单离的多肽。通常，当多肽至少60％(重量)不含与其天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，则单离多肽。优选地，制剂为所需多肽的至少75％、或至少85％、或至少90％、或至少99％重量。例如，通过从天然来源提取、通过表达编码这种多肽的重组核酸；或通过化学合成蛋白质，可以获得单离的多肽。纯度可通过任何合适的方法测量，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
[0044] 所谓“标记”是指具有与疾病或病症相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。
[0045] 本文提及的“新表位”是先前未被免疫系统识别的新形成的(或新的)表位(例如，抗原决定簇)。新表位包括新抗原上的表位，所述新抗原是新形成的抗原。在致癌细胞中发现了通常与肿瘤抗原相关的新抗原。在所述病毒介体中，可以产生大量具有突变的新表位
的蛋白质并，将其分泌到免疫系统的抗原呈递细胞的细胞质中，于此处它们被处理并用于
激活肿瘤特异性T细胞，其接着可以瞄准癌细胞并摧毁它们。
的蛋白质并，将其分泌到免疫系统的抗原呈递细胞的细胞质中，于此处它们被处理并用于
激活肿瘤特异性T细胞，其接着可以瞄准癌细胞并摧毁它们。
[0046] 如本文所用，“获得”如“获得剂”包括合成、购买或以其他方式获取剂。
[0047] 所谓“多核苷酸”是指编码一种或多种多肽的核酸分子，例如双链(ds)DNA多核苷酸、单链(ss)DNA多核苷酸、dsRNA多核苷酸或ssRNA多核苷酸。所述术语包括正义(即，蛋白质编码)能够被转录以形成RNA转录物的DNA多核苷酸，，所述RNA转录物可以在一个或多个
任选的RNA处理事件(例如，通过RNA剪接的内含子切除，或5'帽或3'聚腺苷酸尾的连接)后
翻译以产生多肽。)。所述术语另外包括正义RNA多核苷酸，其能够在一个或多个任选的RNA处理事件后直接翻译以产生多肽。如本文所用，多核苷酸可以包含在病毒介体中，例如辛德毕斯病毒介体。如本文所用的“小基因”是指分子工程化的多核苷酸，例如含有编码不同组分的序列的多基因构建体，其被设计成编码抗原的至少一者，优选两个或更多个表位，例如肿瘤相关的抗原(TAA)，或两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个，优选两个或更多个表位。两个或更多个表位可以来自相同的肿瘤相关抗原或来自不同的肿瘤相关抗原。除了表
位编码序列之外，小基因多核苷酸可以进一步包含核酸序列，其包括，但不限于，框架或基序序列(例如，一个或多个酶切位点)和处理序列，例如核糖体结合位点、信号序列(例如，内质网信号序列)、5'侧翼区和3'终止密码子序列。多核苷酸还可含有编码其他抗原(例如肿
瘤相关抗原)、细胞受体和免疫刺激或免疫调节分子的核酸序列，例如细胞因子、趋化因子、细胞信号分子等。一些或所有前述序列可以包括在多核苷酸中。小基因可以是多核苷酸，例如用作产生正义多核苷酸的模板的负义DNA或RNA多核苷酸。
任选的RNA处理事件(例如，通过RNA剪接的内含子切除，或5'帽或3'聚腺苷酸尾的连接)后
翻译以产生多肽。)。所述术语另外包括正义RNA多核苷酸，其能够在一个或多个任选的RNA处理事件后直接翻译以产生多肽。如本文所用，多核苷酸可以包含在病毒介体中，例如辛德毕斯病毒介体。如本文所用的“小基因”是指分子工程化的多核苷酸，例如含有编码不同组分的序列的多基因构建体，其被设计成编码抗原的至少一者，优选两个或更多个表位，例如肿瘤相关的抗原(TAA)，或两种或更多种肿瘤相关抗原的一个或多个，优选两个或更多个表位。两个或更多个表位可以来自相同的肿瘤相关抗原或来自不同的肿瘤相关抗原。除了表
位编码序列之外，小基因多核苷酸可以进一步包含核酸序列，其包括，但不限于，框架或基序序列(例如，一个或多个酶切位点)和处理序列，例如核糖体结合位点、信号序列(例如，内质网信号序列)、5'侧翼区和3'终止密码子序列。多核苷酸还可含有编码其他抗原(例如肿
瘤相关抗原)、细胞受体和免疫刺激或免疫调节分子的核酸序列，例如细胞因子、趋化因子、细胞信号分子等。一些或所有前述序列可以包括在多核苷酸中。小基因可以是多核苷酸，例如用作产生正义多核苷酸的模板的负义DNA或RNA多核苷酸。
[0048] 如本文所用，短语“药学上可接受的”是指当给药患者(例如，人类患者)时通常不会产生过敏或其他不良反应，例如胃部不适，头晕等的生理学上可耐受的分子实体、生物制品和组合物。
[0049] 如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗”等是指降低在没有但有易发展某种疾病或病况风险的受试者中发生病症或病况的可能性。
[0050] 如本文所用，术语“假型化”是指含有一种或多种外来病毒结构蛋白的病毒介体，例如包膜糖蛋白。假型化病毒可以是其中包膜病毒的包膜糖蛋白或无包膜病毒的衣壳蛋白源自不同于原始病毒基因组来源和基因组复制装置的病毒。(D.A.Sanders,2002,
Curr.Opin.Biotechnol.,13:437-442)。假型化病毒的外源病毒包膜蛋白可用于改变宿主
趋向性或增加或降低病毒颗粒的稳定性。假型化病毒介体的实例包括含有一种或多种并非
天然存在于野生型逆转录病毒或慢病毒外部的包膜糖蛋白，例如一种或多种源自甲病毒的
蛋白质(例如，辛德毕斯病毒，例如辛德毕斯-ZZ E2蛋白(Morizono,K.等人,2010,
J.Virol.,84(14):6923-6934)，或辛德毕斯E1，E2及/或E3蛋白)。假型化病毒介体可以感染细胞，并表达和产生由病毒介体中包含的多核苷酸编码的蛋白质，例如“小基因”。
Curr.Opin.Biotechnol.,13:437-442)。假型化病毒的外源病毒包膜蛋白可用于改变宿主
趋向性或增加或降低病毒颗粒的稳定性。假型化病毒介体的实例包括含有一种或多种并非
天然存在于野生型逆转录病毒或慢病毒外部的包膜糖蛋白，例如一种或多种源自甲病毒的
蛋白质(例如，辛德毕斯病毒，例如辛德毕斯-ZZ E2蛋白(Morizono,K.等人,2010,
J.Virol.,84(14):6923-6934)，或辛德毕斯E1，E2及/或E3蛋白)。假型化病毒介体可以感染细胞，并表达和产生由病毒介体中包含的多核苷酸编码的蛋白质，例如“小基因”。
[0051] 所谓“减少”是指至少5％、10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
[0052] 所谓“参考”是指标准或对照条件。
[0053] 所谓“特异性地结合”是指识别和结合本发明多肽，但实质上不识别和结合样本中其他分子的化合物或抗体，例如天然包含本发明多肽的生物样本。
[0054] 所谓“受试者”是指哺乳动物，其包括，但不限于，人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、牛、马、犬、绵羊或猫科动物。受试者通常是接受如本文所述特定疾病或病况的治疗(例如，细胞增殖疾病，例如癌症或肿瘤)的患者，例如人类患者。受试者和患者的实例包括接受这些疾病或病况的治疗或有患这些疾病或病症的风险的哺乳动物，例如人类。
[0055] 如本文所用，术语“自杀基因”是指编码能够例如通过细胞凋亡诱导细胞死亡的多肽的基因。自杀基因可以通过编码能够将前药转化为细胞毒性分子的蛋白质或肽来起作用。例示性自杀基因包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)等。
[0056] 本文提供的范围被理解为所述范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或
50所组成群组的任何数字、数字组合或子范围。
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或
50所组成群组的任何数字、数字组合或子范围。
[0057] 如本文所用，术语“治疗有效量”是指足给药需要治疗的患者足以治疗、诊断、预防及/或延迟疾病、病症及/或病况的一种或多种症状发作的治疗剂的量。在一些情况下，治疗有效量还可以指预防性地(例如，在发展成熟疾病之前)给药有发展疾病(例如，癌症或肿瘤)或其症状的风险的受试者的一定量的治疗剂。
[0058] 如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减轻或改善与其相关的病症及/或症状。将理解，尽管不排除，但治疗病症或病况不需要完全消除与其相关的病症、病况或症状。“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”可以指治疗性治疗，其中目的是预防或减缓(减轻或减少)不希望的生理变化或病症，例如细胞增殖病症如癌症的进展。无论是可侦测的还是不可侦测的，有益或期望的临床结果包括，但不限于，症状的缓解、疾病程度的减少、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解以及缓解(无论是部分还是全部)。那些需要治疗的患者包括已患有病况
或病症者，以及易患病况或病症者或者要预防病况或病症者。
或病症者，以及易患病况或病症者或者要预防病况或病症者。
[0059] 如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由癌细胞表达的蛋白质、多肽或肽，例如实体瘤内的细胞。肿瘤相关抗原包括在癌细胞表面上表达或相对于非癌细胞过度表达的蛋白质或肽抗原，以及由野生型蛋白质突变产生的蛋白质。由野生型细胞蛋白突变
产生的蛋白质包括在癌症或肿瘤细胞中发生的新表位和新抗原，例如突变的k-Ras蛋白。因此，肿瘤相关抗原包括在癌症或肿瘤细胞表面上表达的细胞表面受体蛋白，例如膜结合蛋
白。肿瘤相关抗原还包括在癌症或肿瘤细胞内表达的细胞内，例如细胞质、细胞核或膜结合蛋白。肿瘤相关抗原可以是肿瘤特异性的，在这种情况下，抗原的表达局限于特定类型的癌细胞。或者，肿瘤相关抗原可能是几种癌症共有的，因此在多种癌细胞类型的表面上表达。
产生的蛋白质包括在癌症或肿瘤细胞中发生的新表位和新抗原，例如突变的k-Ras蛋白。因此，肿瘤相关抗原包括在癌症或肿瘤细胞表面上表达的细胞表面受体蛋白，例如膜结合蛋
白。肿瘤相关抗原还包括在癌症或肿瘤细胞内表达的细胞内，例如细胞质、细胞核或膜结合蛋白。肿瘤相关抗原可以是肿瘤特异性的，在这种情况下，抗原的表达局限于特定类型的癌细胞。或者，肿瘤相关抗原可能是几种癌症共有的，因此在多种癌细胞类型的表面上表达。
[0060] 如本文所用，术语“介体”是指核酸(例如DNA介体，例如质粒)、RNA介体、病毒或其他合适的复制子(例如病毒介体)。已经开发了多种介体以用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。介体可以含有包含感兴趣的基因(例如，编码肿瘤相关抗原
及/或其表位的基因)的多核苷酸序列，以及例如能够调节转录，翻译及/或这些多核苷酸序列整合到细胞的基因组中的其他序列组件。介体可含有调节序列，例如针对基因转录的启
动子，例如亚基因组启动子区和增强子区。介体可含有增强这些基因的翻译速率或改善由
基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列组件可包括例如5'和3'
非翻译区、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)及/或多腺苷酸
化信号位点，以针对表达介体上携带的基因的有效率转录。
及/或其表位的基因)的多核苷酸序列，以及例如能够调节转录，翻译及/或这些多核苷酸序列整合到细胞的基因组中的其他序列组件。介体可含有调节序列，例如针对基因转录的启
动子，例如亚基因组启动子区和增强子区。介体可含有增强这些基因的翻译速率或改善由
基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的多核苷酸序列。这些序列组件可包括例如5'和3'
非翻译区、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)及/或多腺苷酸
化信号位点，以针对表达介体上携带的基因的有效率转录。
[0061] 如本文所用，术语“溶媒”是指药物组合物的溶剂、稀释剂或载体组分。
[0062] 所谓“实质上相同”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述任何一种核酸序列)具有至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这样的序列与用于比较的序列于，例如，在指定的比较窗口上，有至少60％，优选至少70％，更优选80％或85％，最优选90％，95％或甚至99％相同的氨基酸水平或核酸。可以使用Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.,48:443的同源性比对算法进行最佳比对。两
个肽或多肽序列实质上相同的表示是一个肽或多肽与针对第二肽或多肽产生的特异性抗
体具有免疫反应性，尽管这两个多肽不需要这种交叉反应性被认为是实质上相同的。因此，肽或多肽与第二肽或多肽实质上相同，例如，其中两者仅通过保守取代而不同。“实质上相似”的肽或多肽共享如上所述序列，不同之处在于不相同的残基位置可因保守氨基酸变化
而不同。保守取代通常包括，但不限于，以下群组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙氨酸和酪氨酸，以及本领域技术人员已知的其他者。
个肽或多肽序列实质上相同的表示是一个肽或多肽与针对第二肽或多肽产生的特异性抗
体具有免疫反应性，尽管这两个多肽不需要这种交叉反应性被认为是实质上相同的。因此，肽或多肽与第二肽或多肽实质上相同，例如，其中两者仅通过保守取代而不同。“实质上相似”的肽或多肽共享如上所述序列，不同之处在于不相同的残基位置可因保守氨基酸变化
而不同。保守取代通常包括，但不限于，以下群组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙氨酸和酪氨酸，以及本领域技术人员已知的其他者。
[0063] 序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology
Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/
PRETTYBOX程序)来测量。此类软件通过将同源性程度指定为各种取代、缺失及/或其他修饰而匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下群组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的例示性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/
PRETTYBOX程序)来测量。此类软件通过将同源性程度指定为各种取代、缺失及/或其他修饰而匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下群组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的例示性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
[0064] 可用于本发明方法的多核苷酸和病毒核酸分子包括编码本文所述病毒介体组分的任何核酸分子和由病毒介体编码的多肽产物，如甲病毒介体、辛德毕斯病毒介体等，如以及其肽或其成分。此类核酸分子不需要与病毒介体核酸序列100％相同，但通常表现出实质的同一性。与病毒介体序列具有实质同一性的多核苷酸通常能够与病毒介体核酸分子的至
少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分
子。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂
交。“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列(例如，本文所述基因或核酸序列)或其部分之间形成双链分子的核酸分子对(参见，例如Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)
Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分
子。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂
交。“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列(例如，本文所述基因或核酸序列)或其部分之间形成双链分子的核酸分子对(参见，例如Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)
Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
[0065] 例如，严格的盐浓度将通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在不存在有
机溶剂(例如甲酰胺)的情况下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，更优选至少
约50％甲酰胺的存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件通常包括至少约30℃，更优
选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。改变其他参数，例如杂交时间、去污剂浓度(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，以及载体DNA的包含或排除，是本领域技术人员熟知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现各种严格程度。在优选的具体实施例中，杂交将在30℃下
在750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的具体实施例中，杂交将在37
℃，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中发生。在最优选的具体实施例中，杂交将在42℃，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。对于本领域技术人员来说，对这些条件的有用变化是显而易见的。
机溶剂(例如甲酰胺)的情况下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，更优选至少
约50％甲酰胺的存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件通常包括至少约30℃，更优
选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。改变其他参数，例如杂交时间、去污剂浓度(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，以及载体DNA的包含或排除，是本领域技术人员熟知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现各种严格程度。在优选的具体实施例中，杂交将在30℃下
在750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的具体实施例中，杂交将在37
℃，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中发生。在最优选的具体实施例中，杂交将在42℃，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。对于本领域技术人员来说，对这些条件的有用变化是显而易见的。
[0066] 对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性方面变化。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过升高温度来增加洗涤严
格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，最优选小于约
15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃的温度，更
优选至少约42℃，甚至更优选至少约68℃。在优选的具体实施例中，洗涤步骤将是在25℃，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的具体实施例中，洗涤步骤将在
42℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的具体实施例中，洗涤步骤将在68℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。对于本领域技术人员来说，对这些条件的其他变化将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness
(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in
Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to
Molecular Cloning Techniqus,1987，Academic Press,New York)；和Sambrook等人,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，最优选小于约
15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃的温度，更
优选至少约42℃，甚至更优选至少约68℃。在优选的具体实施例中，洗涤步骤将是在25℃，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的具体实施例中，洗涤步骤将在
42℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的具体实施例中，洗涤步骤将在68℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。对于本领域技术人员来说，对这些条件的其他变化将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness
(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in
Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to
Molecular Cloning Techniqus,1987，Academic Press,New York)；和Sambrook等人,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
[0067] 如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上相同，则在它们仍然实质相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格的杂交条件下杂交。“中等严格杂交条件”的非限制性实例包括在37℃，在40％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS的缓冲液中杂交，以及在45℃，在1×SSC中洗涤。阳性杂交至少两次背景。那些普通技术人员将容易认识到，可以利用替代的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。
[0068] 所谓“直系同源基因”是指与参考蛋白质或来自另一生物体的核酸序列高度相关的生物体的任何多肽或核酸分子。相关程度可以表示为参考蛋白质会识别序列的概率，例
如，在blast检索中。参考序列会识别随机序列为直向同源基因的概率极低，小于e-10、e-20、e-30、e-40、e-50、e-75、e-100。技术人员理解直系同源基因可能在功能上与参考蛋白质或核酸序列相关。换句话说，预期直向同源基因及其参考分子在它们各自的生物体(例如小鼠和人类直系同源基因)中实现相似的(如果不是等同的)功能作用。
如，在blast检索中。参考序列会识别随机序列为直向同源基因的概率极低，小于e-10、e-20、e-30、e-40、e-50、e-75、e-100。技术人员理解直系同源基因可能在功能上与参考蛋白质或核酸序列相关。换句话说，预期直向同源基因及其参考分子在它们各自的生物体(例如小鼠和人类直系同源基因)中实现相似的(如果不是等同的)功能作用。
[0069] 当与参考序列比对时，直系同源基因不需要与参考序列具有特定程度的氨基酸序列同一性。例如，蛋白质直向同源基因可以在蛋白质的整个长度上共享显着的氨基酸序列
同一性，或者，可以仅在蛋白质的单个功能重要的结构域上共享显着的氨基酸序列同一性。
这些功能重要的结构域可以通过基因突变或通过结构-功能测定法来定义。可以使用本领
域实践的方法鉴定直系同源基因。可以使用本领域技术人员熟知的方法测定直向同源基因
的功能作用。例如，可以使用生物化学、免疫学或酶测定法；或转化救援在体内或体外测定功能。或者，生物测定法可以在组织培养中进行；还可以通过基因失活(例如，通过RNAi、siRNA或基因敲除)，或基因过度表达以及通过其他方法来测定功能。
同一性，或者，可以仅在蛋白质的单个功能重要的结构域上共享显着的氨基酸序列同一性。
这些功能重要的结构域可以通过基因突变或通过结构-功能测定法来定义。可以使用本领
域实践的方法鉴定直系同源基因。可以使用本领域技术人员熟知的方法测定直向同源基因
的功能作用。例如，可以使用生物化学、免疫学或酶测定法；或转化救援在体内或体外测定功能。或者，生物测定法可以在组织培养中进行；还可以通过基因失活(例如，通过RNAi、siRNA或基因敲除)，或基因过度表达以及通过其他方法来测定功能。
[0070] 除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括在内。除非在上下文中明确说明或显而易见，否则如本文所用，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述”应理解为单数或复数。
[0071] 如本文所用，术语“约”或“近似”意指在所述值类型和用于测量所述值的方法的可接受误差范围内。例如，这些术语可表示在给定值或范围的20％内，更优选地在10％内，并且最优选地在5％内。更具体地，“约”可以理解为在所述值或范围的20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％。或者，特别是在生物系统中，术语“约”表示在一个对数单位内(即，一个数量级)，优选在给定值的两倍之内。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常耐受范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。除非从上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
[0073] 图1A和1B描绘了编码各种组分的多核苷酸(小基因)的设计和序列的示意图，所述组分包括一种或多种(例如3种)例如由如本文所述酶切位点(例如，弗林蛋白酶)分离的肿
瘤相关抗原的两个或更多个，例如3个。图1A显示了用于构建编码3种肿瘤相关抗原的多个
(3)表位的辛德毕斯病毒介体的多核苷酸的示意图。多核苷酸构建体，在图1A中称为“SV/
MG”，在其5'端含有Xba1限制酶位点(TCTAGA，SEQ ID NO：8)，及在其3'端含有Apa1限制酶位点(GGGCCC，SEQ ID NO：9)，用于将多核苷酸插入辛德比斯病毒介体'骨架'。从5'到3'，多核苷酸含有核糖体结合位点起始密码子、内质网信号序列、NY-ESO-1肿瘤相关抗原的表位、
gp70糖蛋白肿瘤相关的表位的抗原、生存素肿瘤相关抗原的表位、分离每个肿瘤相关抗原
表位和终止密码子的弗林蛋白酶切割位点。图1B阐述了图1A中描述的多核苷酸(小基因)
(SEQ ID NO：10)的多核苷酸序列和由多核苷酸编码的多肽和肽组分的相应氨基酸序列
(SEQ ID NO：11)。多核苷酸的组分基因和编码的多肽/多肽的肽在以下图1B中的序列识别。
瘤相关抗原的两个或更多个，例如3个。图1A显示了用于构建编码3种肿瘤相关抗原的多个
(3)表位的辛德毕斯病毒介体的多核苷酸的示意图。多核苷酸构建体，在图1A中称为“SV/
MG”，在其5'端含有Xba1限制酶位点(TCTAGA，SEQ ID NO：8)，及在其3'端含有Apa1限制酶位点(GGGCCC，SEQ ID NO：9)，用于将多核苷酸插入辛德比斯病毒介体'骨架'。从5'到3'，多核苷酸含有核糖体结合位点起始密码子、内质网信号序列、NY-ESO-1肿瘤相关抗原的表位、
gp70糖蛋白肿瘤相关的表位的抗原、生存素肿瘤相关抗原的表位、分离每个肿瘤相关抗原
表位和终止密码子的弗林蛋白酶切割位点。图1B阐述了图1A中描述的多核苷酸(小基因)
(SEQ ID NO：10)的多核苷酸序列和由多核苷酸编码的多肽和肽组分的相应氨基酸序列
(SEQ ID NO：11)。多核苷酸的组分基因和编码的多肽/多肽的肽在以下图1B中的序列识别。
[0074] 图2A和2B显示了用编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体处理携带CT26衍生的肿瘤的小鼠后的治疗方案和肿瘤生长图。图2A描绘了用于对小鼠模型中携带生
长中肿瘤的CT26肿瘤小鼠模型给药含有图1A和1B的多核苷酸的辛德毕斯病毒介体的治疗
方案。荷瘤。图2B显示了用编码多个表位的辛德毕斯病毒介体(即，图1A的SV/MA(其中多个TAA包括NY-ESO-1、生存素和gp70))处理肿瘤动物后与对照相比肿瘤生长随天数变化的图，如下文实施例2中所述。与对照相比(对照：未接受任何辛德毕斯病毒介体的小鼠；SV/LacZ：
编码β-半乳糖苷酶的辛德毕斯病毒介体，无关的细菌酶；及SV/NY-ESO-1，编码NY-ESO-1肿瘤相关抗原的阳性对照)、编码NY-ESO-1的多个肿瘤相关抗原表位的SV/MG病毒介体、生存
素及gp70在注射入肿瘤动物后非常有效地抑制CT26肿瘤细胞的生长(图2B)。显示在图2B中
的图表下方是指示如上所述处理的小鼠的对照组和实验组中肿瘤生长的相对光单位(RLU)
值。
长中肿瘤的CT26肿瘤小鼠模型给药含有图1A和1B的多核苷酸的辛德毕斯病毒介体的治疗
方案。荷瘤。图2B显示了用编码多个表位的辛德毕斯病毒介体(即，图1A的SV/MA(其中多个TAA包括NY-ESO-1、生存素和gp70))处理肿瘤动物后与对照相比肿瘤生长随天数变化的图，如下文实施例2中所述。与对照相比(对照：未接受任何辛德毕斯病毒介体的小鼠；SV/LacZ：
编码β-半乳糖苷酶的辛德毕斯病毒介体，无关的细菌酶；及SV/NY-ESO-1，编码NY-ESO-1肿瘤相关抗原的阳性对照)、编码NY-ESO-1的多个肿瘤相关抗原表位的SV/MG病毒介体、生存
素及gp70在注射入肿瘤动物后非常有效地抑制CT26肿瘤细胞的生长(图2B)。显示在图2B中
的图表下方是指示如上所述处理的小鼠的对照组和实验组中肿瘤生长的相对光单位(RLU)
值。
[0075] 图3显示了如下文实施例3中所述qPCR后含有DNA样本的染色琼脂糖凝胶的UV影像。用对SV RNA基因组特异的寡核苷酸引物进行qPCR。在凝胶中，泳道(-)含有来自未感染BHK的cDNA(对照)；泳道(+)含有pSV/MG-CT.26DNA质粒(对照)；泳道M含有100碱基对的梯形标记(对照)。标记为-4、-3、-2、-1和0的泳道分别反映了用于感染BHK细胞的SV/MG-CT.26病毒的稀释度10-4、10-3、10-2、10-1和100。qPCR片段的大小(～200碱基对)与用质粒DNA对照获得的大小一致。因为向细胞中加入100μl病毒，所以10-4稀释的病毒RNA的出现表明滴度为
5
10个病毒颗粒/ml。该滴度与由qPCR CT(阈值循环)值确定的滴度一致。
5
10个病毒颗粒/ml。该滴度与由qPCR CT(阈值循环)值确定的滴度一致。
[0076] 图4A至4C显示用编码LacZ(代表性肿瘤相关抗原(本文中为“SV/TAA”))的辛德毕斯病毒介体处理肿瘤(LacZ+CT26肿瘤)小鼠，相对于对照实质延长存活，诱导表位扩散，并绕过TAA流失。图4A显示LacZ+CT26荷瘤小鼠用SV/LacZ辛德毕斯病毒介体、编码GFP蛋白
(SV/GFP)的对照SV介体或培养基/PBS(空白)处理，并且仅用SV/LacZ辛德毕斯病毒处理病
毒介体诱导完全肿瘤缓解(100％动物存活)至少60天。数据显示为Kaplan-Meier生存图。显示曲线之间的显着值*P<0.05；**P<0.01。图4B使用四聚体(Altman,JD等人,1996,Science,
274(5284):94-96)证明来自SV/LacZ处理的小鼠的脾细胞含有对LacZ(未显示)和gp70(由
CT26细胞表达的内源性肿瘤相关抗原)特异的CD8+T细胞，因此表明发生了表位扩散。图4C
显示了对照小鼠(“初始”)和注射了SV/LacZ病毒介体后战胜其肿瘤存活的小鼠的照片，如图4所示。图4A(“SV/LacZ幸存者”)证明LacZ(-)CT26肿瘤在初始小鼠中生长，但在用编码LacZ的SV/LacZ病毒介体(SV/LacZ幸存小鼠)治疗的小鼠中不生长。这些结果支持SV/LacZ
诱导的表位扩散成功抵消肿瘤相关抗原(即，LacZ)表达缺失的发现。
(SV/GFP)的对照SV介体或培养基/PBS(空白)处理，并且仅用SV/LacZ辛德毕斯病毒处理病
毒介体诱导完全肿瘤缓解(100％动物存活)至少60天。数据显示为Kaplan-Meier生存图。显示曲线之间的显着值*P<0.05；**P<0.01。图4B使用四聚体(Altman,JD等人,1996,Science,
274(5284):94-96)证明来自SV/LacZ处理的小鼠的脾细胞含有对LacZ(未显示)和gp70(由
CT26细胞表达的内源性肿瘤相关抗原)特异的CD8+T细胞，因此表明发生了表位扩散。图4C
显示了对照小鼠(“初始”)和注射了SV/LacZ病毒介体后战胜其肿瘤存活的小鼠的照片，如图4所示。图4A(“SV/LacZ幸存者”)证明LacZ(-)CT26肿瘤在初始小鼠中生长，但在用编码LacZ的SV/LacZ病毒介体(SV/LacZ幸存小鼠)治疗的小鼠中不生长。这些结果支持SV/LacZ
诱导的表位扩散成功抵消肿瘤相关抗原(即，LacZ)表达缺失的发现。
[0077] 图5A和5B显示了成像和流式细胞术的组合，以评估用编码至少一种肿瘤相关抗原的辛德毕斯病毒介体(SV/荧光素酶作为“SV/TAA”)对动物进行治疗/免疫疗法的效果。图5A显示在用编码荧光素酶的辛德毕斯病毒介体作为肿瘤相关抗原注射动物后，用于非侵入性
地和纵向地确定代表性肿瘤相关抗原(萤火虫荧光素酶)的表达位点的体内成像结果。如在
动物中评估的T细胞活化标记物CD69表达水平所证明，识别为荧光素酶(作为TAA)递送的位
点的纵向淋巴结(MLN)也被发现是有效CD8+T细胞活化的位点。ILN＝对照腹股沟淋巴结(图
5B)。编码荧光素酶的使用允许在动物模型中测量肿瘤生长，其中肿瘤细胞被分子工程化
(例如，转染)以表达荧光素酶基因，其允许肿瘤细胞成像并评估包含这些细胞的肿瘤的生
长。
地和纵向地确定代表性肿瘤相关抗原(萤火虫荧光素酶)的表达位点的体内成像结果。如在
动物中评估的T细胞活化标记物CD69表达水平所证明，识别为荧光素酶(作为TAA)递送的位
点的纵向淋巴结(MLN)也被发现是有效CD8+T细胞活化的位点。ILN＝对照腹股沟淋巴结(图
5B)。编码荧光素酶的使用允许在动物模型中测量肿瘤生长，其中肿瘤细胞被分子工程化
(例如，转染)以表达荧光素酶基因，其允许肿瘤细胞成像并评估包含这些细胞的肿瘤的生
长。
[0078] 图6A至6D显示用PBS注射具有LacZ+CT26肿瘤的小鼠(对照，图6A)或编码LacZ作为肿瘤相关抗原(SV/LacZ)的辛德毕斯病毒介体(图6B-6D)后肿瘤生长对时间(天)的图。与对
照小鼠的结果相比(图6A)，在耗尽CD4+T细胞(图6B)、CD8+T细胞(图6C)或两者(图6D)的小
鼠中未观察到SV/LacZ对皮下肿瘤的治疗效果(即，通过卡尺测量的肿瘤生长减少)。
照小鼠的结果相比(图6A)，在耗尽CD4+T细胞(图6B)、CD8+T细胞(图6C)或两者(图6D)的小
鼠中未观察到SV/LacZ对皮下肿瘤的治疗效果(即，通过卡尺测量的肿瘤生长减少)。
具体实施方式
[0079] 本发明提供了编码一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个表位的多核苷酸和病毒介体，特别是甲病毒介体，以优选在HLA/MHC抗原的背景下，在受试者中诱导针对受试者癌症或肿瘤表达的多种肿瘤相关抗原的有效免疫应答。如上所述多核苷酸和病毒介体也在给
药后导致表位扩散，其用于增强针对多种TAA的免疫应答。
药后导致表位扩散，其用于增强针对多种TAA的免疫应答。
[0080] 如下文更详细报道，本发明至少部分基于以下发现：编码多种肿瘤相关抗原(例如，NY-1ESO、生存素、gp70)的辛德毕斯载体导致荷瘤小鼠的长期存活，并产生针对多种肿瘤抗原的长效CD8+T细胞。显着地，用编码多种肿瘤相关抗原的辛德毕斯病毒介体治疗导致表位扩散，为肿瘤相关抗原流失或修饰的肿瘤逃逸问题提供了有希望的解决方案。由于
gp70是一种鼠逆转录病毒糖蛋白，因此对临床前研究特别有用。用于类似用途但衍生自人
病毒(慢病毒)的糖蛋白的实例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)的gp120和gp41包膜
蛋白或其片段。
gp70是一种鼠逆转录病毒糖蛋白，因此对临床前研究特别有用。用于类似用途但衍生自人
病毒(慢病毒)的糖蛋白的实例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)的gp120和gp41包膜
蛋白或其片段。
[0081] 本文所述分子工程化病毒介体提供了有效率且有效的递送系统，其设计用于携带一种或多种肿瘤抗原(也称为肿瘤相关抗原)的遗传信息，作为肿瘤相关抗原的多个选定表
位，包括新表位，并且启动并延续特定的免疫应答，最终产生被激活以特异性地杀死癌症或肿瘤的细胞毒性T细胞(例如，效应CD8+T细胞)。
位，包括新表位，并且启动并延续特定的免疫应答，最终产生被激活以特异性地杀死癌症或肿瘤的细胞毒性T细胞(例如，效应CD8+T细胞)。
[0082] 本发明一般地涉及基于病毒介体的组合物和方法，其可用于治疗有此需要的受试者(例如患有癌症的患者)的癌症和肿瘤生成及/或其症状。利用病毒介体(其被设计用于携
带编码如本文所述一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个，例如两个或更多个表位的多核
苷酸)的方法涉及给药受试者(例如，哺乳动物，例如人类)治疗有效量的病毒介体(即，病毒颗粒)，或包含病毒介体或颗粒的药物组合物，特别是用于引发T细胞介导的对表达肿瘤相
关抗原或其表位的癌症或肿瘤的免疫应答。
带编码如本文所述一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个，例如两个或更多个表位的多核
苷酸)的方法涉及给药受试者(例如，哺乳动物，例如人类)治疗有效量的病毒介体(即，病毒颗粒)，或包含病毒介体或颗粒的药物组合物，特别是用于引发T细胞介导的对表达肿瘤相
关抗原或其表位的癌症或肿瘤的免疫应答。
[0083] 设计本文所述病毒介体以编码和表达被T细胞受体识别的肿瘤相关抗原的多个表位，例如氨基酸序列(即，“T细胞表位”)。病毒介体表达多个表位。本发明的多种病毒介体的多个表位的表达可以增加触发对多种肿瘤抗原的免疫应答的可能性，并且还包括对具有不
同HLA单倍型的受试者的治疗。此类病毒介体产物也可以设计成含有和表达对T细胞受体具
有最佳亲和力的肿瘤相关抗原的表位。因为本文所述多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒被设
计为携带一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位以及免疫刺激和免疫调节分子，所以这些产
物能够靶向多种癌症和肿瘤类型。
同HLA单倍型的受试者的治疗。此类病毒介体产物也可以设计成含有和表达对T细胞受体具
有最佳亲和力的肿瘤相关抗原的表位。因为本文所述多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒被设
计为携带一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位以及免疫刺激和免疫调节分子，所以这些产
物能够靶向多种癌症和肿瘤类型。
[0084] 因此，编码和表达根据本发明的肿瘤相关抗原的多个表位的病毒介体产品提供了治疗癌症和肿瘤的方法，其可以模拟或增强全生物诱导的免疫力并防止潜在的免疫病原性
或抑制性反应，其中多个一种或多种肿瘤相关抗原的表位被效应T细胞识别，以在接受治疗的受试者中产生有效的免疫应答。如本文所述病毒介体含有肿瘤相关抗原的多个表位，其
被设计为被效应T细胞识别，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞或两者。病毒介体可以同时诱导针对不同细胞毒性淋巴细胞(CTL)决定簇的反应，从而通过诱导攻击和杀死癌症和肿瘤细胞
以及防止癌症生长和复发所需的广度和强度的CD8+CTL反应来优化和最大化体内免疫原
性。
或抑制性反应，其中多个一种或多种肿瘤相关抗原的表位被效应T细胞识别，以在接受治疗的受试者中产生有效的免疫应答。如本文所述病毒介体含有肿瘤相关抗原的多个表位，其
被设计为被效应T细胞识别，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞或两者。病毒介体可以同时诱导针对不同细胞毒性淋巴细胞(CTL)决定簇的反应，从而通过诱导攻击和杀死癌症和肿瘤细胞
以及防止癌症生长和复发所需的广度和强度的CD8+CTL反应来优化和最大化体内免疫原
性。
[0085] 根据本发明，多核苷酸、病毒介体、病毒颗粒和细胞的设计以及含有这些产物的药物组合物编码和表达一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位，例如两个或多个表位，提供了可用于扩展活化T细胞库的生物产物。因此，这种活化的T细胞能够对表达肿瘤相关抗原及
其相关表位的癌症和肿瘤细胞起反应(例如杀死)，从而拓宽本文所述病毒介体(例如甲病
毒)的治疗适用性和功效，例如，甲病毒，(例如，辛德毕斯病毒(SV))、慢病毒、逆转录病毒或假型化载体，构建成含有编码一种或多种肿瘤相关抗原的两个或多个表位的多核苷酸。在
一个具体实施例中，每个肿瘤相关抗原表位被处理位点分开，例如酶切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点，以用于可重复处理表达的表位。
其相关表位的癌症和肿瘤细胞起反应(例如杀死)，从而拓宽本文所述病毒介体(例如甲病
毒)的治疗适用性和功效，例如，甲病毒，(例如，辛德毕斯病毒(SV))、慢病毒、逆转录病毒或假型化载体，构建成含有编码一种或多种肿瘤相关抗原的两个或多个表位的多核苷酸。在
一个具体实施例中，每个肿瘤相关抗原表位被处理位点分开，例如酶切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点，以用于可重复处理表达的表位。
[0086] 根据本发明，在给药患有癌症或肿瘤的受试者后，编码衍生自一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的多个(例如两个或更多个)表位的病毒介体和病毒颗粒或其药物组合物以
RNA的形式将多个表位传递给细胞。将RNA在细胞内处理成蛋白质和蛋白质片段，例如表位
肽，其以免疫系统的细胞(例如，巨噬细胞和树突细胞，在HLA/MHC抗原的背景下)优选呈递给CD8+T细胞的前体。免疫系统的辅助细胞的这种抗原呈递激活CD8+T细胞，其增殖以产生
大量杀死表达肿瘤相关抗原(包括新抗原)的特定表位的癌细胞和肿瘤细胞的细胞毒性T细
胞。因此，优选提供由本文所述多核苷酸和病毒介体编码的表位以引发增强的特异性地针
对癌细胞或表达一种或多种相应肿瘤相关抗原的实体瘤的免疫应答，特别是T细胞介导的
免疫应答。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体中包含的多核苷酸称为小基因或多核
苷酸构建体。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物可包含一种或多种，优选两种或更多种(例如，2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90或更多)来自相同肿瘤相关抗原的表位。例如，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物可包括相同表位的一个或多个拷贝。在一些具体实施例中，本发明的多
核苷酸、病毒介体或药物组合物可包含一种或多种，优选两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多)来自不同肿瘤相关抗原的表位。
RNA的形式将多个表位传递给细胞。将RNA在细胞内处理成蛋白质和蛋白质片段，例如表位
肽，其以免疫系统的细胞(例如，巨噬细胞和树突细胞，在HLA/MHC抗原的背景下)优选呈递给CD8+T细胞的前体。免疫系统的辅助细胞的这种抗原呈递激活CD8+T细胞，其增殖以产生
大量杀死表达肿瘤相关抗原(包括新抗原)的特定表位的癌细胞和肿瘤细胞的细胞毒性T细
胞。因此，优选提供由本文所述多核苷酸和病毒介体编码的表位以引发增强的特异性地针
对癌细胞或表达一种或多种相应肿瘤相关抗原的实体瘤的免疫应答，特别是T细胞介导的
免疫应答。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体中包含的多核苷酸称为小基因或多核
苷酸构建体。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物可包含一种或多种，优选两种或更多种(例如，2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90或更多)来自相同肿瘤相关抗原的表位。例如，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物可包括相同表位的一个或多个拷贝。在一些具体实施例中，本发明的多
核苷酸、病毒介体或药物组合物可包含一种或多种，优选两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、
7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多)来自不同肿瘤相关抗原的表位。
[0087] 肿瘤相关抗原(TAA)
[0088] 衍生自本发明的多核苷酸和病毒介体表达的表位的肿瘤相关抗原可以与例如细胞外或细胞内癌症或肿瘤相关联或由其表达，所述癌症或肿瘤例如，但不限于，卵巢癌、乳癌、睾丸癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌、头颈癌、食道癌、脑癌、咽癌、舌癌、滑膜细胞癌、神经母细胞瘤、子宫癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝肿瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、小细胞肺癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤和视网膜母细胞瘤。因此，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体和药物组合物可用于治疗患有一种或多种上述病症的受试者，例如人类患者。
[0089] 在一个具体实施例中，一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个不同表位可以与相同的癌症或肿瘤类型相关。在另一个具体实施例中，两个或更多个表位可以与不同癌症
类型的肿瘤相关抗原相关，例如，两种或更多种癌症类型。例如，在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包括由一种类型的癌症或肿瘤细胞(例如，卵巢癌细胞)表达的肿瘤相关抗原的一个或多个表位，以及衍生自由另一种癌症或肿瘤细胞表达的
肿瘤相关抗原(例如，乳癌细胞)的一个或多个表位。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包括在一种或多种癌症类型的表面上表达的肿瘤相关抗原的一
个或多个表位，或两个或更多个表位(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
19、18、19、20、30、40、50或更多种癌症或肿瘤类型)。在其他具体实施例中，肿瘤相关抗原的一个或多个表位或两个或更多个表位在一种或多种癌症或肿瘤类型中在细胞内表达。
类型的肿瘤相关抗原相关，例如，两种或更多种癌症类型。例如，在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包括由一种类型的癌症或肿瘤细胞(例如，卵巢癌细胞)表达的肿瘤相关抗原的一个或多个表位，以及衍生自由另一种癌症或肿瘤细胞表达的
肿瘤相关抗原(例如，乳癌细胞)的一个或多个表位。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包括在一种或多种癌症类型的表面上表达的肿瘤相关抗原的一
个或多个表位，或两个或更多个表位(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
19、18、19、20、30、40、50或更多种癌症或肿瘤类型)。在其他具体实施例中，肿瘤相关抗原的一个或多个表位或两个或更多个表位在一种或多种癌症或肿瘤类型中在细胞内表达。
[0090] 在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包括与上述癌症类型相关的一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位。下表1至28提供了各种肿瘤
相关抗原及其表位的非限制性列表，其可以由本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒编
码，或并入本发明的组合物中。肿瘤相关抗原及其表位涵盖人类肿瘤相关抗原及其表位和
肿瘤相关抗原及其表位的人类直系同源基因。例如，在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包含表1至28中任一表中列出的一种或多种肿瘤相关抗原的一
种或多种，或两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90或更多)表位。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包含表1至28中任一表中列出的氨基酸序列的一个或多个，或两个或更多个
(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多个)。
相关抗原及其表位的非限制性列表，其可以由本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒编
码，或并入本发明的组合物中。肿瘤相关抗原及其表位涵盖人类肿瘤相关抗原及其表位和
肿瘤相关抗原及其表位的人类直系同源基因。例如，在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包含表1至28中任一表中列出的一种或多种肿瘤相关抗原的一
种或多种，或两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65、70、75、80、85、90或更多)表位。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物包含表1至28中任一表中列出的氨基酸序列的一个或多个，或两个或更多个
(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多个)。
[0091] 在一个具体实施例中，由本发明的多核苷酸，病毒介体或病毒颗粒编码的肿瘤相关抗原的每个表位通过酶切割(或处理)位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)或本文所述其他
酶切割或处理位点分开。用于切割由根据本发明的多核苷酸和病毒介体编码的表位肽的其
他处理酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶、信号酶、弗林蛋白酶以及弗林蛋白酶相关的
内肽酶，例如PC1/2、PC4/5、PACE4以及PC7。这些酶识别处理信号(R/K)Xn(R/K)，其中Xn表示任何0至6个氨基酸的间隔区(SEQ ID NO：6)，(Seidah和Prat,2012,Nature Reviews Drug Discovery,11:367-383)。包含分开如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒中的每个编码表位的酶切割位点有利地允许在给药后处理表达的表位的再现性，这提供了用于治疗受
试者的更安全的产品。例如，具有根据本发明的多核苷酸含有散布在编码肿瘤相关抗原表
位的每个核酸序列之间的酶切割位点，确保表位的处理和产生是均匀的，尤其是在体内细
胞中，并且所设计的多肽可重复地操作以产生针对编码的目标抗原的适当的免疫应答(例
如，T细胞应答)。在一个具体实施例中，如本文所述，基于肿瘤相关抗原表位与MHC/HLA分子的结合来选择肿瘤相关抗原表位，例如，为了最佳呈递至效应T细胞，从而提供确保最佳免疫应答的再现性。
酶切割或处理位点分开。用于切割由根据本发明的多核苷酸和病毒介体编码的表位肽的其
他处理酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶、信号酶、弗林蛋白酶以及弗林蛋白酶相关的
内肽酶，例如PC1/2、PC4/5、PACE4以及PC7。这些酶识别处理信号(R/K)Xn(R/K)，其中Xn表示任何0至6个氨基酸的间隔区(SEQ ID NO：6)，(Seidah和Prat,2012,Nature Reviews Drug Discovery,11:367-383)。包含分开如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒中的每个编码表位的酶切割位点有利地允许在给药后处理表达的表位的再现性，这提供了用于治疗受
试者的更安全的产品。例如，具有根据本发明的多核苷酸含有散布在编码肿瘤相关抗原表
位的每个核酸序列之间的酶切割位点，确保表位的处理和产生是均匀的，尤其是在体内细
胞中，并且所设计的多肽可重复地操作以产生针对编码的目标抗原的适当的免疫应答(例
如，T细胞应答)。在一个具体实施例中，如本文所述，基于肿瘤相关抗原表位与MHC/HLA分子的结合来选择肿瘤相关抗原表位，例如，为了最佳呈递至效应T细胞，从而提供确保最佳免疫应答的再现性。
[0092] 在其他具体实施例中，一种或多种肿瘤相关抗原的表位各自被一个酶切割位点分开。在一些具体实施例中，表位不被酶切割位点分开，并且编码的序列在通过本文所述病毒介体递送至细胞后在细胞内切割。
[0093] 表1.卵巢癌
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100] 表2.乳癌
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106] 表3.睪丸癌
[0107]
[0108] 表4.胰脏癌
[0109]
[0110] 表5.肝癌
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115] 表6.结直肠癌
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121] 表7.甲状腺癌
[0122]
[0123]
[0124]
[0125] 表8.肺癌
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132] 表9.前列腺癌
[0133]
[0134]
[0135]
[0136] 表10.肾脏癌
[0137]
[0138]
[0139] 表11.黑色素瘤
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148] 表12.鳞状细胞癌
[0149]
[0150] 表13.慢性粒细胞白血病
[0151]
[0152]
[0153] 表14.急性淋巴细胞白血病
[0154]
[0155] 表15.急性髓性白血病
[0156]
[0157] 表16.慢性淋巴细胞白血病
[0158]
[0159]
[0160] 表17.早幼粒细胞白血病
[0161]
[0162] 表18.多发性骨髓瘤
[0163]
[0164]
[0165]
[0166] 表19.B细胞淋巴瘤
[0167]
[0168] 表20.膀胱癌
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173] 表21.头颈癌
[0174]
[0175]
[0176]
[0177] 表22.食道癌
[0178]
[0179]
[0180]
[0181] 表23.脑癌
[0182]
[0183] 表24.咽癌
[0184]
[0185] 表25.舌头肿瘤
[0186]
[0187]
[0188] 表26.滑膜细胞肉瘤
[0189]
[0190]
[0191]
[0192] 表27.神经母细胞瘤
[0193]
[0194]
[0195]
[0196] 表28.子宫癌
[0197]
[0198]
[0199]
[0200] TAA的其他实例在本领域中是已知的，并且例如在Reuschenbach等人,Cancer Immunol.Immunother.58:1535-1544(2009)；Parmiani等人,J.Nat.Cancer Inst.94:805-
818(2002)；Zarour等人,Cancer Medicine.(2003)；Bright等人,
Hum.Vaccin.Immunother.10:3297-3305(2014)；Wurz等人,Ther.Adv.Med.Oncol.8:4-31
(2016)；Criscitiello,Breast Care 7:262-266(2012)；Chester等人,
J.Immunother.Cancer 3:7(2015)；Li等人,Mol.Med.Report 1:589-594(2008)；Liu等人,
J.Hematol.Oncol.3:7(2010)；Bertino等人,Biomed.Res.Int.731469(2015)；以及Suri等
人,World J.Gastrointest.Oncol.7:492-502(2015)中描述。
818(2002)；Zarour等人,Cancer Medicine.(2003)；Bright等人,
Hum.Vaccin.Immunother.10:3297-3305(2014)；Wurz等人,Ther.Adv.Med.Oncol.8:4-31
(2016)；Criscitiello,Breast Care 7:262-266(2012)；Chester等人,
J.Immunother.Cancer 3:7(2015)；Li等人,Mol.Med.Report 1:589-594(2008)；Liu等人,
J.Hematol.Oncol.3:7(2010)；Bertino等人,Biomed.Res.Int.731469(2015)；以及Suri等
人,World J.Gastrointest.Oncol.7:492-502(2015)中描述。
[0201] 本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体和病毒颗粒编码一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、
40、50、60、70、80、90或更多)，其由存在有需要的患者体内的肿瘤或癌细胞表达治疗癌症或肿瘤。在具体实施例中，两个或更多个TAA衍生的表位和用于多核苷酸和病毒介体和颗粒产物的肿瘤相关抗原，以及本发明的组合物和方法是那些表1至28中任一项中列出者。在具体实施例中，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒和药物组合物编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个，例如两个或更多个表位，所述抗原与在给药于受试者(例如患有癌症或肿瘤的患者)时引发针对表达TAA表位的癌症或肿瘤的免疫应答的一个或多个由癌症或
肿瘤表达的肿瘤相关抗原或其表位具有足够的免疫交叉反应性。
40、50、60、70、80、90或更多)，其由存在有需要的患者体内的肿瘤或癌细胞表达治疗癌症或肿瘤。在具体实施例中，两个或更多个TAA衍生的表位和用于多核苷酸和病毒介体和颗粒产物的肿瘤相关抗原，以及本发明的组合物和方法是那些表1至28中任一项中列出者。在具体实施例中，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒和药物组合物编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个，例如两个或更多个表位，所述抗原与在给药于受试者(例如患有癌症或肿瘤的患者)时引发针对表达TAA表位的癌症或肿瘤的免疫应答的一个或多个由癌症或
肿瘤表达的肿瘤相关抗原或其表位具有足够的免疫交叉反应性。
[0202] 具有表位并由癌细胞或实体瘤表达的任何肿瘤相关抗原(TAA)可以与本发明的组合物和方法结合使用。然而，预期不同TAA及其相关表位的功效可能存在变异性以诱导或增加受试者的免疫应答，因为一些TAA及/或其表位可能潜在地诱导更强的应答(即，免疫显性TAA)。相关报道，例如临床前和临床研究报告，可用于针对TAA或其表位的选择，以并入本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物中。在一些具体实施例中，将能够诱导强烈免疫应答以高亲和力结合MHC I类蛋白或以高亲和力结合MHC II类蛋白的TAA
或其表位的编码序列并入本发明的多核苷酸、病毒介体中、病毒颗粒或药物组合物。举例来说，癌症-睾丸抗原NY-ESO-1适合用作癌症免疫疗法的肿瘤相关抗原，因为它在几种不同的癌症和肿瘤类型中表达，例如乳癌、肺癌、黑色素瘤、及睾丸和胎盘；然而，它不在其他正常成人组织中表达。
或其表位的编码序列并入本发明的多核苷酸、病毒介体中、病毒颗粒或药物组合物。举例来说，癌症-睾丸抗原NY-ESO-1适合用作癌症免疫疗法的肿瘤相关抗原，因为它在几种不同的癌症和肿瘤类型中表达，例如乳癌、肺癌、黑色素瘤、及睾丸和胎盘；然而，它不在其他正常成人组织中表达。
[0203] 有多种来源可用于告知技术人员关于TAA或其多个表位的选择，以用于本文所述基于病毒介体的抗癌治疗剂。例如，国家癌症研究所(NCI)成立了一个专家委员会，以评估5年期间进行的临床试验的癌症抗原数据。NCI委员会制定了标准，并使用加权分析层次结构流程对75个代表性TAA进行了排名(Cheevers等人,Clin Cancer Res.,15:5323-5337,
2009)。相关领域的技术人员熟悉使用数据库选择TAA或其多个表位以包含在本发明的多核
苷酸、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物中。这些参考文献包括，但不限于，van der
Bruggen P.等人，Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun,
2013.URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/；Vigneron等人Cancer
Immun.2013；13:15；TANTIGEN:Tumor T cell Antigen Database,http://
cvc.dfci.harvard.edu/tadb/；HPtaa database,http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/；
Backert,L.and Kohlbacher,O.,2015,Genome Medicine,7:119；Nielsen,M.等人,2010,
Immunology,130(3):319-328；Wang,P.等人,2008,PLoS Comput.Biol.,44(4):e10000048；
Wang,P.等人,2010,BMC Bioinformatics,11:568；Chang,S.T.等人,2006,
Bioinformatics,22(22):2761-2767；Guillaume,P.等人,2009,Cancer Immun.(http://
www.cancerimmunity.org/tetramers/)；Chen,Y.T.等人,2000,In:Rosenberg,S.A.,Ed.,
Principles and practice of the biologic therapy of cancer,3rd ed.Philadelphia,
PA:Lippincott Williams&Wilkins,pp.557-570。除了可获得的出版物之外，还可以使用在下表29中呈现的不同网上来源的可用算法分析推定的表位与T细胞受体的结合强度。使用
表29中列出的算法进行表位选择的实例列于下文实施例6中。
2009)。相关领域的技术人员熟悉使用数据库选择TAA或其多个表位以包含在本发明的多核
苷酸、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物中。这些参考文献包括，但不限于，van der
Bruggen P.等人，Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun,
2013.URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/；Vigneron等人Cancer
Immun.2013；13:15；TANTIGEN:Tumor T cell Antigen Database,http://
cvc.dfci.harvard.edu/tadb/；HPtaa database,http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/；
Backert,L.and Kohlbacher,O.,2015,Genome Medicine,7:119；Nielsen,M.等人,2010,
Immunology,130(3):319-328；Wang,P.等人,2008,PLoS Comput.Biol.,44(4):e10000048；
Wang,P.等人,2010,BMC Bioinformatics,11:568；Chang,S.T.等人,2006,
Bioinformatics,22(22):2761-2767；Guillaume,P.等人,2009,Cancer Immun.(http://
www.cancerimmunity.org/tetramers/)；Chen,Y.T.等人,2000,In:Rosenberg,S.A.,Ed.,
Principles and practice of the biologic therapy of cancer,3rd ed.Philadelphia,
PA:Lippincott Williams&Wilkins,pp.557-570。除了可获得的出版物之外，还可以使用在下表29中呈现的不同网上来源的可用算法分析推定的表位与T细胞受体的结合强度。使用
表29中列出的算法进行表位选择的实例列于下文实施例6中。
[0204] 在更个人化的疫苗方法中，当不可能进行活体组织检查时，可以从患者的活体组织检查或生物样本中识别由患者肿瘤表达的肿瘤相关抗原及其表位。从受试者(患者)获得
的生物样本可包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿液、粪便、痰液、唾液、泪液、脑脊髓液、腹膜液、皮肤、组织、细胞、组织和皮肤的刮屑，并处理，例如，均质化或重构的形式。cDNA表达库的血清学分析(serological analysis of cDNA expression library，SEREX)先前已用
于识别人类TAA。还可以通过使用ELISA或西方印迹分析来测试受试者的血清样本对已知一
组TAA蛋白。可以使用本领域已知的方法，例如测量T细胞活化的Elispot测定法，进一步测试从受试者血清中识别的TAA的表位以刺激患者T细胞的效应子活性的能力。
的生物样本可包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿液、粪便、痰液、唾液、泪液、脑脊髓液、腹膜液、皮肤、组织、细胞、组织和皮肤的刮屑，并处理，例如，均质化或重构的形式。cDNA表达库的血清学分析(serological analysis of cDNA expression library，SEREX)先前已用
于识别人类TAA。还可以通过使用ELISA或西方印迹分析来测试受试者的血清样本对已知一
组TAA蛋白。可以使用本领域已知的方法，例如测量T细胞活化的Elispot测定法，进一步测试从受试者血清中识别的TAA的表位以刺激患者T细胞的效应子活性的能力。
[0205] 表29.排名HLA/MHC表位结合算法的URL
[0206]
[0207] 表位选择
[0208] 通常，CD8+细胞毒性T细胞被编程以识别与所有有核细胞上的MHC I类分子相关的肽(表位氨基酸序列)。这些肽或表位具有某些一般特征。通常，能够引发CD8+T细胞应答的表位是与MHC I类分子结合的氨基酸序列或肽，长度为约3至50个氨基酸，或长度为约3至30个氨基酸，或长度为约5至30个氨基酸，或长度为约5至25个氨基酸，或长度为约7至20个氨基酸，或长度为约8至10个氨基酸。不希望受理论束缚，表位肽沿着MHC I类肽结合沟呈细长构象。然而，在大多数情况下，肽长度的变化似乎适应肽骨架中的扭结(kinking)。因此，CD8+T细胞激活表位的一些长度变化是可能的。
[0209] 能够引发CD4+T细胞应答的表位通常是与MHC II类分子结合的肽(表位氨基酸序列)。与MHC II类分子结合的肽的长度至少为13个氨基酸，并且可以长得多。表位肽位于沿着MHC II类肽结合沟的延伸构象中。表位肽通过突出到由多态性残基环绕(lined)的浅和
深袋中的肽侧链，，以及通过肽骨架和在所有MHC II类分子中环绕肽结合裂缝的保守氨基
酸的侧链之间的相互作用两者而保持在这个凹槽中。因为肽被其主链结合并且允许从结合
沟的两端出现，原则上对于可以结合MHC II类分子的肽的长度没有上限。然而，在大多数情况下，与肽II酶分子结合的较长肽通常被肽酶修剪至13至17个氨基酸的长度。
深袋中的肽侧链，，以及通过肽骨架和在所有MHC II类分子中环绕肽结合裂缝的保守氨基
酸的侧链之间的相互作用两者而保持在这个凹槽中。因为肽被其主链结合并且允许从结合
沟的两端出现，原则上对于可以结合MHC II类分子的肽的长度没有上限。然而，在大多数情况下，与肽II酶分子结合的较长肽通常被肽酶修剪至13至17个氨基酸的长度。
[0210] 虽然可以通过文献、数据库(Vigneron,N.等人,2013,Database of T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun.,Vol.13；and the Immune Epitope Database)
及在计算机中进行的算法(表29)中来针对预期引发T细胞应答的表位的选择，这些方法不
是意欲为限制性的，并且可以使用任何通常与上述与肿瘤细胞结合发现的表位的描述一致
的侦测TAA表位的方法。数据库管理来自文献的表明表位是否已成功引发免疫应答的数据。
许多表位预测算法是可获得的，其中一些列于表29中。使用各种标准的计算机程序可用于
分析最可能结合MHC受体和T细胞的肽区域的氨基酸序列，所述标准包括结构、物理化学性
质、灵活性、电荷和蛋白酶处理(Yang and Yu,2009,Rev.Med.Virol.,19:77-96)。可以使用几种算法分析肿瘤相关抗原蛋白的氨基酸序列，以找到用于引发抗癌/抗肿瘤免疫应答的
最佳共有表位。使用表位预测算法选择用于本发明的表位的实例列于下文实施例6中。
及在计算机中进行的算法(表29)中来针对预期引发T细胞应答的表位的选择，这些方法不
是意欲为限制性的，并且可以使用任何通常与上述与肿瘤细胞结合发现的表位的描述一致
的侦测TAA表位的方法。数据库管理来自文献的表明表位是否已成功引发免疫应答的数据。
许多表位预测算法是可获得的，其中一些列于表29中。使用各种标准的计算机程序可用于
分析最可能结合MHC受体和T细胞的肽区域的氨基酸序列，所述标准包括结构、物理化学性
质、灵活性、电荷和蛋白酶处理(Yang and Yu,2009,Rev.Med.Virol.,19:77-96)。可以使用几种算法分析肿瘤相关抗原蛋白的氨基酸序列，以找到用于引发抗癌/抗肿瘤免疫应答的
最佳共有表位。使用表位预测算法选择用于本发明的表位的实例列于下文实施例6中。
[0211] 实验性结合测定，例如iTopia表位发现系统(iTopia Epitope Discovery System，Beckman Coulter)进一步改进表位的选择。iTopia筛选测定允许基于MHC结合亲和力和肽：MHC复合物稳定性对预测的表位进行优先级排序。可选择以高频率存在于群体中的受限于HLA等位基因的表位，以拓宽包含在本文所述多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒和组合物中的TAA衍生的表位的适用性。HLA I和HLA II等位基因的频率是针对全世界人
群编制的，并且对于技术人员是可获得的，例如，可于www.allelefrequencies.net；bioinformatics.bethematchclinical.org获得。当考虑给定TAA的几个表位时，选择那些与最频繁的HLA等位基因结合的TAA表位以允许个别患者的个人化治疗可能是有用的。
群编制的，并且对于技术人员是可获得的，例如，可于www.allelefrequencies.net；bioinformatics.bethematchclinical.org获得。当考虑给定TAA的几个表位时，选择那些与最频繁的HLA等位基因结合的TAA表位以允许个别患者的个人化治疗可能是有用的。
[0212] 编码肿瘤相关抗原和其他多肽表位的多核苷酸
[0213] 例如，如所述用于并入辛德毕斯病毒介体中的多核苷酸(小基因)可以进一步包括编码增加肽表位-MHC相互作用的分子的序列。例如，钙网蛋白和钙联接蛋白代表MHC I类蛋白质产生中的整合蛋白质。当钙连蛋白进入内质网时，钙连蛋白与新合成的MHC I类α链结合，从而将它们保持在部分折叠状态。在β2-微球蛋白与肽加载复合物(PLC)结合后，钙网蛋白(与ERp57一起)接管伴随MHC I类蛋白的功能，而tapasin将复合物与与抗原处理(TAP)复
合物相关的转运蛋白连接(associate)。该连接制备MHC I类分子用于结合抗原以在细胞表
面上呈递。因此，可以构建辛德毕斯病毒复制子颗粒，其编码与编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的多核苷酸连接的钙网蛋白(CRT)。
合物相关的转运蛋白连接(associate)。该连接制备MHC I类分子用于结合抗原以在细胞表
面上呈递。因此，可以构建辛德毕斯病毒复制子颗粒，其编码与编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的多核苷酸连接的钙网蛋白(CRT)。
[0214] 举例来说，可以通过聚合酶链式反应(PCR)使用一系列重叠的DNA寡聚体引物构建多核苷酸(小基因)，该过程称为基因'通过重叠延伸的剪接'或“正在通过重叠延伸的剪接
(SOEing)”的基因(Horton，RM,等人,2013.BioTechniques,8(5):528-535；(1990年11月)；；
Horton等人,Biotechniques.2013；54:129-133)。多表位多肽的弗林蛋白酶处理有效诱导T细胞活化。当辛德毕斯病毒多肽由弗林蛋白酶天然处理时，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒和药物组合物被设计为包括弗林蛋白酶切割位点以分离多个表位编码序
列。例如，本发明的组合物可包括辛德毕斯弗林蛋白酶消化序列XRSKRX(SEQ ID NO：5)，其中X表示疏水残基。用于切割由根据本发明的多核苷酸和病毒介体编码的表位肽的其他处
理酶的非限制性实例包括弗林蛋白酶相关的内肽酶，例如PC1/2、PC4/5、PACE4和PC7。这些酶识别处理信号(R/K)Xn(R/K)，其中Xn表示任何0至6个氨基酸的间隔区(SEQ ID NO：6)，
(Seidah和Prat,2012,Nature Reviews Drug Discovery,11:367-383)。编码连续表位的核
酸序列(Thompson等人,1998,J.Immunol.,160:1717-23)或具有间隔物的表位，例如AAA或
GGG，可包括在本文所述多核苷酸(小基因)或病毒介体中，从而允许细胞处理。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物编码没有酶切割位点或间隔区的连
续表位。
(SOEing)”的基因(Horton，RM,等人,2013.BioTechniques,8(5):528-535；(1990年11月)；；
Horton等人,Biotechniques.2013；54:129-133)。多表位多肽的弗林蛋白酶处理有效诱导T细胞活化。当辛德毕斯病毒多肽由弗林蛋白酶天然处理时，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒和药物组合物被设计为包括弗林蛋白酶切割位点以分离多个表位编码序
列。例如，本发明的组合物可包括辛德毕斯弗林蛋白酶消化序列XRSKRX(SEQ ID NO：5)，其中X表示疏水残基。用于切割由根据本发明的多核苷酸和病毒介体编码的表位肽的其他处
理酶的非限制性实例包括弗林蛋白酶相关的内肽酶，例如PC1/2、PC4/5、PACE4和PC7。这些酶识别处理信号(R/K)Xn(R/K)，其中Xn表示任何0至6个氨基酸的间隔区(SEQ ID NO：6)，
(Seidah和Prat,2012,Nature Reviews Drug Discovery,11:367-383)。编码连续表位的核
酸序列(Thompson等人,1998,J.Immunol.,160:1717-23)或具有间隔物的表位，例如AAA或
GGG，可包括在本文所述多核苷酸(小基因)或病毒介体中，从而允许细胞处理。在一些具体实施例中，本发明的多核苷酸、病毒介体或药物组合物编码没有酶切割位点或间隔区的连
续表位。
[0215] 半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶酶S(CAT S)也可用于蛋白水解处理由本发明的多核苷酸(小基因)或病毒介体编码的肽和多肽。CAT S位于抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬
细胞和B淋巴细胞)的内体区室，并且可以在抗原处理中起作用，特别是在MHC II上。CAT S的内切裂解位点是PMGAP(SEQ ID NO：270)和PMGLP(SEQ ID NO：271)。
细胞和B淋巴细胞)的内体区室，并且可以在抗原处理中起作用，特别是在MHC II上。CAT S的内切裂解位点是PMGAP(SEQ ID NO：270)和PMGLP(SEQ ID NO：271)。
[0216] 由本发明的多核苷酸(小基因)或病毒介体编码的肿瘤相关抗原衍生的表位肽可含有，例如，5至50个氨基酸残基。在具体实施例中，肿瘤相关抗原的表位包含5至30个氨基酸残基，5至25个氨基酸残基，5至20个氨基酸残基，7至25个氨基酸残基，7至20个氨基酸残基或7至14个氨基酸残基。作为非限制性实例，本发明的多核苷酸编码21至42个残基。由于编码辛德毕斯病毒结构基因的大约3700个核苷酸在编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个
表位的辛德毕斯病毒介体的生产过程中从复制子载体中除去，因此估计弗林蛋白酶切割位
点在两侧的大约60至90个表位编码序列插入本发明的病毒介体中，例如本文所述pT7StuI-
R/表位介体中。
表位的辛德毕斯病毒介体的生产过程中从复制子载体中除去，因此估计弗林蛋白酶切割位
点在两侧的大约60至90个表位编码序列插入本发明的病毒介体中，例如本文所述pT7StuI-
R/表位介体中。
[0217] 编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的多核苷酸和病毒介体
[0218] 在一些具体实施例中，提供含有编码一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的多核苷酸(小基因)的病毒介体、病毒颗粒或药物组合物，其中表位诱导强烈的免疫应
答(例如体液或细胞介导的免疫反应)。在一个具体实施例中，多核苷酸编码如本文所述甲
病毒蛋白或其片段。在一个具体实施例中，多核苷酸编码如本文所述辛德毕斯病毒蛋白或
其片段。引发的免疫应答可以通过例如确定针对肿瘤相关抗原产生的抗体滴度或患者体内
或从患者获得的生物样本中TAA介导的T细胞活化程度来评估。选择肿瘤相关抗原及其表位
诱导强烈的体液或细胞介导的免疫应答以及可以并入本发明的多核苷酸、病毒介体、病毒
颗粒或组合物中的方法在本文中进一步详细描述。
答(例如体液或细胞介导的免疫反应)。在一个具体实施例中，多核苷酸编码如本文所述甲
病毒蛋白或其片段。在一个具体实施例中，多核苷酸编码如本文所述辛德毕斯病毒蛋白或
其片段。引发的免疫应答可以通过例如确定针对肿瘤相关抗原产生的抗体滴度或患者体内
或从患者获得的生物样本中TAA介导的T细胞活化程度来评估。选择肿瘤相关抗原及其表位
诱导强烈的体液或细胞介导的免疫应答以及可以并入本发明的多核苷酸、病毒介体、病毒
颗粒或组合物中的方法在本文中进一步详细描述。
[0219] 在某些具体实施例中，并且不希望是限制性的，本发明的多核苷酸(小基因)、多核苷酸、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物含有编码以下一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的多核苷酸:NY-ESO-1、CEA、k-Ras、c-myc、HPV E6、HPV E7、细胞周期蛋白B1、Her2、MUC1、p53、p62、生存素、WT1、sp17和Pdz结合激酶(PBK)。例如，在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1的
一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)。，和肿瘤相关抗原CEA的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的CEA的表位)的多核苷酸。在一些具体
实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和肿瘤相关抗原k-Ras的一
个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的k-RaS表位)的多核苷酸。在一些具体实施
例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)。)，和肿瘤相关抗原c-myc的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-
ESO-1的表位)，和细胞周期蛋白B1的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位
(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和Her2的一个或多个表位(例如，表1至
28中任一个中列出的Her2的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中
任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和MUC1的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施
例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和p53的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的p53的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基
因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至
28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位和p62的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实
施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和生存素的一个或多个表位
或其表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1
的表位)和WT1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的WT1的表位)的多核苷
酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和sp17的
一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的sp17的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和gp70的一个或多个表位的
多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位))和
pbk的一个或多个表位(在许多肿瘤中过度表达的PDZ结合激酶)的多核苷酸。在一些具体实
施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和生存素的一个或多个表位
的多核苷酸。
一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)。，和肿瘤相关抗原CEA的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的CEA的表位)的多核苷酸。在一些具体
实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和肿瘤相关抗原k-Ras的一
个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的k-RaS表位)的多核苷酸。在一些具体实施
例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)。)，和肿瘤相关抗原c-myc的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-
ESO-1的表位)，和细胞周期蛋白B1的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位
(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和Her2的一个或多个表位(例如，表1至
28中任一个中列出的Her2的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中
任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和MUC1的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实施
例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和p53的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的p53的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基
因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至
28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位和p62的一个或多个表位的多核苷酸。在一些具体实
施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和生存素的一个或多个表位
或其表位的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1
的表位)和WT1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的WT1的表位)的多核苷
酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和sp17的
一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的sp17的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和gp70的一个或多个表位的
多核苷酸。在一些具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位))和
pbk的一个或多个表位(在许多肿瘤中过度表达的PDZ结合激酶)的多核苷酸。在一些具体实
施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)和生存素的一个或多个表位
的多核苷酸。
[0220] 在其他具体实施例中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)、p53的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的p53的表位)、sp17的一个或多个表位
(例如，表1至28中任一个中列出的sp17的表位))、生存素的一个或多个表位以及WT1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的WT1的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例
中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)、gp70的一个或多个表位以及pbk
的一个或多个表位的多核苷酸，例如，如下文实施例2中所述。
(例如，表1至28中任一个中列出的sp17的表位))、生存素的一个或多个表位以及WT1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的WT1的表位)的多核苷酸。在一些具体实施例
中，多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物包含编码NY-ESO-1的一个或多个表位(例如，表1至28中任一个中列出的NY-ESO-1的表位)、gp70的一个或多个表位以及pbk
的一个或多个表位的多核苷酸，例如，如下文实施例2中所述。
[0221] 病毒和病毒介体
[0222] 甲病毒、辛德毕斯病毒和辛德毕斯病毒介体
[0223] 甲病毒属于第IV组披膜病毒科病毒，其是小的，球形的，有包膜的，正义的单链RNA病毒。大多数甲病毒在脊椎动物宿主中和例如蚊子的吸血节肢动物中感染和复制。蚜虫病毒颗粒是球形的，具有包封在脂质-蛋白质包膜中的二十面体核衣壳。甲病毒RNA是约4×
106道尔顿的单个42S链，其被封端并多聚腺苷酸化。甲病毒包膜包含衍生自宿主细胞质膜
的脂质双层，并含有两种病毒糖蛋白E1(48,000道尔顿)和E2(52,000道尔顿)。第三种小E3
蛋白(10,000至12,000道尔顿)作为可溶性蛋白从病毒中释放出来，而不是塞姆利基森林病
毒，其中E3蛋白仍与病毒相关。
106道尔顿的单个42S链，其被封端并多聚腺苷酸化。甲病毒包膜包含衍生自宿主细胞质膜
的脂质双层，并含有两种病毒糖蛋白E1(48,000道尔顿)和E2(52,000道尔顿)。第三种小E3
蛋白(10,000至12,000道尔顿)作为可溶性蛋白从病毒中释放出来，而不是塞姆利基森林病
毒，其中E3蛋白仍与病毒相关。
[0224] 如本文所述，本发明包括编码甲病毒蛋白或其片段的多核苷酸，和一种或多种肿瘤相关抗原的两个或多个表位，其中每个表位被酶切位点分开。此外，本发明包括病毒介体和用其他病毒类型的蛋白质(例如包膜蛋白)假型化的颗粒。本文所述多核苷酸、病毒介体
和病毒颗粒包括甲病毒属成员的核酸序列和多肽序列，包括各种菌株、抗原复合物、物种和亚型。本发明包括甲病毒、系统发育相关的甲病毒、甲病毒复合物及其结构组分，例如包膜蛋白，例如E1，如例如Powers,A.M等人,2011,J.Virol.,75(21):10118-10131。可用于本文所述多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒中的甲病毒及其多核苷酸和蛋白质以及其多核苷酸和
蛋白质的片段的非限制性实例包括巴马森林病毒、巴马森林病毒复合体、东部马脑炎病毒
(EEEV)、东部马脑炎病毒复合体、脑炎病毒复合体、米德尔堡病毒、米德尔堡病毒复合体、恩杜姆病毒、恩杜姆病毒复合体、塞姆利基森林病毒、塞姆利基森林病毒复合物体、贝巴鲁病毒、基孔肯尼亚病毒、马亚罗病毒、亚型乌纳病毒、奥-奈氏病毒、亚型伊博-奥拉病毒、罗斯河病毒、亚型木屐病毒、亚型贝巴鲁病毒、亚型鹭山病毒、亚型米酛病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、VEEV复合体，卡巴斯欧病毒、大沼泽地病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、巴拉马那病毒、那皮舒纳病毒、西部马脑炎病毒(WEEV)、里奥内格罗病毒、特罗卡拉病毒、亚型比朱桥病毒、西部马脑炎病毒复合体、奥拉病毒、巴班肯病毒、孜拉加奇病毒、辛德毕斯病毒、奥克尔布病毒、瓦塔罗阿病毒、博吉河病毒、摩根堡病毒、高地J病毒、埃拉特病毒、鲑鱼胰腺病毒病毒(SPDV)、南象海豹病毒(SESV)、泰森林病毒以及托莱特病毒。
和病毒颗粒包括甲病毒属成员的核酸序列和多肽序列，包括各种菌株、抗原复合物、物种和亚型。本发明包括甲病毒、系统发育相关的甲病毒、甲病毒复合物及其结构组分，例如包膜蛋白，例如E1，如例如Powers,A.M等人,2011,J.Virol.,75(21):10118-10131。可用于本文所述多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒中的甲病毒及其多核苷酸和蛋白质以及其多核苷酸和
蛋白质的片段的非限制性实例包括巴马森林病毒、巴马森林病毒复合体、东部马脑炎病毒
(EEEV)、东部马脑炎病毒复合体、脑炎病毒复合体、米德尔堡病毒、米德尔堡病毒复合体、恩杜姆病毒、恩杜姆病毒复合体、塞姆利基森林病毒、塞姆利基森林病毒复合物体、贝巴鲁病毒、基孔肯尼亚病毒、马亚罗病毒、亚型乌纳病毒、奥-奈氏病毒、亚型伊博-奥拉病毒、罗斯河病毒、亚型木屐病毒、亚型贝巴鲁病毒、亚型鹭山病毒、亚型米酛病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、VEEV复合体，卡巴斯欧病毒、大沼泽地病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、巴拉马那病毒、那皮舒纳病毒、西部马脑炎病毒(WEEV)、里奥内格罗病毒、特罗卡拉病毒、亚型比朱桥病毒、西部马脑炎病毒复合体、奥拉病毒、巴班肯病毒、孜拉加奇病毒、辛德毕斯病毒、奥克尔布病毒、瓦塔罗阿病毒、博吉河病毒、摩根堡病毒、高地J病毒、埃拉特病毒、鲑鱼胰腺病毒病毒(SPDV)、南象海豹病毒(SESV)、泰森林病毒以及托莱特病毒。
[0225] 辛德毕斯病毒作为一种甲病毒，是一种小的、有包膜的、正义的单链RNA病毒。甲病毒属的其他成员包括，但不限于，塞姆利基森林病毒(SFV)，委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)和罗斯河病毒(RRV)。包括辛德毕斯病毒在内的甲病毒形成直径为60至70nm的球形颗粒；通过低温电子显微镜(cryo-EM)和晶体学研究，许多α病毒的二十面体结构被定义为非常高的分辨率，揭示了结构蛋白之间相互作用的细节(Jose,J.等人,2009,Future Microbiol.,4:837-856)。基因组由长度约为11至12kb的单链正义RNA组成，并且编码涉及病毒复制和发病的四种非结构蛋白(nsP1至nsP4)，以及构成病毒颗粒的五种结构蛋白，即，核衣壳蛋白C和包膜蛋白、P62(蛋白水解切割成成熟包膜蛋白E2和E3)和E1蛋白。甲病毒展现出有效的复
制，并具有广范围的易感和许可的宿主；因此，这些病毒非常适合异源基因表达和基因治疗递送介体。甲病毒介体适合用于编码多核苷酸(小基因)以用于递送如本文所述肿瘤相关抗
原的多表位。
制，并具有广范围的易感和许可的宿主；因此，这些病毒非常适合异源基因表达和基因治疗递送介体。甲病毒介体适合用于编码多核苷酸(小基因)以用于递送如本文所述肿瘤相关抗
原的多表位。
[0226] 任何辛德毕斯病毒介体都可以与本发明的多核苷酸、病毒介体、组合物和方法结合使用，包括具有复制能力的介体(参见，例如，美国专利第8,282,916号)和复制缺陷型介体(参见，例如，美国专利第7,303,898、7,306,792和8,093,021号)。复制缺陷型介体优选用于本发明，因为它们提供另一层保护免健康组织受到感染。辛德毕斯病毒介体也可以构建
成含有一个以上的亚基因组启动子，以使用本领域已知的方法表达超过一种的基因。
成含有一个以上的亚基因组启动子，以使用本领域已知的方法表达超过一种的基因。
[0227] 举例来说，为了产生pT7StuI-R/表位介体，编码辛德毕斯复制酶基因(nsP1-nsP4)的复制子质粒和编码病毒结构基因(衣壳蛋白C、E1、E2、E3和6K)辅助质粒在体外转录。为了限制体内病毒复制，复制子基因已从结构基因中分离出来，结构基因还含有突变的包装信
号，以防止掺入病毒颗粒(Bredenbeek,P.J.等人,1993,J Virol 67:
号，以防止掺入病毒颗粒(Bredenbeek,P.J.等人,1993,J Virol 67:
[0228] 6439-6446)。通过用体外合成的辛德毕斯复制子RNA和辅助RNA转录物瞬时转染幼仓鼠肾(BHK)细胞以产生病毒颗粒。在细胞内，通过辛德毕斯复制酶复制基因组RNA，并从封端的复制子RNA转录物中表达。结构蛋白由辅助RNA转录物表达。仅将复制子RNA包装到衣壳中以形成核衣壳，然后核衣壳与病毒糖蛋白E1和E2结合并从细胞中芽出。得到的病毒体含
有编码病毒复制酶的nsP1至nsP4基因的封端的SV单链RNA信息，其为复制酶可从从而转录
插入的感兴趣的基因和聚腺苷酸尾的亚基因组启动子(Psg)。
有编码病毒复制酶的nsP1至nsP4基因的封端的SV单链RNA信息，其为复制酶可从从而转录
插入的感兴趣的基因和聚腺苷酸尾的亚基因组启动子(Psg)。
[0229] 为了制备编码多个TAA表位(“SV/TAA”)并显示出刺激抗肿瘤T细胞库的潜力的辛德毕斯病毒介体，将编码多个个由酶切割位点分开的T细胞识别表位的多核苷酸(例如，DNA小基因)插入辛德毕斯病毒介体(例如，pT7StuI-R LacZ#202；美国专利第8,093,021号)中。
因为SV/TAA病毒粒子诱导强烈的先天免疫应答并表达激活CD8+T细胞的TAA表位，本发明的
病毒介体不需要信号和免疫原性肽，尽管如果需要可以包括这种肽。如果需要，可以容易地操作介体以包括如下所述免疫增强组件。
因为SV/TAA病毒粒子诱导强烈的先天免疫应答并表达激活CD8+T细胞的TAA表位，本发明的
病毒介体不需要信号和免疫原性肽，尽管如果需要可以包括这种肽。如果需要，可以容易地操作介体以包括如下所述免疫增强组件。
[0230] 慢病毒
[0231] 慢病毒介体特别适用于基因的长期表达，因为它们具有感染分裂和非分裂细胞的能力。为了提高安全性，优选第三代慢病毒系统(Breckpot,K.,等人,2007,Gene Ther,14:
847-862)。这些包括例如其中插入了编码肿瘤相关抗原的两个或多个表位的核酸序列的转
移质粒、gag和pol基因的包装质粒和rev基因的另一个包装质粒。为了获得最佳表达，转移表达介体含有剪接供体、包装信号(psi)、Rev反应组件(RRE)、剪接受体、中央多嘌呤道
(cPPT)和土拨鼠肝炎病毒转录反应组件(Wood chuck hepatitis virus，WPRE)(Shaw和
Cornetta,2014,Biomedicines,2:14-35)。转移介体构建体还可含有用于在哺乳动物细胞
中表达的启动子。组成型启动子，例如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、哺乳动物β-肌动蛋白或泛蛋白启动子可以掺入本发明的组合物中。在一些具体实施例中，使用组织特异
性启动子，例如CD4+T细胞特异性启动子。
847-862)。这些包括例如其中插入了编码肿瘤相关抗原的两个或多个表位的核酸序列的转
移质粒、gag和pol基因的包装质粒和rev基因的另一个包装质粒。为了获得最佳表达，转移表达介体含有剪接供体、包装信号(psi)、Rev反应组件(RRE)、剪接受体、中央多嘌呤道
(cPPT)和土拨鼠肝炎病毒转录反应组件(Wood chuck hepatitis virus，WPRE)(Shaw和
Cornetta,2014,Biomedicines,2:14-35)。转移介体构建体还可含有用于在哺乳动物细胞
中表达的启动子。组成型启动子，例如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、哺乳动物β-肌动蛋白或泛蛋白启动子可以掺入本发明的组合物中。在一些具体实施例中，使用组织特异
性启动子，例如CD4+T细胞特异性启动子。
[0232] 用于产生慢病毒介体的质粒可以从Addgene(Cambridge，MA，非营利性质粒库)获得，并且必要时使用本领域的标准技术进行修饰。可以使用标准的第3代包装质粒。适合的转移介体包括例如pLX301、pFUGW和pWPXL。这些介体包含上述所有必需的特征。为了增加安全性，可以使慢病毒转移介体突变以降低整合并增加感染细胞中的附加体复制。例如，使用本领域已知的标准技术，可以进行以下修改：在3'LTR的U3区域内进行删除以产生自失活
LTR(SIN-LTR)；删除U3和U5LTR区域内的LTR att位点被或使其突变；删除或修改3'LTR-近
侧多嘌呤道(PPT)(Shaw和Cornetta,2014)。
LTR(SIN-LTR)；删除U3和U5LTR区域内的LTR att位点被或使其突变；删除或修改3'LTR-近
侧多嘌呤道(PPT)(Shaw和Cornetta,2014)。
[0233] 假型化病毒介体和病毒粒子也可用于与本发明的多核苷酸和组合物结合使用。这种病毒体含有病毒颗粒和一种或多种外来病毒包膜蛋白。(D.A.Sanders,2002,
Curr.Opin.Biotechnol.,13:437-442)。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体可以是含有甲病毒蛋白或其片段的慢病毒，例如包膜蛋白或其功能片段。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体可以是含有辛德毕斯病毒包膜糖蛋白或某些辛德毕斯病毒包膜糖蛋白的慢
病毒。举例来说，为了产生包含用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白的假型化慢病毒骨架
的构建体(例如，假型病毒介体)，辛德毕斯包膜质粒，例如T7DM辅助#101(美国专利第8,
093,021号)是与慢病毒质粒一起转染到BHK或293细胞中，产生假型化病毒粒子。
Curr.Opin.Biotechnol.,13:437-442)。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体可以是含有甲病毒蛋白或其片段的慢病毒，例如包膜蛋白或其功能片段。在一些具体实施例中，本发明的病毒介体可以是含有辛德毕斯病毒包膜糖蛋白或某些辛德毕斯病毒包膜糖蛋白的慢
病毒。举例来说，为了产生包含用一种或多种辛德毕斯病毒包膜蛋白的假型化慢病毒骨架
的构建体(例如，假型病毒介体)，辛德毕斯包膜质粒，例如T7DM辅助#101(美国专利第8,
093,021号)是与慢病毒质粒一起转染到BHK或293细胞中，产生假型化病毒粒子。
[0234] 逆转录病毒
[0235] 逆转录病毒介体也适用于本发明。在一些具体实施例中，逆转录病毒介体是用辛德毕斯包膜蛋白的假型化莫罗尼鼠白血病病毒(Mo-MuLV)。可以使用本领域已知的方法进
行假型化(参见，例如，Sharkey等人,2001,J.Virology,75(6):2653-2659)。在一些具体实施例中，基于Mo-MuLV的逆转录病毒颗粒被改造为包括并使用本领域已知和实践的方法表
达甲病毒罗斯河病毒(RRV)的糖蛋白。
行假型化(参见，例如，Sharkey等人,2001,J.Virology,75(6):2653-2659)。在一些具体实施例中，基于Mo-MuLV的逆转录病毒颗粒被改造为包括并使用本领域已知和实践的方法表
达甲病毒罗斯河病毒(RRV)的糖蛋白。
[0236] 辛德毕斯病毒包膜假型介体
[0237] 辛德毕斯病毒(SV)包膜有利于用作基因或多核苷酸递送介体。SV是一种血液传播的病毒，具有相对较长的半衰期。安定的病毒易于生产，并且可以浓缩用于给药。与细胞表面分子结合的辛德毕斯E2包膜蛋白的修饰不影响细胞进入所需的E1融合包膜蛋白，因此允
许病毒的工程化靶向。辛德毕斯病毒通过与高亲和力层粘连蛋白受体(LAMR)相互作用而特
异性地靶向肿瘤(美国专利第7,306,792号)，所述层粘连蛋白受体被许多肿瘤过度表达，并且不感染正常组织。作为血源性病毒，辛德毕斯病毒能够通过血流接触播散的转移性肿瘤
细胞。
许病毒的工程化靶向。辛德毕斯病毒通过与高亲和力层粘连蛋白受体(LAMR)相互作用而特
异性地靶向肿瘤(美国专利第7,306,792号)，所述层粘连蛋白受体被许多肿瘤过度表达，并且不感染正常组织。作为血源性病毒，辛德毕斯病毒能够通过血流接触播散的转移性肿瘤
细胞。
[0238] 辛德毕斯病毒包膜结构蛋白可以假型化其他病毒介体，如慢病毒、逆转录病毒和水泡性口炎病毒(Vesticular Stomatitus virus，VSV)，以提高其靶向能力和增加病毒粒
子的安定性。特别地，设计为包含插入E2包膜蛋白的金黄色葡萄球菌蛋白A的Fc结合结构域的辛德毕斯-ZZ蛋白(美国专利第6,432,699号)可与用于复位向SV和其他介体的靶向的细
胞表面特异性抗体结合。
子的安定性。特别地，设计为包含插入E2包膜蛋白的金黄色葡萄球菌蛋白A的Fc结合结构域的辛德毕斯-ZZ蛋白(美国专利第6,432,699号)可与用于复位向SV和其他介体的靶向的细
胞表面特异性抗体结合。
[0239] 在需要长期稳定表达多个表位的某些具体实施例中，使用用野生型或工程化辛德毕斯病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒或慢病毒介体。慢病毒介体有利于分裂和非分裂细
胞的感染。与辛德毕斯病毒基因组一样，慢病毒基因组可以分为两个或三个介体，并且可以修饰或删除基因以提高安全性。逆转录病毒亚型慢病毒天然地整合到宿主基因组中。然而，含有长末端重复序列(LTR)或整合酶突变的介体可以作为细胞核中的安定、非整合的附加
体存在(Breckpot,K.,等人,2007,Gene Ther.,14:847-862)。
胞的感染。与辛德毕斯病毒基因组一样，慢病毒基因组可以分为两个或三个介体，并且可以修饰或删除基因以提高安全性。逆转录病毒亚型慢病毒天然地整合到宿主基因组中。然而，含有长末端重复序列(LTR)或整合酶突变的介体可以作为细胞核中的安定、非整合的附加
体存在(Breckpot,K.,等人,2007,Gene Ther.,14:847-862)。
[0240] 增强所述病毒介体的免疫原性，例如辛德毕斯病毒介体
[0241] 本发明中包括由本文所述病毒介体编码的多个TAA相关表位引发的免疫应答的增强，例如pT7StuI-R/表位介体。例如，促进CD4+T细胞(T细胞辅助)的增加可以增强肿瘤抗原的交叉呈递并刺激CD8+记忆T细胞的产生。实际上，当小鼠耗尽CD4T细胞时，避免了由编码一种或多种肿瘤相关抗原(SV/TAA)的多个表位的辛德毕斯病毒介体提供的免疫应答和抗
癌疗法(图6A至6D)。
癌疗法(图6A至6D)。
[0242] Pan HLA-DR反应性表位AKFVAAWTLKAAA(PADRE)(SEQ ID NO：7)能够产生抗原特异性CD4+T细胞，其以高亲和力结合各种HLA II类分子以刺激T细胞辅助(Alexander,J等人,
1994,Immunity,1:751-761)。在某些具体实施例中，除了编码一种或多种肿瘤相关抗原的
多个(例如两个或更多个)表位的序列外，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体或病毒颗
粒还含有编码PADRE表位的序列，其中表位序列通过处理位点如酶切位点分开。另外，编码同源CD4+T细胞表位的序列和编码CD8+T细胞表位的序列可以包括在多核苷酸和病毒介体中
以增强功效。
1994,Immunity,1:751-761)。在某些具体实施例中，除了编码一种或多种肿瘤相关抗原的
多个(例如两个或更多个)表位的序列外，本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体或病毒颗
粒还含有编码PADRE表位的序列，其中表位序列通过处理位点如酶切位点分开。另外，编码同源CD4+T细胞表位的序列和编码CD8+T细胞表位的序列可以包括在多核苷酸和病毒介体中
以增强功效。
[0243] 包含内质网(ER)信号序列可以促进多表位多肽易位到将发生弗林蛋白酶消化的ER中。潜在的ER信号肽包括序列，例如甲病毒内质网信号序列(Garoff,H.等人,1990,
J.Cell.Biol.,111:867-876)、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-68(Anderson,K.等人,1991,J Exp Med,174:489-492)、或组织纤溶酶原激活肽(Aurisicchio,L.等人,2014,
Oncoimmunology 3:e27529)。用于本发明的信号序列如下所述。
J.Cell.Biol.,111:867-876)、流感病毒基质蛋白衍生肽M57-68(Anderson,K.等人,1991,J Exp Med,174:489-492)、或组织纤溶酶原激活肽(Aurisicchio,L.等人,2014,
Oncoimmunology 3:e27529)。用于本发明的信号序列如下所述。
[0244] 可以并入本文所述多核苷酸(小基因)和病毒介体中以增强给药后多表位多肽的细胞内处理的另外的ER信号编码核酸序列包括，但不限于，腺病毒ER信号：
MRYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO:272)和组织纤溶酶原激活肽：MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS
(SEQ ID NO:273)。
MRYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO:272)和组织纤溶酶原激活肽：MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS
(SEQ ID NO:273)。
[0245] 编码免疫原性肽的核酸序列也可以包括在如本文所述多核苷酸(小基因)和病毒介体中。这些序列包括，但不限于，大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB):MNKVKFYVLFTALLSSLCAHGAPQSITELCSEYHNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMK
DTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMEN(SEQ ID NO:274)；流感病毒基质蛋白M57-68:
KGILGFVFTLLV(SEQ ID NO:275)；破伤风毒素片段c：IDKISDVSTIVPYIGPALNI(SEQ ID NO:
276)；溶酶体相关膜蛋白(LAMP)：MLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVG(SEQ ID NO:277)；以及
Hsp70肽：TKDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:278)。
DTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMEN(SEQ ID NO:274)；流感病毒基质蛋白M57-68:
KGILGFVFTLLV(SEQ ID NO:275)；破伤风毒素片段c：IDKISDVSTIVPYIGPALNI(SEQ ID NO:
276)；溶酶体相关膜蛋白(LAMP)：MLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVG(SEQ ID NO:277)；以及
Hsp70肽：TKDNNLLGRFELSG(SEQ ID NO:278)。
[0246] 在一些具体实施例中，在本文所述多核苷酸(小基因)或病毒介体的羧基末端(3'末端)包含编码多肽佐剂的核酸序列用于增强给药和表达后的免疫应答。用于增强免疫应
答的例示性序列包括热休克蛋白70，溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的通用辅助T细胞(Th)表位和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(Facciabene,A.等人,2007,Vaccine,26:47-
58；and 2006,Hum Gene Ther.,17:81-92)。
答的例示性序列包括热休克蛋白70，溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的通用辅助T细胞(Th)表位和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(Facciabene,A.等人,2007,Vaccine,26:47-
58；and 2006,Hum Gene Ther.,17:81-92)。
[0247] 在其他具体实施例中，本文所述多核苷酸(小基因)和病毒介体中包含编码突变或过度表达的癌基因、细胞因子、趋化因子、抗体和已知由处理位点(例如酶(例如弗林蛋白
酶)切割位点)分开的免疫原性TAA的表位的核酸序列包括在。突变的癌基因可以最小化可
能引发自身免疫的自身基因。通过仅将所有这些基因与它们之间的酶切位点串联连接，所
有这些基因的表达可以由介体中的一个或多个亚基因组启动子驱动。作为非限制性实例，
编码一种或多种癌基因的多个表位或其突变形式的多核苷酸序列可包括在本发明的多核
苷酸和病毒介体中，包括雄激素受体(Olson,B.M.等人 ,2013 ,Cancer
Immunol.Immunother.,62(3):585-596)、Her-2/neu(Parmiani,G.等人,2002,
J.Natl.Cancer Inst.,94(11):805-818)、P53(Ito,D.等人,2007,Int.J.Cancer,120(12):
2618-2624)、EphA2(Tandon,M.等人,2011,Expert Opin.Ther.Targets,15(1):31-51)、K-
Ras(Gjertsen,M.K.等人,1997,Int.J.Cancer,72(5):784-790)以及H-Ras(Fossum,B.等
人,1993,J.Immunol.,23:2687-2691)。在其他具体实施例中，编码可包括在本发明的多核
苷酸和病毒介体中的一种或多种免疫疗法增强基因的多个表位的多核苷酸序列的非限制
性实例包括生存素(Siegel,S.A.等人,2003,Br.J.Haematol.,122:911-914；Yang,Z.等人,
2008,Mol.Immunol.,45:1674-1681)、WT1(Miwa,H.等人,1992,Leukemia,6:405；Oji,Y.等
人,1999,Japan.J.Cancer.Res.,90:194；Oka Y.等人,2000,J.Immunol.2000,164(4):
1873-80；Li Z.等人,2008,Microbiol.Immunol.,52:551-558)。HTERT(Bright,R.K.,等人,
2014,Human Vaccines&Immunotherapeutics,10(11):3297-3305)、肿瘤蛋白D52(Bright,
R.K.,等人,2014,Ibid.)、IL-12(Tseng,J.C.等人,2004,Cancer Res.,64:6684-6692；
Tseng,J.C.等人,2004,Nature Biotechnol.,22:70-77；Granot,T.等人,2013,Mol.Ther.,
22(1):112-122；Granot,T.等人,2011,PLoS One,6(6):e20598)、干扰素-γ(Granot,T.等
人,2013,Mol.Ther.,22(1):112-122；Granot,T.等人,2011,PLoS One,6(6):e20598)以及
钙网蛋白(Wang,H.T.等人,2012,Int.J.Cancer,130:2892-2902)。
酶)切割位点)分开的免疫原性TAA的表位的核酸序列包括在。突变的癌基因可以最小化可
能引发自身免疫的自身基因。通过仅将所有这些基因与它们之间的酶切位点串联连接，所
有这些基因的表达可以由介体中的一个或多个亚基因组启动子驱动。作为非限制性实例，
编码一种或多种癌基因的多个表位或其突变形式的多核苷酸序列可包括在本发明的多核
苷酸和病毒介体中，包括雄激素受体(Olson,B.M.等人 ,2013 ,Cancer
Immunol.Immunother.,62(3):585-596)、Her-2/neu(Parmiani,G.等人,2002,
J.Natl.Cancer Inst.,94(11):805-818)、P53(Ito,D.等人,2007,Int.J.Cancer,120(12):
2618-2624)、EphA2(Tandon,M.等人,2011,Expert Opin.Ther.Targets,15(1):31-51)、K-
Ras(Gjertsen,M.K.等人,1997,Int.J.Cancer,72(5):784-790)以及H-Ras(Fossum,B.等
人,1993,J.Immunol.,23:2687-2691)。在其他具体实施例中，编码可包括在本发明的多核
苷酸和病毒介体中的一种或多种免疫疗法增强基因的多个表位的多核苷酸序列的非限制
性实例包括生存素(Siegel,S.A.等人,2003,Br.J.Haematol.,122:911-914；Yang,Z.等人,
2008,Mol.Immunol.,45:1674-1681)、WT1(Miwa,H.等人,1992,Leukemia,6:405；Oji,Y.等
人,1999,Japan.J.Cancer.Res.,90:194；Oka Y.等人,2000,J.Immunol.2000,164(4):
1873-80；Li Z.等人,2008,Microbiol.Immunol.,52:551-558)。HTERT(Bright,R.K.,等人,
2014,Human Vaccines&Immunotherapeutics,10(11):3297-3305)、肿瘤蛋白D52(Bright,
R.K.,等人,2014,Ibid.)、IL-12(Tseng,J.C.等人,2004,Cancer Res.,64:6684-6692；
Tseng,J.C.等人,2004,Nature Biotechnol.,22:70-77；Granot,T.等人,2013,Mol.Ther.,
22(1):112-122；Granot,T.等人,2011,PLoS One,6(6):e20598)、干扰素-γ(Granot,T.等
人,2013,Mol.Ther.,22(1):112-122；Granot,T.等人,2011,PLoS One,6(6):e20598)以及
钙网蛋白(Wang,H.T.等人,2012,Int.J.Cancer,130:2892-2902)。
[0248] 调节由编码多个(两个或更多)肿瘤相关抗原表位的辛德毕斯病毒介体引发的免疫应答
[0249] 除了激活CD8+T细胞并引发它们对肿瘤抗原及其表位的反应性之外，用编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体进行治疗可以激活另外的免疫(或非免疫)细胞，
其包括，但不限于，CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、中性粒细胞和其他细胞，以及体液免疫反应。表位扩散不仅可以发生在CD8+T细胞中，也可以发生在CD4+T细胞中(Granot,T.和D.Meruelo,2012,Cancer Gene TheR.,19:588-591；Granot,
T.等人,2011,PLoS One 6:e20598；Granot,T.等人,2014,Mol Ther,22:112-122)。为了在
淋巴结中产生T细胞刺激的最佳条件，本发明的一个具体实施例包括多核苷酸和病毒介体，例如辛德毕斯病毒表达介体，其含有并递送编码(一种或多种)肿瘤相关抗原的多个(例如，两个或更多个)表位的核酸序列与编码某些免疫刺激细胞因子的核酸序列(基因)结合。此
类免疫刺激细胞因子包括，但不限于，白细胞介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-17。另外的细胞因子包括IL-18至IL-36。
其包括，但不限于，CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、中性粒细胞和其他细胞，以及体液免疫反应。表位扩散不仅可以发生在CD8+T细胞中，也可以发生在CD4+T细胞中(Granot,T.和D.Meruelo,2012,Cancer Gene TheR.,19:588-591；Granot,
T.等人,2011,PLoS One 6:e20598；Granot,T.等人,2014,Mol Ther,22:112-122)。为了在
淋巴结中产生T细胞刺激的最佳条件，本发明的一个具体实施例包括多核苷酸和病毒介体，例如辛德毕斯病毒表达介体，其含有并递送编码(一种或多种)肿瘤相关抗原的多个(例如，两个或更多个)表位的核酸序列与编码某些免疫刺激细胞因子的核酸序列(基因)结合。此
类免疫刺激细胞因子包括，但不限于，白细胞介素IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-17。另外的细胞因子包括IL-18至IL-36。
[0250] 编码趋化因子的核酸序列也可以包括在多核苷酸和病毒介体核酸序列中，所述趋化因子包括，但不限于，CCL1至CCL27和其他CC趋化因子；CXCL1至CXCL13和其他CXC趋化因子；C趋化因子；和CX3C趋化因子。也可以使用编码细胞因子或趋化因子受体和可溶性受体的核酸序列。编码可以使用并掺入本发明的多核苷酸和病毒介体(例如，SV/TAA)的核酸序
列中的其他免疫调节剂的核酸序列包括，但不限于，TGF-β和TNFα。也可以使用上述(或替代的)细胞因子的不同组合。将理解，编码免疫刺激分子的核酸序列(基因)可以从插入例如编码如本文所述多个TAA表位的辛德毕斯病毒介体中的另外的启动子表达，或者可以包含在
共给药的单独介体中。
列中的其他免疫调节剂的核酸序列包括，但不限于，TGF-β和TNFα。也可以使用上述(或替代的)细胞因子的不同组合。将理解，编码免疫刺激分子的核酸序列(基因)可以从插入例如编码如本文所述多个TAA表位的辛德毕斯病毒介体中的另外的启动子表达，或者可以包含在
共给药的单独介体中。
[0251] 药物组合物
[0252] 本发明包括用于治疗患有癌症或肿瘤或有患癌症或肿瘤风险的受试者的药物组合物或制剂。在一个具体实施例中，药物组合物包含编码肿瘤相关抗原的多个(例如，两个或更多个)表位的多核苷酸(小基因)，其中每个表位被酶切割位点分开(例如弗林蛋白酶切
割位点)，以及用于处理和表达如本文所述编码表位的其他序列，以及可包括在多核苷酸中的其他编码序列(例如免疫刺激分子编码序列)，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在一个具体实施例中，药物组合物包含病毒介体或颗粒，例如本文所述辛德毕斯病毒介体
或假型化病毒介体，其含有编码肿瘤相关抗原的多个表位(例如，两个或更多个)的多核苷
酸(小基因)(其中每个表位被酶切割位点分开(例如弗林蛋白酶切割位点))，以及用于处理
和表达如本文所述编码表位的其他序列，以及可包含在多核苷酸中的其他编码序列(例如
免疫刺激分子编码序列)，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。当配制成药物组合物时，可以将本发明的治疗化合物或产品与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
割位点)，以及用于处理和表达如本文所述编码表位的其他序列，以及可包括在多核苷酸中的其他编码序列(例如免疫刺激分子编码序列)，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在一个具体实施例中，药物组合物包含病毒介体或颗粒，例如本文所述辛德毕斯病毒介体
或假型化病毒介体，其含有编码肿瘤相关抗原的多个表位(例如，两个或更多个)的多核苷
酸(小基因)(其中每个表位被酶切割位点分开(例如弗林蛋白酶切割位点))，以及用于处理
和表达如本文所述编码表位的其他序列，以及可包含在多核苷酸中的其他编码序列(例如
免疫刺激分子编码序列)，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。当配制成药物组合物时，可以将本发明的治疗化合物或产品与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
[0253] 包含本文中用于治疗癌症或肿瘤的剂组合的组合物的给药可以通过导致当与其他组分组合时治疗剂的浓度可有效改善、减少或稳定受试者的癌症的任何合适的方式。所
述组合物可以例如，配制在药学上可接受的缓冲液如生理盐水中而全身给药。给药途径包
括例如通过注射，例如，皮下(sc)、静脉内(iv)、腹膜内(ip)、肌肉内(im)或皮内给药，较佳在患者中提供连续、持续水平的药剂。待给药的治疗剂的量根据给药方式、患者的年龄、身体状况和体重以及癌症或肿瘤的临床症状而变化。通常，量将在那些用于治疗癌症或肿瘤
的其他基于病毒介体的剂的范围内，但在某些情况下，如果剂显示出增加的特异性，则需要更低的量。以显示治疗功效的剂量给药组合物，例如如通过本领域技术人员已知的方法测
定的增加免疫细胞(例如，效应T细胞；CD8+T细胞)水平，特别是TAA表位特异性T细胞水平，或降低癌细胞增殖。
述组合物可以例如，配制在药学上可接受的缓冲液如生理盐水中而全身给药。给药途径包
括例如通过注射，例如，皮下(sc)、静脉内(iv)、腹膜内(ip)、肌肉内(im)或皮内给药，较佳在患者中提供连续、持续水平的药剂。待给药的治疗剂的量根据给药方式、患者的年龄、身体状况和体重以及癌症或肿瘤的临床症状而变化。通常，量将在那些用于治疗癌症或肿瘤
的其他基于病毒介体的剂的范围内，但在某些情况下，如果剂显示出增加的特异性，则需要更低的量。以显示治疗功效的剂量给药组合物，例如如通过本领域技术人员已知的方法测
定的增加免疫细胞(例如，效应T细胞；CD8+T细胞)水平，特别是TAA表位特异性T细胞水平，或降低癌细胞增殖。
[0254] 一种或多种治疗剂可以任何合适的量包含在任何合适的载体物质中，并且通常以组合物总重量的1至95％重量的量存在。所述组合物可以以适合肠胃外(例如，皮下、静脉
内、肌肉内或腹膜内)给药途径的剂型提供，使得药剂(例如，本文所述病毒介体)全身递送。
可根据常规药学实践配制药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000and
Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,
1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
内、肌肉内或腹膜内)给药途径的剂型提供，使得药剂(例如，本文所述病毒介体)全身递送。
可根据常规药学实践配制药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000and
Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,
1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
[0255] 根据本发明的药物组合物可以配制成刚给药实质上立即释放活性剂，或在给药后的任何预定时间或时间段释放活性剂。后述类型的组合物通常称为控释制剂，其包括(i)在延长的时间段内在体内产生实质恒定浓度的剂的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在延长
的时间段内在体内产生实质恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有
效水平而在预定时间段内维持作用的制剂，伴随着与活性物质的血浆水平波动相关的不良
副作用的最小化(锯齿动力学模式)；(iv)通过例如邻近肿瘤或与肿瘤接触的控释组合物的
空间放置来定位作用的制剂；(v)允许方便给药的制剂，例如每一周或两周给药一次；(vi)使用载体或化学衍生物靶向癌症以将治疗剂递送至特定细胞类型(例如癌症或肿瘤细胞)
的制剂。对于一些应用，控释制剂消除了在白天频繁给药以维持所给药药剂的血浆水平在
治疗水平的需要。
的时间段内在体内产生实质恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有
效水平而在预定时间段内维持作用的制剂，伴随着与活性物质的血浆水平波动相关的不良
副作用的最小化(锯齿动力学模式)；(iv)通过例如邻近肿瘤或与肿瘤接触的控释组合物的
空间放置来定位作用的制剂；(v)允许方便给药的制剂，例如每一周或两周给药一次；(vi)使用载体或化学衍生物靶向癌症以将治疗剂递送至特定细胞类型(例如癌症或肿瘤细胞)
的制剂。对于一些应用，控释制剂消除了在白天频繁给药以维持所给药药剂的血浆水平在
治疗水平的需要。
[0256] 获得其中释放速率超过所述试剂的代谢速率的控制释放的方法并不意味着限制。举例来说，通过适当选择各种制剂参数和成分(包括，例如，各种类型的控释组合物和包衣)可以获得控制释放。因此，将治疗剂与合适的赋形剂一起配制成药物组合物，其在给药时以受控方式释放药剂。实例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、奈米颗粒、贴剂和脂质体。
[0257] 药物组合物可以通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)以剂型、制剂或通过合适的递送装置或包含常规、无毒的药学上可接受的载体和佐剂的植入物肠胃外给药。这些组合物的配方和制备是药物制剂领域技术人员所熟知的，并且可以在例如
Remington：The Science and Practice of Pharmacy中找到，见上文。
Remington：The Science and Practice of Pharmacy中找到，见上文。
[0258] 用于肠胃外递送和给药的组合物可以以单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)或在含有几个剂量的小瓶中提供，并且其中可以添加合适的防腐剂(参见下文)。组合物可以是溶
液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或者它可以作为干粉存在，以在使用前用水或其他合适的溶媒重组。除活性剂(例如，本文所述多核苷酸、病毒介体或颗粒)外，组合物可包括合适的肠胃外接受载体及/或赋形剂。可以将活性治疗剂掺入微球、微胶囊、奈米颗粒、脂质体等中以控制释放。此外，该组合物可包括悬浮、增溶、安定、pH调节剂、张力调节剂及/或分散剂。
液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或者它可以作为干粉存在，以在使用前用水或其他合适的溶媒重组。除活性剂(例如，本文所述多核苷酸、病毒介体或颗粒)外，组合物可包括合适的肠胃外接受载体及/或赋形剂。可以将活性治疗剂掺入微球、微胶囊、奈米颗粒、脂质体等中以控制释放。此外，该组合物可包括悬浮、增溶、安定、pH调节剂、张力调节剂及/或分散剂。
[0259] 在一些具体实施例中，配制包含一种或多种活性治疗剂(即，本文所述多核苷酸、病毒介体或颗粒)的组合物用于静脉内递送。如上所述，根据本发明的药物组合物可以是适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将一种或多种合适的治疗剂溶解或悬浮在
肠胃外可接受的液体溶媒中。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括水，通过加入适量的盐
酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至适当pH的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和右旋糖溶液。含水制剂还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种试剂仅微量或微溶于水的情况下，可以加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可以包括10至60％水于水的丙二醇等。
肠胃外可接受的液体溶媒中。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括水，通过加入适量的盐
酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至适当pH的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和右旋糖溶液。含水制剂还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种试剂仅微量或微溶于水的情况下，可以加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可以包括10至60％水于水的丙二醇等。
[0260] 传递方法
[0261] 向受试者(例如患有癌症的患者)给药本发明的多核苷酸(小基因)、病毒介体或药物组合物以治疗一种或多种上述癌症可导致表位在患者体内扩散。先前癌症疫苗策略的一
个缺点是肿瘤细胞群的异质性和基因组不稳定性，再加上治疗诱导的选择性压力，可能通
过流失或修饰疫苗中使用的肿瘤相关抗原而导致肿瘤逃逸。在这种情况下，本发明的一个
有利方面是诱导表位扩散的潜力，即针对癌症或肿瘤细胞内源的肿瘤相关抗原表位的抗肿
瘤T细胞应答的扩展，但不是在用癌症疫苗治疗期间由介体主动递送。临床试验越来越多地结合表位扩散的分析，并且在一些情况下，表现出表位扩散的诱导和治疗功效之间的正相
关性。
个缺点是肿瘤细胞群的异质性和基因组不稳定性，再加上治疗诱导的选择性压力，可能通
过流失或修饰疫苗中使用的肿瘤相关抗原而导致肿瘤逃逸。在这种情况下，本发明的一个
有利方面是诱导表位扩散的潜力，即针对癌症或肿瘤细胞内源的肿瘤相关抗原表位的抗肿
瘤T细胞应答的扩展，但不是在用癌症疫苗治疗期间由介体主动递送。临床试验越来越多地结合表位扩散的分析，并且在一些情况下，表现出表位扩散的诱导和治疗功效之间的正相
关性。
[0262] 在具体实施例中，可以任何方式递送本发明的可用于引发针对由这些剂编码的肿瘤相关抗原的多个表位的T细胞应答的多核苷酸(小基因)、病毒介体、病毒颗粒或药物组合物，例如，至细胞(特别是癌症或肿瘤细胞)，使得多核苷酸、病毒介体、病毒颗粒或组合物具有功能性和活性以表达编码序列。说明性地，可以将编码多个肿瘤相关抗原表位的氨基酸
序列的多核苷酸递送至细胞，用于异源表达细胞中的表位。因此，本发明的特征在于通过使细胞与包含多核苷酸，病毒介体或病毒颗粒的组合物接触或通过异源表达多核苷酸，病毒
介体或病毒颗粒而递送至细胞的多核苷酸，病毒介体或病毒颗粒细胞。
序列的多核苷酸递送至细胞，用于异源表达细胞中的表位。因此，本发明的特征在于通过使细胞与包含多核苷酸，病毒介体或病毒颗粒的组合物接触或通过异源表达多核苷酸，病毒
介体或病毒颗粒而递送至细胞的多核苷酸，病毒介体或病毒颗粒细胞。
[0263] 多核苷酸疗法
[0264] 用于治疗癌症或肿瘤生成的一种治疗方法是使用编码肿瘤相关抗原表位(例如本发明的一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位)的多核苷酸的多核苷酸疗法。预期
此类多核苷酸或核酸分子在相关细胞中的表达刺激免疫应答，例如细胞毒性T细胞应答、降低细胞存活及/或增加细胞死亡。可将此类核酸分子递送至患有癌症或肿瘤的受试者的细
胞。核酸分子必须以可以摄取它们的形式递送到受试者的细胞中，从而可以产生治疗有效
水平的编码产物。
此类多核苷酸或核酸分子在相关细胞中的表达刺激免疫应答，例如细胞毒性T细胞应答、降低细胞存活及/或增加细胞死亡。可将此类核酸分子递送至患有癌症或肿瘤的受试者的细
胞。核酸分子必须以可以摄取它们的形式递送到受试者的细胞中，从而可以产生治疗有效
水平的编码产物。
[0265] 转导病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)介体可用于将编码的蛋白质和肽产物递送至细胞，特别是因为它们具有高效率的感染和稳定的整合和表达(参见，例
如，Cayouette等人,Human Gene Therapy,8:423-430,1997；Kido等人,Current Eye
Research,15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology,71:6641-6649,1997；
Naldini等人 ,Science,272:263-267 ,1996；以及Miyoshi等人 ,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:10319,1997)。例如，可以将编码一种或多种肿瘤相关抗
原的多个表位的多核苷酸克隆到介体中，例如，如本文所述辛德毕斯病毒介体或假型化病
毒介体，并且可以从其内源启动子驱动表达、来自逆转录病毒长末端重复、或来自对目标靶细胞类型特异的启动子。可以使用的其他病毒介体包括例如痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或疱
疹病毒(参见，例如，Miller,Human Gene Therapy,15-14,1990；Friedman,Science,244:
1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques,6:608-614,1988；Tolstoshev等人,
Current Opinion in Biotechnology,1:55-61,1990；Sharp,The Lancet,337:1277-1278,
1991；Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology,36:311-322,
1987；Anderson,Science,226:401-409,1984；Moen,Blood Cells,17:407-416,1991；
Miller等人,Biotechnology,7:980-990,1989；Le Gal La Salle等人,Science,259:988-
990,1993；以及Johnson,Chest,107:77S-83S,1995的介体)。逆转录病毒介体是充分开发并且已经使用，例如，如在Rosenberg等人,NEJM,323:370,1990；Anderson等人和美国专利第
5,399,346号中所述。在一些具体实施例中，全身给药含有编码多种肿瘤相关抗原表位的多核苷酸或小基因的病毒介体。
如，Cayouette等人,Human Gene Therapy,8:423-430,1997；Kido等人,Current Eye
Research,15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology,71:6641-6649,1997；
Naldini等人 ,Science,272:263-267 ,1996；以及Miyoshi等人 ,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:10319,1997)。例如，可以将编码一种或多种肿瘤相关抗
原的多个表位的多核苷酸克隆到介体中，例如，如本文所述辛德毕斯病毒介体或假型化病
毒介体，并且可以从其内源启动子驱动表达、来自逆转录病毒长末端重复、或来自对目标靶细胞类型特异的启动子。可以使用的其他病毒介体包括例如痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或疱
疹病毒(参见，例如，Miller,Human Gene Therapy,15-14,1990；Friedman,Science,244:
1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques,6:608-614,1988；Tolstoshev等人,
Current Opinion in Biotechnology,1:55-61,1990；Sharp,The Lancet,337:1277-1278,
1991；Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology,36:311-322,
1987；Anderson,Science,226:401-409,1984；Moen,Blood Cells,17:407-416,1991；
Miller等人,Biotechnology,7:980-990,1989；Le Gal La Salle等人,Science,259:988-
990,1993；以及Johnson,Chest,107:77S-83S,1995的介体)。逆转录病毒介体是充分开发并且已经使用，例如，如在Rosenberg等人,NEJM,323:370,1990；Anderson等人和美国专利第
5,399,346号中所述。在一些具体实施例中，全身给药含有编码多种肿瘤相关抗原表位的多核苷酸或小基因的病毒介体。
[0266] 如本领域技术人员将理解的，非病毒方法也可用于将治疗性多肽引入受试者的细胞，所述受试者需要诱导T细胞表位免疫应答以抑制癌症或肿瘤的生长或诱导癌症或肿瘤
细胞死亡。例如，可以通过在脂质转染存在下给药核酸将核酸分子引入细胞中(Feigner等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,Neuroscience Letters,17:259,
1990；Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298:278,1989；Staubinger等人,Methods in
Enzymology,101:512,1983)、脱唾液酸黏蛋白-聚左旋赖氨酸接合(Wu等人,Journal of
Biological Chemistry,263:14621,1988；Wu等人,Journal of Biological Chemistry,
264:16985,1989)，或在手术条件下微注射(Wolff等人,Science,247:1465,1990)。另外，核酸可以与脂质体和鱼精蛋白组合给药。
细胞死亡。例如，可以通过在脂质转染存在下给药核酸将核酸分子引入细胞中(Feigner等
人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,Neuroscience Letters,17:259,
1990；Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298:278,1989；Staubinger等人,Methods in
Enzymology,101:512,1983)、脱唾液酸黏蛋白-聚左旋赖氨酸接合(Wu等人,Journal of
Biological Chemistry,263:14621,1988；Wu等人,Journal of Biological Chemistry,
264:16985,1989)，或在手术条件下微注射(Wolff等人,Science,247:1465,1990)。另外，核酸可以与脂质体和鱼精蛋白组合给药。
[0267] 也可以使用体外转染方法实现基因转移。这些方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。脂质体也可能有利于将DNA递送到细胞中。
[0268] 用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以来自任何合适的启动子(例如，辛德毕斯病毒启动子、人类巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)，并受任何适当的哺乳动物调节组件的调节。例如，如果需要，已知优先引导特定细胞类型中基因表达的增强子可用于引导核酸的表达。使用的增强子可包括，但不限于，那些特征为组织或细胞特异性增强子者。或者，调节可以由同源调节序列介导，或者如果需要，可以由衍生自异源的调节序列介导，包括上述任何启动子或调节组件。
[0269] 给药方法和治疗方案
[0270] 提供了向需要的受试者给药治疗剂的方法，例如患有癌症或肿瘤的受试者，或被识别为需要这种治疗的受试者)，其中有效量的如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗
粒，或将本文所述组合物给药于受试者以产生治疗攻果。根据本发明，治疗功效包括，但不限于，针对在其表面上表达TAA相关表位的癌症和肿瘤细胞的表位特异性免疫应答，例如通过由多核苷酸或病毒介体编码的多个表位激活的效应T细胞(例如，CD8+T细胞)，例如任选
地与MHC I类或II类分子结合的编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体。识别
需要这种治疗的受试者可以是受试者或健康护理专业人员的判断，并且可以是主观的(例
如意见)或客观的(例如可通过测试或诊断方法测量的)。
粒，或将本文所述组合物给药于受试者以产生治疗攻果。根据本发明，治疗功效包括，但不限于，针对在其表面上表达TAA相关表位的癌症和肿瘤细胞的表位特异性免疫应答，例如通过由多核苷酸或病毒介体编码的多个表位激活的效应T细胞(例如，CD8+T细胞)，例如任选
地与MHC I类或II类分子结合的编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体。识别
需要这种治疗的受试者可以是受试者或健康护理专业人员的判断，并且可以是主观的(例
如意见)或客观的(例如可通过测试或诊断方法测量的)。
[0271] 本发明的治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向有需要的受试者((例如，动物、人)，包括哺乳动物，特别是人)给药治疗有效量的本文所述药剂，例如多核苷酸、病毒介体、病毒颗粒或含有上述药剂的组合物。这种治疗将适合给药患有、易患癌症或肿瘤或具有癌
症或肿瘤风险的受试者，特别是人类。可以通过诊断测试或受试者或健康护理提供者的意
见(例如，基因测试、酶或蛋白质标记物或生物标记物、家族史等)以任何客观或主观确定来确定“有风险”的受试者。本文所述多核苷酸和病毒介体试剂也可用于治疗其中可能涉及一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的任何其他疾病或病症。
症或肿瘤风险的受试者，特别是人类。可以通过诊断测试或受试者或健康护理提供者的意
见(例如，基因测试、酶或蛋白质标记物或生物标记物、家族史等)以任何客观或主观确定来确定“有风险”的受试者。本文所述多核苷酸和病毒介体试剂也可用于治疗其中可能涉及一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的任何其他疾病或病症。
[0272] 在使用小鼠的临床前研究中，单次腹膜内(ip)注射治疗有效量的编码一种或多种7
肿瘤相关抗原(SV/TAA)的多个(例如，两个或更多个)表位的辛德毕斯病毒介体(～10 病毒
颗粒)，导致快速免疫原性递送至淋巴结并引发针对肿瘤的的可侦测CD8+介导的免疫应答
(实施例5，下文)。本领域技术人员将理解，对于在人类受试者中实现最大响应可能需要其他方案。例如，在人类患者中，治疗有效量的本发明的介体可以在约1至约8次腹膜内注射之间的范围内，每次治疗可以在约6至约12Log10的介体颗粒/kg的范围内进行，在约1周至数周的时间段内注射，可以注射一次或多次加强注射一周、几个月或几年，例如1年或更长时间。
肿瘤相关抗原(SV/TAA)的多个(例如，两个或更多个)表位的辛德毕斯病毒介体(～10 病毒
颗粒)，导致快速免疫原性递送至淋巴结并引发针对肿瘤的的可侦测CD8+介导的免疫应答
(实施例5，下文)。本领域技术人员将理解，对于在人类受试者中实现最大响应可能需要其他方案。例如，在人类患者中，治疗有效量的本发明的介体可以在约1至约8次腹膜内注射之间的范围内，每次治疗可以在约6至约12Log10的介体颗粒/kg的范围内进行，在约1周至数周的时间段内注射，可以注射一次或多次加强注射一周、几个月或几年，例如1年或更长时间。
[0273] 本发明的病毒介体、多核苷酸(小基因)和药物组合物可用于治疗患有癌症或肿瘤的患者，或预防性地接种具有某些癌症或肿瘤风险的患者，例如一般人口中的癌症预防性
疫苗。预防有效量的本发明介体的范围可以是受体每千克体重约102TU(转导单位)和受体
每千克约106TU千克体重的。相关癌症的小鼠模型可用于优化剂量和治疗方案。为了促进包括效应子和记忆CD8+T细胞的有效、持久的免疫应答，建立最佳剂量和免疫间隔。对初始甲病毒疫苗的CD8+T细胞应答迅速收缩，允许记忆T细胞的发育。在此收缩之前，额外给药病毒介体不会增加免疫应答(Knudsen,M.L.等人,2014,J Virol.,88:12438-12451)。强烈的I型
干扰素(IFN)对甲病毒RNA扩增的应答通过激活树突状细胞促进交叉启动来刺激记忆T细胞
的产生(Fuertes,M.B.等人,J Exp Med,208:2005-2016)。
疫苗。预防有效量的本发明介体的范围可以是受体每千克体重约102TU(转导单位)和受体
每千克约106TU千克体重的。相关癌症的小鼠模型可用于优化剂量和治疗方案。为了促进包括效应子和记忆CD8+T细胞的有效、持久的免疫应答，建立最佳剂量和免疫间隔。对初始甲病毒疫苗的CD8+T细胞应答迅速收缩，允许记忆T细胞的发育。在此收缩之前，额外给药病毒介体不会增加免疫应答(Knudsen,M.L.等人,2014,J Virol.,88:12438-12451)。强烈的I型
干扰素(IFN)对甲病毒RNA扩增的应答通过激活树突状细胞促进交叉启动来刺激记忆T细胞
的产生(Fuertes,M.B.等人,J Exp Med,208:2005-2016)。
[0274] 使用本发明组合物的典型治疗方案可包括SV/多个TAA表位病毒介体给药，随后每周数次监测淋巴细胞，使用流式细胞术确定效应CD8+T细胞的峰值和下降(CD62L-CD127-)。
此时，可以给药介体的加强剂，允许效应记忆T细胞(CD62L-CD127+)、中枢记忆T细胞(CD62L+CD127+)和具有持久高回忆能力的T细胞(CD27+CD43-)的增加。功效由阳性免疫反应和低肿
瘤复发决定。
此时，可以给药介体的加强剂，允许效应记忆T细胞(CD62L-CD127+)、中枢记忆T细胞(CD62L+CD127+)和具有持久高回忆能力的T细胞(CD27+CD43-)的增加。功效由阳性免疫反应和低肿
瘤复发决定。
[0275] 本发明不限于用于免疫和加强的介体。由DNA启动的甲病毒复制子诱导的T细胞亚群的分布可以通过异源加强来改变(Knudsen,M.L.等人,2-14,J.Virology,88：12438-
12451)。例如，用痘病毒介体(改良的牛痘安卡拉或MVA)加强可以促进T细胞区室的扩增，这可以大幅增加功效。在这具体实施例中，用于加强剂给药的病毒介体编码一种或多种肿瘤
相关抗原的多个(例如，两个或更多个)表位。任何抗原递送系统可用于加强由本发明的介
体诱导的免疫应答。非限制性实例包括复制缺陷型腺病毒、禽痘病毒、痘苗病毒、流感病毒、仙台病毒、裸DNA、质粒和肽(Woodland,D.L.,2004,TRENDS in Immunology,Vol.25(2):98-
104)。
12451)。例如，用痘病毒介体(改良的牛痘安卡拉或MVA)加强可以促进T细胞区室的扩增，这可以大幅增加功效。在这具体实施例中，用于加强剂给药的病毒介体编码一种或多种肿瘤
相关抗原的多个(例如，两个或更多个)表位。任何抗原递送系统可用于加强由本发明的介
体诱导的免疫应答。非限制性实例包括复制缺陷型腺病毒、禽痘病毒、痘苗病毒、流感病毒、仙台病毒、裸DNA、质粒和肽(Woodland,D.L.,2004,TRENDS in Immunology,Vol.25(2):98-
104)。
[0276] 介体给药的例示性途径包括，但不限于，肠胃外给药，例如通过腹膜内、静脉内、皮下、立体定位、肌肉内、鼻内、皮内、眶内、结节内和瘤内注射。其他给药方式可包括口服、颅内、眼、眶内、耳内、直肠、阴道内、栓剂、鞘内、吸入、气溶胶等。
[0277] 在某个具体实施例中，用于治疗的介体是有缺陷的辛德毕斯病毒介体，肿瘤是癌症或肿瘤，例如卵巢癌，并且肿瘤相关抗原的两个或更多个编码的表位包括p53、SP17、生存素、WT1和NY-ESO-1。在另一个具体实施例中，TAA是NY-ESO-1、gp70和pbk。在另一个具体实施例中，TAA包括NY-ESO-1和生存素。
[0278] 给药本发明的病毒介体的患者也可受益于辅助或其他治疗，例如如本领域技术人员所熟知的化学疗法及/或放射疗法。特别地，SV/TAA辛德毕斯病毒介体可以与化学疗法组合。在某些情况下，SV和化学疗法协同作用(例如，美国专利申请公开案第2016/0008431
号)，因此提供了改善的治疗功效及/或结果的潜力。合适的化疗包括，但不限于，刺激免疫系统的化学治疗，或抑制免疫系统中的抑制组件，或影响肿瘤细胞并使其对T细胞(或其他
免疫细胞)细胞毒性更敏感的化学治疗。例如，某些化学疗法可以促进用本文所述SV/TAA病毒介体进行治疗和疗法，因为它们减弱免疫抑制细胞的活性，从而增强SV/TAA病毒介体的
免疫刺激。此外，化学疗法可以增强肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性的易感性。
号)，因此提供了改善的治疗功效及/或结果的潜力。合适的化疗包括，但不限于，刺激免疫系统的化学治疗，或抑制免疫系统中的抑制组件，或影响肿瘤细胞并使其对T细胞(或其他
免疫细胞)细胞毒性更敏感的化学治疗。例如，某些化学疗法可以促进用本文所述SV/TAA病毒介体进行治疗和疗法，因为它们减弱免疫抑制细胞的活性，从而增强SV/TAA病毒介体的
免疫刺激。此外，化学疗法可以增强肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性的易感性。
[0279] 试剂盒
[0280] 本发明提供了用于治疗或预防癌症或肿瘤的试剂盒，特别是那些表达一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的试剂盒。在一个具体实施例中，所述试剂盒包含含有有效量的
如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒的治疗或预防组合物，其包含编码由酶切割位
点分开的一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的多核苷酸。在一个具体实施例
中，多核苷酸编码甲病毒蛋白或其片段。在一个具体实施例中，甲病毒蛋白或其片段是辛德毕斯病毒蛋白或其片段。在具体实施例中，表位和肿瘤相关抗原是那些上文表1至28中所示者。在一些具体实施例中，试剂盒包含无菌容器，其含有治疗或预防组合物；这种容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管子、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。
如本文所述多核苷酸、病毒介体或病毒颗粒的治疗或预防组合物，其包含编码由酶切割位
点分开的一种或多种肿瘤相关抗原的两个或更多个表位的多核苷酸。在一个具体实施例
中，多核苷酸编码甲病毒蛋白或其片段。在一个具体实施例中，甲病毒蛋白或其片段是辛德毕斯病毒蛋白或其片段。在具体实施例中，表位和肿瘤相关抗原是那些上文表1至28中所示者。在一些具体实施例中，试剂盒包含无菌容器，其含有治疗或预防组合物；这种容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管子、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。
[0281] 如果需要，一起提供包含一种或多种本发明的编码TAA多表位的病毒介体试剂的组合物，以及将该试剂给予患有癌症或肿瘤或具有有患癌症或肿瘤风险的对象的说明书。
说明书将通常包括关于组合物用于治疗或预防癌症或肿瘤的信息。在其他具体实施例中，
说明书包括以下的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防局部缺血或其症状的剂量方
案和给药；注意事项；警告；适应症；反的指示；药物过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；及/或参考。说明书可以直接印在容器上(当存在时)、或作为施用于容器的标签、或作为在容器中或与容器一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹。
说明书将通常包括关于组合物用于治疗或预防癌症或肿瘤的信息。在其他具体实施例中，
说明书包括以下的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防局部缺血或其症状的剂量方
案和给药；注意事项；警告；适应症；反的指示；药物过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；及/或参考。说明书可以直接印在容器上(当存在时)、或作为施用于容器的标签、或作为在容器中或与容器一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹。
[0282] 除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的知识范围内。这些技术在文献中有充分的解释，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”
(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒的生产，因此，可以在制备和实施本发明时考虑这些技术。用于特别具体实施例的特别有用的技术将在以
下部分中讨论。
(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸、病毒介体和病毒颗粒的生产，因此，可以在制备和实施本发明时考虑这些技术。用于特别具体实施例的特别有用的技术将在以
下部分中讨论。
[0283] 提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的测定法、筛选和治疗方法的完整揭示内容和描述，并且不旨在限制发明人视为他们的发明的范围。
[0284] 实施例
[0285] 实施例1-方法
[0286] 介体制备：使用分子生物学领域中普通技术人员熟知的标准技术进行重组病毒介体的构建，包括但不限于质粒纯化、限制性内切酶消化、连接、转化、聚合酶链式反应和DNA测序(例如，Current Protocols in Molecular Biology,EM.Ausubel等人(Eds),John
Wiley and Sons,Inc.,NY,USA.(1998)and Molecular Cloning:A Laboratory Manual
(2nd Ed.),J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis(Eds),Cold Spring Harbor
Laboratory Press,NY,USA.(1989))。
Wiley and Sons,Inc.,NY,USA.(1998)and Molecular Cloning:A Laboratory Manual
(2nd Ed.),J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis(Eds),Cold Spring Harbor
Laboratory Press,NY,USA.(1989))。
[0287] 对于使用编码LacZ(SV/LacZ)的辛德毕斯病毒介体作为免疫原性SV/TAA剂，以及SV/Fluc和SV/GFP作为对照介体的实验，如前所述制备介体。(Tseng J.C.等人,2004,
Nat.Biotechnol.,22:70–77)。简而言之，携带复制子(SinRep5-LacZ、SinRep5-GFP或
SinRep5-Fluc)或DHBB辅助RNA(SinRep5-tBB)的质粒用XhoI(对于SinRep5-LacZ、SinRep5-
GFP和SinRep5-tBB)或PacI线性化(对于SinRep5-Fluc)。使用mMessage mMachine RNA转录
试剂盒(Ambion,Austin,TX)进行体外转录。然后将辅助细胞和复制子RNA电穿孔到BHK细胞
中，并在37℃在补充有10％FBS的α-MEM中培养。12小时后，用补充有CaCl2(100μg/ml)的OPTI-MEM I(Invitrogen,Carlsbad，CA)替换培养基，并将细胞在37℃培养。24小时后，收集上清液，离心以除去细胞碎片，并在-80℃冷冻。如本领域已知的方式测定载体滴度(Tseng JC等人,2002,J Natl Cancer Inst.,94:1790-1802)，并且在所有三种介体(SV/LacZ，SV/
Fluc和SV/GFP)中相似。
Nat.Biotechnol.,22:70–77)。简而言之，携带复制子(SinRep5-LacZ、SinRep5-GFP或
SinRep5-Fluc)或DHBB辅助RNA(SinRep5-tBB)的质粒用XhoI(对于SinRep5-LacZ、SinRep5-
GFP和SinRep5-tBB)或PacI线性化(对于SinRep5-Fluc)。使用mMessage mMachine RNA转录
试剂盒(Ambion,Austin,TX)进行体外转录。然后将辅助细胞和复制子RNA电穿孔到BHK细胞
中，并在37℃在补充有10％FBS的α-MEM中培养。12小时后，用补充有CaCl2(100μg/ml)的OPTI-MEM I(Invitrogen,Carlsbad，CA)替换培养基，并将细胞在37℃培养。24小时后，收集上清液，离心以除去细胞碎片，并在-80℃冷冻。如本领域已知的方式测定载体滴度(Tseng JC等人,2002,J Natl Cancer Inst.,94:1790-1802)，并且在所有三种介体(SV/LacZ，SV/
Fluc和SV/GFP)中相似。
[0288] 细胞系和细胞培养：幼仓鼠肾(BHK)、CT26.WT和表达LacZ的CT26.CL25细胞获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas，VA)。将
BHK细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)的最低限度的必需α-修饰的培养基(α-MEM)(Mediatech，VA)中。将CT26.WT，CT26.CL25细胞维持在含有补充有10％FBS的4.5g/L葡萄糖(Mediatech)的达尔伯克氏改良的必需培养基(DMEM)中。所
有基础培养基补充有100mg/mL的青霉素-链霉素(Mediatech)和0.5mg/mL的两性霉素B
(Mediatech)。病毒体产生：如美国专利案第7,303,898、7,306,792和8,093,021号中所述产生辛德毕斯病毒介体。简而言之，携带复制子pT7StuI-R或DHBB辅助RNA(SinRep5-tBB)的质粒用合适的限制酶线性化。使用mMessage RNA转录试剂盒(Ambion，TX)，根据制造商的说明书进行体外转录。然后将辅助和复制子RNA电穿孔到BHK细胞中，并在37℃在补充有10％FBS的MEM中培养。12小时后，用补充有CaCl2(100μg/mL)的OPTIMEM I(Life Sciences，CA)取代培养基，并将细胞在37℃培养24小时后，收集上清液，离心以除去细胞碎片，在-80℃冷冻。
使用本领域中实施的RT-qPCR测定介体的滴度。
BHK细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)的最低限度的必需α-修饰的培养基(α-MEM)(Mediatech，VA)中。将CT26.WT，CT26.CL25细胞维持在含有补充有10％FBS的4.5g/L葡萄糖(Mediatech)的达尔伯克氏改良的必需培养基(DMEM)中。所
有基础培养基补充有100mg/mL的青霉素-链霉素(Mediatech)和0.5mg/mL的两性霉素B
(Mediatech)。病毒体产生：如美国专利案第7,303,898、7,306,792和8,093,021号中所述产生辛德毕斯病毒介体。简而言之，携带复制子pT7StuI-R或DHBB辅助RNA(SinRep5-tBB)的质粒用合适的限制酶线性化。使用mMessage RNA转录试剂盒(Ambion，TX)，根据制造商的说明书进行体外转录。然后将辅助和复制子RNA电穿孔到BHK细胞中，并在37℃在补充有10％FBS的MEM中培养。12小时后，用补充有CaCl2(100μg/mL)的OPTIMEM I(Life Sciences，CA)取代培养基，并将细胞在37℃培养24小时后，收集上清液，离心以除去细胞碎片，在-80℃冷冻。
使用本领域中实施的RT-qPCR测定介体的滴度。
[0289] 小鼠、肿瘤接种和治疗功效：4至8周龄雌性BALB/c小鼠购自Taconic(Germantown，NY)。对于腹膜内注射0.2mL PBS中的肿瘤模型，2.5×104或5×104个CT26.CL25细胞。每只老鼠。对于肺肿瘤模型，将0.2ml PBS中的0.3×106个CT26.WT.Fluc或CT26.CL25.Fluc细胞静脉内注射到每只小鼠中。以三种方式监测治疗功效：肿瘤体积(用于皮下肿瘤，用机械卡尺测量)、肿瘤发光和存活。使用IVIS光谱成像系统(Caliper Life Sciences，Inc.，MA)进行无创生物发光成像，并使用Living Image 3.0软件(Caliper Life Sciences)定量肿瘤生
长。每天监测并记录动物的存活率。
长。每天监测并记录动物的存活率。
[0290] 流式细胞术：流式细胞术用于分析从器官、腹膜或外周血液中提取的淋巴细胞。用1x RBC裂解缓冲液(eBioscience)处理细胞以消除红细胞。收集腹膜细胞并用各种Ab染色，用HBSS缓冲液(Mediatech)洗涤两次，并使用LSR II机器(BD Biosciences，San Jose，CA)分析。使用FlowJo(Tree Star，San Carlos，CA)分析数据。
[0291] SV/Fluc的生物发光成像：给荷瘤的和无肿瘤的小鼠腹膜内注射SV/Fluc(在0.5ml 7
OPTI-MEM I 0.5ml中～10个噬斑形成单位)。处理后，通过IVIS在指定的时间点侦测生物
发光信号(Tseng,J.C.等人，2004)。
OPTI-MEM I 0.5ml中～10个噬斑形成单位)。处理后，通过IVIS在指定的时间点侦测生物
发光信号(Tseng,J.C.等人，2004)。
[0292] 实施例2-构建表达多个表位的辛德毕斯病毒介体以诱导抗肿瘤免疫
[0293] 使用标准分子生物学方法，由GeneArt(Life Technologies Corp.，Waltham MA)合成编码由弗林蛋白酶切割位点分开的多个T细胞识别表位的多核苷酸(DNA序列；小基
因)。合成的多核苷酸含有核糖体结合位点、翻译起始密码子、内质网信号序列，随后是散布有表位编码序列的弗林蛋白酶切割位点、终止密码子和允许多核苷酸序列插入辛德华斯复
制子pT7StuI-RLacZ#202的XbaI/ApaI限制性内切核酸酶位点(WO 2015/035213A2)以取代
LacZ基因的限制酶位点。辛德华斯复制子含有XbaI位点上游的病毒亚基因组启动子序列和
位于ApaI位点下游的mRNA多腺苷酸序列。这合成的DNA序列及其编码的氨基酸序列如下：
因)。合成的多核苷酸含有核糖体结合位点、翻译起始密码子、内质网信号序列，随后是散布有表位编码序列的弗林蛋白酶切割位点、终止密码子和允许多核苷酸序列插入辛德华斯复
制子pT7StuI-RLacZ#202的XbaI/ApaI限制性内切核酸酶位点(WO 2015/035213A2)以取代
LacZ基因的限制酶位点。辛德华斯复制子含有XbaI位点上游的病毒亚基因组启动子序列和
位于ApaI位点下游的mRNA多腺苷酸序列。这合成的DNA序列及其编码的氨基酸序列如下：
[0294] DNA序列
[0295] TCTAGAGCCACCATGCTGGTGACAGCCATGTGTCTGCTGGGCAATGTCAGCTTCGTCCGGAGCAAGCGGCTGCGGGGACCAGAGTCTCGGCTCCTGGAGGTGCGGAGCAAGCGGCTGTCCCCATCTTACGCCTACCACCAGTTC
GTCCGGAGCAAGCGGCTGGGCTGTGCCTTCCTGACCGTGAAGCAGATGCGGAGCAAGCGGCTGTGAGGGCCC(SEQ
ID NO：10)
GTCCGGAGCAAGCGGCTGGGCTGTGCCTTCCTGACCGTGAAGCAGATGCGGAGCAAGCGGCTGTGAGGGCCC(SEQ
ID NO：10)
[0296] 氨基酸序列
[0297] MLVTAMCLLGNVSFVRSKRLRGPESRLLEVRSKRLSPSYAYHQFVRSKRLGCAFLTVKQMRSKRL*(SEQ ID NO：11)
[0298] 将合成的多核苷酸序列插入GeneArt pMX质粒中，并作为DNA质粒提供。将质粒转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(New England BioLabs)中。使克隆生长，并纯化质粒
DNA。通过DNA测序(Macrogen USA)验证克隆。限制酶XbaI和ApaI用于从pMX质粒介体中切除DNA多核苷酸(小基因)。提取后，将多核苷酸(小基因)克隆到pT7StuI-RLacZ#202介体中。示意性地，所描述的小基因在图1A中描绘出，而且图1B中示出了精确的顺序排列。
DNA。通过DNA测序(Macrogen USA)验证克隆。限制酶XbaI和ApaI用于从pMX质粒介体中切除DNA多核苷酸(小基因)。提取后，将多核苷酸(小基因)克隆到pT7StuI-RLacZ#202介体中。示意性地，所描述的小基因在图1A中描绘出，而且图1B中示出了精确的顺序排列。
[0299] 因为辛德毕斯病毒多肽由弗林蛋白酶天然处理，编码辛德毕尔弗林蛋白酶消化基序XRSKRX(SEQ ID NO：5)(其中X是疏水残基)的核酸序列被掺入多核苷酸中以允许正确处
理肿瘤相关抗原的编码表位。弗林蛋白酶表位-弗林蛋白酶序列的5'侧翼区域也编码核糖
体结合位点、起始密码子和甲病毒内质网(ER)信号序列。包括ER信号序列以促进多表位多
肽易位到其中发生弗林蛋白酶消化的ER中。终止密码子包括在多核苷酸的3'末端(小基
因)。限制酶位点XbaI和ApaI分别被分子工程化到多核苷酸的5'和3'末端中，以便将合成的多核苷酸序列克隆到就在驱动高水平转录的病毒亚基因组启动子下游的辛德毕斯病毒介
体核酸中。
理肿瘤相关抗原的编码表位。弗林蛋白酶表位-弗林蛋白酶序列的5'侧翼区域也编码核糖
体结合位点、起始密码子和甲病毒内质网(ER)信号序列。包括ER信号序列以促进多表位多
肽易位到其中发生弗林蛋白酶消化的ER中。终止密码子包括在多核苷酸的3'末端(小基
因)。限制酶位点XbaI和ApaI分别被分子工程化到多核苷酸的5'和3'末端中，以便将合成的多核苷酸序列克隆到就在驱动高水平转录的病毒亚基因组启动子下游的辛德毕斯病毒介
体核酸中。
[0300] 在该实施例中，将不同肿瘤相关抗原的两个或更多个表位(即，3个不同表位)掺入辛德毕斯病毒介体，即如本文所述人类NY-ESO-1(其是在人类卵巢癌和其他人类癌症中表
达的肿瘤相关抗原)的表位；gp70(其是内源性鼠白血病病毒抗原)的表位；和生存素(其是
在许多肿瘤中高度表达的抗凋亡蛋白)的表位。三个表位在表30中呈现，并且在CT26肿瘤中高度表达，但在正常小鼠组织中具有低表达。
达的肿瘤相关抗原)的表位；gp70(其是内源性鼠白血病病毒抗原)的表位；和生存素(其是
在许多肿瘤中高度表达的抗凋亡蛋白)的表位。三个表位在表30中呈现，并且在CT26肿瘤中高度表达，但在正常小鼠组织中具有低表达。
[0301]
[0302] 确定体内抗肿瘤功效：为了测试编码如上所述不同肿瘤相关抗原(TAA)的多个(3)表位的辛德毕斯病毒介体的抗肿瘤功效(本文中表示为“SV/MG”或“SV/MG-CT26”)，使用Balb/c CT26结肠癌肿瘤模型(其中将CT26/NY-ESO-1细胞腹膜内注射到BALB/c小鼠中)。
CT26是用人类NY-ESO-1cDNA转染并稳定表达人类NY-ESO-1及其表位的鼠结肠癌细胞系，可
从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。当注射到易感小鼠中时，细胞在动物中形成实体瘤。CT26细胞也可以用蛋白质转染，例如LacZ、荧光素酶、GFP，以帮助在动物研究中侦测肿瘤。例示性给药方案如图2A所示。
CT26是用人类NY-ESO-1cDNA转染并稳定表达人类NY-ESO-1及其表位的鼠结肠癌细胞系，可
从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。当注射到易感小鼠中时，细胞在动物中形成实体瘤。CT26细胞也可以用蛋白质转染，例如LacZ、荧光素酶、GFP，以帮助在动物研究中侦测肿瘤。例示性给药方案如图2A所示。
[0303] 肿瘤成像：使用IVIS系统定期监测生物发光信号。使用Living Image软件(Xenogen Corp.，Alameda，CA)对成像数据进行网格化，并将每个盒装区域中的总生物发光信号(RLU)进行积分，以获得图2B所示的数据。野生型CT26细胞和表达LacZ的CT26细胞
(CT26.CL25(LacZ)细胞)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。CT26.CL.25(LacZ)细胞表达几种肿瘤相关抗原。(Castle,J.C.等人,2014,BMC Genomics,15:190)。表达NY-
ESO-1表位的CT26.CL25细胞如Gnjatic,S.等人,2006,Adv Cancer Res,95:1-30中所述。通
过将表达Fluc的质粒稳定转染到CT26.WT和CT26.CL25细胞中，而产生用于非侵入性生物发
光成像的表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的CT26细胞(CT26.WT.Fluc和CT26.CL25.Fluc)。通过
将SV40启动子序列引入pGL4.20介体的多克隆位点，来构建表达Fluc的质粒(Promega,WI)
(Granot,T.等人,2014,Mol.Ther.,22:112-122)。
(CT26.CL25(LacZ)细胞)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。CT26.CL.25(LacZ)细胞表达几种肿瘤相关抗原。(Castle,J.C.等人,2014,BMC Genomics,15:190)。表达NY-
ESO-1表位的CT26.CL25细胞如Gnjatic,S.等人,2006,Adv Cancer Res,95:1-30中所述。通
过将表达Fluc的质粒稳定转染到CT26.WT和CT26.CL25细胞中，而产生用于非侵入性生物发
光成像的表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的CT26细胞(CT26.WT.Fluc和CT26.CL25.Fluc)。通过
将SV40启动子序列引入pGL4.20介体的多克隆位点，来构建表达Fluc的质粒(Promega,WI)
(Granot,T.等人,2014,Mol.Ther.,22:112-122)。
[0304] 如图2B所示，与用阴性对照和无关对照辛德毕斯病毒介体处理的动物相比，用多TAA表位辛德毕斯病毒介体(SV/MG)处理的动物中CT26/NY-ESO-1肿瘤细胞在延长的时间段
(例如，给药后第27天)的生长惊人的低。图2B显示的对照是未接受辛德毕斯病毒介体的小
鼠(对照)，其为接受SV/LacZ(其是编码细菌酶β-半乳糖苷酶(LacZ)的辛德毕斯病毒介体，为无关的肿瘤相关抗原)的小鼠，；和阳性对照辛德毕斯病毒介体SV/NY-ESO-1，其编码NY-ESO-1肿瘤相关抗原并且有效地减少了荷瘤的动物中CT26/NY-ESO-1肿瘤细胞的生长。
(例如，给药后第27天)的生长惊人的低。图2B显示的对照是未接受辛德毕斯病毒介体的小
鼠(对照)，其为接受SV/LacZ(其是编码细菌酶β-半乳糖苷酶(LacZ)的辛德毕斯病毒介体，为无关的肿瘤相关抗原)的小鼠，；和阳性对照辛德毕斯病毒介体SV/NY-ESO-1，其编码NY-ESO-1肿瘤相关抗原并且有效地减少了荷瘤的动物中CT26/NY-ESO-1肿瘤细胞的生长。
[0305] 在相关实施例中，可以使用上述用于在CT26肿瘤小鼠模型中测试的相同技术制备编码肿瘤相关抗原的多个表位的另一种辛德毕斯病毒介体(例如，称为SV/MG介体)。用于治疗CT26小鼠模型中的肿瘤的辛德毕斯病毒介体编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1的表位、病毒抗
原gp70的表位和来自肿瘤相关抗原Pbk的表位，也称为T细胞源蛋白激酶的TOPK。有利地，这些表位在CT26.CL25肿瘤细胞中高度表达，但在小鼠组织中具有低表达。包含在SV/MG介体
中的表位序列示于下表31中。在具体实施例中，SV介体中包含HIV gp120或gp41的表位序列和来自人类pbk或人类pbk直向同源基因的表位序列。
原gp70的表位和来自肿瘤相关抗原Pbk的表位，也称为T细胞源蛋白激酶的TOPK。有利地，这些表位在CT26.CL25肿瘤细胞中高度表达，但在小鼠组织中具有低表达。包含在SV/MG介体
中的表位序列示于下表31中。在具体实施例中，SV介体中包含HIV gp120或gp41的表位序列和来自人类pbk或人类pbk直向同源基因的表位序列。
[0306] 表31.在辛德毕斯病毒多TAA表位介体中使用的表位
[0307]抗原 MHC 1 表位
NY-ESO-1 H2Dd LLMWITQCF(SEQ ID NO:1)
MuLV gp70 H2Ld SPSYVYHQF(SEQ ID NO:281)
d
Pbk H2D GSPFPAAVI(SEQ ID NO:2)
NY-ESO-1 H2Dd LLMWITQCF(SEQ ID NO:1)
MuLV gp70 H2Ld SPSYVYHQF(SEQ ID NO:281)
d
Pbk H2D GSPFPAAVI(SEQ ID NO:2)
[0308] 通过合成如下所述双链寡聚体和DNA引物(GeneLink Inc.)，而制备包含用于辛德毕斯病毒介体表达的肿瘤相关抗原NY-ESO-1、gp70和pbk的多个表位序列的多核苷酸。常规PCR技术用于产生两个片段，其末端通过错误引发而被修饰，使得它们共享同源区域。当这两个片段混合，变性和再退火时，片段顶链的3'末端退火到片段底链的3'末端，并且这种重叠延伸而形成重组产物。重复该过程，直至并入所有表位片段。
[0309] A.低聚物
[0310]
[0311] RSKR＝弗林素序列
[0312] B.引物
[0313] 引物1:5'agg agc aaa aga cac agc ccc agc 3'(SEQ ID NO:288)
[0314] 引物2:5'tct ttt gct cct gaa ctg gtg gta 3'(SEQ ID NO:289)
[0315] 引物3:5'tac cac cag ttc agg agc aaa aga 3'(SEQ ID NO:290)
[0316] 引物4:5'tct ttt gct cct gaa gca ctg ggt 3'(SEQ ID NO:291)
[0317] 引物5:5'acc cag tgc ttc agg agc aaa aga 3'(SEQ ID NO:292)
[0318] 引物6:5'ggt cac agc ggc ggg gaa 3'(SEQ ID NO:293)
[0319] 通过悬突延伸(SOE)PCR反应进行PCR和剪接在热循环仪中进行25个循环，每个循环包括94℃进行1分钟，50℃进行2分钟和72℃进行3分钟。用终体积为20μl的含有dNTP(200μM)、正向和反向引物(0.5μM/各引物)和1μTaq-DNA聚合酶的反应缓冲液进行Taq-PCR反应。
通过琼脂糖凝胶中的电泳而分析PCR产物，从凝胶上切下DNA条带，并用凝胶提取试剂盒
(Zymo Research)纯化。将完成的多表位片段平端连接到pT7StuI-RΔLacZ#202质粒介体的
NaeI位点，转化到大肠杆菌中，纯化并测序。
通过琼脂糖凝胶中的电泳而分析PCR产物，从凝胶上切下DNA条带，并用凝胶提取试剂盒
(Zymo Research)纯化。将完成的多表位片段平端连接到pT7StuI-RΔLacZ#202质粒介体的
NaeI位点，转化到大肠杆菌中，纯化并测序。
[0320] 实施例3-编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体产生多表位mRNA
[0321] 进行实验以确定编码肿瘤相关抗原(即，如上文实施例2中所述NY-ESO-1、gp70和生存素)的多个表位的辛德毕斯病毒介体(SV MG-CT26)，是否产生了正确的多表位mRNA。对于所述实验，使用10倍连续稀释的编码多个表位的辛德毕斯病毒介体(本文称为“SV/MG-
CT.26”(100至10-11))来感染2×104个幼仓鼠肾细胞。培养过夜后，通过离心而收集细胞，并使用Qiagen试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据制造商的说明单离RNA。使用nanodrop分光亮度计定量RNA。
CT.26”(100至10-11))来感染2×104个幼仓鼠肾细胞。培养过夜后，通过离心而收集细胞，并使用Qiagen试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据制造商的说明单离RNA。使用nanodrop分光亮度计定量RNA。
[0322] 根据制造商的说明书，使用ThermoScript(Life Technologies，CA)对1微克(1μg)的每个样本进行逆转录。cDNA5_R反向引物5'TTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG(SEQ ID NO：294)以50μM的浓度使用，以将RNA转录成cDNA。使用30μl总cDNA反应中的5μl进行定量PCR(qPCR)。根据制造商的说明书(BioRad，CA)，使用Syber绿色主反应混合物。使用10倍稀释的pT7StuI-R-MG_CT26质粒DNA产生标准曲线，从其制备病毒介体。为了进行qPCR，正向引物是：辛德毕斯位置7692：TGATCCGACCAGCAAAACTC(SEQ ID NO：295)，反向引物是cDNA5_R pos.7990：TTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG(SEQ ID NO：294)。使用的引物浓度为10μM。
使用MyiQ循环器(BioRad，CA)进行qPCR。产生的转录物的稀释因子和皮克(pg)列于下表中。
使用MyiQ循环器(BioRad，CA)进行qPCR。产生的转录物的稀释因子和皮克(pg)列于下表中。
[0323] 表32
[0324]稀释因子 转录物(以pg计)
100 1122
10-2 26.5
10-4 1.39
100 1122
10-2 26.5
10-4 1.39
[0325] 图3显示了经过琼脂糖凝胶电泳的染色的qPCR DNA产物的UV图像。在来自qPCR的染色DNA样本的UV图像中，泳道如下识别：泳道(-)：来自未感染BHK的cDNA；泳道(+)：来自pSV/MG质粒的RNA/cDNA；泳道M，100碱基对梯子标记；泳道(-4)、泳道(-3)、泳道(-2)、泳道(-1)和泳道(0)分别显示分别稀释为10-4、10-3、10-2、10-1的来自以所述稀释度感染SV/MG-CT.26的幼仓鼠肾(BHK)细胞的RNA的qPCR产物。来自表32中所示的qPCR实验的结果表明编
码NY-ESO-1、gp70和生存素肿瘤相关抗原的多个表位的多核苷酸在BHK细胞中转录。琼脂糖凝胶电泳表明qPCR转录物的预期大小为204个碱基对(bp)(图3)。
码NY-ESO-1、gp70和生存素肿瘤相关抗原的多个表位的多核苷酸在BHK细胞中转录。琼脂糖凝胶电泳表明qPCR转录物的预期大小为204个碱基对(bp)(图3)。
[0326] 实施例4-用SV/多表位介体进行临床前预防性和治疗性治疗
[0327] 表33中呈现的治疗方案用于测试CT26/NY-ESO-1肿瘤细胞的预防性、治疗性和联合治疗，其通过给药编码肿瘤相关抗原(特别是，如上文实施例2中所述NY-ESO-1癌抗原)的多个表位的辛德毕斯病毒介体，并显示于图2A中。该方案设计成在确定在接种肿瘤细胞(例如，辛德毕斯病毒介体疫苗)之前，用表达来自多种肿瘤相关抗原(即，SV/NY-ESO-1-gp70-生存素)的表位的辛德毕斯病毒介体预防性治疗动物的功效。该方案还被设计成用于确定
以两个时间间隔给药的额外加强接种的功效；肿瘤接种后仅进行介体治疗的效果；以及联
合疫苗和治疗介体治疗的效果。
以两个时间间隔给药的额外加强接种的功效；肿瘤接种后仅进行介体治疗的效果；以及联
合疫苗和治疗介体治疗的效果。
[0328] 表33使用SV/多表位介体的治疗方案
[0329]
[0330] 实施例5-用辛德毕斯病毒-多表位介体的临床治疗
[0331] 编码卵巢癌肿瘤相关抗原(SV/多表位介体)的多个表位的辛德毕斯病毒介体，所述抗原包括例如NY-ESO-1、CEA或CA-125中的两种或更多种(Schwab,CL等人,2014),
Immunotherapy,6:1279-1293)将会有利于用于治疗卵巢癌。筛查来自经历肿瘤切除手术的
患者的肿瘤可用于确定用编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体治疗是否将
基于患者的癌症或肿瘤细胞上的TAA的存在以及患者的特异性抗原呈递HLA单倍型而有益，
例如，如下文实施例6中所述。在给药编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体后，可以获得所选患者的体液样本，例如血液、血清或血浆，以监测血液淋巴细胞，以检查患者的免疫应答并引导治疗方案。例如，可以随时间分析患者血液中效应CD8+T细胞的存在，并确定效应细胞是否下降并且是否出现记忆(CD27+CD43-CD8+)T细胞。本领域的常规技术适用于分析患者血液样本中是否存在合适的T细胞，例如流式细胞术、免疫组织化
学、染色(例如免疫荧光染色)。当侦测到记忆细胞应答时，可以给药编码肿瘤相关抗原表位的辛德毕斯病毒介体的第二次给药以增强患者的免疫应答。
Immunotherapy,6:1279-1293)将会有利于用于治疗卵巢癌。筛查来自经历肿瘤切除手术的
患者的肿瘤可用于确定用编码肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体治疗是否将
基于患者的癌症或肿瘤细胞上的TAA的存在以及患者的特异性抗原呈递HLA单倍型而有益，
例如，如下文实施例6中所述。在给药编码一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位的辛德毕斯病毒介体后，可以获得所选患者的体液样本，例如血液、血清或血浆，以监测血液淋巴细胞，以检查患者的免疫应答并引导治疗方案。例如，可以随时间分析患者血液中效应CD8+T细胞的存在，并确定效应细胞是否下降并且是否出现记忆(CD27+CD43-CD8+)T细胞。本领域的常规技术适用于分析患者血液样本中是否存在合适的T细胞，例如流式细胞术、免疫组织化
学、染色(例如免疫荧光染色)。当侦测到记忆细胞应答时，可以给药编码肿瘤相关抗原表位的辛德毕斯病毒介体的第二次给药以增强患者的免疫应答。
[0332] 表达例示性肿瘤相关抗原(TAA)LacZ的SV介体在CT26肿瘤小鼠模型中有效并维持具有表达LacZ的CT26肿瘤的小鼠的存活(图4A)，以及诱导CD8+T细胞对肿瘤模型的应答的
多样化(图4B)已由本发明人使用编码细菌β-半乳糖苷酶(LacZ)酶的辛德毕斯病毒介体
(SV/LacZ)和编码绿色荧光蛋白(GFP)的比较对照德毕斯病毒病毒介体(SV/GFP)的研究证
明。。图4A显示用上述不同辛德毕斯病毒介体处理的小鼠的存活图。对于这些研究，在肿瘤接种后4天，用SV/LacZ介体、对照SV/GFP介体或培养基(模拟)处理CT26荷瘤小鼠。将0.5ml Optimem(Mediatech，VA)中的107个病毒颗粒的腹膜内接种给药小鼠。仅发现SV/LacZ介体
诱导完全肿瘤缓解至少60天。图4B涉及使用四聚体，标记的四聚体MHC分子(Altman,JD等
人,1996,Science,274(5284):94-96)作为识别用辛德毕斯介体SV/处理的小鼠中的特异性
T细胞的敏感手段。在用编码LacZ的辛德毕斯介体处理后，发现来自SV/LacZ处理的小鼠的
脾细胞含有对LacZ和gp70两者(内源性CT26肿瘤相关抗原)特异的CD8+T细胞。不同于给药
于小鼠的SV/LacZ介体所产生者，针对抗原的效应T细胞的产生因此表明在SV/LacZ处理的
动物中发生了表位扩散。图4C呈现用SV/LacZ介体或初始对照处理后成像14天的代表性小
鼠的照片，其中发现肿瘤(CT26结肠肿瘤)在初始小鼠(即，那些未用SV/LacZ处理的小鼠)中生长，但是在用表达LacZ抗原的SV/LacZ介体(SV/LacZ存活小鼠)处理的小鼠中没有。
多样化(图4B)已由本发明人使用编码细菌β-半乳糖苷酶(LacZ)酶的辛德毕斯病毒介体
(SV/LacZ)和编码绿色荧光蛋白(GFP)的比较对照德毕斯病毒病毒介体(SV/GFP)的研究证
明。。图4A显示用上述不同辛德毕斯病毒介体处理的小鼠的存活图。对于这些研究，在肿瘤接种后4天，用SV/LacZ介体、对照SV/GFP介体或培养基(模拟)处理CT26荷瘤小鼠。将0.5ml Optimem(Mediatech，VA)中的107个病毒颗粒的腹膜内接种给药小鼠。仅发现SV/LacZ介体
诱导完全肿瘤缓解至少60天。图4B涉及使用四聚体，标记的四聚体MHC分子(Altman,JD等
人,1996,Science,274(5284):94-96)作为识别用辛德毕斯介体SV/处理的小鼠中的特异性
T细胞的敏感手段。在用编码LacZ的辛德毕斯介体处理后，发现来自SV/LacZ处理的小鼠的
脾细胞含有对LacZ和gp70两者(内源性CT26肿瘤相关抗原)特异的CD8+T细胞。不同于给药
于小鼠的SV/LacZ介体所产生者，针对抗原的效应T细胞的产生因此表明在SV/LacZ处理的
动物中发生了表位扩散。图4C呈现用SV/LacZ介体或初始对照处理后成像14天的代表性小
鼠的照片，其中发现肿瘤(CT26结肠肿瘤)在初始小鼠(即，那些未用SV/LacZ处理的小鼠)中生长，但是在用表达LacZ抗原的SV/LacZ介体(SV/LacZ存活小鼠)处理的小鼠中没有。
[0333] 图5B中呈现的结果证明SV/LacZ诱导的表位扩散成功地抵抗了LacZ表达的丧失。由SV/LacZ处理的小鼠中的阴性肿瘤细胞生长所证明，通过将SV/LacZ介体给药CT26肿瘤小
鼠模型中的小鼠，而产生的这种SV/LacZ依赖性表位扩散显着促进了用SV/LacZ辛德毕斯病
毒介体处理的小鼠中肿瘤生长及其存活的完全抑制(图4C)。这些结果证明携带β半乳糖苷
酶(LacZ)的SV介体在表达LacZ的CT26荷瘤小鼠中具有显着的治疗效果。
鼠模型中的小鼠，而产生的这种SV/LacZ依赖性表位扩散显着促进了用SV/LacZ辛德毕斯病
毒介体处理的小鼠中肿瘤生长及其存活的完全抑制(图4C)。这些结果证明携带β半乳糖苷
酶(LacZ)的SV介体在表达LacZ的CT26荷瘤小鼠中具有显着的治疗效果。
[0334] 图5A和5B显示用于评估体内治疗(免疫疗法)的结果的成像和流式细胞术的组合，所述体内治疗使用表达至少一种源自肿瘤相关抗原(SV/TAA)的表位(即，LacZ多肽)和用于
病毒传递的成像的萤火虫荧光素酶的辛德毕斯病毒介体。图5A显示用于在小鼠中非侵入性
地和纵向地确定在用SV/TAA介体注射小鼠后，由如本文所述辛德毕斯病毒介体编码的荧光
素酶肿瘤相关抗原的表达位点的体内成像的代表性结果。在SV/TAA介体接种后3小时，对小鼠成像。在24小时，提取纵隔和腹股沟淋巴结，并单离T细胞和评估T细胞活化标记物CD69的存在。与腹股沟淋巴结(ILN)中对照T细胞活化标记物CD69的表达水平相比(图5A和5B)，纵
隔淋巴结(MLN)被鉴定为荧光素酶抗原的递送位点(图5)。在24小时后，还发现有效的CD8+T细胞活化位点(图5B)。
病毒传递的成像的萤火虫荧光素酶的辛德毕斯病毒介体。图5A显示用于在小鼠中非侵入性
地和纵向地确定在用SV/TAA介体注射小鼠后，由如本文所述辛德毕斯病毒介体编码的荧光
素酶肿瘤相关抗原的表达位点的体内成像的代表性结果。在SV/TAA介体接种后3小时，对小鼠成像。在24小时，提取纵隔和腹股沟淋巴结，并单离T细胞和评估T细胞活化标记物CD69的存在。与腹股沟淋巴结(ILN)中对照T细胞活化标记物CD69的表达水平相比(图5A和5B)，纵
隔淋巴结(MLN)被鉴定为荧光素酶抗原的递送位点(图5)。在24小时后，还发现有效的CD8+T细胞活化位点(图5B)。
[0335] 图6A至6D呈现了具有皮下LacZ+CT26肿瘤的小鼠中的相对肿瘤生长相对使用如上所述编码LacZ多肽的辛德毕斯病毒介体(例如，SV/LacZ)处理后的天数的关系图。图中显示的结果获得自实验，其中对照或介体处理的肿瘤小鼠通过下述方式使用抗CD8抗体和抗CD4
抗体耗尽CD8+和CD4+T细胞：每种抗体0.4mg在用SV/LacZ病毒介体或模拟对照进行第一次
处理前1天，将0.2ml PBS注入每只小鼠，然后每2至3天注射抗体进行2周。用PBS注射模拟对照小鼠。用SV/LacZ病毒介体(辛德毕斯/LacZ)或PBS(模拟)处理LacZ+CT26荷瘤小鼠。通过
卡尺测量确定肿瘤生长。图6A显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的对照肿瘤小鼠的
结果。图6B显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD4+T细胞耗尽的肿瘤小鼠的结果。
图6C显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD8+T细胞耗尽的肿瘤小鼠的结果。图6D显
示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞均耗尽的肿瘤小鼠的结果。
抗体耗尽CD8+和CD4+T细胞：每种抗体0.4mg在用SV/LacZ病毒介体或模拟对照进行第一次
处理前1天，将0.2ml PBS注入每只小鼠，然后每2至3天注射抗体进行2周。用PBS注射模拟对照小鼠。用SV/LacZ病毒介体(辛德毕斯/LacZ)或PBS(模拟)处理LacZ+CT26荷瘤小鼠。通过
卡尺测量确定肿瘤生长。图6A显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的对照肿瘤小鼠的
结果。图6B显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD4+T细胞耗尽的肿瘤小鼠的结果。
图6C显示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD8+T细胞耗尽的肿瘤小鼠的结果。图6D显
示使用模拟处理或用SV/LacZ介体处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞均耗尽的肿瘤小鼠的结果。
[0336] 图6B至6D描绘的结果证明在具有正常T细胞补体的对照小鼠中观察到SV/LacZ介体对减少皮下肿瘤生长的治疗效果，而在T细胞耗尽的小鼠中未观察到治疗效果。根据本发明，用编码一种或多种肿瘤相关抗原的至少一者，优选两个或更多个表位的辛德毕斯病毒
介体(即，SV/TAA病毒介体)处理获得的治疗益处不一定需要直接靶向肿瘤细胞。如本文实
施例所支持，SV/TAA疗法涉及将肿瘤相关抗原瞬时早期递送至引流注射部位的淋巴结，特
别是在腹膜内注射SV/TAA病毒的情况下的纵隔淋巴结(MLN)的载体，如图5A中所示。用SV/
TAA病毒介体处理也诱导有效的TAA特异性CD8+T细胞应答，其随后再度针对表达同源TAA的
肿瘤细胞。此外，SV/TAA治疗导致表位扩散，为TAA流失或修饰而造成的肿瘤逃逸问题提供了可能的解决方案，而且SV/TAA治疗最终导致荷瘤小鼠的长期存活，并产生针对多种TAA的长效记忆CD8+T细胞。图6A至6D提供证据证明用编码至少一种，优选两种或更多种肿瘤相关抗原表位的辛德毕斯病毒介体治疗的体内治疗效果是T细胞依赖性的，因为给药SV/LacZ病
毒介体后未在T细胞耗尽的小鼠中观察到肿瘤减少(图6B至6D)。
介体(即，SV/TAA病毒介体)处理获得的治疗益处不一定需要直接靶向肿瘤细胞。如本文实
施例所支持，SV/TAA疗法涉及将肿瘤相关抗原瞬时早期递送至引流注射部位的淋巴结，特
别是在腹膜内注射SV/TAA病毒的情况下的纵隔淋巴结(MLN)的载体，如图5A中所示。用SV/
TAA病毒介体处理也诱导有效的TAA特异性CD8+T细胞应答，其随后再度针对表达同源TAA的
肿瘤细胞。此外，SV/TAA治疗导致表位扩散，为TAA流失或修饰而造成的肿瘤逃逸问题提供了可能的解决方案，而且SV/TAA治疗最终导致荷瘤小鼠的长期存活，并产生针对多种TAA的长效记忆CD8+T细胞。图6A至6D提供证据证明用编码至少一种，优选两种或更多种肿瘤相关抗原表位的辛德毕斯病毒介体治疗的体内治疗效果是T细胞依赖性的，因为给药SV/LacZ病
毒介体后未在T细胞耗尽的小鼠中观察到肿瘤减少(图6B至6D)。
[0337] 利用编码多个肿瘤相关表位的SV载体的体内实验的结果证明SV为多个TAA表位的免疫原性递送提供了有效的治疗平台。此外，从SV/TAA获得的治疗益处产生抗肿瘤免疫应
答，导致肿瘤细胞杀伤，即使肿瘤细胞本身不直接被介体靶向。SV/TAA疗法涉及将TAA表位瞬时早期递送至引流注射部位的淋巴结，特别是在腹膜内SV注射的情况下的MLN。此外，SV/TAA疗法诱导了有效的TAA特异性CD8+T细胞应答，其随后再针对表达同源TAA的肿瘤细胞并
导致表位扩散，因而为TAA流失或修饰所造成的肿瘤逃逸问题提供了可能的解决方案。如本文的实验结果所示，SV/TAA疗法最终导致荷瘤小鼠的长期存活以及针对多种TAA产生长效
+
记忆CD8T细胞。
答，导致肿瘤细胞杀伤，即使肿瘤细胞本身不直接被介体靶向。SV/TAA疗法涉及将TAA表位瞬时早期递送至引流注射部位的淋巴结，特别是在腹膜内SV注射的情况下的MLN。此外，SV/TAA疗法诱导了有效的TAA特异性CD8+T细胞应答，其随后再针对表达同源TAA的肿瘤细胞并
导致表位扩散，因而为TAA流失或修饰所造成的肿瘤逃逸问题提供了可能的解决方案。如本文的实验结果所示，SV/TAA疗法最终导致荷瘤小鼠的长期存活以及针对多种TAA产生长效
+
记忆CD8T细胞。
[0338] 实施例6-预测用于辛德毕斯病毒介体的肿瘤相关抗原表位
[0339] 可以使用免疫表位数据库(Immune Epitope Database)(www.IEDB.org)分析一种或多种肿瘤相关抗原的多个表位氨基酸序列以并入根据本发明的辛德毕斯病毒介体中，例
如，将表位与BALB/c H2d的I类MHC结合。
如，将表位与BALB/c H2d的I类MHC结合。
[0340] 该实施例提供了不同的表位预测算法，以用于选择由本文所述多核苷酸和病毒介体编码和表达的多个表位。如下所述，通过三个预测程序来分析肿瘤相关抗原NY-ESO-1的
氨基酸序列，所述预测程序是BIMAS：生物信息学和分子分析科(BioInformatics and
Molecular Analysis Section)，其通过来自HLA等位基因的预测解离常数而对肽进行排
序；IEDB：免疫表位数据库(IEDB.org)；以及Rankpep，其用于预测肽与MHC分子的结合。
氨基酸序列，所述预测程序是BIMAS：生物信息学和分子分析科(BioInformatics and
Molecular Analysis Section)，其通过来自HLA等位基因的预测解离常数而对肽进行排
序；IEDB：免疫表位数据库(IEDB.org)；以及Rankpep，其用于预测肽与MHC分子的结合。
[0341] 分析用于确定表位以产生最佳T细胞应答的NY-ESO-1序列如下所示。
[0342] NY-ESO-1序列>gi|4503119|ref|NP_001318.1|癌症/睪丸抗原1[智人]
[0343] MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQ
LQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR(SEQ ID NO:296)
LQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR(SEQ ID NO:296)
[0344] HLA-A0201是一种常见的人类等位基因，用于筛选表位。
[0345] BIMAS:生物信息学和分子分析科(BIMAS)，美国国立卫生研究院的信息技术中心，(http://www-bimas.cit.nih.gov)。这网站允许用户定位和分级含有HLA I类分子的肽结
合基序的8聚体、9聚体或10聚体肽。这排名采用了哈佛医学院的波士顿儿童医院的Kenneth Parker博士和在马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院(NIH)的国家过敏和传染病研究
所(NIAID)的文献推导出的氨基酸/位置系数表。这网站是由国立卫生研究院的计算机研究
与技术部(CIT)的计算机生物科学与工程实验室(CBEL)的BIMAS的Ronald Taylor与Parker
博士合作创建。可以经由BISMAS进行HLA肽基序检索的信息和背景(https://www-
bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/hla_motif_sea rch_info.html)。BISMAS提供HLA
肽结合预测和一个或多个通过来自HLA等位基因的预测解离常数对肽进行排序的算法。HLA
肽结合预测基于对预测的HLA 1类分子的解离半衰期，而对潜在的8至10聚体肽进行排序。
用于分析肽/MHC I类肽结合基序和分级HLA结合肽的参考文献包括例如，Maier,R.等人,
1994,Immunogenetics,40:306-308；Raghavan,等人,1996,Protein Science,5:2080-
2088；Parker,K.C.等人,1994,J.Immunol.,152:163-175；以及Rammensee,H.G.等人,1999,Immunogenetics,50:213-219。用于基于肽序列和MHC特异性分析，而获得表位序列信息的
另一数据库和计算机软件源(H.G.Rammensee)是SYFPEITHI(BMI Biomedical
Informatics,SYFPEITHI@BMI-Heidelberg.com)。
合基序的8聚体、9聚体或10聚体肽。这排名采用了哈佛医学院的波士顿儿童医院的Kenneth Parker博士和在马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院(NIH)的国家过敏和传染病研究
所(NIAID)的文献推导出的氨基酸/位置系数表。这网站是由国立卫生研究院的计算机研究
与技术部(CIT)的计算机生物科学与工程实验室(CBEL)的BIMAS的Ronald Taylor与Parker
博士合作创建。可以经由BISMAS进行HLA肽基序检索的信息和背景(https://www-
bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/hla_motif_sea rch_info.html)。BISMAS提供HLA
肽结合预测和一个或多个通过来自HLA等位基因的预测解离常数对肽进行排序的算法。HLA
肽结合预测基于对预测的HLA 1类分子的解离半衰期，而对潜在的8至10聚体肽进行排序。
用于分析肽/MHC I类肽结合基序和分级HLA结合肽的参考文献包括例如，Maier,R.等人,
1994,Immunogenetics,40:306-308；Raghavan,等人,1996,Protein Science,5:2080-
2088；Parker,K.C.等人,1994,J.Immunol.,152:163-175；以及Rammensee,H.G.等人,1999,Immunogenetics,50:213-219。用于基于肽序列和MHC特异性分析，而获得表位序列信息的
另一数据库和计算机软件源(H.G.Rammensee)是SYFPEITHI(BMI Biomedical
Informatics,SYFPEITHI@BMI-Heidelberg.com)。
[0346] 表34显示了HLA肽基序检索结果，以及可经由BIMAS获得的相关用户参数和评分信息。表34中的“子序列残基清单”中列出的氨基酸序列如下：LMWITQCFL(SEQ ID NO:297)、RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298)、GVLLKEFTV(SEQ ID NO:299)、WITQCFLPV(SEQ ID NO:300)、
QLSLLMWIT(SEQ ID NO:301)、QQLSLLMWI(SEQ ID NO:302)、SLLMWITQC(SEQ ID NO:32)、
SLAQDAPPL(SEQ ID NO:303)、ILTIRLTAA(SEQ ID NO:304)以及LWLSISSCL(SEQ ID NO:
305)。
QLSLLMWIT(SEQ ID NO:301)、QQLSLLMWI(SEQ ID NO:302)、SLLMWITQC(SEQ ID NO:32)、
SLAQDAPPL(SEQ ID NO:303)、ILTIRLTAA(SEQ ID NO:304)以及LWLSISSCL(SEQ ID NO:
305)。
[0347] 表34 HLA肽基序检索结果
[0348]
[0349]
[0350] IEDB:免疫表位数据库(IEDB.org)。IEDB预测工具使用预测表位与HLA等位基因结合的不同算法的共识(consensus)。然后对表位进行排序--较低百分位数预测较高的结合。
预测MHC-1结合的结果显示在下表35中。表35中所示的肽如下鉴定：SLAQDAPPL(SEQ ID NO:
303)、LMWITQCFL(SEQ ID NO:297)、RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298)、WITQCFLPV(SEQ ID NO:
300)、GVLLKEFTV(SEQ ID NO:299)、AQDAPPLPV(SEQ ID NO:306),QQLSLLMWI(SEQ ID NO:
302)、LLMWITQCF(SEQ ID NO:1)、LQLSISSCL(SEQ ID NO:307)、SLLMWITQC(SEQ ID NO:32)、ILTIRLTAA(SEQ ID NO:304)、SISSCLQQL(SEQ ID NO:308)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:46)、
FATPMEAEL(SEQ ID NO:44)、CLQQLSLLM(SEQ ID NO:309)、FTVSGNILT(SEQ ID NO:310)、
FYLAMPFAT(SEQ ID NO:311)。
预测MHC-1结合的结果显示在下表35中。表35中所示的肽如下鉴定：SLAQDAPPL(SEQ ID NO:
303)、LMWITQCFL(SEQ ID NO:297)、RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298)、WITQCFLPV(SEQ ID NO:
300)、GVLLKEFTV(SEQ ID NO:299)、AQDAPPLPV(SEQ ID NO:306),QQLSLLMWI(SEQ ID NO:
302)、LLMWITQCF(SEQ ID NO:1)、LQLSISSCL(SEQ ID NO:307)、SLLMWITQC(SEQ ID NO:32)、ILTIRLTAA(SEQ ID NO:304)、SISSCLQQL(SEQ ID NO:308)、LAMPFATPM(SEQ ID NO:46)、
FATPMEAEL(SEQ ID NO:44)、CLQQLSLLM(SEQ ID NO:309)、FTVSGNILT(SEQ ID NO:310)、
FYLAMPFAT(SEQ ID NO:311)。
[0351] 表35
[0352]
[0353] Rankpep:这表位实验工具使用来自结合MHC/HLA的已知肽的实验数据，然后使用位置特异性评分矩阵比较序列。Rankpep使用位置特异性评分矩阵(Position Specific
Scoring Matrices，PSSM)或来自已知结合给定MHC分子的一组序列比对的肽(例如，通过结构或序列相似性排列的肽)的设定档作为MHC-肽结合的预测物。
Scoring Matrices，PSSM)或来自已知结合给定MHC分子的一组序列比对的肽(例如，通过结构或序列相似性排列的肽)的设定档作为MHC-肽结合的预测物。
[0354] (http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep_help.html)。它还考虑了哪些肽可能被蛋白酶处理。(Reche P.A.et al.,2002,Prediction of MHC Class I Binding
Peptides Using Profile Motifs,Human Immunology,63:701-709；Reche P.A.et al.,
2004,Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide
binding to MHC molecules using profiles,Immunogenetics,56:405-419；Reche
P.A.and Reinherz E.L.,2007,Prediction of peptide-MHC binding using
profiles.Methods Mol Biol.,409:185-200.。MHC数据库的非限制性实例，包括基因序列、多态性等，包括IMGT(ImMunoGene Tics数据库)；IMGT/HLA数据库、dbMHC(NCBI数据库)、等位基因频率数据库；HLA信息学组；IHWG(国际组织兼容性工作组)；MHC的遗传学和分子遗传学；以及肿瘤基因数据库。肽数据库的非限制性实例包括MHCPEP、SYFPEITHI、HIV分子免疫学数据库、MHCPEP HLA配体/基序数据库；MHCBN数据库(MHC结合和非结合肽的综合数据
库)；HLA配体/基序数据库；JenPep数据库(MHC和TAP配体，T和B细胞表位)；FIMM数据库(T和B细胞表位)；以及MPID(MHC-肽相互作用数据库)。
Peptides Using Profile Motifs,Human Immunology,63:701-709；Reche P.A.et al.,
2004,Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide
binding to MHC molecules using profiles,Immunogenetics,56:405-419；Reche
P.A.and Reinherz E.L.,2007,Prediction of peptide-MHC binding using
profiles.Methods Mol Biol.,409:185-200.。MHC数据库的非限制性实例，包括基因序列、多态性等，包括IMGT(ImMunoGene Tics数据库)；IMGT/HLA数据库、dbMHC(NCBI数据库)、等位基因频率数据库；HLA信息学组；IHWG(国际组织兼容性工作组)；MHC的遗传学和分子遗传学；以及肿瘤基因数据库。肽数据库的非限制性实例包括MHCPEP、SYFPEITHI、HIV分子免疫学数据库、MHCPEP HLA配体/基序数据库；MHCBN数据库(MHC结合和非结合肽的综合数据
库)；HLA配体/基序数据库；JenPep数据库(MHC和TAP配体，T和B细胞表位)；FIMM数据库(T和B细胞表位)；以及MPID(MHC-肽相互作用数据库)。
[0355] 基于Rankpep输出预测结合MHC分子的肽的结果显示在下表36中。表36中所示的肽序列如下识别：TVSGNILTI(SEQ ID NO:312)、SISSCLQQL(SEQ ID NO:308)、RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298)、CLQQLSLLM(SEQ ID NO:313)、SLAQDAPPL(SEQ ID NO:303)、SLLMWITQC(SEQ ID NO:32)、SCLQQLSLL(SEQ ID NO:314)、ILTIRLTAA(SEQ ID NO:304)、QLQLSISSC(SEQ ID NO:
315)以及WITQCFLPV(SEQ ID NO:300)。
315)以及WITQCFLPV(SEQ ID NO:300)。
[0356] 表36
[0357]
[0358]
[0359] 在以上的表36中，浅灰色凸显第1至5行表示预测的粘合剂。表的第2、5和7行提供了关于通过切割模型预测的具有C端的肽的信息。
[0360] 分析结果
[0361] NY-ESO-1肿瘤相关抗原的表位分析结果显示使用上述算法对蛋白质中几种不同表位的排序。经常用于癌症免疫疗法的NY-ESO-1表位是SLLMWITQC(SEQ ID NO：32)。通过使用三种算法确定的表位的级别如下：
[0362] 比马斯：7；IEDB：10；Rankpep：7(10+7+7＝24)，如下表37所示。
[0363] 结果表明肽RLLEFYLAM(SEQ ID NO：298)也可以是良好的表位，因为它被所有三种算法评定为最高级别。
[0364] 表37–表位排序基于BIMAS，IEDB和RANKPEP算法
[0365]表位 BIMAS IEDB RANKPEP
SLAQDAPPL(SEQ ID NO:303) 8 1 5
LMWITQCFL(SEQ ID NO:297) 1 2 -
RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298) 2 3 3
WITQCFLPV(SEQ ID NO:300) 4 4 10
GVLLKEFTV(SEQ ID NO:299) 3 5 -
SLLMWITQC(SEQ ID NO:32) 7 10 7
SLAQDAPPL(SEQ ID NO:303) 8 1 5
LMWITQCFL(SEQ ID NO:297) 1 2 -
RLLEFYLAM(SEQ ID NO:298) 2 3 3
WITQCFLPV(SEQ ID NO:300) 4 4 10
GVLLKEFTV(SEQ ID NO:299) 3 5 -
SLLMWITQC(SEQ ID NO:32) 7 10 7
[0366] 其他具体实施例
[0368] 本文中对变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将所述变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文对实施例的描述包括作为任何单个实施例的该实
施例或者与任何其他实施例或其部分的组合。
施例或者与任何其他实施例或其部分的组合。
[0369] 这说明书中提及的所有专利和出版物均通过引用方式并入本文，其引用程度如同每个独立专利和出版物被具体和单独地指出通过引用方式并入。
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