酒糟脱水
阅读：799发布：2020-05-11
专利汇可以提供酒糟脱水专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 酒糟 脱 水 ，具体的涉及将酒糟脱水的方法，其包括使酒糟经过能够降解酒糟成分的一种或多种酶处理，和将步骤i)中获得的材料分离成固体级分和液体级分。，下面是酒糟脱水专利的具体信息内容。
1.一种将酒糟脱水的方法，其包括步骤：
i)使酒糟经过能够降解一种或多种酒糟成分的一种或多种酶的处理；
ii)将所述材料分离成固体级分和液体级分。
2.权利要求1的方法，其中将步骤i)和ii)同时或顺序进行。
3.权利要求1或2的方法，还包括干燥所述固体级分的步骤iii)。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中通过离心，优选沉降式离心机来进行步骤ii)中的分离。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中通过过滤，优选使用滤压机、螺旋压制机、板框式压制机、重力浓缩机或脱水机来进行步骤ii)中的分离。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤i)在温度20-60℃进行。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤i)在pH3-7，优选3-6进行。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述酒糟源自生产发酵产物的过程，优选生产液体发酵产物的过程。
9.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述酒糟源自使用含淀粉材料作为原料生产发酵产物的过程。
10.权利要求9的方法，其中所述原料是谷物。
11.权利要求9-10的方法，其中所述原料选自下组：玉米、小麦、大麦、木薯、高粱、黑麦、马铃薯或它们的任何组合。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中步骤i)中使用的酶是糖酶。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤i)中使用的酶选自下组：淀粉酶，例如α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，半纤维素酶，例如木聚糖酶，果胶酶，甘露聚糖酶和蛋白酶，或是它们的混合物。
15.糖酶用于将酒糟分离成固体级分和液体级分的用途。
16.淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶或蛋白酶，或它们的混合物用于将酒糟分离成固体级分和液体级分的用途。
17.权利要求15或16的用途，其中通过离心或过滤来进行所述分离。
酒糟脱水
技术领域
背景技术
[0003] 发酵产物例如酒精如下生产：首先通过液化和糖化将含有淀粉的材料降解成可发酵的糖，其后使用发酵生物将糖直接或间接转化成期望的发酵产物。从发酵醪(通常称作“啤酒醪(beer mash)”)中回收液体发酵产物，例如通过蒸馏，其将期望的发酵产物与其它液体和/或固体分开。剩余的级分称作“酒糟”，将其脱水并且分离成固相和液相，例如通过离心进行。将固相称作“湿饼(wet cake)”(或“湿谷物(wet grain)”)，并且将液相(上清)称作“稀釜馏物(thin stillage)”。将脱水的湿饼干燥以提供作为动物饲料中的营养物使用的“干酒糟(Distillers Dried Grains)”(DDG)。通常将稀釜馏物蒸发脱水以提供浓缩物和糖浆(syrup)，或者可以直接再循环至浆料罐(slurry tank)作为“逆流(backset)”。可将浓缩物送至甲烷转化器然后排出或可以再循环至浆料罐。可将主要由极限糊精和不可发酵的糖组成的糖浆混入DDG或添加至湿饼然后干燥以产生DDGS(Distillers Dried Grain with Solubles；带有可溶物的干酒糟)。
[0004] 美国专利申请号2005/0079270A1公开了将玉米釜馏物固体脱水的方法，其包括向所述固体添加包含丙烯酸钠盐、甲基丙烯酸钠盐或2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐的阴离子共聚物以形成水与凝固和絮凝的固体的混合物；和使用脱水设备将水从凝固和絮凝的固体分离。
发明内容
[0006] 本发明具体地涉及如下各项：
[0007] 1.一种将酒糟脱水的方法，其包括步骤：
[0008] i)使酒糟经过能够降解一种或多种酒糟成分的一种或多种酶的处理；
[0009] ii)将所述材料分离成固体级分和液体级分。
[0010] 2.项1的方法，其中将步骤i)和ii)同时或顺序进行。
[0011] 3.项1或2的方法，还包括干燥所述固体级分的步骤iii)。
[0012] 4.项1-3中任一项的方法，其中通过离心，优选沉降式离心机来进行步骤ii)中的分离。
[0013] 5.项1-4中任一项的方法，其中通过过滤，优选使用滤压机、螺旋压制机、板框式压制机、重力浓缩机或脱水机来进行步骤ii)中的分离。
[0014] 6.项1-5中任一项的方法，其中步骤i)在温度20-60℃进行。
[0015] 7.项1-6中任一项的方法，其中步骤i)在pH3-7，优选3-6进行。
[0016] 8.项1-7中任一项的方法，其中所述酒糟源自生产发酵产物的过程，优选生产液体发酵产物的过程。
[0017] 9.项1-9中任一项的方法，其中所述酒糟源自使用含淀粉材料作为原料生产发酵产物的过程。
[0018] 10.项9的方法，其中所述原料是谷物。
[0020] 12.项8-11中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇，优选乙醇。
[0021] 13.项1-12中任一项的方法，其中步骤i)中使用的酶是糖酶。
[0022] 14.项1-13中任一项的方法，其中步骤i)中使用的酶选自下组：淀粉酶，例如α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，半纤维素酶，例如木聚糖酶，果胶酶，甘露聚糖酶和蛋白酶，或是它们的混合物。
[0023] 15.糖酶用于将酒糟分离成固体级分和液体级分的用途。
[0024] 16.淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶或蛋白酶，或它们的混合物用于将酒糟分离成固体级分和液体级分的用途。
[0025] 17.项15或16的用途，其中通过离心或过滤来进行所述分离。
[0027] 图1示意性显示乙醇生产方法。
[0028] 发明详述
[0029] 本发明的目的是提供使酒糟脱水的方法。
[0030] 本发明的发明人令人惊讶地发现，使酒糟经过能够降解酒糟成分的酶的处理使固-液分离得到改进，并且由此使离心之后湿饼中的固体含量与不存在酶时进行的相应方法相比增加。用于降解酒糟成分的酶包括糖酶例如α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，纤维素酶和/或半纤维素酶，例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶，果胶酶和蛋白酶，或它们的混合物。实施例1显示使酒糟经过能够降解酒糟成分的一种或多种酶的处理使离心之后湿饼中固体的百分比增加。这是有利的，因为在制造DDG或DDGS时将干燥湿饼的能源成本降低。还降低了将湿饼从一地运至另一地的成本。此外，还降低了维护和修理离心机、干燥机和使用的其它设备的需要。总而言之，将生产成本降低。实施例2和3也公开使用能够降解至少一种酒糟成分的酶的酶法脱水。
[0031] 因此，本发明的第一个方面涉及将酒糟脱水的方法，其包括步骤：
[0032] i)使酒糟经过能够降解一种或多种酒糟成分的一种或多种酶的处理，[0033] ii)将材料分离成固体级分和液体级分。
[0034] 所述固体级分通常称作“湿饼”，而所述液体级分通常称作“稀釜馏物”。步骤i)和ii)可同时或顺序进行。
[0035] 酒糟和发酵产物的制造
[0036] 本发明的方法可用于源自任何合适发酵产物的生产中的酒糟。用于生产发酵产物的原料可以是任何含淀粉的材料，优选含淀粉的植物材料，包括：块茎、根、整谷粒(whole grain)；和它们的任何组合。含淀粉的材料可以从谷物获得。合适的含淀粉材料包括玉米(玉蜀黍(maize))、小麦、大麦、木薯、高粱、黑麦、马铃薯，或它们的任何组合。玉米是优选的原料，尤其当发酵产物是乙醇时。含淀粉的材料还可包含例如来自淀粉加工的侧流(side stream)或由其组成，所述侧流例如可能不适于制造糖浆的含有C6糖的工业生产液流(process stream)。酒糟通常含有大约10-15wt-%干固体。酒糟成分包括来自含淀粉原料的纤维、壳(hull)、胚(germ)、油和蛋白成分以及未发酵的淀粉。
[0037] 通常将发酵产物的生产分为以下主要加工阶段：
[0038] a)降低含淀粉材料的颗粒大小，例如，通过干磨或湿磨进行；
[0039] b)在含水浆料(aqueous slurry)中烹制含淀粉材料以使淀粉糊化(gelatinize)，
[0041] d)将麦芽糊精(糊精)糖化以产生发酵生物能够代谢的低分子糖(例如，DP1-2)；
[0042] e)使用合适的发酵生物发酵糖化的材料，所述发酵生物直接或间接地将低分子糖转化成期望的发酵产物；
[0043] f)回收发酵产物，例如，通过蒸馏回收发酵产物以从发酵醪分离发酵产物。
[0044] 如在上文的“背景”部分所解释，酒糟是由从发酵醪(啤酒醪)回收(例如通过蒸馏回收)期望的发酵产物之后剩余的液体和固体组成的副产品。根据本发明发酵产物可以是任何发酵产物，包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖酸酯、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。发酵还通常用在可消费醇(consumable alcohol)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在酸奶和干酪的制造中)、皮革和烟草工业中。在优选的实施方式中，发酵产物是液体，优选是醇，特别是乙醇。
[0045] 根据本发明预期的酒糟可以是从发酵产物生产过程产生的副产品，所述生产过程包括上述步骤a)至f)。然而，酒糟还可以是从其它发酵产物生产过程产生的副产品，所述其它发酵产物生产过程以含淀粉的起始物料为基础。
[0046] 酒糟的脱水
[0047] 为了去除大部分的液体/水，可使用任何合适的分离技术根据本发明(步骤ii)来进行酒糟的脱水，所述分离技术包括离心、压制和过滤。在实施方式中，将酒糟加热至大约20-60℃的温度或大约所述酶的最适温度。pH范围是3-7，优选pH3-6。通常在适合于所述酶的条件下进行酒糟的酶法处理。
[0048] 在优选的实施方式中，通过离心进行脱水。目前在工业上优选的离心机是沉降式离心机，优选高速沉降式离心机。合适的离心机的实例是来自Alfa Laval的NX400steep cone系列，其是高效沉降机。
[0049] 在另一个优选的实施方式中，使用其它常规分离设备来进行分离，例如板框式滤压机(plate/frame filter presses)、带式滤压机(belt filter presses)、螺旋压制机(screw presses)、重力浓缩机(gravity thickeners)和脱水机(deckers)，或类似设备。
[0050] 湿饼的干燥
[0051] 在将含有大约30-35wt-%干固体的湿饼脱水之后，可将其在鼓式干燥机(drum dryer)、喷雾干燥机(spray dryer)、环式干燥机(ring drier)、流化床干燥机(fluid bed drier)等中干燥以产生“干酒糟”(DDG)。DDG是有价值的用于家畜、家禽和鱼类的饲料成分。优选提供的DDG具有少于大约10-12wt.-%的湿含量以避免霉菌和微生物分解并且增加存放期。此外，高湿含量还使得运输DDG更加昂贵。优选在不使湿饼中的蛋白质变性的条件下干燥湿饼。可将湿饼与分离自稀釜馏物级分的糖浆混合并且干燥成带有可溶物的DDG(DDGS)。
[0052] 用于处理酒糟的酶活性
[0053] 根据本发明可以使用以下酶活性的一种或多种来处理酒糟，从而增加湿饼中的固体含量。在优选的实施方式中，酶包括一种或多种糖酶。
[0054] α-淀粉酶
[0055] 可以使用任何合适的α-淀粉酶来进行本发明的方法，包括步骤i)。在优选的实施方式中，可以使用细菌α-淀粉酶和/或真菌α-淀粉酶。可以将α-淀粉酶以有效量添加，优选范围为0.001-1mg酶蛋白每克DS(酒糟中)，优选0.01-0.5mg酶蛋白每克DS。
[0056] 细菌α-淀粉酶
[0057] 合适的α-淀粉酶的实例包括以下所述。步骤i)中使用的优选的细菌α-淀粉酶可以源自芽孢杆菌属(genus Bacillus)(某些情况下称作土芽孢杆菌属(Geobacillus))的菌株，包括地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株。其它细菌α-淀粉酶包括源自芽孢杆菌属菌种NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的α-淀粉酶，其全部在WO95/26397中详细描述，和由Tsukamoto 等,Biochemical and Biophysical Research Communications,151(1988),pp.25-31(其作为参考并入本文)描述的α-淀粉酶。
[0058] 芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，特别是在WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355(将全部文件通过参考并入本文)任一中描述的变体和/或杂合体。特别期望的α-淀粉酶变体在美国专利nos.6,093,562、6,297,038或美国专利no.6,187,576(作为参考并入本文)中公开，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，其在位置R179至G182具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO1996/023873中公开的双缺失—参见例如第20页第1-10行(作为参考并入本文)，优选与WO99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比相应于delta(181-182)的双缺失，或是使用WO99/19467中的SEQ ID NO:3来编号的氨基酸R179和G180的缺失(将所述文件作为参考并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO99/19467中公开的SEQ ID NO:3中所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有相应于delta(181-182)的双缺失，并且进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
[0059] 特别预期的杂合α-淀粉酶包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445C-末端氨基酸残基(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37N-末端氨基酸残基(WO99/19467的SEQ ID NO:5中所示)，具有以下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467中SEQ ID NO:4的编号)。特别优选的是具有突变H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S中的一个或多个和/或在位置176和179之间具有两个残基的缺失的变体，所述两个残基的缺失优选是E178和G179的缺失(使用WO99/19467中SEQ ID NO:5的编号)。
[0060] 商业上可以获得的细菌α-淀粉酶产品和含有α-淀粉酶的产品包括TM TM TM TMTERMAMYL SC、LIQUOZYME SC、BAN(Novozymes A/S,Denmark)DEX-LO 、SPEZYME ETHYL、TM TM TM
SPEZYME XTRA、SPEZYME AA、SPEZYME FRED-L、SPEZYME ALPHA、SPEZYME HPA 和TM
SPEZYME DELTA AA(来自Genencor Int.,USA)、ULTRA-THIN(Valley Research,IN,USA。可
6 6
将α-淀粉酶以范围为0.0001x10–1x10KNU每吨干底物(酒糟)的有效量添加。
SPEZYME XTRA、SPEZYME AA、SPEZYME FRED-L、SPEZYME ALPHA、SPEZYME HPA 和TM
SPEZYME DELTA AA(来自Genencor Int.,USA)、ULTRA-THIN(Valley Research,IN,USA。可
6 6
将α-淀粉酶以范围为0.0001x10–1x10KNU每吨干底物(酒糟)的有效量添加。
[0061] 真菌α-淀粉酶
[0062] 真菌α-淀粉酶(EC3.2.1.1)优选是丝状真菌来源的。真菌α-淀粉酶可以是真菌酸性α-淀粉酶。
[0063] 真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属(genus Aspergillus)菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)α-淀粉酶。
[0064] 优选的真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶，其优选源自米曲霉菌株。在本公开中，术语"Fungamyl-样α-淀粉酶"指与WO96/23874中SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性的α-淀粉酶，即多于70%、多于75%、多于80%、多于85%多于90%、多于95%、多于96%、多于97%、多于98%、多于99%或甚至100%同一性的α-淀粉酶。
[0065] 另外的优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在优选的实施方式中，酸性真菌α-淀粉酶是来自黑曲霉的α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以初始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库，并且在WO89/01969(实施例3)中有更详细的描述。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还作为SEQ ID NO:1示于WO2004/080923(Novozymes)，将其作为参考并入本文。还预期的是所述酸性真菌淀粉酶的变体，所述变体与WO2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70%同一性，例如至少80%或甚至至少90%同一性、例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。合适的商业上可以获得的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
[0066] 真菌酸性α-淀粉酶还可以是包含糖结合模块(DBM)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)或其变体。在实施方式中，野生型酸性真菌α-淀粉酶源自川地曲霉(Aspergillus kawachii)的菌株。
[0067] 商业上可以获得的包含真菌α-淀粉酶的组合物包括FUNGAMYLTM和以商标名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
[0068] 在实施方式中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括WO2005/003311或美国专利公开no.2005/0054071(Novozymes)或美国专利公开60/638,614(Novozymes)的α-淀粉酶，其作为参考并入本文。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域，和任选的接头。
[0069] 预期的杂合α-淀粉酶的具体实例包括共同未决的(co-pending)美国专利申请no.60/638,614中实施例的表1至5中公开的那些，包括具有催化域JA118和Athelia rolfsii SBD的Fungamyl变体(本文的SEQ ID NO:2和US60/638,614中的SEQ ID NO:100)，具有Athelia rolfsii AMG接头和SBD的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:3和US60/638,614的SEQ ID NO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其公开于美国申请no.11/316,535中的表5作为氨基酸序列SEQ ID NO:20SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合，并且进一步作为本文的SEQ ID NO:13)，和带有Athelia rolfsii葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌(Meripilus giganteus)α-淀粉酶(本文的SEQ ID NO:4和US60/638,614中的SEQ ID NO:102)。其它特别预期的杂合α-淀粉酶是美国申请no.11/316,535或(WO2006/069290)(作为参考并入本文)的实施例4中的表3、4、5和6中所列的任何一种。预期的杂合α-淀粉酶的其它具体实例包括美国专利公开no.2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3中公开的那些，例如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
[0070] 可以将真菌α-淀粉酶以有效量添加，优选范围是0.001-1mg酶蛋白每克DS(酒糟中)，优选0.01-0.5mg酶蛋白每克DS。
[0071] 葡糖淀粉酶
[0072] 可以使用任何合适的葡糖淀粉酶进行本发明的方法，包括步骤i)。在优选的实施方式中，葡糖淀粉酶是细菌或真菌来源的。
[0073] 可将葡糖淀粉酶以有效量添加，优选范围在0.001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.01-0.5mg酶蛋白每克干底物。
[0074] 预期的葡糖淀粉酶包括来自下组的那些：曲霉属葡糖淀粉酶，具体而言黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)或其变体，例如WO92/00381、WO00/04136和WO01/04273中公开的那些(来自Novozymes,Denmark)；WO84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996),Prot.Eng.9,499-505)；
D257E和D293E/Q(Chen等(1995),Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等(1994),Biochem.J.301,275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996),Biochemistry,35,8698-8704；和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997),Protein Eng.10,1199-1204。
D257E和D293E/Q(Chen等(1995),Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等(1994),Biochem.J.301,275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996),Biochemistry,35,8698-8704；和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997),Protein Eng.10,1199-1204。
[0075] 预期的其它葡糖淀粉酶包括源自Athelia的菌株的葡糖淀粉酶，优选Athelia rolfsii(先前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))的菌株的葡糖淀粉酶(参见美国 专 利no.4,727,026和(Nagasaka,Y. 等(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,Appl Microbiol Biotechnol50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具体而言 源 自 Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus( 美 国专 利 no.Re.32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus( 美 国 专利no.4,587,215)。还预期的是如WO2006/060062中SEQ ID NO:4公开的里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶，和与其是至少80%或至少90%同一的葡糖淀粉酶，以及如US10/992,187(通过参考并入本文)中SEQ ID NO:3公开的源自灰腐质霉(Humicola grisea)的葡糖淀粉酶或与其具有至少80%或至少90%同一性的葡糖淀粉酶。
[0076] 其它预期的葡糖淀粉酶包括源自栓菌属(Trametes)菌株的葡糖淀粉酶，优选WO2006/069289(将其作为参考并入本文)中公开的Trametes cingulata菌株的葡糖淀粉酶。根据本发明还预期杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例在WO2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合葡糖淀粉酶(将所述杂合体作为参考并入本文)。
[0077] 预期的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(genus Clostridium)的葡糖 淀 粉 酶，具 体 而 言 是C.thermoamylolyticum(EP135,138) 和 热 硫 化 氢 梭 菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
[0078] 商业上可获得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER、TM TM TM TM TMSAN EXTRA L、SPIRIZYME PLUS、SPIRIZYME FUEL、SPIRIZYME B4U和AMG E(来自Novozymes TM TM TM
A/S)；OPTIDEX 300( 来 自 Genencor Int.)；AMIGASE 和 AMIGASE PLUS( 来 自 DSM)；
TM TM
G-ZYME G900、G-ZYME 和G990ZR(来自Genencor Int.)。
A/S)；OPTIDEX 300( 来 自 Genencor Int.)；AMIGASE 和 AMIGASE PLUS( 来 自 DSM)；
TM TM
G-ZYME G900、G-ZYME 和G990ZR(来自Genencor Int.)。
[0079] 在实施方式中可将葡糖淀粉酶以0.02-20AGU/g DS，优选0.05-5AGU/gDS(酒糟中)，特别是0.1-2AGU/g DS的量添加。
[0080] 纤维素酶和半纤维素酶
[0081] 纤维素酶
[0082] 根据本发明使用的纤维素酶可以是任何纤维素酶，具体而言是微生物来源，具体而言是真菌或细菌来源的，例如可源自丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium))菌株的纤维素酶。优选地，纤维素酶同时作用于纤维素和木质纤维素材料。在本发明中使用的优选的纤维素酶包括外切作用的(exo-acting)纤维素酶(celluase)和纤维二糖酶(cellobiase)，和它们的组合。更优选地，处理涉及外切作用的纤维素酶和纤维二糖酶的组合。优选地，纤维素酶具有在pH7以下的酸性条件下水解纤维素和木质纤维素的能力。
[0083] 商业上可以获得的根据本发明适合的纤维素酶的实例包括，例如，TM TMCELLULCLAST ( 可 从 Novozymes A/S 获 得 )、NOVOZYM 188( 可 从 Novozymes A/TM TM
S获得)。其它商业上可以获得的包含纤维素酶的制剂包括CELLUZYME 、CEREFLOTM TM TM
和 ULTRAFLO (Novozymes A/S)，LAMINEX 和 SPEZYME CP(Genencor Int.)和ROHAMENTTM7069W(来自 GmbH)。可将纤维素酶以有效量添加，范围为
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0.1x10-10x10ECU每吨干底物(酒糟中)或0.1x10-10x10EGU每吨干底物(酒糟中)。
S获得)。其它商业上可以获得的包含纤维素酶的制剂包括CELLUZYME 、CEREFLOTM TM TM
和 ULTRAFLO (Novozymes A/S)，LAMINEX 和 SPEZYME CP(Genencor Int.)和ROHAMENTTM7069W(来自 GmbH)。可将纤维素酶以有效量添加，范围为
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0.1x10-10x10ECU每吨干底物(酒糟中)或0.1x10-10x10EGU每吨干底物(酒糟中)。
[0084] 半纤维素酶
[0085] 可将能够降解酒糟成分的任何半纤维素酶根据本发明用于步骤i)中。用于本发明的优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶(exo-galactanses)和它们的混合物。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，其在pH7以下的酸性条件TM下具有水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYME L (可从
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Novozymes A/S,Denmark获得)。可将半纤维素酶以范围为0.001x10-10x10FBG每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
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Novozymes A/S,Denmark获得)。可将半纤维素酶以范围为0.001x10-10x10FBG每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
[0086] 木聚糖酶
[0087] 根据本发明可在步骤i)中使酒糟经有效量的任何木聚糖酶(EC3.2.1.8)处理，例如经任何下述木聚糖酶处理。木聚糖酶活性可源自任何合适的生物，包括真菌和细菌生物。真菌木聚糖酶可以源自包括曲霉属、Disporotrichum、青霉属(Penicillium)、脉孢菌属(Neurospora)、镰孢属和木霉属的菌属的菌株。
[0088] 合适的木聚糖酶的实例包括源自如下的木聚糖酶：特异腐质霉(H.insolens)(WO92/17573；塔 宾 曲 霉(Aspergillus tubigensis)(WO92/01793)；黑 曲 霉 (Shei等,1985,Biotech.and Bioeng.Vol.XXVII,pp.533-538，和Fournier等,1985,Bio-tech.Bioeng.Vol.XXVII,pp.539-546；WO91/19782 和EP463706)；棘 孢 曲 霉 (A.aculeatus)(WO94/21785)。
[0089] 合适的细菌木聚糖酶的实例包括源自芽孢杆菌属菌株的木聚糖酶，例如枯草芽孢杆菌，例如美国专利no.5,306,633中公开的菌株，或Bacillus agaradhaerens，包括WO94/01532中公开的Bacillus agaradhaerens AC13，短小芽孢杆菌菌株，例如WO95/182109中公开的菌株，源自嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，例如WO95/182109中公开的菌株。
[0090] 在具体实施方式中，木聚糖酶是WO94/21785中公开的木聚糖酶I、II或III。优选来自棘孢曲霉的木聚糖酶II。
[0091] 预期的商业上可以获得的木聚糖酶包括SHEARZYMETM、BIOFEEDWHEATTM、TM TM TMPULPZYME HC(来自Novozymes A/S)、BioBrite EB(来自Iogen,Canada)和SPEZYME CP(来
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自Genencor Int.)。可将木聚糖酶以范围为0.001x10-10x10FXU每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
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自Genencor Int.)。可将木聚糖酶以范围为0.001x10-10x10FXU每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
[0092] 甘露聚糖酶
[0093] 甘露聚糖酶是分类为EC3.2.1.78的半纤维素酶，并且称为内切-1,4-β-甘露糖苷酶。甘露聚糖酶包括β-甘露聚糖酶、内切-1,4-甘露聚糖酶和半乳甘露聚糖酶。甘露聚糖酶优选能够催化甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键的水解，所述甘露聚糖包括葡甘露聚糖(glucomannan)、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(galactoglucomannan)。甘露聚糖是主要或全部由D-甘露糖单位组成的多糖。甘露聚糖酶可以是任何来源例如细菌或真菌生物的。
[0094] 在具体实施方式中，甘露聚糖酶源自丝状真菌曲霉属菌株，优选黑曲霉或棘孢曲霉(WO94/25576)。WO93/24622公开了对于漂白木质纤维素纸浆(lignocellulosic pulp)有用的从里氏木霉分离的甘露聚糖酶。
[0095] 已经在几种芽孢杆菌属生物中鉴定了甘露聚糖酶。例如，Talbot等,Appl.Environ.Microbiol.,Vol.56,No.11,pp.3505-3510(1990)描述了源自嗜热脂肪芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。Mendoza等,World J.Microbiol.Biotech.,Vol.10,No.5,pp.551-555(1994)描述了源自枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶。JP-A-03047076公开了源自芽孢杆菌属菌种的β-甘露聚糖酶。JP-A-63056289描述了碱性、热稳定的β-甘露聚糖酶的产生。JP-A-63036775涉及产生β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的芽孢杆菌属微生物FERM P-8856。JP-A-08051975公开了来自碱性芽孢杆菌属菌种AM-001的碱性β-甘露聚糖酶。
在WO97/11164中公开了来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的甘露聚糖酶。WO91/18974描述了半纤维素酶例如葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。
在WO97/11164中公开了来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的甘露聚糖酶。WO91/18974描述了半纤维素酶例如葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。
[0096] 商业上可以获得的甘露聚糖酶的实例包括可以从Novozymes A/SDenmark获得的TMGAMANASE 。
[0097] 可将甘露聚糖酶以范围为0.01x109–10x109VHCU每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
[0098] 果胶酶
[0099] 果胶酶可以是任何果胶酶，具体而言是微生物来源，具体而言是细菌来源的，例如源自以下属内的菌种的果胶酶：芽孢杆菌属、梭菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单孢菌属(Xanthomonas)和欧文氏菌属(Erwinia)；或是真菌来源的，例如源自曲霉属内菌种的果胶酶，具体而言源自黑曲霉和棘孢曲霉菌种内的菌株。预期的商业上可以获得的果胶酶TM TM TM TM TM包括BIOPREP 、NOVOZYM 863、PEXTINEX 3XL、PECTINEX SMASH和PECTINEX SMACH XXL、TM
BIOCIP MEMBRANE(全部可从NovozymesA/S,Denmark获得)。
BIOCIP MEMBRANE(全部可从NovozymesA/S,Denmark获得)。
[0100] 可将果胶酶以范围为0.01x106-10x106PECTU每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
[0101] 蛋白酶
[0102] 根据本发明的方法，在步骤i)中可以存在有效量的蛋白酶。蛋白酶是本领域熟知的，并且指催化肽键切割的酶。合适的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，特征在于在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的能力。
[0103] 合适的酸性真菌蛋白酶包括源自如下的真菌蛋白酶：曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙菌属(Irpex)、青霉属、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。特别预期的是源自如下的蛋白酶：黑曲霉(参见，例如，Koaze等,(1964),Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛 曲霉(Hayashida等 ,(1977)Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933，棘孢曲霉(WO95/02044)，或米曲霉，例如蛋白酶pepA；和源自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
[0104] 商业上的蛋白酶包括GC106TM和SPEZYMETMFAN(可从Genencor,USA获得)。TM
合适的细菌蛋白酶，尽管不是酸性蛋白酶，包括商业上可以获得的产品ALCALASE 和TM
NEUTRASE (可从Novozymes A/S获得)。
合适的细菌蛋白酶，尽管不是酸性蛋白酶，包括商业上可以获得的产品ALCALASE 和TM
NEUTRASE (可从Novozymes A/S获得)。
[0105] 优选 地，蛋 白酶是 天冬 氨酸 蛋白 酶，例如 Handbook of Proteolytic Enzymes, 由 A.J.Barrett,N.D.Rawlings 和 J.F.Woessner 编 ,Academic Press,San Diego,1998,Chapter270)中所述。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，R.M.Berka等Gene,96,313(1990))；(R.M.Berka等 Gene,125,195-198(1993))；和Gomi等Biosci.Biotech.Biochem.57,1095-1100(1993)中公开的那些，将其通过参考并入本文。
[0106] 可将蛋白酶以范围为0.0001x106–1x106AU每吨干底物(酒糟中)的有效量添加。
[0107] 在本文中描述并且要求保护的发明不限于本文公开的具体实施方式的范围，因为这些实施方式旨在说明本发明的几个方面。任何等同的实施方式应在本发明的范围之内。事实上，除了本文显示和说明的那些内容之外，根据前述描述对本发明进行多种修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修饰也落入所附权利要求范围之内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。本文引用了多篇参考文件，将其全部内容并入作为参考。通过以下实施例进一步描述本发明，不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。
[0108] 材料和方法
[0109] 酶：
[0110] 纤维素酶DM是液态多组分纤维素酶制剂，其由源自里氏木霉和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的纤维素酶得到，并且可以从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0111] 纤维素酶CZ是单组分特异腐质霉内切葡聚糖酶EGV，并且可以从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0112] 纤维素酶C是液态多组分纤维素酶制剂，其源自里氏木霉，并且可以从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0113] 木聚糖酶HC是WO94/01532中公开的源自Bacillus agaradhaerens的木聚糖酶，并且可以从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0114] 木聚糖酶SZ是在WO94/21785中作为XYL II公开的源自棘孢曲霉的木聚糖酶，并且可以从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0115] 半纤维素酶VL：是含有多种糖酶的多酶复合物，所述糖酶包括阿聚糖酶(arabinanase)、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶。酶制剂由选择的棘孢曲霉菌株产生，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0116] 甘露聚糖酶GN是源自黑曲霉的甘露聚糖酶，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0117] 果胶酶BC是多聚半乳糖醛酸酶、葡糖淀粉酶和果胶甲酯酶的多活性酶制剂，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0118] β-葡聚糖酶CF是源自解淀粉芽孢杆菌的β-葡聚糖酶，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0119] β-葡聚糖酶BG是源自橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的β-葡聚糖酶，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0120] 葡糖淀粉酶SF是源自Talaromyces emersonii的菌株的葡糖淀粉酶，在WO9928448中公开，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0121] 葡糖淀粉酶TC是WO2006/069289的SEQ ID NO:2中公开的源自Trametes cingulata的葡糖淀粉酶，并且可从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0122] α-淀粉酶JA是源自微小根毛霉的α-淀粉酶，并且作为V039在WO2006/069290的表5中公开。
[0123] 测定α-淀粉酶活性(KNU)
[0124] 1.Phadebas测定法
[0125] 通过使用 片剂作为底物的方法来测定α-淀粉酶活性。Phadebas片剂( Amylase Test，由Pharmacia Diagnostic供应)含有交联的不溶性呈蓝色的淀粉聚合物，将其与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并且制成片剂。
[0126] 对于每个单独的测量，将一个片剂悬浮在含有5ml50mMBritton-Robinson缓冲剂(50mM乙酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2，用NaOH将pH调节至感兴趣的值)的管中。在感兴趣的温度在水浴中进行测试。将待测试的α-淀粉酶在x ml的50mM Britton-Robinson缓冲剂中稀释。将1ml这种α-淀粉酶溶液添加至5ml50mM Britton-Robinson缓冲剂。α-淀粉酶水解淀粉产生可溶性蓝色片段。在620nm以分光光度法测量所得蓝色溶液的吸光度，所述吸光度是α-淀粉酶活性的函数。
[0127] 重要的是在温育10或15分钟(测试时间)之后测量的620nm吸光度范围是0.2-2.0吸光度单位。在此吸光度范围内，活性和吸光度之间存在线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调节酶的稀释物以符合此标准。在指定的一组条件(温度、pH、反应时间、缓冲条件)下，1mg给定的α-淀粉酶将水解一定量的底物，并且将产生蓝颜色。在给定的一组条件下测量的吸光度与所述α-淀粉酶的比活性(活性/mg的纯α-淀粉酶蛋白)成正比。
[0128] 2.可选择的方法
[0129] 可选择地通过使用PNP-G7底物的方法来测定α-淀粉酶活性。PNP-G7是对硝基苯基-α,D-麦芽七糖苷(p-nitrophenyl-alpha,D-maltoheptaoside)的缩写，其是能够由内切淀粉酶切割的封闭寡糖(blocked oligosaccharide)。在切割之后，试剂盒(kit)中包含的α-葡糖苷酶将底物消化以释放具有黄颜色的游离PNP分子，并且由此能够通过可见分光光度法(visible spectophometry)在波长Lambda=405nm(400-420nm)来测量。含有PNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Bohringer-Mannheim制造(产品目录No.1054635)。
[0130] 将一瓶底物(BM1442309)添加至5ml缓冲剂(BM1442309)来制备底物。将一瓶α-葡糖苷酶(BM1462309)添加至45ml缓冲剂(BM1442309)来制备α-葡糖苷酶。通过混合5mlα-葡糖苷酶溶液和0.5ml底物来制备工作溶液。
[0131] 通过将20微升酶溶液转移至96孔微量滴定板并且在25℃温育来进行测定。添加25℃的200微升工作溶液。混合所述溶液并且预温育1分钟，在3分钟内每15秒测量OD405nm的吸收。
[0132] 在给定的一组条件下依赖于时间的吸收曲线的斜率与所述α-淀粉酶的比活性(活性每mg酶)成正比。用于测定KNU和FAU的Novozymes的方法的详细描述可根据要求作为标准方法EB-SM-0009.02/01获得。
[0133] 测定酸性淀粉分解活性(FAU)
[0134] 将一个真菌α-淀粉酶单位(1FAU)定义为按照用于测定α-淀粉酶的Novozymes的标准方法每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6,Batch9947275)的酶量，所述测定基于以下标准条件：
[0135]
[0136] 用于测定KNU和FAU的Novozymes的方法的详细描述可根据要求作为标准方法EB-SM-0009.02/01获得。
[0137] 测定酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
[0138] 以AFAU(Acid Fungal Alpha-amylase Units；酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品测定。
[0139] 使用的标准品是AMG300L(由Novozymes A/S出售的野生型黑曲霉G1AMG)。在室温贮藏3周之后，这种AMG中的中性α-淀粉酶从大约1FAU/mL降低至0.05FAU/mL以下。
[0140] 根据AF91/3(用于测定真菌α-淀粉酶的Novo方法)测定这种AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
[0141] 碘与淀粉形成蓝色复合物，但是与其降解产物不形成蓝色复合物。因此颜色的强度与淀粉的浓度成正比。在指定的分析条件下，使用反向比色法将淀粉浓度的减少测定为淀粉酶活性。
[0142]
[0143] 标准条件/反应条件:(每分钟)
[0144]
[0145] 进一步的细节可见于标准方法文件EB-SM-0259.02/01，该文件可根据要求从Novozymes A/S获得，将该文件夹作为参考并入本文。
[0146] 葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶活性(AGU)
[0147] 将Novo葡糖淀粉酶单位(Novo Glucoamylase Unit;AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件是37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲剂：乙酸0.1M，反应时间5分钟。
[0148] 可以使用自动分析系统。将变旋酶(Mutarotase)添加至葡萄糖脱氢酶试剂，从而使存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，使用光度计在340nm测定NADH作为对初始葡萄糖浓度的量度。
[0149] AMG温育:
[0150]
[0151] 颜色反应:
[0152]
[0153] 更详细描述这种分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得，将所述文件夹并入本文作为参考。
[0154] 测定木聚糖酶活性(FXU)
[0155] 通过以下测定法来测定内切木聚糖酶活性，在所述测定法中将木聚糖酶样品与remazol-木聚糖底物(用Remazol Brilliant Blue R,Fluka染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖)，pH6.0温育。将温育在50℃进行30分钟。通过乙醇沉淀未降解的经染色的底物的背景(background)。通过分光光度法在585nm测定上清中剩余的蓝色并且其与内切木聚糖酶活性成比例。
[0156] 相对于酶标准品测定样品的内切木聚糖酶活性。
[0157] 所述测定法在分析方法EB-SM-397.02中进一步描述，EB-SM-397.02可以根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0158] 测定内切纤维素酶单位(ECU)
[0159] 相对于酶标准品测定ECU(endocellulose unit；内纤维素单位)。
[0160] 内切纤维素酶分解羧甲基纤维素，CMC。制备的底物溶液在pH7.5的0.1M磷酸缓冲液中含有35g/l CMC(Blanose Aqualon)。将待分析的酶样品溶解在相同的缓冲液中来测定。
[0161] 将0.15ml标准酶溶液或未知酶样品置于10ml试管。添加预热至40℃的5ml CMC底物溶液。将加入的溶液充分混合，温育30分钟并且置于粘度计中。
[0162] 所述方法在AF302/1-GB中进一步详细描述，AF302/1-GB可根据要求从Novozymes A/S获得。
[0163] 测定内切葡聚糖酶活性(EGU)
[0164] 制备底物溶液，其在0.1M磷酸盐缓冲液，pH6.0中含有34.0g/l CMC(Blanose Aqualon)。将待分析的酶样品溶解在相同的缓冲液中。将14ml底物溶液和0.5ml酶溶液混合并且转移至恒温在40℃的振动粘度计(例如可从Sofraser,France获得的MIVI3000)。将样品的粘度和标准酶溶液的粘度之间的比率测定为内切葡聚糖酶单位(EGU)。
[0165] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0275.02/01中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0166] 测定果胶反式消除酶单位(PECTU)
[0167] 所述方法基于通过反式消除反应的果胶溶液中酶降解，形成的双键致使分光光度计跟踪的238nm的吸收增加。
[0168] 反应条件
[0169]
[0170] 相对于PECTU标准品测定所述活性。以与标准品相同的单位给出结果，所述单位表示为：PECTU–果胶反式消除酶单位(Pectintranseliminase Unit)。
[0171] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0573.02中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0172] 测定真菌β-葡聚糖酶活性(FBG)
[0173] 真菌β-葡聚糖酶与β-葡聚糖反应形成葡萄糖或还原糖，使用Somogyi Nelson方法将所述葡萄糖或还原糖测定为还原糖。
[0174] 1真菌β-葡聚糖酶单位(FBG)是在上文所列的标准条件下以等同于每分钟1微摩尔葡萄糖的还原能力(reduction capacity)释放葡萄糖或还原糖的酶量。
[0175] 反应条件
[0176]
[0177] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0338.02/01中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0178] 测定半纤维素酶(VHCU)
[0179] 半纤维素酶单位(VHCU)表示酶水解溶解的半乳甘露聚糖中甘露糖分子之间的β-1,4键并且由此使溶液的粘度降低的能力。相对于Novozymes A/S酶标准品测定所述单位。
[0180] 反应条件:
[0181]
[0182] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0156.02/01中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0183] 测定β-葡聚糖酶活性(BGU)
[0184] 1β-葡聚糖酶单位(BGU)是在上文所列的标准条件下，以等同于每分钟1微摩尔葡萄糖的还原能力释放葡萄糖或还原糖的酶量。
[0185] 反应条件:
[0186]
[0187] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0275.02/01中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0188] 测定蛋白酶活性(AU)
[0189] 通过蛋白水解酶将二甲基酪蛋白(DMC)水解成小肽。在此过程中形成的伯氨基与三硝基苯磺酸(TNBS)反应形成有色复合物。原位监测这种显色(coloured complex)，由此能够计算每时间单位吸收的变化。这种图形是反应速率的量度，并且因此是酶活性的量度。
[0190] 用于DMC反应的反应条件
[0191]
[0192] 相对于酶标准品测定所述活性。
[0193] 所述测定法在标准方法文件EB-SM-0218.02/02中进一步描述，所述文件可根据要求从Novozymes A/S,Denmark获得。
[0194] 实施例
[0195] 实施例1
[0196] 将酒糟脱水
[0197] 使用来自常规干磨乙醇发酵的酒糟(7.7wt-%干固体，pH=4.5)作为底物。
[0199] 将所述离心管在2000rpm离心5分钟。
[0200] 将上清倾出，并且将所得湿饼小心地转移至去皮重的(tared)坩埚中并且在烘箱中(105℃)干燥过夜。
[0201] 称量干燥的饼固体并且与对照固体(其中不使用酶)重量比较。将结果以及测试的几种其它酶示于表1。
[0202] 表1：
[0203]1
[0204] 干燥饼固体的质量除以湿饼的质量。2
[0205] (饼固体减去对照饼固体x100)除以对照饼固体。
[0206] 实施例2
[0207] 使用CST方法将酒糟脱水
[0208] 对于本研究使用来自干磨玉米的常规乙醇发酵的酒糟。使用Moisture Analyzer IR-200(Denver Instrument)测定干固体含量为10.58%DS。测量酒糟的pH为4.05。在本研究的过程中不调节pH。将50mL酒糟移液入(pipette into)每个试管。向试管中添加100微升下表中所列的酶。在用Vortex-2Genie(Scientific Industries)混合之后，将全部试管置于45℃摇动水浴。轻度摇动20小时之后，取出试管并且冷却至室温。使用Capillary Suction Timer(CST)(Triton Electronics,Ltd)评估酶的脱水效果。记录水在滤纸上行进的时间。该时间越短，脱水效果越好。纤维素酶和/或半纤维素酶包括木聚糖酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶对酒糟具有脱水效果。在pH4具有低活性的酶显示几乎没有或完全没有效果。全部实验一式两份进行。结果在下表中。
[0209]
[0210] 实施例3
[0211] 使用CST方法将酒糟脱水
[0212] 本研究中的酒糟与实施例中相同而未改变。将50ml酒糟移液入每个试管中。向试管中添加一定量的酶。在用Vortex-2Genie(Scientific Industries)混合之后，将全部试管置于50℃摇动培养箱(incubator)中。摇动45分钟之后，取出试管并且冷却至室温。使用Capillary Suction Timer(CST)(Triton Electronics,Ltd)评估酶的脱水效果。结果示于下表。
[0213]
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