肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法
阅读：602发布：2020-05-21
专利汇可以提供肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 基于HLA‑C1/C2基因的序列特征和HLA‑C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，采用HLA‑C位点特异性PCR引物和HLA‑C1/C2组特异性引物扩增策略，即设计一条共用的HLA‑C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA‑C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA‑C2的组特异性PCR引物进行配组，仅用2个PCR反应分别扩增HLA‑C1、C2基因；由于所用引物具有相近的 退火 温度 ，可在同一PCR扩增条件下进行同步扩增；扩增产物经琼脂糖 电泳 检测，可清晰直观地判定受检者的HLA‑C1/C2基因型，无需大型贵重设备、无需对当前国际上IMGT/HLA 数据库 已公布的3800余种HLA‑C等位基因进行基因分型；具有实验操作简单、所需时间短、成本低，适合于肝移植前对肝供体进行快速检测，以减少急性排斥、提高移植效果。，下面是肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法专利的具体信息内容。
1.肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，其特征在于：采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；
所述HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，所述上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57；所述下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG-3'，位于第2外显子，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464；
所述HLA-C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，其中，所述上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57；所述下游引物HLA-C2-RB的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT-3'，位于第2外显子，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HLA-C1基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子序列，目的片段长度为
541bp；
所述HLA-C2基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子，目的片段长度为541bp。
3.如权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所述HLA-C1及HLA-C2的PCR扩增反应体系均为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件均为：
肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法
技术领域
背景技术
[0002] 人类白细胞抗原(HLA)为人类主要组织相容性系统，承担重要的免疫识别、免疫应答和免疫调节的功能，与骨髓和实体器官移植的排斥反应密切相关。HLA-C分子为经典的HLA I类分子，不仅递呈内源性抗原肽给CD8+T细胞识别，介导特异性T细胞的免疫应答反应；而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer immunoglobulin-like receptor,KIR)[1]的配体，调节自然杀伤细胞的活性 ，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中发挥了重要作用。HLA-C分子由一条具有多态性的α多肽链(45kDa)和一条由位于15号染色体基因编码、没有多态性的β2微球蛋白(12kDa)通过非共价键组成异二聚体。编码α链的HLA-C基因共包括8个外显子及7个内含子；其中第1外显子编码引导肽，第2、第3、第4外显子分别编码α1、α2、α3区，第5外显子编码跨膜区，第6～8外显子编码胞浆尾。
[0003] HLA-C分子为KIR受体的重要配体，根据IPD-KIR数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/ligand.html)和HLA-C分子第80位氨基酸残基的差异[2-3]，HLA-C分子可分为HLA-C1组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为天冬氨酸)和HLA-C2组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为赖氨酸)。所有的HLA-C分子均为KIR的配体，HLA-C1分子特异性识别KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2，而HLA-C2特异性识别KIR2DL1及KIR2DS1。
[0004] 近年来有研究表明HLA-C基因匹配程度对无关供者造血干细胞(骨髓)移植的效果具有显著影响[4-5]，因此HLA-C位点被列入了骨髓库HLA入库数据、临床供-受者骨髓移植HLA配型的常规检测项目。但是肝移植中受肝供体来源短缺等诸多因素影响，难以做到肝移植供-受者HLA完全匹配，通常肝移植前也不进行HLA配型检测，而肝移植急性排斥仍然是肝移植后面临的重要问题。当前，在HLA-KIR基因多态性与肝移植急性排斥的回顾性研究结果表明：HLA-C1/C2及其基因型与急性排斥相关，如Lee等[6]采用PCR-SSO方法对韩国肝移植供者进行HLA-C基因的基因分型，发现供者携带HLA-C2基因时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.0423)，并且随着供者HLA-C2基因数量的增加，急性排斥发生率也随之增高，即供者携带HLA-C2是急性排斥的易感因子并出现剂量效应。López-Alvarez等[7]在采用PCR-SSO方法对西班牙肝移植供-受者携带的HLA-C基因进行基因分型，研究HLA-C1/C2基因的多态性与急性排斥的关联研究，发现HLA-C1C1基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著降低(P＝0.004)，HLA-C2C2基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.005)。Bishara等[8]采用血清学及分子生物学方法进行HLA-A、-B、-C分型，发现供-受者HLA-C1/C2配体相匹配时，移植后受者一年内出现急性排斥的发生率显著降低(P＝0.0002)；而供-受者HLA-Bw4匹配程度对移植效果没有影响。
[0005] 综上可见，HLA-C1/C2与肝移植急性排斥密切相关，因此在肝移植前对供者的HLA-C1/C2基因型进行鉴定，有利于提高供肝及受者的存活率。如在肝移植前检测供者携带HLA-C2，则可提前对接受携带HLA-C2供肝的受者的急性排斥风险进行预测，并制定相应的免疫抑制治疗方案。建立适合于肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，是当前一项急迫的任务。
[0006] HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性，截止到2018年4月，IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html，Release3.32)中公布的HLA-C等位基因共计3854种(其中含无效等位基因144种)，编码2644种HLA-C分子。当前区分HLA-C1/C2通常做法是：首先采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)、基于Luminex流式磁珠仪的反向序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-rSSO)或基于测序仪的PCR产物直接测序(PCR-SBT)的方法，鉴定并获得受检者的HLA-C基因型；然后再在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
[0007] 以往的这种方法鉴定HLA-C1/C2基因型存在的不足包括：(1)HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性,当前国际上普遍采用的Sanger测序法(PCR-SBT)及流式磁珠PCR-rSSO法进行HLA-C基因分型[6,7]，实验所需时间长、成本高、实验操作步骤多；易于出现模棱两可[9]的检测结果(须增加其方法进行鉴定) ，并且实验过程中需要使用的大型贵重设备——流式磁珠仪或测序仪；(2)采用PCR-SSP法进行HLA-C基因分型，虽不需要使用大型贵重设备，但由于HLA-C等位基因水平的多态性极为丰富，需采用一系列的等位基因特异性引物、特异性扩增HLA-C位点的目的基因，PCR扩增反应的数量多，PCR Set-up(加样)及PCR产物电泳检测所需时间长；(3)无论是PCR-SSP、PCR-rSSO或PCR-SBT法进行HLA-C基因分型，在获得了受检者HLA-C基因型后，还要在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
发明内容
[0008] 本发明旨在基于HLA-C1/C2基因的序列特征和HLA-C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，创建一种HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定的方法，以应用于临床肝移植急性排斥相关的快速检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究领域。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供一种HLA-C1/C2PCR-SSP基因分型的方法，该方法包括：
[0010] 采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；其中HLA-C基因特异性PCR扩增引物与业已公布的全部HLA-C等位基因的序列相匹配，HLA-C1的组特异性引物只能特异性扩增HLA-C1相关的目的序列，而HLA-C2组特异性PCR引物只能扩增HLA-C2相关的目的序列。
[0011] HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57)；下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG-3'，位于第2外显子(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464)。HLA-C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，其中，上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57)；下游引物HLA-C2-RB的序列为：
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT-3'，位于第2外显子(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：
nt442～nt464)。
5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT-3'，位于第2外显子(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：
nt442～nt464)。
[0012] HLA-C1基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子序列，目的片段长度为541bp。HLA-C2基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子，目的片段长度为541bp。
[0013] HLA-C1及HLA-C2的PCR扩增反应体系均为：
[0014]
[0015] PCR扩增条件均为(以利于同步扩增)：
[0016]
[0017] 扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。根据HLA-C1/C2基因特异性扩增条带的有无，直观地判定HLA-C1/C2基因型。
[0018] 本发明的贡献和技术特征在于：无需对高度多态性的HLA-C基因进行PCR-SSP、PCR-rSSO、PCR-SBT基因分型，本发明设计采用HLA-C位点特异性引物和HLA-C1或C2组特异性引物扩增策略，即设计一条共用的HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物进行配组，仅用2个PCR扩增反应特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；由于所用引物具有相近的退火温度，可在同一PCR扩增条件下进行同步扩增；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可清晰地判定受检者的HLA-C1/C2基因型，无需对国际上IMGT/HLA数据库当前业已公布的3854种HLA-C等位基因进行基因分型。具有实验操作简单、特异性扩增产物电泳条带清晰、结果判读简单直观、实验成本低、无需大型贵重设备、且实验所需时间短(2小时内完成)等技术特征；有效解决了以往区分HLA-C1/C2基因的方法不足，适合于临床肝移植急性排斥相关的检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究领域。
[0019] 本发明的贡献和价值还体现在其临床意义上：由于供-受者的HLA-C1/C2基因型与肝移植急性排斥密切相关，因此在肝移植前鉴定HLA-C1/C2基因型，有利于预测肝移植后受者出现急性排斥的风险，有利于开展个体化免疫抑制治疗，避免过度免疫抑制治疗导致的感染和肿瘤复发，提高供肝及受者的存活率。本发明适合于临床肝移植急性排斥相关的快速检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究等领域。附图说明
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0022] 注：样本1经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*01:02,03:02；在IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)中查找检出的C*01:02、C*03:02这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C1C1基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR产物电泳仅见清晰的HLA-C1特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C1C1；
[0023] 样本2：经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*07:02,15:05；在IMGT/HLA数据库中查找检出的C*07:02、C*15:05这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C1C2基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR扩增产物电泳均见清晰的HLA-C1及HLA-C2特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C1C2；
[0024] 样本3：经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*04:01,06:02；在IMGT/HLA数据库中查找检出的C*04:01、C*06:02这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C2C2基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR产物电泳仅见清晰的HLA-C2特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C2C2。
[0025] 图2为“实施例2”的287例南方汉族健康无关个体中，随机的16例样本的HLA-C1/C2PCR-SSP法扩增产物电泳图，均可清晰、直观地判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
[0026] 本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0027] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例给出了3例业已经HLA-C基因测序分型、但HLA-C1/C2基因型各不相同的样本，包括HLA-C1C1、-C1C2及-C2C2基因型各一例，采用本发明对这3例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，以验证本发明的实施效果。
[0030] 首先，采用本发明中的上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，扩增HLA-C1组基因；采用上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，扩增HLA-C2组基因；扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
[0031]
[0032] PCR扩增条件均为：
[0033]
[0034] 扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照Takara DL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。PCR产物条带清晰、特异，电泳效果见图1。
[0035] 本实施例中，三例样本的PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，与测序分型已知的结果完全相符合。
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例给出了经HLA-C基因测序分型、HLA-C1/C2基因型已知的287例南方汉族健康无关个体，采用本发明对这287例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，进一步验证本发明的实施效果。
[0038] 首先，采用本发明中的上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，扩增HLA-C1组基因；采用上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，扩增HLA-C2组基因；扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
[0039]
[0040] PCR扩增条件均为：
[0041]
[0042] 扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照Takara DL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。随机的16例样本用PCR-SSP法扩增HLA-C1/C2基因，PCR扩增产物电泳效果图，见图2。
[0043] 本实施例中，采用本发明对287例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，结果与PCR-SBT测序分型判定的HLA-C1/C2基因型的结果完全一致，见表1。
[0044] 表1 287例样本采用本发明的PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型结果与PCR-SBT测序分型判定的HLA-C1/C2基因型的结果对比
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
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