本发明涉及抗微生物剂。更准确地讲，本发明涉及一系列脱水果 糖衍生物的抗微生物活性。

各种原因造成的食物腐败见于文献中，已知各种化学药品可抑制 一种原因造成的各方面的降解。已知降解和新鲜割伤植物部分颜色或 香味的丧失是由于氧化作用、酶、微生物和金属离子引起的。例如， 已知酸化剂通过保持相对低pH环境可防止微生物降解，但其有效性 仅仅是暂时性的。

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是可以污染某 些食物的生物的一个例子，所述细菌表现出对多种理化处理有抗性。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种主要在免疫妥协患者和新生儿中引起 严重感染的革兰氏阳性芽孢杆菌。脑膜炎和菌血症都是李斯特菌病最 为常见的表现形式。

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)是食物中毒的另一种常见病因。已 鉴定出两种不同的临床综合征，第一种具有约4小时的短潜伏期，第 二种的潜伏期约为17小时。蜡状芽孢杆菌食物中毒当孢子形成没有烹 调杀死时且让污染食物达到允许所述孢子萌发和释放肠毒素的温度时 发生。

其中有2000多种不同菌株的沙门氏菌属(Salmonella)，是人类食 物中毒的另一病因。沙门氏菌属是棒状革兰氏阴性肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)中的一个属，它在肠内定居且引起各种感染例如胃 肠炎和伤寒。当侵入时，它们可以引起伤寒(例如，由伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi)引起的伤寒或由副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)引起的副伤寒)。沙门氏菌属中的其它菌株与食物中毒有关 (通常是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、巴拿马沙门氏菌 (Salmonella panama)或肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)，后者是众 所周知的家禽污染物)且偶尔在非肠组织中引起败血症。

本领域众所周知的是，沙门氏菌属不能在pH值低于4.5的情况下 繁殖。因此，弱酸性制品例如精制食品和非发酵肉制品对沙门氏菌属 的攻击尤其敏感。

对于肉制品，通常用亚硝酸盐作为防腐剂。然而，亚硝酸盐的添 加由于其有毒而受到限制(由于其急性毒性以及有与亚硝胺生成相关 的危险性)。由于沙门氏菌属仅在亚硝酸盐浓度超过1,000ppm才被抑 制，而这远远超过法规的限制。

然而，已经显示亚硝酸盐和山梨酸的组合可以增加对沙门氏菌属 的有效性[亚硝酸钠和山梨酸钾可抑制沙门氏菌属，载于：Frankfurters， Journal of Food Science，47，1982，第1615 ff页]。在浓度超过50ppm的 亚硝酸盐联用2600ppm山梨酸时已经观察到抑制作用。

诸如细菌素(Nisin)的其它试剂不能抑制食物中的沙门氏菌属，而 苯甲酸由于只能在酸性制品中观察到抑制效应而不太适用。也测试了 从不同诸如得自不同香料的油提取物的植物成分(“天然物质”)的抑 制效应，但是再次证明达到对沙门氏菌属的抑制效应的所需浓度太 高，而且对食物的感官影响太强。

因此，迄今为止，化学物质的应用因为以下原因而严重受限：一 方面，根据毒理学观点它们必须是安全的，而另一方面，它们必须在 感官上不影响所述产品。

本发明力图解决与现有技术化学物质相关的问题，提供基于脱水 果糖衍生物的新型抗微生物组合物。具体地说，本发明力图提供适合 用于食品/饲料的抗微生物剂。

在第一个方面，本发明提供包含具有式I的环状化合物的抗微生 物组合物， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中 R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻 原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。

本发明的第二个方面提供一种防止和/或抑制某种物质中微生物 生长和/或杀死所述微生物的方法，所述方法包括将所述物质与具有式 I的环状化合物接触的步骤， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中 R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻 原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。

在第三个方面，本发明涉及具有式I的化合物在防止和/或抑制某 种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物中的应用， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中 R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻 原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。

人们将会认识到，术语“酯基”是指式X-C(O)O-Y的基团，其中 X和Y均为烃基。

所述物质最好是食品或饲料。因此，在一个优选的方面，本发明 涉及适合用于食品和/或饲料中的抗微生物物质，以抑制食物中毒和其 中所含有的腐败菌。

在另一个优选的实施方案中，所述物质是家用品、机体护理品或 化妆品例如花露水。

作为定义，术语“抗微生物剂”是指杀死或防止或抑制微生物生 长或繁殖的物质。抗微生物剂一般依照它们有效抵抗的微生物类型来 分类。例如，抗细菌物质有效抵抗细菌，抗真菌物质有效抵抗包括酵 母在内的真菌，而抗病毒物质有效抵抗病毒。某些抗微生物剂可以在 体内使用例如抗生素类药物，而其它抗微生物剂仅可外用例如防腐 剂。

本文所用的术语“烃基”是指包含至少C和H的基团并且可以任 选包含一个或多个其它合适的取代基。这类取代基的实例可包括卤基 -、烷氧基-、硝基-、羟基、羧基、环氧基、丙烯基、烃基、N-酰基或 环基等等。除所述取代基可为环基外，所述取代基的组合也可以形成 环基。如果烃基包含不止一个C，则那些碳不一定需要相互连接。例 如，所述碳中至少2个可以通过合适的元素或基团连接。因此，烃基 可以含有杂原子。合适的杂原子对本领域技术人员而言是显而易见 的，包括例如硫、氮和氧。

在一个更优选的方面，本发明的环状化合物是具有式II的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5如上文限定。

优选所述环状化合物是具有式III的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5如上文限定。

在一个优选的实施方案中，所述环状化合物为式IV化合物， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中 R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻 原子的化学键；其中R6和R7各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和 -OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5代表与所述环状化 合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。

更优选所述环状化合物为式V化合物， 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如上文限定。

优选R1选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。

优选R2选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。

优选R3选自包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或 烃基。

甚至更优选R3为-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。

甚至更优选R3为-OC(O)R’，其中R’为烃基。

在一个优选的实施方案中，R3为-OC(O)R’，其中R’为R”基团。

优选R’和/或R”为支链或直链、取代或未取代的烷基。

更优选R’和/或R”为(CH2)pCH3，其中p为1-24。

甚至更优选R’和/或R”为C8烷基。

在另一个优选的实施方案中，R’和/或R”为C12烷基。

在另一个优选的实施方案中，R’和/或R”为C16烷基或C18烷基。

在本发明的一个优选实施方案中，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3，其中n和p各自独立地为1-24。

更优选R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)7CH3，其中n为1-24、最好是 1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。

在一个替代优选实施方案中，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)11CH3， 其中n为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、 2或3。

在一个优选的实施方案中，R4选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基。

在一个特别优选的实施方案中，R4选自烃基、H、OH和＝O。

在一个优选的实施方案中，R5选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’， 其中R’为H或烃基。

在一个特别优选的实施方案中，R5选自烃基、H、OH和＝O。

在一个优选的实施方案中，R4和R5代表与所述环状化合物环上与 相邻原子的化学键。

在一个尤其优选的实施方案中，所述化合物被酯化为脱水果糖， 其中脱水果糖的至少一个OH基团被酯化，形成-OC(O)R基团，其 中R为烃基。

优选R为支链或直链、取代或未取代的烷基。

甚至更优选R为(CH2)pCH3，其中p为1-24。

再更优选R为C8烷基。

在一个替代优选实施方案中，R为C12烷基。

在另一个优选的实施方案中，R为C16烷基或C18烷基。

在本发明的一个优选实施方案中，所述环状化合物为下式化合 物：

在本发明的一个优选实施方案中，环状化合物为下式化合物：

更优选所述环状化合物选自以下化合物： 更优选所述环状化合物选自以下化合物：

优选本发明的化合物为壳二孢吡喃酮(Ascopyrone)P、壳二孢吡哺 酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2、壳二孢 吡喃酮T3的衍生物和它们的混合物的衍生物。

甚至更优选本发明的化合物选自酯化壳二孢吡喃酮P、酯化壳二 孢吡喃酮M、酯化壳二孢吡喃酮T、酯化壳二孢吡喃酮T1、酯化壳二 孢吡喃酮T2、酯化壳二孢吡喃酮T3和它们的混合物。

壳二孢吡喃酮P、壳二孢吡喃酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡 喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2和壳二孢吡喃酮T3的结构如下所示。 壳二孢吡喃酮M            壳二孢吡喃酮P            壳二孢吡喃酮T 壳二孢吡喃酮T1         壳二孢吡喃酮T2          壳二孢吡喃酮T3 壳二孢吡喃酮是一种已知的化合物。在1978和1981年，一个美 国科学家小组为了应用壳二孢吡喃酮P作为有机合成的原材料而在 Montana的Wood Chemistry laboratory通过热解胶淀粉、直链淀粉和纤 维素来制备壳二孢吡喃酮P[Shafizadeh，F.，Furneaux R.H.，Stevenson， T.T.和Cochran，T.G.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖和纤维素 的其它热解产物，Carbohydr.Res.67(1978)：433-447；Stevenson，T.T.， Stenkmap，R.E.，Jensen，L.H.，Cochran，T.T.，Shafizadeh，F.和Furneaux R.H.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖的晶体结构，Carbohydr. Res.90(1981)：319-325]。他们通过例如1H和13C NMR以及IR光谱学 技术表征了壳二孢吡喃酮P。提供了壳二孢吡喃酮P的三维结构。通 过热解获得的壳二孢吡喃酮P的收率低于3％并且必须使用复杂的分 离方法。

关于壳二孢吡喃酮P天然存在于得自Alps的非常少研究的真菌的 某些种型中已有陈述[M.-A.Baute，G.Deffieux，J.Vercauteren，R.Baute 和Badoc A.，盘菌目和块菌目酶活性降解1，4-α-葡聚糖为壳二孢吡喃 酮P和壳二孢吡喃酮T(Enzymatic activity degrading 1，4-α-glucans to Ascopyrones P and T in Pezizales ad Tuberales)，Phytochemistry，33 (1993)：41-45]。真菌中存在的壳二孢吡喃酮P立刻使人提出壳二孢吡 喃酮P可作为抗生素使用的假说。然而，在所公开的试验中壳二孢吡 喃酮P作为抗生素使用并不令人满意。

壳二孢吡喃酮P和壳二孢吡喃酮T可以采用从以下真菌制备的无 细胞提取物从1，5-脱水-D-果糖酶法生产：盘菌目(Pezizales)例如 Plicaria leiocarpa和Anthracobia melaloma以及块菌目(Tuberales)例如 黑孢块菌(Tuber melanosporum)。壳二孢吡喃酮T1是壳二孢吡喃酮T 的二水合物形式，而壳二孢吡喃酮T2和壳二孢吡喃酮T3是壳二孢吡 喃酮T的互变异构体一水合物形式。

壳二孢吡喃酮M可以通过从以下真菌分离的EDTA敏感的脱水酶 从1，5-脱水-D-果糖来生产：羊肚菌例如Morchella vulgaris、鹿花菌属 (Gyromitres)、盘菌(pezizes)例如Peziza echinospora。

壳二孢吡喃酮M、P和T也可以在温和条件下通过用碱处理1，5- 脱水-D-果糖来化学生产[对某些戊糖和1，5-脱水-D-果糖降解、淀粉降 解酶a-1，4-葡聚糖裂合酶产物的研究(Studies on the degradation of some pentoses and of 1，5-anhydro-D-fructose，the product of the starch- degrading enzyme a-1，4-glucan lyase)；Ahmad，T.的论文，The Swedish University of Agricultural Sciences，Sweden，1995]。

当通过化学方法制备本发明的化合物时，可以按照任一下述方法 制备所述化合物：

(1)壳二孢吡喃酮P可以在温度升高的情况下例如在70℃下通过 用非水酸处理1，5-脱水-D-果糖来生产。

(2)壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、T和M)可以通过依照 Ahmad，T.，1995的碱处理法从1，5-脱水-D-果糖来生产。

所生产的所有壳二孢吡喃酮的结构都通过NMR技术加以证实。

本发明的化合物最好通过如M.-A.Baute等，[Phytochemistry，33 (1993)：41-45)中公开的酶法来制备。例如可以采用如M.-A.Baute等公 开的酶法从1，5-脱水-D-果糖生产壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、 T和M)。

在一个特别优选的实施方案中，所述化合物选自以下化合物或其 酯化衍生物：

在一个优选的实施方案中，具有式I的环状化合物具有针对革兰 氏阳性细菌和酵母的抗微生物效应。

优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生 物效应：李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、 酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属 (Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球 菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Eterobacter) 和接合酵母属(Zygosaccharomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、埃 希氏菌属(Escherichia)。

甚至更优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的 抗微生物效应：单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌(E.coli)、金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、 鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌(Salmonella sp.)、蜡状芽孢杆菌、枯草杆菌 (Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母奇异 变种(Saccharomyces cerevisiae var.paradoxus)、卡尔酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、清酒乳杆菌 (Lactobacillus sake)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)、藤黄微 球菌(Micrococcus luteus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和拜耳接合酵母 (Zygosaccharomyces bailii)。

甚至更优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的 抗微生物效应：单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、 酿酒酵母、卡尔酵母、荧光假单胞菌、生孢梭菌、清酒乳杆菌、热杀 索丝菌和藤黄微球菌。

在一个高度优选的方面，式I化合物的衍生物为下式化合物：

该化合物(3，6-二-O-乙酰基-1，5-脱水-4-脱氧D-甘油-己-3-烯醇吡 喃糖-2-酮糖)可以按照Andersen等(1998)(1，5-脱水-D-果糖的结构：晶 态乙酰化二聚体形式的X射线分析，J.Carbohydr.Chem.17：1027-1035) 所述方法来制备。

本发明该方面特别优选的是其中式I化合物的衍生物为酯，因为 所述化合物可以为亲脂性的和/或可以既具有疏水特性又具有亲水特 性。当所述化合物既具有疏水特性又具有亲水特性时，所述化合物容 易地存在于乳剂的水/油界面。

所述化合物存在于乳剂的水/油界面可以使其作为乳化剂起作 用。因此，本发明可以进一步提供具有双功能效应的化合物。所述化 合物既可以用作抗微生物剂又可以用作乳化剂。

许多本发明的化合物可以衍生自1，5-脱水果糖。1，5-脱水果糖是存 在于细菌、红藻、真菌和哺乳动物中的单酮糖。在红藻和真菌中，通 过α-1，4-葡聚糖裂合酶[EC 4.2.2.13]的作用分别从红藻淀粉和糖原产生 1，5-脱水果糖。

当从1，5-脱水-D-果糖制备本发明化合物时，1，5-脱水-D-果糖最好 是依照GB-A-2296717来制备。换句话说，1，5-脱水-D-果糖最好通过 包括用所述酶α-1，4-葡聚糖裂合酶处理α-1，4-葡聚糖的方法来制备，其 特征为使用基本纯形式的所述酶。

本发明的环状化合物最好包含五元环或六元环。

本发明的化合物包含至少一个酯基。因此，本文所用的术语“酯” 包括单酯、二酯、三酯和多酯。

在一个优选的方面，式I化合物是二酯，其中R1取代基是-OH基 团，其中由R4取代基的-OH基团和R3取代基的-OH基团形成所述酯 键。

如上所述，在本发明一个特别优选的实施方案中，所述化合物是 如下所示的6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖。

6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖的制备可以依照WO 00/56745中详述的 方法通过化学方法或通过酶法来完成。

所述化学方法可以包括以下反应，以合成脱水果糖的C12酯：

所述反应用月桂酰氯和吡啶来进行。酰化位点通过NH2OR衍生 化后产物的分离和NMR来确定。已发现所述产物为

50％ 6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖

11％ 3-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖

可以使用类似的方法来制备脱水果糖的其它酯衍生物。

制备6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖的酶学方法可以包括脂酶和蛋白 酶的应用。在水溶液中，脂酶和蛋白酶可切割酯键。脂酶是糖特异性 的，而蛋白酶是脂肪酸特异性的。然而，Synthesis 1990，112-115公开 了脂酶和蛋白酶在非水溶液中可提供活性的逆转，从而形成酯键。因 此可以用非水溶液中的脂酶和蛋白酶制备按照本发明的化合物。

按照J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，1995，2203-2222，对脂酶进行筛 选以鉴定用于制备按照本发明化合物的合适脂酶。用吡啶筛选鉴定了 Candida antarctica、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞 菌和猪胰腺。用叔丁醇∶吡啶为2∶1筛选鉴定了Candida antarctica、 Candida cylindrace、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、猪胰腺。

因此，按照本发明的化合物最好用从Candida antarctica、洋葱假 单胞菌、荧光假单胞菌、猪胰腺和Candida cylindrace中获得的脂酶来 制备。

按照本发明的化合物最好用从Candida antarctica中获得的脂酶来 制备。Candida antarctica可得自Novo Nodisk A/S，丹麦，商品名为 Novozym 435。

所述酶法通过用月桂酸酶促酰化1，5-脱水-D-果糖生成6-O-酰基- 1，5-脱水-D-果糖加以证实。 月桂酸 (mol/mol) 溶剂 3分子筛 (w/w) 温度 (℃) 反应时间 (h) 转化率 1 叔丁醇 - 40  24  21％ 1 叔丁醇 1(粉状) 40  24  56％ 1 叔丁醇 1(粉状) 40  72  62％ 1 丙酮 1(粉状) 20  24  55％ 1 叔丁醇 5  45  24  56％ 1 叔丁醇 10  45  24  61％ 1 叔丁醇 20  45  24  66％ 3 叔丁醇 20  45  24  73％ 3 叔丁醇 20(粉状) 45  24  78％ 3 叔丁醇 20(粉状) 45  48  定量 3 丙酮 20  20  72  定量

所述化学方法可以包括用月桂酸、棕榈酸和硬脂酸如下将1，5-脱 水-D-果糖定量转化为6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖：

所述反应形成包含单体酮/二聚体1型/二聚体2型-1∶3∶1的组合 物。所述混合物可以经硅胶色谱纯化，得到约70％收率。

本发明的环状化合物可以单独使用或与其它组分联合使用，所述 其它组分例如一种或多种防腐剂、一种或多种螯合剂(例如EDTA钠 盐、多磷酸盐或柠檬酸盐)和/或一种或多种抗氧化剂(例如抗坏血酸、 异抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、BHA或BHT)。

作为定义，在广义上，术语“防腐剂”意指包括所有抑制微生物 生长或杀死所述微生物的物质。在狭义上，一般理解的是防腐剂以浓 度为0.5％或更低浓度使用。有关除着色剂和甜味剂以外的食品添加 剂，在1995年2月20日的European Parliament and Council的Regulation No.95/2/EG中列出了允许用作防腐剂的食品添加剂。

EU许可的适合与本发明化合物联用的典型食品防腐剂包括山梨 酸、苯甲酸、PHB酯(对羟基苯甲酸酯)和二氧化硫。这些防腐剂的作 用模式以及它们的有效范围如下所述。 山梨酸(E200-203)：

作用模式：抑制所述微生物细胞内的各种酶。

有效范围：主要抗酵母和霉菌以及过氧化氢酶阳性细菌。不抑制 过氧化氢酶阴性细菌以及乳酸细菌和梭菌。

有效浓度：500-3000ppm。

食品中的最大许可量：马铃薯面团(potato dough)、加工干酪、包 装面包、精加工焙烤产品、乳化调味汁等中至多2000ppm。 苯甲酸(E210-213)：

作用模式：抑制通过细胞膜的氧交换且影响酶结构。

有效范围：仅对于酸性产品，至多约pH4.5；抑制酵母和霉菌， 有限抑制细菌(没有或仅非常微弱地抑制乳酸细菌和梭菌)。

食品中的最大许可量：肉冻、果品、果酱等中至多500ppm。 PHB酯(对羟基苯甲酸酯)(E214-219)

作用模式：由于表面活性而损伤细菌膜，由于蛋白质变性而对原 生质有毒性作用。

有效范围：主要抑制酵母和真菌，但在pH范围3.0-8.0之间也抑 制革兰氏阳性细菌。

有效浓度：在浓度超过约0.08％时有感官影响。 二氧化硫(E220-224；E226-227)

作用模式：在很大程度上取决于pH，事实上二氧化硫仅在酸性 pH值(＜4，0)时有效。机制非常复杂。

有效范围：主要抗细菌，尤其抗革兰氏阴性需氧细菌。

有效浓度：250-500ppm可抑制需氧革兰氏阴性细菌，800-2000 ppm可抗革兰氏阳性细菌、酵母和霉菌。

食品中的最大许可量：用于家庭葡萄酒酿造的干果、葡萄汁浓缩 物中最大2000ppm，在某些情况下，最大许可量仅为20-30ppm。

对于更为特殊的应用，本发明化合物也可以与以下防腐剂联合使 用：联苯、二苯、邻苯基苯酚、噻苯哒唑、乳链菌肽、那他霉素、六 亚甲基四胺、二碳酸二甲酯、硼酸、四硼酸钠、亚硝酸盐、丙酸和丙 酸盐以及溶菌酶。这些防腐剂的作用模式以及它们的有效范围和具体 应用如下所述。 联苯、二苯(E230)

有效范围：抑制霉菌。

用于处理水果的物质：表面处理柑桔类水果。

最大许可量：70ppm 邻苯基苯酚(E231/E232)

与E230一样，限于处理水果，如表面处理柑桔类水果。 噻苯哒唑(E233)

表面处理柑桔类水果和香蕉。 乳链菌肽(E234)

作用模式：扰乱膜功能。

有效范围：革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌无影响。

食品中的最大许可量(EU)：粗面粉布丁和类似产品3ppm，成熟干 酪和加工干酪12.5ppm(＝12.5IU/g)，凝结奶油10ppm，马斯卡朋10 ppm。 那他霉素(海松素)(E235)

作用模式：特异性地攻击细胞膜，其中一般而言与甾醇相互作用， 从而增加膜的通透性。

有效范围：霉菌和酵母，对细菌无效。有效剂量率低于约50mg/l。 表面最大浓度为1mg/dm2，最大穿透5mm。

应用：表面处理硬质干酪、半硬质干酪和半软干酪以及干腊肠。 六亚甲基四胺(E239)

六亚甲基四胺通过将氨加入至甲醛水溶液中而形成。杀微生物作 用由于甲醛所致。

仅许可用于意大利波罗伏洛干酪(25ppm残留量)。 二碳酸二甲酯(E242)

仅许可用于非酒精饮料、无醇果汁酒和液体浓缩物。 硼酸、四硼酸钠(E284/E285)

仅许可用于鱼子酱。 亚硝酸盐(E249和E250)

许可以亚硝酸盐腌制用盐形式用于处理肉制品(“红色制品”)。 用于腌制的不能加热处理的干燥肉制品以及用于其它腌制的肉制品， 按照指南固定添加150ppm。这些浓度显示起不到防腐作用。主要由 于它们的技术特性(构成颜色、味道)以及由于它们的抗氧化作用而将 其加入。 丙酸和丙酸盐(E280、E281、E282和E283)

作用模式：与山梨酸相似，最适pH＜4.5。

在细胞内积累导致抑制各种酶。

抑制范围：在pH5.5、浓度为125-12500ppm时抑制霉菌，为了 抑制细菌，必需更高的浓度(＞16000ppm)。

应用：切片包装面包。

最大许可量：3000ppm。 溶菌酶(E1105)

仅许可用于成熟干酪。

最大许可量：适量。

申请人通过对本发明化合物抑制效应进行研究，在近中性pH(pH 6.8)的培养基(Elliker肉汤)中进行了测试，已显示可有效抵抗革兰氏阳 性细菌和革兰氏阴性细菌。上述多种防腐剂显示抑制效应主要在低 pH，显然应用本发明化合物扩大了潜在的应用范围。

原则上，化学防腐物质的应用取决于下列因素：

(a)毒理学上无害

·所述物质当短期、中期和长期应用时的效应。

·测试急性毒性(LD50)、动力学和代谢、药理学作用、生殖毒性等。

(b)技术/食品化学方面：

·水溶解性：因为微生物在水相中生长，所以防腐剂必须为水溶 性的

·与食品成分的反应，异味问题(感官接受性)

·干扰食品成分(例如硫酸破坏维生素B1)

因此，一系列不同因素决定化学物质在食品和饲料中的抗微生物 效应。其中，微生物组成、食品组成(成分、pH、水活度、含盐量等)、 包装、时间-温度-条件等都是影响抗微生物剂的抑制活性的关键因 素。

现在仅通过实施例并参考附图来描述本发明，附图中：

图1显示一幅用以下试剂处理的藤黄微球菌(上面1个平板)、蜡 状芽孢杆菌(中间2个平板)和生孢梭菌(下面2个平板)的孔扩散试验照 片：

上面右边部分：3％ C8脱水果糖酯；

中间右边部分：0.3％ C8脱水果糖酯；

下面右边部分：3％ C12脱水果糖酯；

下面左边部分：0.3％ C12脱水果糖酯；

中间左边部分：25％甲醇的等量甲醇对照；

上面左边部分：2.5％甲醇的等量甲醇对照。

图2显示一幅用以下试剂处理的藤黄微球菌的孔扩散试验照片：

部分1：3％ C8脱水果糖酯；

部分2：0.3％ C8脱水果糖酯；

部分3：3％ C12脱水果糖酯；

部分4：0.3％ C12脱水果糖酯；

部分5：25％甲醇的等量甲醇对照；

部分6：2.5％甲醇的等量甲醇对照。

实施例 化学合成

本发明化合物按照WO 00/56745中公开的通用方法制备、表征和 纯化。 材料和方法 试验菌株

所有微生物取自-80℃的贮藏物。大多数生物用得自过夜肉汤培养 物的营养细胞悬液进行测试。芽孢杆菌和梭菌用较早制备且贮藏于4 ℃的内生孢子悬液进行测试。

对于肉汤培养物和Bioscreen试验，让大多数细菌在脑心浸液(BHI， Oxoid，pH7.4)中生长。让清酒乳杆菌A10在de Man，Rogosa，Sharpe 培养基(MRS，Oxoid)中生长。让酵母在沙氏液体培养液(Sabouraud Liquid medium)(SLM，Oxoid)中生长。大多数细菌于30℃培养。让乳酸 细菌在富含CO2的环境下在固体培养基上生长。让梭菌在强化梭菌培 养基(RCM)中在无氧条件下于37℃生长。让热杀索丝菌和酵母于25℃ 生长。 Rioscreen试验

采用自动化微生物读数仪Bioscreen C测量在有和无试验样品的 情况下所述菌株的生长曲线。Bioscreen C可通过纵向光度测定法同时 测量200孔蜂窝状微量滴定板中的动力学浊度(即生长)。所述系统由 Bioscreen C分析仪(它有一个培养箱和测量装置)、集成PC、软件 (BioLink v 5.30)、打印机和‘Honeycomb 2’比色杯式多孔板组成。可以 用BioLink软件分析生长曲线数据或将所述数据输出到诸如Excel的程 序中。 方案

向14mg样品中加入50μl 100％甲醇。然后加入66.7μl IMS(工业 含甲醇酒精，96％乙醇)，以制备12％(w/v)溶液。

对于所述试验，然后该溶液用无菌蒸馏水以1∶4进行稀释。这一 步是必需的，因为样品中的乙醇浓度会抑制所述试验微生物。这制成 3％(w/v)的终溶液。

所述试验样品不能进行过滤除菌，因为损失会太大，仅可得到约 470μl。对样品进行无菌操作，希望该样品是无菌的。由于相同原因未 测量样品的pH。

然后在Bioscreen中在0.3％浓度下测试所述样品。然而，立刻会 认识到，这可能有问题，因为AF酯1试验样品是浑浊的乳白色。遗 撼的是，当将其加入到Bioscreen各孔中时，原始浊度太高，以致无法 分辩任何微生物的生长。因此，为了确证是否发生任何抑制，必需对 接种物进行活菌计数，然后在Bioscreen中于30℃培养24小时后，直 接取样测试Bioscreen板中的样品。然后可通过将其与含有2.5％乙醇 的对照孔最终活细胞数进行比较来评价抑制。 Bioscreen BS021100结果

AF酯1＝脱水果糖的C8酯(权利要求32中所示结构-LHS)。 表1 试验菌株 初次计数 (cfu/ml)  30℃24小时后的计数(cfu/ml)  2.5％乙醇对照 0.3％AF酯1 蜡状芽孢杆菌204  1×103  1.3×107 2.4×102 单核细胞增生李斯特氏菌S23  1.2×103  1.1×109 ＜102 清酒乳杆菌A10  ＜102  1.9×102 ＜102 大肠杆菌S15  5.3×102  1.1×109 3.7×107 荧光假单胞菌3756  3.6×102  1.1×109 2.3×107 酿酒酵母9763  3.6×102  2.0×106 2×101 卡尔酵母6418  5.2×102  9.7×104 1×101 结论

表1中的结果显示AF-酯1抑制所有被测微生物。抑制活性的顺 序如下：革兰氏阳性细菌＞酵母＞革兰氏阴性细菌。该样品对单核细 胞增生李斯特氏菌特别有效，但对芽孢杆菌也非常有效。有针对单核 细胞增生李斯特氏菌杀菌活性的证据，并且可能对所述酵母有杀菌活 性。 脱水果糖酯1：杀菌试验

在Bioscreen中用活菌计数证实较早测试的样品进行初步杀菌实 验。这显示良好活性。对于所述杀菌实验，所选试验生物为单核细胞 增生李斯特氏菌S23，因为该菌在生长抑制试验中显示最高敏感性。 方案

等份3×890ml 10mM HEPES缓冲液，pH7。向一个试验对照中 加入100ml水，向另一个试验对照中加入100ml等量乙醇对照，向试 验样品中加入100ml AF酯1。向所有试验中加入10ml过夜培养物。 将样品在环境保护温度下静置2小时。进行活菌计数。请注意：AF酯 1会在试验期间沉淀出来。 结果 试验                 活菌计数(cfu/ml) 对照/水               3.1×108 对照/乙醇             2.0×107 试验/AF酯1            2.4×107

根据该结果得出的结论是，AF酯1不具有任何杀菌活性。 新样品的测试：

脱水果糖酯C8(AFC8)＝脱水果糖的C8酯(权利要求32中所示结 构-LHS)

脱水果糖酯C12(AFC12)＝脱水果糖的C12酯(权利要求32中所示 结构-RHS)

葡萄糖酯C8(GC8)-对照

葡萄糖酯C12(GC12)-对照

将AF酯通过于70℃加热10-15分钟或者于100℃加热5-10分钟 而溶于水中。两种方法均未取得成功，加热后所述酯最终制成0.5％ (w/v)的50∶50甲醇/水溶液。AFC8未溶解，但其它样品较好溶解。 结果

未观察等量甲醇对照区。 表2 试验菌株  针对0.5％(wt/vol)提取物所测的孔扩散区(mm)  AF C8  AF C12  葡萄糖C8  葡萄糖C12 蜡状芽孢杆菌204  0  6.82  0  0 生孢梭菌Campden  3.90  11.30  0  +/-(3.50) 单核细胞增生李斯特氏菌S23  0  0  0  0 清酒乳杆菌A10  0  0  0  0 热杀索丝菌CRA7883  0  7.50  0  0 藤黄微球菌  0  8.95  0  0 大肠杆菌S15  0  0  0  0 荧光假单胞菌327  0  0  0  0 酿酒酵母ATCC9763  0  +/-(10.00)  0  0 卡尔酵母CRA6413  0  0  0  0 BS191200 Bioscreen试验结果 表3 菌株(对照：不含甲 醇的平均OD) 试验浓度 ％(wt/vol)  30℃生长18小时或24小时的终-min OD  AFC8  AFC12  GC8  GC12 对照：等量 甲醇浓度 蜡状芽孢杆菌204 (0.80)  0.05  0  0  0.242  0  0.194  0.025*  0.168  0  0.785  0.561  0.619 蜡状芽孢杆菌 Campden(0.72)  0.05  0  0  0.882  0.437  0.75  0.025*  0.8  0  0.777  0.641  0.707 单核细胞增生李斯 特氏菌S23(0.66)  0.05  0  0  0.242  0.19  0.27  0.025  0.027  0  0.514  0.379  0.537 清酒乳杆菌A10 (0.90)  0.05  0  0  0.245  0.392  0.123  0.025  0.535  0.376  0.81  0.785  0.477 大肠杆菌S15 (0.95)  0.05  0.573  0.478  0.654  0.745  0.716  0.025  0.753  0.703  0.818  0.875  0.851 大肠杆菌CRA109 (0.86)  0.05  0  0  0.285  0.149  0.187  0.025  0.697  0.738  0.789  0.759  0.84 荧光假单胞菌3756 (1.2)  0.05  0  0  0  0  0  0.025  0.068  0.192  0.82  0.953  0.973 荧光假单胞菌327 (0.37)  0.05  0  0  0  0  0  0.025  0.12  0.178  0.21  0.354  0.219

*AF C12显示Bc204和Bc Campden在最低试验浓度0.0125％时的完全抑制。

该轮对照基于在等量甲醇浓度于30℃生长18小时或24小时的终 OD。根据细菌数目是否比甲醇对照细菌数目低来判断所述AF酯的抑 制作用。 结论

·孔扩散结果显示0.5％ AFC8和AFC12两者均有抗梭菌活性，并 且AFC12还有抗芽孢杆菌属、索丝菌属、微球菌属的活性，也许还有 抗酵母活性，但无抗单核细胞增生李斯特氏菌或革兰氏阴性(GN)细菌 的活性。

·Bioscreen结果得自0.05％样品的试验。

·Bioscreen证实的活性顺序如下：AFC12＞AFC8。Bioscreen也证 实抗芽孢杆菌属的活性，但也观察到抗单核细胞增生李斯特氏菌和清 酒乳杆菌的活性以及一定抗革兰氏阴性(GN)细菌的活性。 Bioscreen分析的描述：BS040101

将0.3％ AF酯溶于2.5％甲醇中。制备连续稀释液。测试以下浓度： 0.3％、0.15％、0.075％、0.038％和0％。将APP溶于水中。该样品在 30℃24小时后进行分析(表4)。 表4 菌株  AF酯C8  AF酯C12 Bc 204  0.15％完全抑制  0.075％抑制 0.038％完全抑制 Lm S23  0.15％完全抑制  0.038％抑制 0.038％完全抑制 Lbs A10  0.3％完全抑制  0.15％抑制 0.15％完全抑制 0.038％抑制 Ec S15  0.3％不抑制 0.3％不抑制 Psf3756  0.3％抑制 0.3％抑制 BS040101的活菌计数

通过在任一种AF酯存在下的终计数是否比在2.5％甲醇(对照)的 终计数低来判断抑制。结果示于表5中。 表5 菌株  24小时后的终活菌计数(cfu/ml)  0.3％ AFE C8  0.3％ AFE C12  2.5％甲醇对照 Bc 204  1×103  1.5×103  1×105 Lm S23  2.5×103  1.5×103  2.9×109 Lbs A10  ＜105  ＜105  3.7×107 Ec S15  3.5×107  1.7×109  2.3×109 Psf 3756  1.7×108  2.7×108  3.2×109 Sce 9763  9.4×104  7.4×102  4.5×106 Sca 6413  3.3×104  nd  1.4×104 孔扩散试验

藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌204、蜡状芽孢杆菌Campden、生孢 梭菌1.221和生孢梭菌Campden的结果示于图1和图2和表6中。甲 醇对照试验没有得到任何扩散区。各孔编号：1＝3％ AFEC8，2＝0.3％ AFEC8，3＝3％ AFEC12，4＝0.3％ AFEC12，5＝25％甲醇的等量甲醇 对照，6＝2.5％甲醇的等量甲醇对照， 表6 试验菌株  针对0.3％和3％(wt/vol)提取物所测的孔扩散区(mm)  AFE C8  3％  AFE C8  0.3％ AFE C12  3％  AFE C12  0.3％ 蜡状芽孢杆菌204  2.29  0  7.75  1.27 蜡状芽孢杆菌Campden  ＜0.5  0  3.23  ＜0.5 生孢梭菌1.221  6.00  0  16.83  5.06 生孢梭菌Campden  6.15  5.05  14.15  6.15 单核细胞增生李斯特氏菌S23  1.62  0  2.26  +/- 单核细胞增生李斯特氏菌272  2.36  0  +/-8.82  0 清酒乳杆菌A10  +/-  0  +/-(2.8)  +/- 热杀索丝菌CRA7883  0.98  0  7.55  +/- 藤黄微球菌  3.95  0  9.42  2.33 大肠杆菌S15  0  0  0  0 荧光假单胞菌327  0  0  0  0 荧光假单胞菌3756  0  0  0  0 酿酒酵母ATCC 9763  E  E  +  E 卡尔酵母CRA6413  E  E  +  E 代码(CODE)(酵母)：E＝生长增加；+＝观察到抑制区。 APP的进一步试验

3％时的孔扩散区(相对于生孢梭菌Campden(4.72)和热杀索丝菌 7883(2.96)) BS040101的活菌计数 表7 菌株  0.3％ APP的活菌计数 Bc 204  7.0×101 Lm S23  5.4×107 Lbs A10  1.9×108 Ec S15  6.2×108 Psf 3756  ＜102 Sce 9763  3.1×105 Sca  1.1×105

本发明的所述方法和系统在不偏离本发明的范围和精神的情况下 的各种修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此对实 施本发明的所述方式进行相关领域技术人员显而易见的修改属于下列 权利要求书范围。