技术领域

本发明涉及农业生物技术，具体涉及赋予植株对真菌和/或病毒的抗性的方法 和遗传材料。

技术背景

保护植株免受病原体的侵害一直是农业上最重要的研究课题。许多商业上有 价值的农作物易受植物病毒和真菌的感染，这些病毒和真菌能够在特定的季节对 作物造成严重的侵害，由此极大地降低了其经济价值。对农民造成的经济价值的 降低继而造成购买者商品消费的增高。已公开了一些研究，为了赋予植株抗病毒 性，对植物病毒衣壳蛋白在植株内的表达进行了研究。例如参见Abel等，《科 学》(Science)232：738-43(1986)；Guozzo等，《生物技术》 (Bio/Technology)6：549-57(1988)；Hemenway等，《欧洲分子生物学协会杂志》 (EMBO J.)7：1273-80(1988)；Stark等，《生物技术》7：1257-62(1989)和Lawson 等，《生物技术》8：127-34(1990)。但是，转基因植株只表现出对同源病毒和相 关病毒的抗性，而没有对非相关病毒的抗性。Kawchuk等在《分子和植物微生物 相互作用》(Mol.Plant-Microbe Interactions)3(5)：301-07(1990)中描述了野生型马铃 薯卷叶病病毒(PLRV)外被蛋白基因在马铃薯植株内的表达。虽然被感染的植株表 现出对PLRV抗性，但是用PLRV接种的全部转基因植株都被病毒感染，这样就 十分不利地允许了病毒的继续传播，因而不可能获得高水平的抗性。参见美国专 利No.5,304,730。

Lodge等，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：7089-93(1993) 报道了用编码野生型商陆抗病毒蛋白(PAP)的cDNA经根瘤土壤杆菌介导转化烟 草，以及转基因烟草植株对非相关病毒的抗性。PAP，存在于美洲商陆细胞壁内 的一种I型核糖体抑制蛋白(RIP)是一单条多肽链，催化性去除真核核糖体的28S rRNA内高度保守的茎-环结构中一特定的腺嘌呤残基，干扰延长因子2的结合， 由此抑制细胞的蛋白质合成。参见例如Irvin等，Pharmac.Ther.55：279- 302(1992)；Endo等，《生物物理学研究通讯》(Biophys.Res.Comm.)150：1032- 36(1988)和Hartley等，FEBS Lett.290：65-68(1991)。Lodge的结果与过去的研究 截然相反，即前文所述：表达病毒基因的转基因植株只对该病毒和与之密切相关 的病毒具有抗性。参见Beachy等，《植物病理学年鉴》(Ann.Rev.Phytophathol.) 28：451-74(1990)和Golemboski等，《美国科学院院报》87：6311-15(1990)。但是， Lodge还报道，表达PAP的烟草植株(即表达蛋白超过10ng/mg)倾向于矮化、带 斑点的表型，而其它积聚了最高水平PAP的转基因烟草植株是无繁殖能力的。已 经证明了RIP在诸如靶特异性等其它方面的性能是不可预测的。与上文Lodge所 证明的PAP(上文Lodge所述)不同，自蓖麻籽中分离得到的蓖麻毒蛋白对哺乳动 物核糖体的作用比对植物核糖体强1000倍。参见Harley等，《美国科学院院报》 79：5935-5938(1982)。大麦胚乳RIP对植物核糖体的活性也很低。参见例如Endo 等，《生物化学和生物物理学学报》(Biochem.Biophys.Acta)994：224-226(1988) 和Taylor等，《植物杂志》(Plant J.)5：827-835(1984)。

真菌病原体是植株中病原体严重爆发的重要原因。植物已经发展出了自然防 御系统，其中包括细胞壁的形态修饰和各种抗病原化合物的合成。参见，Boller 等，《植物生理学》(Plant Physiol)74：442-444(1984)；Bowles，《生物化学年鉴》 59：873-907(1990)；Joosten等，《植物生理学》89：945-951(1989)；Legrand等， 《美国科学院院报》84：6750-6754(1987)和Roby等，《植物细胞》(Plant Cell)2：999-1007(1990)。几种病理相关性(PR)蛋白已被证明具有抗真菌性能，并可 在被病原体感染后被诱导产生。这些是不同形式的水解酶，例如在体外通过破坏 真菌细胞壁来抑制真菌生长的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶。参见Boller等，同上； Grenier等，《植物生理学》103：1277-123(1993)；Leah等，《生物化学杂志》 266：1464-1573(1991)；Mauch等，《植物生理学》87：325-333(1988)和Sela- Buurlage Buurlage等，《植物生理学》101：857-863(1993)。

人们已经进行了一些努力，试图用编码对真菌细胞壁具有显著裂解活性的病 理相关蛋白(例如几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶)的基因通过重组法来加强植株的抗 病性。参见例如Broglie等，《科学》254：1194-1197(1991)；Vierheilig等，《分 子和植物微生物相互作用》6：261-264(1993)和Zhu等，《生物技术》12：807- 812(1994)。最近，发现了另外两类基因具有在植株内产生抗病性的潜力。Wu等 在《植物细胞》7：1357-1368(1995)中报道，表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的转基 因马铃薯对胡萝卜欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)和蔓延疫霉的抗性加强。对此 的假设是，由葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖的氧化产生了过氧化氢，当它在植株内 积聚时导致活性氧类物质的积累，继而引发产生各种抗病原和抗真菌机制，例如 植物抗毒素(参见Apostol等，《植物生理学》90：109-116(1989)和Degousee，《植 物生理学》104：945-952(1994))，病理相关蛋白(Klessig等，《植物分子生物学》 (Plant Mol.Biol.)26：1439-1458(1994))，植物细胞壁的加强(Brisson等，《植物细 胞》6：1703-1712(1994))，水杨酸诱导的系统获得性抗性(Chen等，《科学》 162：1883-1886(1993))和超敏防御反应(Levine等，《细胞》(Cell)79：583-593(1994))。

除了对植株内抗病毒性的研究之外，还结合抗真菌性对RIP进行了研究。例 如，Logeman等在《生物技术》10：305-308(1992)中报道，分离自大麦胚乳的一 种RIP能够保护转基因烟草植株免受真菌的感染。大麦胚乳RIP和大麦II类几丁 质酶的重组在体外和体内都具有对茄属丝核菌抗性的协同加强作用。参见Lea 等，同上；Mauch等，同上；Zhu等，同上和Jach等，《植物杂志》(The Plant Journal)8：97-109(1995)。但是，没有证明PAP具有体外抗真菌活性。参见Chen 等，《植物生理学》40：612-620(1991)，其中报道了PAP在体外对真菌蔓延疫霉、 Colletotrichum coccodes、腐皮镰孢、硫色镰孢、Phoma foreata和茄属丝核菌没 有作用。

所以，一直以来需要有一种赋予植株广谱抗病毒和/或真菌的方法，该方法不 会导致细胞的死亡或不育、而且只需要很少量的转基因。

本发明综述

本发明涉及植物毒性被降低而且在植株内表现出PAP生物活性的PAP突变蛋 白。“PAP生物活性”指PAP抗病毒活性和/或PAP抗真菌活性。一类较好的 PAP突变蛋白其特征在于在成熟PAP的N末端至少有一个氨基酸取代，例如75 位的甘氨酸残基被取代或97位的谷氨酸残基被取代。另一类PAP突变蛋白的特 征在于在成熟PAP的N末端被截短达38个氨基酸。另一类较好的PAP突变蛋白 其特征在于具有在成熟PAP的C末端区域被截短之类的突变。更好的是C末端 截短至少约26至约76个成熟PAP氨基酸的PAP突变蛋白(不包括野生型PAP C 末端29个氨基酸的延伸)。还有一类PAP突变蛋白是无酶活性的，在体外或植株 内不表现PAP抗病毒性，但在植株内表现PAP抗真菌性。本发明的PAP突变蛋 白还包括22个氨基酸的N末端信号序列和/或野生型PAP的C末端延伸。

本发明还提供了编码PAP突变蛋白的DNA分子，这些分子可以同时还编码或 不编码成熟PAP 22个氨基酸的N末端信号序列和/或野生型PAP 29个氨基酸的C 末端延伸。这些DNA可以与在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如植物)内 具有功能的启动子可操作地连接，然后稳定地转化到在所述细胞内具有功能的载 体中。本发明还提供了用编码突变型PAP的DNA稳定转化的宿主例如原核或真 核细胞(例如酵母或植物)，以及用这些DNA转化的原生质体。本发明还提供了含 有DNA的转基因植物和种子。以上DNA在转基因植物内的表达为植株提供了广 谱的抗病毒和/或抗真菌性，但并不象野生型PAP那样对植物具有植物毒性。本 发明范围内的植物包括单子叶植物例如谷物类和双子叶植物。

本发明还提供了鉴定植物毒性降低、而且在植株内表现出PAP生物活性的 PAP突变蛋白的方法。该方法的步骤包括提供一种经转化的真核细胞，例如包含 与真核细胞内功能性诱导型操纵子可操作性连接的、编码PAP的DNA分子的酵 母。在转化前诱变编码PAP的DNA，或对转化后细胞进行诱变(即在用PAP构 建物转化细胞后进行诱变)。将如此转化的细胞培养在合适的培养基中，在规定的 时间后，在培养基中加入诱导物诱导DNA分子的表达。然后确定培养细胞的存 活是否是由于突变型PAP的表达。对宿主基本上没有毒性的突变PAP型被认为 是表现为植物毒性降低的PAP突变蛋白。由此鉴定出的PAP突变蛋白经体外(例 如使用外源病毒或真菌)或体内(例如通过转基因植物内的表达)测定表现出广谱 抗病毒和/或抗真菌性的同时被认为是保留了PAP在植物内生物活性的PAP突变 蛋白。本发明还提供了用上述方法鉴定的经分离和纯化的PAP突变蛋白。 本发明的最佳实施方式

本发明表达编码PAP突变蛋白的DNA的转基因植物与产生成熟、野生型 PAP(“PAP”)或变异PAP即PAP-v的转基因植物相比，表现出被降低的植物毒 性，但表现出抗病毒性和/或抗真菌性。“降低的植物毒性”指表达编码突变型 PAP的DNA的转基因植物表现出正常和有繁殖能力的表型，而不是产生成熟PAP 的转基因植物所特有的矮化、带斑点的表型(例如Lodge在前文文献中所述)。“野 生型PAP”指PAP氨基酸序列1-262，22个氨基酸的N末端信号肽(“野生型 PAP的N末端信号序列”)和29个氨基酸的C末端延伸(第263至291位氨基酸)， 以上序列均显示在下表I中作为SEQ ID NO：2。对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。所以，“野生型、成熟PAP”或“成熟PAP”指表I所示的PAP氨基酸 序列1-262。

                        表I 5'CTATGAAGTCGGGTCAAAGCATATACAGGCTATGCATTGTTAGAAACATTGATGCCTCTGA TCCCGATAAACAATACAAATTAGACAATAAGATGACATACAAGTACCTAAACTGTGTATGGGG GAGTGAAACCTCAGCTGCTAAAAAAACGTTGTAAGAAAAAAAGAAAGTTGTGAG

                                                      A TTAACTACAGGGCGAAAGTATTGGAACTAGCTAGTAGGAAGGGAAG ATG AAG TCG ATG

                                           Met Lys Ser Met CTT GTG GTG ACA ATA TCA ATA TGG CTC ATT CTT GCA CCA ACT TCA ACT Leu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala Pro Thr Ser Thr

  (67)                                         (100) TGG GCT GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGC Trp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile Ser

   (1)                                  (10)

                 G AAA TAC GCC ACT TTT CTG AAT GAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCA Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro

                (20)                                    (30) AGT TTA AAA TGC TAT GGA ATA CCA ATG CTG CCC AAT ACA AAT ACA AAT Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn

                                (40)

    C CCA AAG TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA AAT AAA AAA ACC ATC Pro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn Lys Lys Thr Ile

        (50)                                    (60) ACA CTA ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGT TAT TCT GAT Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp

                        (70) CCC TTT GAA ACC AAT AAA TGT CGT TAC CAT ATC TTT AAT GAT ATC TCA Pro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser    (80)                                     (90) GGT ACT GAA CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT GCC AAT Gly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn

              (100)                                    (110) TCT CGT GTT AGT AAA AAC ATA AAC TTT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTG Ser Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu

                                (120) GAA TCA AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAG GTC CAA CTG GGA ATT Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln Leu Gly Ile

       (130)                                   (140) CAA ATA CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ATG TCA TTC Gln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly Val Met Ser Phe ACT GAG AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA TTG GTA GCC ATA CAA ATG GTA Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val

(160)                                  (170) TCA GAG GCA GCA AGA TTC AAG TAC ATA GAG AAT CAG GTG AAA ACT AAT Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn

               (180)                                  (190) TTT AAC AGA GCA TTC AAC CCT AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG CAA GAG Phe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gln Glu

                               (200) ACA TGG GGT AAG ATT TCA ACA GCA ATT CAT GAT GCC AAG AAT GGA GTT Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val

       (210)                                   (220) TTA CCC AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG ATA Leu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp Ile

                       (230) GTG TTG AGA GTG GAT GAA ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TAC Val Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr    (240)                                   (250) GTT GGT GGG AGC TGT CAG ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCT Val Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Ala Met Phe Pro

               (260)   (262)                          (270) CAA CTT ATA ATG TCT ACT TAT TAT AAT TAC ATG GTT AAT CTT GGT GAT Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val Asn Leu Gly Asp

                               (280) CTA TTT GAA GGA TTC TGATCATAAACA Leu Phe Glu Gly Phe

       (290) TAATAAGGAGTATATATATATTACTCCAACTATATTATAAAGCTTAAATAAGAGGCCGTGTTA ATTAGTACTTGTTGCCTTTTGCTTTATGGTGTTGTTTATTATGCCTTGTATGCTTGTAATATT ATCTAGAGAACAAGATGTACTGTGTAATAGTCTTGTTTGAAATAAAACTTCCAATTATGATGC AAAAAAAAAAAAAAA3'

表I还以与野生型PAP对齐的方式显示了PAP-v氨基酸和对应的核苷酸。 PAP-v的氨基酸序列与野生型PAP的差别主要在于Leu20Arg(即成熟PAP 20位 的精氨酸对亮氨酸)和Tyr49His取代。PAP-v核苷酸序列中的第三处改变对氨基 酸序列没有影响(对应于信号序列中第一个Ser的密码子TCG→TCA)。表I还显 示了 5’端和3’端的非编码、侧翼序列。在真核细胞内表达后，野生型PAP其N 末端的22氨基酸序列被共翻译地切除，生成分子量约32KD的多肽，该多肽经进 一步加工即切除C末端的29个氨基酸(“野生型PAP的C末端延伸”或 “PAP(263-292)”)后生成分子量约29KD的成熟、野生型PAP(后文称为 “PAP(1-262)”)(即分离自美洲商陆的叶中的PAP)。参见Irvin等，Pharmac.Ther. 55：279-302(1992)；Dore等，《核酸研究》(Nuc.Acids Res.)21(18)：4200-05(1993)； Monzingo等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)233：705-15(1993)；Tumer等， 《美国科学院院报》92：8448-8452(1995)。

“PAP抗病毒活性”指本发明突变型PAP在转基因植物内的表达产生了广谱 的抗病毒性，即对大量非相关病毒引起的感染的抗性或抑制能力，这些病毒包括 但不限于RNA病毒例如马铃薯X病毒组(PVX，马铃薯病毒X)、马铃薯Y病毒组 (PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、小 麦条斑花叶病毒、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)、洋李痘病毒、西瓜花叶病毒、南瓜 黄色花叶病毒、木瓜环斑病毒、甜菜西方黄化病毒、大豆矮化病毒、胡萝卜read 叶病毒，和DNA植物病毒例如西红柿黄叶卷曲病毒。参见Lodge等，同上； Tomlinson等，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)22：225-32(1974)；和Chen等， 《植物生理学》40：612-20(1991)。

“PAP抗真菌活性”指本发明的突变型PAP使植株具有广谱抗真菌性。本发 明的突变型PAP提高了对植物真菌引起的病害的抗性，这些真菌例如腐霉(烂种、 枯苗和根烂的原因之一)、疫霉(造成马铃薯的晚疫以及许多其它植物的根烂和疫 病)、盘梗霉、霜霉、单轴霉、假霜霉和指梗霉(造成绒毛霉)、禾白粉菌(造成谷类 和草类的粉状霉变)、轮枝孢(造成蔬菜、花卉、农作物和树木维管的枯萎)、丝核 菌(造成许多植物的枯萎病和草皮的褐斑病)、镰孢(造成大豆的根烂、马铃薯干 枯)、旋孢腔菌(造成根茎腐烂和谷类及草类的疫病)、赤霉(造成苗疫病和玉米以及 小谷类的根茎腐烂)、顶囊壳菌(造成谷类的全部顶囊枯黄病)、核盘菌(造成花卉和 蔬菜花冠腐烂和枯萎，以及草皮的银元疹)、柄锈菌(造成小麦和其它小谷类的茎 锈)、黑粉菌(造成玉米的黑穗病)、Magnaporthae(造成草皮的夏季斑病)和小核菌 (Schlerotium)(造成草皮的北方枯萎病)。其它重要的真菌类病害包括由尾孢、壳 针孢、球腔菌、病霉、刺盘孢、长蠕孢、链格孢、葡萄孢、枝孢和曲霉引起的病 害。

申请人还认为，本发明的突变型PAP还提高植物对害虫、细菌和线虫的抗性。 重要的细菌类病害包括由假单孢菌、黄单孢菌、欧文氏菌、Clavibacter和链霉菌 造成的病害。

本发明的PAP突变蛋白与野生型PAP的不同主要在于：(1)体内区室化改变； (2)C末端突变，包括但不限于缺失或移码突变；(3)N末端突变；和(4)活性位点突 变。第一类PAP突变蛋白可能具有被改变的体内区室化特性；即，它们可能不与 野生型定位在相同的亚细胞区室。虽然不想局限于特定的作用理论，申请人确信 在酵母中，这些PAP突变蛋白不能经受共翻译加工(去除22个氨基酸的信号肽) 和/或翻译后加工(去除29个氨基酸的C末端片段)，由此造成细胞毒性完全或基 本上被消除。这些突变蛋白同时也是非植物毒性的。有关这些突变型PAP体内功 能的尤其令人惊奇或出乎意料的是，突变作用定位于编码成熟PAP(1-262)的序列 内，而不在N末端信号肽或29氨基酸的C末端延伸内。此外，突变型PAP具有 体外抑制翻译的酶活性，这表明植物毒性不完全是酶活性的作用。较好的PAP突 变蛋白包括一个保守性点突变，在野生型PAP的氨基酸残基75甘氨酸(Gly75)变 成缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，或者(2)在野生型PAP氨基酸残基97谷 氨酸(Glu97)处的保守性或非保守性点突变。更好的PAP突变蛋白是PAP(1-262， Gly75Val)和PAP(1-262，Glu97Lys)，各自的DNA可以方便地通过将野生型甘氨 酸75的密码子GGT改为GTT(缬氨酸)和将谷氨酸97的密码子GAA改为AAA(赖 氨酸)来制备。其它区室化特性被改变的PAP突变蛋白可以通过后文的选择方法 来鉴定。Dore等在前文文献中描述了一种Arg67Gly PAP突变蛋白(在Dore的论 文中由于存在一个N末端的甲硫氨酸残基而编号为Arg68Gly)，但它对真核细胞 有毒而对原核细胞例如大肠杆菌无毒。该突变蛋白不包括在本发明的范围之内。

本发明的第二类PAP突变蛋白在PAP的C末端区域内有缺失或氨基酸取代。 申请人意外发现，这些突变蛋白虽然在体外抑制翻译但在体内是无毒性的(即非植 物毒性的)。较好的突变蛋白缺失了成熟PAP的约26至约76个氨基酸，更好的 PAP突变蛋白是突变型PAP(1-236)-PAP(1-184)，包括端值。所以，开始于野生型 成熟PAP第237位氨基酸残基的截短形式属于本发明范围之内，其中例如 PAP(1-236)，PAP(1-235)，PAP(1-234)，PAP(1-233)，PAP(1-232)，PAP(1- 231)，PAP(1-230)，PAP(1-229)，PAP(1-228)，PAP(1-227)，PAP(1-226)， PAP(1-225)，PAP(1-224)，PAP(1-223)，PAP(1-222)，PAP(1-221)，PAP(1- 220)，PAP(1-219)，PAP(1-218)，PAP(1-217)，PAP(1-216)，PAP(1-215)， PAP(1-214)，PAP(1-213)，PAP(1-212)，PAP(1-211)，PAP(1-210)，PAP(1- 209)，PAP(1-208)，PAP(1-207)，PAP(1-206)，PAP(1-205)，PAP(1-204)， PAP(1-203)，PAP(1-202)，PAP(1-201)，PAP(1-200)，PAP(1-199)，PAP(1- 198)，PAP(1-197)，PAP(1-196)，PAP(1-195)，PAP(1-194)，PAP(1-193)， PAP(1-192)，PAP(1-191)，PAP(1-190)，PAP(1-189)，PAP(1-188)，PAP(1- 187)，PAP(1-186)，PAP(1-185)和PAP(1-184)。更好的突变蛋白包括PAP(1- 184Glu)、PAP(1-188Lys)、PAP(1-206Glu)、PAP(1-209)和PAP(1-236Lys)。只要 对植物细胞无毒，这可以用后文的选择方法进行确定，而且在植物内产生抗真菌 性和/或抗病毒性，少于26(即1至25个氨基酸，包括端值)或超过76个成熟PAP 的氨基酸的缺失也属于本发明范围之内。后一种特性可以如下测定，即通过例如 在病毒或真菌存在下用PAP突变蛋白体外接种植物器官例如叶，或通过体内分别 测定，即用真菌或病毒接种用编码突变型PAP的DNA转化的转基因植株。一种 较好的C末端取代突变蛋白是PAP(1-262，Leu202Phe)。同样，不想局限于任何特 定的作用理论，申请人认为PAP氨基酸序列244Glu至259Cys(表I所示)涉及PAP 与内质网(ER)膜上磷脂的结合，这种结合促进PAP向细胞的胞质溶胶转移并在此 抑制蛋白质的合成，所述的氨基酸序列与原核细胞膜脂蛋白的脂结合位点的共有 序列同源(参见Hayashi等，《生物能和生物膜杂志》(J.Bioenerg.Biomem)22： 451-71(1990))，而且在上述PAP突变蛋白中都缺失。例如因缺失或移码突变失去 了这一功能，使PAP突变蛋白具有本文所述的特性。

Dore等(同上)，同时还公开了一种Phe195Tyr，Lys211Arg PAP突变蛋白(由于 在大肠杆菌内表达时必需有N末端Met残基，所以编号与本文所用的编号差相地 加1)，它对真核细胞(例如植物)有毒但对原核细胞例如大肠杆菌无毒。所以，Dore 的文献中公开的这种PAP突变蛋白不在本发明的范围之内。

第三类PAP突变蛋白的特征在于截短了成熟PAP内1至至少约38个N末端 氨基酸残基。这些突变蛋白包括PAP(2-262)，PAP(3-262)，PAP(4-262)， PAP(5-262)，PAP(6-262)，PAP(7-262)，PAP(8-262)，PAP(9-262)，PAP(10- 262)，PAP(11-262)，PAP(12-262)，PAP(13-262)，PAP(14-262)，PAP(15- 262)，PAP(16-262)，PAP(17-262)，PAP(18-262)，PAP(19-262)，PAP(20- 262)，PAP(21-262)，PAP(22-262)，PAP(23-262)，PAP(24-262)，PAP(25- 262)，PAP(26-262)，PAP(27-262)，PAP(28-262)，PAP(29-262)，PAP(30- 262)，PAP(31-262)，PAP(32-262)，PAP(33-262)，PAP(34-262)，PAP(35- 262)，PAP(36-262)，PAP(37-262)，PAP(38-262)和PAP(39-262)。如果在体内表 现出PAP的生物活性和降低的植物毒性，大于38个成熟PAP N末端氨基酸残基 的截短形式也在本发明范围之内。这些特性可以通过后文实施例中的方法来测 定。

第四类PAP突变蛋白包含使得PAP分子失去酶活性(根据其在体外和/或真核 细胞核糖体内抑制翻译的能力的丧失来确定)的活性位点突变。申请人意外发现， 当这些突变蛋白在植株内表达时表现出广谱抗真菌活性，但是几乎没有抗病毒活 性。推定的PAP活性位点包括氨基酸残基Tyr72、Tyr123、Glu176、Arg179 和Trp208。所以，失去了酶活性但保留抗真菌活性的PAP活性位点突变蛋白， 例如在PAP活性位点内包含一个保守或甚至非保守取代，或者至少一个活性位点 氨基酸缺失或被其它氨基酸取代的突变蛋白属于本发明范围之内。PAP突变蛋 白的酶活性和抗真菌活性可以用后文实施例中的测试方法来测定。一种较好的 PAP活性位点突变蛋白是PAP(1-262，Glu176Val)。

至于所述的PAP突变蛋白，“与野生型PAP的区别主要在于…”指除了赋予 降低的植物毒性和抗病毒和/或抗真菌活性所必需的氨基酸改变(上述)之外，突变 型PAP的氨基酸序列与成熟PAP基本一致。“基本一致”指只要生成的PAP突 变蛋白保留上述降低的植物毒性和PAP生物活性，本发明的PAP突变蛋白还可 以通过另外的取代、插入或缺失进一步被修饰。例如，可以通过取代或插入将突 变型PAP的N末端变为甲硫氨酸残基，以便允许编码突变型PAP的DNA在各种 宿主细胞，特别是大肠杆菌中表达。本发明的PAP突变蛋白还可以包含野生型 PAP的N末端的22氨基酸信号肽和/或29氨基酸的C末端延伸，两者都表示在 表I中。

可以利用已知的PAP基因来制备本发明编码突变型PAP的DNA。参见Ausubel 等编辑，《分子生物学中的最新方法》(Current Protocols in Molecular Biology)第 1卷，第8章，Wiley，NY(1990)。也可以利用PCR技术来制备DNA。参见《PCR 方法》(PCR Protocols)，Innis等编辑，Academic Press，San Diego，CA(1990)。编 码突变型PAP的DNA(例如cDNA)最好以一个表达盒的形式插入在植物转化载体 中，该表达盒包含转化植物细胞的全部必需元件。该表达盒按照正确的读码框通 常包含植物细胞内功能性的启动子，5’端的非翻译前导序列，突变型PAP DNA， 和3’端非翻译区，该区能够在植物内引起RNA序列3’末端的聚腺苷酸化核苷酸 的加成。植物细胞内功能性的启动子可以从多种来源获得，例如植物或植物DNA 病毒。表达盒内启动子的选用将决定构建物在转基因植物内的空间和时间表达方 式。被选用的启动子可能具有组成型活性，其中包括CaMV 35S启动子、肌动蛋 白启动子(McElroy等，《植物细胞》2：163-71(1990)；McElroy等，《分子和普 通遗传学》231：150-160(1991)；Chibbar等，《植物细胞报道》12：506- 509(1993))，和遍在蛋白启动子(Binet等，《植物科学》(Plant Science)79：87-94(1991)， Christensen等，《植物分子生物学》12：619-6231993)；Taylor等，《植物细胞 报道》12：491-495(1993))。或者，它们可以经创伤诱导(Xu等，《植物分子生物 学》22：573-588(1993)；Logemann等，《植物细胞》1：151-158(1989)；Rohrmeier &Lehle，《植物分子生物学》22：783-792(1993)；Firek等，《植物分子生物学》 22：129-142(1993)；Warener等，《植物杂志》3：191-201(1993))，它们由此在创伤 或病原感染位置驱动突变型PAP基因的表达。其它有用的启动子在特定的细胞(例 如叶上皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或特定组织或器官(例如根、叶或花)内表 达。专利申请WO93/07278说明了在髓细胞内优选表达的玉米trpA基因的分离。 Hudspeth&Grula在《植物分子生物学》12：579-589(1989)中说明了一种启动子， 它来自编码烯醇式丙酮酸磷酸羧酶(PEPC)的玉米基因，并指导叶特异性方式的表 达。或者，选用的启动子可以在光诱导性或其它时序调控启动子下驱动基因的表 达。又或者，选用的启动子是化学调控的。DNA还可以编码野生型PAP的N末 端信号序列和/或C末端延伸。

有许多可用在表达盒中的转录剪切及聚腺苷酸化位点。这些位点负责正确加 工(形成)mRNA的3’末端。已知在植物内起作用的合适的转录剪切及聚腺苷酸化 位点包括CaMV 35S剪切和聚腺苷酸化位点、tml剪切和聚腺苷酸化位点、胭脂 氨酸合成酶剪切和聚腺苷酸化位点、豌豆rbcS E9剪切和聚腺苷酸化位点。这些 位点在单子叶及双子叶植物中均可使用。

许多序列被发现能够增强转录单元内基因的表达，可将这些序列与本发明的 基因结合使用来提高它们在转基因植物内的表达。许多内含子序列被证明能够增 强表达，尤其在单子叶细胞内。例如，已经证明在转导入玉米细胞后，在同源启 动子下，玉米Adhl基因的内含子显著增强野生型基因的表达。内含子1被发现 特别有效，并以与氯霉素乙酰转移酶基因融合的形式增强表达(Callis等，《遗传 学进展》(Genes Develop)1：1183-1200(1987))。在相同的实验系统中，来自玉米 bronze-1基因的内含子在增强表达方面具有类似的效果(Callis等，同上)。一般总 将内含子序列结合到植物转化载体中，通常位于非翻译前导序列内。

已知大量来自病毒的非翻译前导序列也增强表达，这些序列在双子叶细胞内 尤其有效。具体地说，来自烟草花叶病毒的前导序列(TMV，“Ω-序列”)、玉 米褪绿斑点病毒(MCMV)、和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已被证明能够增强 表达(Gallie等，《核酸研究》15：8693-8711(1987)；Skuzeski等，《植物分子生 物学》15：65-79(1990))。

许多转化载体可用于植物的转化，而本发明的基因可以与这些载体中任何一 种结合使用。载体的选用取决于选用的转化技术和转化目标的种类。对于某些目 标种类，宜使用不同的抗菌素或除草剂选择标记。转化中的常用选择标记包括提 供卡那霉素抗性的nptll基因(Messing&Vierra，《基因》19：259-268(1982)； Bevan等，《自然》304：184-187(1983))，提供对除草剂草胺膦抗性的bar基因(White 等，《核酸研究》18：1062(1990)；Spencer等，《理论及应用遗传学》79：626- 631(1990))，提供潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann，《分子细胞生 物学》4：2929-2931)和提供氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Fling&Elwell，1980)。适用 于土壤杆菌转化的载体通常带有至少一个T-DNA边界序列。这些载体包括例如 pBIN19(Bevan，《核酸研究》(1984))和pCIB200(EP 0 332 104)。

不用根瘤土壤杆菌进行的转化不需要在选用的转化载体中含有T-DNA序列， 因此除了上述含有T-DNA序列的载体之外，没有该序列的载体也可以使用。不 靠土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击转化、原生质体吸收(例如PEG和电穿 孔)和微注射法。载体的选择很大程度上取决于对被转化种类的选择。例如， pCIB3064是pUC衍生的载体，适用于直接基因转移技术，并结合以用除草剂草 胺膦进行选择。WO93/07278和Koziel等，(《生物技术》11：194-200(1993))对此 进行了说明。

包含上述各种元件的含有编码突变型PAP的DNA的表达盒可以利用标准重组 DNA技术插入植物转化载体内。或者，载体中可以存在表达盒的部分或全部元 件，其余元件则视需要加入载体。

双子叶植物的转化技术在本领域是众所周知的，包括基于土壤杆菌的技术和 不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌类技术包括异源遗传物质直接被原生质体或 细胞吸收。这可以利用PEG或电穿孔介导的吸收、粒子轰击介导的传递或微注射 来进行。这些技术的实例的说明可参见Paszkowski等，《欧洲分子生物学协会杂 志》3：2717-2722(1984)，Potrykis等，《分子和普通遗传学》199：169- 177(1985)，Reich等，《生物技术》4：1001-1004(1986)和Klein等，《自然》 327：70-73(1987)。在所有情况中，都使用标准方法将细胞再生为完整的植株。

转化双子叶植物，土壤杆菌介导的转化是一种较好的技术，因为它转化效率 高，而且适用于多个不同的种。通常可用土壤杆菌转化的许多作物种类包括烟 草、西红柿、向日葵、棉花、油籽菜、马铃薯、大豆、苜蓿和杨树(EP0 317 511(棉 花)，EP0 249 432(西红柿)，WO87/07299(芥蓝)，美国专利4,795,511(杨树))。土 壤杆菌转化通常包括将携有目标外源DNA的二元载体(例如pCIB200或 pCIB2001)转移到合适的土壤杆菌菌株内，该菌株依赖于宿主土壤杆菌携带在共 存质粒或染色体上的vir基因的互补(例如适合pCIB200的菌株CIB542(Uknes 等，《植物细胞》5：159-169(1993)))。利用三亲本交配法进行重组二元载体向土 壤杆菌的转移，即使用带有重组二元载体的大肠杆菌，带有能够使重组二元载体 向靶土壤杆菌菌株移动的质粒例如pRK2013的辅助大肠杆菌。或者，可以通过 DNA转化法将重组二元载体向土壤杆菌转移(Hofgen&Willmitzer，《核酸研究》 16：9877(1988))。

用重组土壤杆菌转化靶植株通常将土壤杆菌与取自植株的外植体共培养，并 遵循本领域已知的方法。将带有位于二元质粒T-DNA边界之间的抗菌素或除草 剂抗性标记的转化组织在可选择培养基上再生。

较好的用于单子叶植物的转化技术包括利用PEG或电穿孔技术将基因直接转 移到原生质体中，以及利用粒子轰击法转移到愈伤组织中。转化可以利用一种 DNA或多种DNA(共转化)进行，这两种方法都适用于本发明。共转化的优点在 于不需要构建复杂的载体，而且可以产生带有非连锁基因座的目的基因和可选择 标记基因的转基因植物，这样可以在需要时在后代中去除可选择标记。但是，共 转化的缺点在于各DNA整合到基因组中的机率低于100％(Schocher等，《生物 技术4：1093-1096(1986))。

已公开的专利申请EP O 292 435、EP O 392 225和WO93/07278描述了制备 玉米的愈伤组织和原生质体、用PEG或电穿孔法转化原生质体和由转化后原生质 体再生玉米植株的方法。Gordeon-Kamm等，《植物细胞》2：603-618(1990)和 Fromm等，《生物技术》11：194-200(1993)描述了利用粒子轰击术转化玉米良种 近交系的方法。

水稻的转化也可以通过利用原生质体或粒子轰击法的直接基因转移来进行。 日本型和印度型的原生质体介导的转化已经有所记述(Zhange等，《植物细胞报 道》7：739-384(1988)；Shimamoto等，《自然》338：274-277(1989)；Datta等，《生 物技术》8：736-740(1990))。以上两种植株通常也可用粒子轰击法转化(Christou 等，《生物技术》9：957-962(1991))。

专利申请EP 0 332 581描述了生成、转化和再生早熟禾亚科(Pooidea)原生质体 的方法。而且，Vasil等(《生物技术》10：667-674(1992))描述了小麦的转化，即 用粒子轰击法转化到C类长期可再生愈伤组织的细胞内，以及同样是Vasil等(《生 物技术》11：1533-1558(1993))和Weeks等(《植物生理学》102：1077-1084(1993)) 所述的对未成熟胚和未成熟胚衍生愈伤组织的粒子轰击法。

转化单子叶植物细胞例如玉米(Zea mays)可以将单子叶植物细胞与许多可能 刺穿细胞的针状体接触，造成细胞壁破裂，由此允许转化DNA进入细胞。参见 美国专利5,302,523。以下美国专利中还公开了对单子叶植物和双子叶植物都适 合的转化技术：美国专利5,240,855(粒子枪)，5,204,253(气体冷激的加速微粒)、 5,179,022(粒子轰击装置)、4,743,548和5,114,854(微注射)；5,149,65和 5,120,657(加速粒子介导的转化)；5,066,587(气体驱动的微粒加速器)； 5,015,580(粒子介导的大豆植株的转化)；5,013,660(激光束介导的转化)；和 4,849,355和4,663,292。

然后，将如上所述转化的植物细胞或植物组织按照标准方法培养成完整的植 株。可以根据标准方法由转基因的花期植株获得转基因的种子。同样，可以利用 各种已知技术来繁殖马铃薯和甜菜之类非花期的植物。参见Newell等，《植物细 胞报道》10：30-34(1991)(其中描述了用茎培养的马铃薯转化)。

本发明编码突变型PAP的DNA可使任何能够表达该DNA的植物具有广谱的 抗真菌性和抗病毒性，其中包括单子叶植物(例如谷类)和双子叶植物。特定的实 例包括玉米、西红柿、草皮、芦笋、木瓜、向日葵、黑麦、菜豆、生姜、荷花、 竹子、马铃薯、水稻、花生、大麦、麦芽、小麦、苜蓿、大豆、燕麦、茄子、南 瓜、洋葱、花茎甘蓝、甘蔗、甜菜、甜菜根、苹果、橘子、葡萄柚、梨、李子、 桃、菠萝、葡萄、玫瑰、香石竹、雏菊、郁金香、黄杉、雪松、白松、欧洲赤松、 云杉、豌豆、棉花、亚麻和咖啡。

除前文所述之外的PAP突变蛋白可以利用真核细胞内的选择系统来鉴定。在 一优选实施例中，按照标准技术，随机诱变与一真核细胞内功能性的启动子可操 作性连接的一编码PAP的DNA分子。然后用诱变后的PAP构建物转化细胞。然 后将如此转化的细胞在合适的培养基中培养规定的时间，例如足够使细胞进行一 定程度生长的时间，然后在此时在培养基中加入诱导物引起诱变DNA分子的表 达。如果培养的细胞能够在诱导诱变PAP DNA分子的表达后存活，这表明诱变 引起了非毒性PAP突变蛋白的表达，然后可以对该PAP突变蛋白进行体外或体 内实验以确定它是否保留了PAP的生物活性。较好的体外实验包括真核细胞翻译 系统，例如测定PAP突变蛋白引起的对蛋白质合成的抑制程度的网织红细胞裂解 物系统。较好的宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母，在后文实施例1中对此有 详细说明。也可以用许多随机诱变的编码PAP的DNA分子实施该方法。然后可 按照标准方法将经以后的实验证实植物毒性降低且保留PAP抗病毒性和/或抗真 菌活性的PAP突变蛋白分离出来，纯化并测序。

在其它实施例中，诱变在转化真核细胞之后进行。转化之后诱变DNA的缺点 在于宿主的染色体DNA也会被诱变。为了确定存活细胞中的突变在染色体上还 是在质粒上，该实施方式需要用诱导型启动子调控下的野生型编码PAP的DAN 取代进行转化的编码PAP的DNA，并在诱导物存在下培养该细胞。保留生长能 力的突变体是染色体突变体，而不能生长的突变体是质粒上突变的突变体(即 PAP)。

参照以下实施例将进一步说明本发明。给出这些实施例的目的只是为了说 明，而不是为了限定，除非另作说明。

实施例1

A.酵母表达载体的构建，以及在酵母中的PAP表达分析。将Lodge等所述、 表1所示的PAP和PAP-v的相应全长cDNA克隆到酵母表达载体中，位于半乳 糖诱导型启动子GAL1的调控之下。选择酿酒酵母作为表达系统，因为酵母的优 点在于可提供真核细胞特异性翻译后修饰作用。因为酵母的核糖体对PAP敏感， 所以使用一个可调型启动子驱动PAP的表达。编码PAP和PAP-v的cDNA被以 在半乳糖诱导型启动子pGal1调控下的BgIII/Smal片段形式克隆在酵母表达载体 pAC55中，该质粒包含可选择标记URA3。按照Ito等在《细菌学杂志》 153：163-68(1983)中所述的方法将包含PAP和PAP-v的载体(NT123和NT124)转 化到酵母株W303(Mat a，ade2-1 trp1-1 ura3-1 leu2-3，112his3-11，15can1- 100)(Bossie等，《细胞的分子生物学》3：875-93(1992))中，在30℃，在含有葡 萄糖的尿嘧啶缺陷培养基上选择转化子。

含有NT123(野生型PAP)或NT124(PAP-v)的酵母细胞在含有2％棉籽糖的尿嘧 啶缺陷培养基上在30℃培养48小时，使密度达到5×107细胞/ml。取一半培养 物，其中加入2％半乳糖诱导PAP蛋白质的表达，另一半用作不诱导的对照。使 细胞再生长4小时，然后10,000g离心5分钟收集细胞。将细胞重悬在含有蛋白 酶抑制剂(各0.1μg/ml抗蛋白酶、抑蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白 酶肽、胃蛋白酶抑制剂)的RIPA缓冲液(9150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸 钠，0.1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8)中，并用玻璃微珠(0.5mm)裂解。按照 Tomlinson，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.，同上)所述的方法，将提取物上 样在10％SDS-PAGE凝胶上。利用增强的化学发光(ECL)法(Amersham)，使用抗 纯化PAP的抗体进行免疫印迹分析。

在半乳糖诱导后，PAP和PAP-v都在酵母中表达。根据与PAP蛋白标准物的 比较，含有PAP质粒(NT123)的酵母细胞同时表达成熟PAP和一种较大形式 PAP，而含有PAP-v(NT124)的酵母细胞主要表达较大的PAP和很少的成熟PAP。 在培养基中没有发现PAP。不限于任何特定的作用理论，申请人认为该结果表 明：(1)在酵母中，PAP被表达为前体形式，然后被加工成成熟形式；(2)除了共 翻译地切除N末端信号肽之外，PAP还经受其它加工(Lodge等，同上)，因为成 熟PAP和酵母中表达的PAP其大小小于预计的切除信号序列后的大小。

B.PAP和PAP-v的体外翻译和加工。为了在体外检查PAP的加工，在35S-甲 硫氨酸存在下，用T7偶联的带有或不带犬微粒体膜(Promega)的网织红细胞裂解 物翻译系统转录和翻译实施例1A中所述的两种构建物。PAP和PAP-v的cDNA 被克隆在pGem3Z载体(Promega)T7启动子的下游。在35S-甲硫氨酸存在下，用 T7偶联的带有或不带犬胰腺微粒体膜(Promega)的网织红细胞裂解物翻译系统 (Promega)体外转录和翻译等量的两种构建物(1μg)。在5mM EDTA和125mM蔗 糖存在下，翻译产物与0.2mg/ml蛋白酶K孵育90分钟。加入4mM PMSF激活蛋 白酶K，在室温下孵育2小时。然后在0.1％SDS和0.1M柠檬酸钠，pH5.5存在 下，在37℃用Endo-H(内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)(1mU/10μl)处理翻译产物12小 时。按照Laemmli等在《自然》(London)227：680-5(1970)中所述的方法在 10％SDS-PAGE上分析等量的蛋白质(3.5μl)。

PAP和PAP-v分别编码33和34KD的前体蛋白，在与微粒体膜孵育后，两种 前体都被加工成32KD的形式。加工后的蛋白质仍然大于成熟形式(29KD)，这表 明PAP前体还经受了其它翻译后加工。PAP不包含任何N连接的糖基化位点， 所以体外翻译的蛋白质在接受去糖的内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-H)处理 后，大小不变。以上结果表明PAP前体包含被共翻译切除的N末端信号序列和 另一段翻译后去除的序列。此外，通过X光结构分析获得了C末端加工的证据， 这些证据证明成熟PAP在其C末端比根据其cDNA预计的序列短29个氨基酸。 参见Monzingo等，《分子生物学杂志》233：705-15(1993)。

C.转化后酵母的生长：在2％棉籽糖、与GAL基因表达相关的非抑制、非诱 导碳源存在下，含有NT123或NT124的酵母转化子的生长与含单独载体的转化 子没有区别。含NT123的转化酵母的生长在向培养基中加入诱导物半乳糖后被抑 制。含有NT123或NT124的细胞不能在含有半乳糖的平板培养基上生长。但是， 在液体培养基中，对NT123的抑制程度大于对NT124的抑制，这可能是因为含 NT124的酵母产生较少的成熟PAP。在培养基中加入半乳糖后2小时内可检测到 PAP的表达。在6至8小时后达到最高水平。使用抗PAP抗体的免疫印迹分析在 NT123转化子内检测到的最高PAP水平为1μg/mg酵母蛋白，在NT124转化子中 的为250ng/mg酵母蛋白。这些结果与酵母中活性PAP的产量一致。

D.PAP质粒的诱变。为了分离对酵母无毒性的PAP突变蛋白，按照(5)中所述 的方法利用羟基胺诱变含有PAP(NT123)或PAP-v(NT124)的表达质粒，将它们转 化到酵母中，将细胞平板培养在含有葡萄糖的培养基上，将平行样品平板培养在 含半乳糖的培养板上。将约10μg纯化的质粒DNA加到500μl新鲜制备的羟基胺 溶液(0.35g羟基胺-HCl和0.09g NaOH在5ml水中形成的溶液)中，在37℃温育 20小时。加入10μl 5M NaCl，5μl 1mg/ml BSA和1ml100％乙醇终止诱变，在- 70℃温育10分钟以沉淀诱变DNA。将DNA重悬在TE中后再次沉淀。然后将 DNA转化到酵母中，平板培养在含有2％葡萄糖的尿嘧啶缺陷培养基上，将平行 样品平板培养在含2％半乳糖的培养基上。利用前文Lodge等所述的ELISA对生 长在半乳糖培养基上的集落分析其PAP的表达，并用免疫印迹分析鉴定表达羟基 胺产生的突变型PAP的突变体。

E.突变型酵母的生长。经NT123衍生的突变体在含半乳糖培养基上的生长与 在含棉籽糖培养基上的没有区别。利用NT124衍生的突变体也得到了相似的结 果。对酵母内蛋白质积累的分析显示，是野生型PAP的表达，而不是羟基胺产生 的突变型PAP的表达导致了酵母内蛋白质积累的降低(数据未显示)。

诱变之后，通过使用PAP抗体的ELISA对生长在尿嘧啶缺陷半乳糖培养基上 的集落进行PAP表达的分析，对阳性集落再进行免疫印迹分析。在总共28个来 自NT123诱变的突变体中，6个不同的分离体表达与PAP抗体交叉反应的蛋白 质。在总共44个来自NT124诱变的分离突变体中，24个不同的分离体产生与 PAP抗体交叉反应的蛋白质。4个突变体(HMNT123-1、124-6、124-7和124- 1)产生比成熟PAP(29KD)大的蛋白质，这表明将PAP加工成成熟形式的过程在这 些突变体中被抑制。2个突变体(HMNT123-2和123-3)产生与PAP成熟形式共迁 移的蛋白质，其它几种突变体(HMNT123-4、123-5、123-6、124-2和124-3) 产生较小的蛋白质。突变体内蛋白质的表达水平在0.005至0.08％总可溶蛋白之 间。

F.PAP突变蛋白的核苷酸序列分析。通过对回收自酵母的质粒的序列分析鉴 定PAP突变蛋白中的氨基酸改变位置。从突变体中分离出质粒，按照前文Rose 等所述的方法将其转化到大肠杆菌中，然后用Sequenase 2.0 DNA测序试剂盒 (USB)测序。参见Robzyk等，《核酸研究》20：3790(1992)。对HMNT123-2的 测序分析揭示，它包含单个点突变，该突变在推定活性位点将176位的谷氨酸变 为缬氨酸(E176V)(表II)。HMNT123-2产生与野生型PAP一样大小的蛋白质。 176位的谷氨酸(E176)在至今测序过的所有RIP中是高度保守的，并被认为位于 PAP的活性位点裂隙中(4)。参见Stevens等，《实验》(Experientia)37：257-9(1981)。 HMNT123-6、HMNT124-2和HMNT124-3都有一个靠近C末端的点突变，该突 变在237位引入一个终止密码子取代了色氨酸(W237)(表II)。该突变的结果是， 突变型PAP的C末端缺失了26个氨基酸，由此产生了一个截短的蛋白质。 HMNT123-5包含一个移码突变，该突变在大约为Glu184的密码子(GAG)处缺失 了2个核苷酸(GA)，读码框由此被改变，Asn190的密码子因为读码框移动了-1 个位置而变成了TAA，由此导致截短蛋白质的表达。HMNT124-1内的一个点突 变将97位的谷氨酸变成了赖氨酸(E97K)(表I)。HMNT123-1内也含有一个点突 变，在75位将甘氨酸变成缬氨酸(G75V)。以上两种突变体都表达比纯化的成熟 PAP大的蛋白质，这表明PAP的加工在这些突变体中被抑制。

为了证实观察到的突变体的表型是由经鉴定的PAP序列中的突变而不是染色 体突变引起的，分离出各种突变型PAP质粒并重新转化宿主株W303，然后选择 URA+转化子。这些转化子在半乳糖培养基上的生长速度与野生型相同，这表明 转化子经PAP表达诱导作用后存活的能力是质粒连锁的。

表II.消除PAP对真核细胞毒性的突变

HMNT123-1    Gly-75(GGT)→Val(GTT)

HMNT123-2    Glu-176(GAG)→Val(GTG)

HMNT123-4   Trp-208(TGG)→终止子(TAG)

HMNT123-5    Glu-184(GAG)→Glu(GAA)

HMNT123-6   Trp-237(TGG)→终止子(TAG)

HMNT124-1    Glu-97(GAA)→Lys(AAA)

HMNT124-2   Trp-237(TGG)→终止子(TAG)

HMNT124-3   Trp-237(TGG)→终止子(TAG)

HMNT124-13   Leu-202(CTT)→Phe(TTT)

G.PAP突变蛋白的酶活性：使用体外翻译测定来比较PAP突变蛋白的酶活 性。如前文Lodge等所述，在含有不同量PAP的酵母提取物存在下，在兔网织红 细胞裂解物系统(Promega)中翻译雀麦草花叶病毒(BMV)RNA，利用ELISA定量 酵母中的PAP水平(Lodge等，同上)。在0.1至1ng PAP/ml之间，抑制曲线是线 性的。表III显示在0.2ng/ml提取自酵母的PAP存在下进行的蛋白质合成抑制实 验的结果。通过添加野生型酵母提取物或RIPA缓冲液，将总蛋白和PAP分别调 节至87ng/ml和0.2ng/ml。在过去的实验中，当在0.2ng/ml BSA存在下进行体 外翻译时，没有对翻译的抑制。加入0.2ng/ml提取自非转化酵母(WT)的蛋白质 时，可以观察到轻微的翻译抑制。在存在0.2ng/ml以下物质时，翻译被抑制：(1) 加入至野生型酵母提取物的纯化PAP(WT+PAP)；(2)含有NT123或NT124的酵 母的蛋白质提取物和(3)含有羟基胺产生的突变蛋白HMNT123-3、HMNT124- 1、HMNT124-3和HMNT124-13的酵母的蛋白质提取物。相反，提取自 HMNT123-2的蛋白质在网织红细胞裂解物系统中不抑制蛋白质的合成。在用 0.1ng/ml PAP进行体外翻译实验时也获得相似的结果。

表III.PAP突变蛋白对蛋白质合成的抑制

加入翻译培养基中的蛋白质    蛋白质的合成(掺入的cpm)

无RNA                            2,246+/-204

BSA                                244,956

WT                              176,723±713

PAP+WT                          146,660±2474

NT123                           110,007±445

HMNT123-2                       213,952±767

HMNT123-3                       134,202±5522

HMNT124                          84,959±661

HMNT124-1                       119,529±2049

HMNT124-3                       132,955±3739

HMNT124-13                      145,899±4457

实施例2

转基因烟草中PAP突变蛋白的表达

将突变型PAP改造成在植物内呈组成型表达，用以确定它们是否对植物无 毒，以及是否保留PAP的抗病毒特性。

为了将PAP基因插入植物表达载体，如实施例1所述，从酵母中分离编码突 变型PAP的质粒DNA，转化到大肠杆菌中。从用HindIII消化的大肠杆菌中分离 编码突变型PAP的质粒DNA，用Klenow DNA聚合酶补平HindIII位点，用SacI 消化质粒，分离出编码突变型PAP的772bp的SacI/HindIII片段。将编码突变型 PAP的SacI/HindIII片段在用SacI和SmaI消化去除野生型PAP的cDNA插入片 段后克隆到pMON8443中(Lodge等，美国科学院院报》90：7089-7093(1993))。 将来自HMNT123-2的SacI/HindIII片段克隆到SacI/SmaI消化的pMON8443中形 成NT144，将来自HMNT124-3的SacI/HindIII片段克隆到SacI/SmaI消化的 pMON8443中形成NT145。分别用HMNT123-2和HMNT124-3的772bp的 SacI/HindIII片段取代pMON8443中772bp野生型PAP cDNA插入片段的 SacI/HindIII片段来形成NT146和NT147。

将质粒NT144、NT145、NT146和NT147迁移到根瘤土壤杆菌ABI株中用 于转化烟草和马铃薯(Lodge等，1993)。为了转化红花烟草(N.tabacum)，用水将 1月龄烟草植株的幼叶覆盖20至30分钟。待水流干，用10％chlorox和0.04％吐 温20将叶覆盖15分钟，然后用水漂洗3次。用蒸汽灭菌的单孔打孔机切取叶盘， 将它正面朝下在MS104培养基(4.4g/l MS盐，30g/l蔗糖，维生素B5，1.0mg/l NAA和0.1mb/l BA)上放置一天，以进行预培养。将预培养后的叶盘放在50ml 试管内，接种按1∶5稀释的土壤杆菌通宵培养物。将试管颠倒数次。然后取出叶 盘在无菌滤纸上拍干，然后面朝下放在带有过滤片的MS104培养板上共培养2 天。然后将叶盘转移到MS104选择培养基(含100μg/ml卡那霉素和300μg/ml cefataxime)上，并放置在培养箱中。在约3周后出现愈伤组织和枝条。将枝条转 移到带选择的MSO培养基(4.4g/l MS盐，30g/l蔗糖和维生素B5)plantcon上。2 周后形成根，生根后的枝条被转移到土壤中并保持在高湿环境中。然后用ELISA 在再生植株中筛选新霉素磷酸转移酶(NPTII)以鉴定表达子。

红花烟草(N.tabacum cv Samsun)的转化频率通常在10至12％之间(即由每片叶 盘获得的转基因植株数量)。如同以前的报道，当转化中使用含野生型PAP或变 异PAP的载体(pMON8443或pMON8442)时，红花烟草转化的频率显著下降 (Lodge等，1993)。相反，如表IV所示，当转化中使用含有非毒性突变型PAP 的载体时，没有观察到转化频率的下降。

表IV

质粒    转化频率

NT144    13％

NT145    11％

NT147    12％

如同以前的报道，表达野生型PAP或变异PAP的转基因植物表现出生长减 少、缺氯症和叶斑(Lodge等，1993)。相反，表达突变型PAP的转基因植物表型 正常。它们的生长速度与野生型植物相同，而且不表现出缺氯症或叶斑，这表明 突变型PAP的表达对转基因植物无毒。突变型PAP在大肠杆菌中也被表达，而 且其表达不影响大肠杆菌的生长速度，这表明它们对大肠杆菌无毒。

实施例3

转基因烟草中表达的突变型PAP的抗病毒活性

用ELISA(Lodge等，1993)测试转基因烟草(N.tabacum cv Samsun)植株以测定 突变型PAP的表达水平。在表V中，将转基因植物内表达的突变型PAP的表达 水平与变异PAP(pMON8442)(Lodge等，1993)的表达水平进行了比较。

表V：转基因烟草中表达的PAP水平

植株编号              表达水平

NT144-12              1.5μg/mg

NT144-13              0.9μg/mg

NT145-13              4.4ng/mg

pMON8442(26139-11)    9.6ng/mg

如表V所示，包含C末端缺失突变体的转基因植株(NT145-13)表达突变型 PAP的水平与表达变异PAP的植株(pMON8442)相似(Lodge等，1993)。相反， 含有活性位点突变体的转基因植物(NT144)表达突变型PAP的水平明显较高。

为了体外测试PAP突变蛋白(NT144和NT145构建物)是否具有抗病毒活性， 在取自表达突变型PAP、PAP-v(pMON8442)和非转化(野生型)烟草植株的蛋白 质提取物存在下，用马铃薯X病毒接种野生型烟草。用ELISA定量转基因植物 内的PAP水平。植株系145-13内的PAP表达水平为4.4ng/mg，植株系144 -12内的PAP表达水平为1.5μg/mg。用每片叶含5ng PAP和1.1mg总蛋白的转 基因植物的提取物接种植株。由非转化烟草(WT)的叶制备蛋白质提取物。在6.7μg 至1.1mg不等量的来自非转化烟草的蛋白质存在下，将50μl 1μg/ml的PVX接种 到烟草叶上。20株烟草植株在6.7μg至1.1mg不等量的来自非转化植株的蛋白质 存在下接种了50μl 1μg/ml的PVX。如表VI所示，全部WT植株都被PVX感染， 表现出局部损伤、系统性症状和接种叶之上的叶(系统叶)内的病毒积累。这些结 果证明，来自非转化烟草的蛋白质提取物对PVX感染没有作用。当在5至10ng 纯化PAP(WT+PAP)存在下使用来自非转化烟草植株的蛋白质提取物时，在接种 叶上观察到数量较少的PVX损伤，这表明在纯化PAP存在下，烟草植株得到免 受PVX感染的保护。但是，虽然在这些植株的接种叶上观察到较少的损伤，但 是它们表现出了系统症状，而且其PVX抗原的表达水平与在来自非转化烟草植 株(WT)的蛋白质提取物存在下用PVX接种的植株相似。

表VI

PAP突变蛋白对烟草叶的PVX感染的作用1 植物提取物a水平   PAP ng/叶    平均损伤数b   PVX抗原

(ng/mg)c

  WTd              0        66.6±10.1    4.4±1.4

WT+PAPe            5        9.0±2.0      3.1±1.9

                   10        1.5±2.0      2.8±2.6

26139               5        1.8±2.9         NA

145-13              5        12.5±7.4     0.2±0.3

144-12              5        57.8±7.4     3.2±2.5

                   10        56.1±4.9     2.5±1.4

                   20        55.5±13.8    4.3±1.4

                   50        53.3±14.9    2.8±0.3

                  100        68.0±11.7    3.0±0.9

a从非转化或带植物表达载体(pMON8442，NT145和NT144)的转化烟草叶制备 植物提取物。

b在接种后第9天计数损伤数量。

c在接种后第12天，从第1，2和3片系统叶取样三片叶盘放在一个试管内， 然后均质化在ELISA缓冲液中。用ELISA定量PVX抗原的平均水平。用BCA 试剂(Pierce)定量各提取物中的总蛋白。

d从非转化烟草叶中提取蛋白质提取物。

e将PAP(Calbiochem)加到取自非转化烟草叶的蛋白质提取物中。

1.20株用于野生型(wt)，10株用于wt+PAP，5株用于各种转基因蛋白质提 取物。在不同量的PAP或PAP突变蛋白存在下，用50μl PVX(1μg/ml)接种每株 的2片叶。

在5ng表达变异PAP(pMON8442)的转基因植物(26139)的蛋白质存在下接种 PVX时，在接种叶上可以观察到明显较少的损伤，这些植株避免了系统性的感 染。同样，在5ng表达C末端缺失突变蛋白的转基因植物(145-13)的蛋白质存在 下接种PVX时，损伤数量明显较少。这些植株不表现出系统症状，而且接种叶 上的PVX抗原水平显著降低。相反，在5至100ng表达活性位点突变蛋白的植株 (144-12)的蛋白质存在下接种PVX时，接种叶上观察到的损伤数与在非转化烟草 植株(wt)的蛋白质存在下接种的相近。在这些植株上观察到了系统性症状，系统 叶中PVX抗原的水平与在非转化烟草植物提取物存在下接种PVX的植株中相 当。以上结果证明，在体外具有酶活性的C末端缺失突变蛋白在体外保留了其抗 病毒活性。相反，在体外不具有酶活性的活性位点突变蛋白在体外失去了其抗病 毒活性，这表明PAP的酶活性对其体外抗病毒活性来说是决定性的。

实施例4

转基因马铃薯中PAP突变蛋白的表达

将马铃薯的茎切成3mm厚的片，放在无菌水中。将含有NT144，NT145， NT146和NT147的土壤杆菌培养通宵。离心沉淀细胞，然后重悬在10ml水中。 将土壤杆菌按1∶10稀释在水中。去除马铃薯茎外植体上的水，加入稀释过的土壤 杆菌。将茎外植体与土壤杆菌一起孵育15分钟。去除细菌，将外植体放在覆盖 有Whatman#1无菌滤纸的1/10 MSO培养板上。MSO在1L体积中含有4.4g MS 盐，30g蔗糖和1ml维生素B5(500X)，pH5.7。在暗环境中共培养2天后，将 外植体放置在PC培养基上培养4周，每升该培养基含有MSO加0.5mg/l玉米素 核糖核苷(zeatin riboside)(ZR)，5mg/l AgNO3和0.1mg/l NAA(萘乙酸)，100mg卡 那霉素和300mg cefataxime。4周后，将外值体置于PS培养基上，该培养基中 含有MSO加5mg/l ZR，0.3mg/l赤霉酸，每升100mg卡那霉素和300mg cefataxime。4至8周后开始抽枝。然后将枝条摘取后放在含有PM培养基的 plantcons中(每升含4.4g MS盐，30g蔗糖，0.17g NaH2PO4H2O，1ml盐酸硫胺 素和0.1g肌醇，pH6.0，以及0.2％Gelrite琼脂)。将植株植入土壤，使其耐寒， 并利用NPTII ELISA分析鉴定出转基因植物。然后用ELISA分析转基因马铃薯中 的PAP表达。利用ELISA鉴定出了表达NT144，NT145和NT146的转基因马 铃薯。用含有突变型PAP的构建物对转化频率没有影响，而且表达突变型PAP 的转基因植物表型正常，这表明突变型PAP的表达对马铃薯没有毒性。

实施例5

转基因草皮中PAP突变蛋白的表达

将PAP突变蛋白改造成在单子叶植物中组成型地表达。苇草(Agrostis plustris， Huds.)是一种草皮，用在高尔夫球场、航路、球场和草坪，并被用作用于转化的 单子叶植物。为了构建单子叶植物的表达载体，将玉米遍在蛋白基因(Toki等， 《植物生理学》100：1503-1507(1992))的启动子和第一个内含子克隆到pMON969 中构建成NT168。pMON969用HindIII和BglII消化去除CaMV 35S启动子区。 用HindIII和BamHI消化含有遍在蛋白启动子和第一个内含子的质粒 pAHC20(Toki等，1992)，分离出2016bp的HindIII/BamHI片段，将其与pMON969 的HindIII/BglII片段连接成NT168。用BgIII和BamHI消化NT144和NT145， 分离出编码突变型PAP的cDNA片段，将其克隆到NT168的BamHI位置。然后， 将含有突变型PAP的cDNA的单子叶表达载体和含有可选择标记bar基因的 pSLI2011(Hartmann等，1994《生物技术》12：919-923)一起用于转化。用两种不 同的方法转化草皮，使用粒子枪的粒子轰击转化法和前文所述的原生质体转化 法。

由7种苇草栽培品种经表面灭菌的种子开始成胚发生愈伤组织培养物： “Cobra”、“Emerald”、“PennLinks”、“Providence”、“Putter”、 “Southshore”和“SR1020”，按照Hartmann等在《生物技术》12：919-923(1994) 中所述将其用于粒子轰击(biolistic)转化。愈伤组织起始培养基是MS基本培养基 和MS维生素类，其中补充以100mg/L肌-肌醇，3％蔗糖，以及用于MSA2D的 150mg/L天冬酰胺和2mg/L 2，4-D或者用于MMS的500mg/L酪蛋白水解物， 6.6mg/L麦草畏(dicamba)和0.5mg/L 6-BA。用0.2％PhytagelR(Sigma)固化培养基。 在暗环境中于25℃培养4至6周后，挑选出胚发生愈伤组织转移到新鲜培养基 上。将1至2g愈伤组织加到含有50ml液体培养基的250ml烧瓶中制备成悬浮液， 在暗环境中于25℃以120rpm的速度振荡培养，并且每周传代2次。

将1ml细胞悬浮液放在含加了0.4M甘露醇的MSA2D培养基的培养板中的 5.5cm滤片上，制备成用于粒子轰击的培养板。在粒子轰击前20小时制备培养板 并保存在暗环境中。金颗粒(Gold particles)的制备为在100％乙醇中于95℃加热 30分钟，粗略离心，然后重悬在新鲜乙醇中。颗粒在水浴中经超声波处理10至 30分钟，用无菌蒸馏水洗涤3次，然后重悬在水中。含有50μl(5mg)金颗粒悬浮 液，10μg靶DNA、50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺的DNA样品经涡流搅 拌、离心并重悬在乙醇中。乙醇洗涤总共重复3次。最后将沉淀重悬在30μl乙醇 中，每次射击使用5μl DNA溶液。使用Bio-Rad PDS-1000，He Biolistic Delivery System，在1100psi进行轰击。轰击实验后的愈伤组织在含有2或4mg/l用于选 择的双丙氨酰膦(bialaphos)的MSA2D培养板上培养3至4天以进行轰击后的选 择，然后不转移，继续培养8周。8周的平板选择后，将愈伤组织转移到不含激 素的MS培养基上进行再生。在2至8周内开始再生。将枝条转移到含有MS培 养基的plantcon中，在2至4周后开始生根。

至于原生质体转化，在传代4天后分离原生质体。与培养基(加有5％甘露醇的 MSA2D或MMS)中过滤灭菌的酶溶液，于28℃，以50rpm振荡培养细胞4小时， 酶溶液中含有1％纤维素酶Onozuka RA(Yakult Pharmaceutical Co.LTD)，0.1％ 溶果胶酶Y-23(Seishin Pharmaceutical Co.LTD)，和0.1％MES(2-[N-吗啉基]乙烷- 磺酸)(Sigma)。约每1g新鲜重量的悬浮培养物用10ml酶溶液处理。使原生质体 滤过Miracloth并用含有5％甘露醇的培养基洗涤两次。甘露醇被用作渗透压稳定 剂。使用饲养层系统培养原生质体(Rhodes等，1988)。洗涤、过滤后的原生质体 被移液到放置在已分散于5％甘露醇培养基中的一悬浮细胞饲养层上的黑色硝酸 纤维素薄膜上(Lee等，1989)。1周后，将有原生质体的薄膜转移到3％甘露醇培 养板上的新鲜饲养层上。在分离后2周从饲养层取下原生质体。将分离后3周时 的可见集落数除以平板培养的原生质体的总数，如此计算出平板培养效率。将愈 伤组织衍生的原生质体放在不含激素或含有1mg/L 6-BA或细胞分裂素的MS培 养基上进行植物的再生。4至5周后，将枝条转移到不含有激素的MS培养基的 PlantconR上生根。按照Negrutiu等(1987)所述的方法利用PEG法，或使用Gene- Pulster(Bio-Rad)在170V/cm利用电穿孔转化原生质体。在PEG实验中，将新鲜 分离的原生质体以1×107原生质体/ml的密度重悬在含有15mM MgCl2和0.1％ MES的5％甘露醇溶液中。取约0.3ml原生质体与20至40μg质粒DNA和13％PEG 孵育10至15分钟，离心后逐步稀释并重悬在含有5％甘露醇的培养基(pH5.8)中。 在电穿孔实验中，原生质体以5×106/ml的密度重悬在冷的过滤灭菌的电穿孔缓 冲液中，其中含有5.2g/L KCl，0.835g/L CaCl2，0.976g/L MES和5％甘露醇， pH5.8。将约0.8ml原生质体与20μg DNA通过倒转混合，在170V/cm进行电穿 孔，并在冰上放置15分钟，然后用含有5％甘露醇的培养基稀释至3ml总体积。 在分离和转化原生质体16天后，用4mg/L bialaphos进行选择。在无激素、含6- BA或细胞分裂素的MS培育基上的抗性集落如前文所述。将枝条转移到PlantconR 上生根。用商品名为HerbiaceR(Meiji Seika Kaishya，LTD.)的市售bialapho制剂用 于暖房内的除草剂实验。HerbiaceR的除草剂比率使用对照植株，并以市售品的 0.75磅AI/公顷(1倍于大田比率)为基准确定HerbiaceR的除草剂比率。以每片地 块120ml的比率用画笔对所有露出地面的分蘖都施以除草剂。地块的面积为 0.1431m2，其上有96或24株植物。

实施例6

转基因烟草植株内PAP突变蛋白的表达和对病毒感染的抗性 A.转基因烟草中PAP突变蛋白的表达

为了确定PAP的酶活性是否是其抗病毒活性所必需的，如实施例2所述，将 编码活性位点突变蛋白NT123-2的cDNA克隆到去除了野生型PAP插入片段的 pMON8443植物表达载体中，形成NT144。同样，如实施例2所述，将编码C 末端缺失突变蛋白的NT124-3克隆到pMON8443形成NT145和NT147。突变型 PAP的表达由增强的CaMV35S启动子驱动。将质粒NT144、NT145和NT147 迁移到根瘤土壤杆菌中用于转化到烟草中。根据每片叶盘获得的转基因植株数， 红花烟草的转化频率通常在10至12％之间(Lodge等，1993)。用NT144的转化 频率为13％，使用NT145为11％。表达活性位点突变蛋白或C末端缺失突变蛋 白的转基因植株表型正常。它们与野生型的生长速度相同，不表现出缺氯症或叶 斑，这表明突变型PAP的表达对转基因烟草是无毒的。这些结果与以前的报道 (Lodge等，1993)相反，其中报道用含有PAP的载体(pMON8443)时，红花烟草 的转化频率下降至0.7％，使用含PAP-v的载体(pMON8442)时，下降至3.7％，两 种突变蛋白都具有酶活性(Lodge等，1993)。Lodge等没有回收到表达高水平 PAP的转基因植物，而且，表达高水平PAP-v的转基因植物表现出生长抑制、缺 氯症和叶斑。

先用ELISA对再生的转基因植物进行新霉素磷酸转移酶(NPTII)表达的分析。 然后用ELISA和免疫印迹对NPTII阳性植株进行PAP表达的分析。利用ELISA 测定，11种不同的转基因植物表达可测水平的活性位点突变蛋白。表达活性位 点突变型PAP的植株产生一种与成熟PAP共迁移的29KD蛋白质，这表明在转 基因植物中，活性位点突变型PAP被完全加工成了成熟形式(数据未显示)。转基 因植物表达活性位点突变蛋白的水平明显高于表达PAP或PAP-v的植株。在野 生型烟草或表达β-葡糖醛酸酶的烟草中检测不到对应于PAP的条带。C末端缺失 突变蛋白的表达水平明显低于活性位点突变蛋白。 B.转基因烟草内活性位点突变蛋白的抗病毒活性

为了确定表达活性位点突变型PAP的转基因系是否抗病毒感染，用PVX接种 转化的植株系的后代。用ELISA在自体受精的后代中筛选PAP的存在。转基因 植株系后代中PAP水平随植株年龄和生长条件而不同。PAP水平的差异程度与 以前表达PAP或PAP-v的转基因系的有关报道相近(Lodge等，1993)。各取表达 活性位点突变型PAP(144-1和144-7)、PAP-v(26139-19)、PAP(33617-11)的10 株转基因系后代和10株非转化烟草植株用1μg/ml PVX接种。在接种后21天内 每天观察接种叶和系统叶上症状的发展。此外，为了定量病毒的复制与传播，在 接种后第12天取样每棵植株的接种叶和第1，2和3片系统叶的叶盘。

如表VII所示，表达PAP-v或野生型PAP的转基因植物在接种后第9天在接 种叶上不形成任何损伤。相反，表达活性位点突变蛋白的转基因植物其接种叶上 的损伤与对照植株的一样多。对系统叶的ELISA显示，在接种后12天，90％的 野生型烟草植株被PVX系统性地感染，但分别只有30％和40％表达PAP或PAP-v 的转基因植物表现出系统性PVX感染。相反，表达活性位点突变蛋白的植株100％ 地表现出PVX感染(表VII)。在接种后21天评价植株时，获得的结果相近。

表VII

植株系    表达的PAP     PAP水平    损伤数b   表现出系统性

                       (ng/mg)a              感染的植株％c

  WT                      0        77+/-12         90   26139-19      PAP-v      5.6+/-2.6     0**         30**   33617-11       PAP       0.6+/-0.02    0**         40*    144-1        E176V      43.8+/-4.8  78+/-16        100    144-7        E176V      46.2+/-5.6  72+/-11        100 a从每系20株植株上各取4片叶盘，用ELISA定量PAP水平。给出平均值+/-标 准偏差。 b每系10棵植株，每株在2片叶上接种50μl 1μg/ml PVX。在接种后第9天计数 损伤数。给出平均值+/-标准偏差。 c在接种后第12天从第1，2和3系统叶上取样3片叶盘，利用ELISA定量病毒 抗原水平。用BCA试剂盒(Pierce)定量每份提取物中的总蛋白量。 **与野生型1％的水平有显著不同 *与野生型5％的水平有显著不同。

为了确定表达高水平的活性位点突变蛋白的转基因植物是否也易被PVX感 染，用0.5μg/ml PVX接种表达高水平活性位点突变型PAP的转基因系144-12的 纯合后代(R2代)。如以下表VIII所示，产生高水平活性位点突变蛋白的转基因系 在其接种叶上的损伤数与野生型烟草植株的相同，但是表达PAP-v或PAP的转 基因植株后代其损伤数明显较低。对系统叶的ELISA分析显示，接种21天后， 90％野生型烟草植株和100％表达活性位点突变蛋白的转基因植株被PVX感染。 相反，表达PAP-v或PAP的转基因植株在其接种叶上的损伤较少，而且植株中 被PVX系统性感染的百分比较低。

在其它实验中，对7个表达活性位点突变蛋白的不同转基因系的后代分析了 其对PVX感染的易感性；其中对PVX都没有抗性(数据未显示)。

表VIII

表达C末端缺失突变蛋白(W237终止子)的

转基因烟草植株对PVX感染的易感性

植株系    表达的PAP    PAP水平    损伤数b 表现出系统性感

                      (ng/mg)a              染的植株％c

                                             12天后  21天后

 WT                      0        24+/-15     90     90   26139-19     PAP-v        9.6       1+/-2**    10**   30**   33617-11      PAP         1.6       11+/-4**   10*    40*   147-12       E176V        1500      23+/-13     100     100   145-19     W237终止子     4.5       12+/-10**  20**   60   144-13     W237终止子     4.4       6+/-4**    30**   60 a在原代转基因植株中利用ELISA定量PAP水平 b在每8至10棵各转基因系纯合后代(R2代)的植株中，每株在两片叶上接种以 0.5μg/ml PVX 50μl。在接种后第12天计数损伤数。显示平均值+/-标准偏差。 c在接种后第12天，从各植株的第1和第2系统感染叶上取两片叶片，并在接种 后第21从第3和第4系统感染叶上取两片叶盘。用ELISA定量病毒抗原的水平。 用BCA试剂盒(Pierce)定量每份提取物中的总蛋白量。 **与野生型1％的水平有显著不同 *与野生型5％的水平有显著不同。 C.转基因烟草内C末端缺失突变蛋白的抗病毒活性

为了确定表达C末端缺失突变蛋白的转基因系是否抗病毒感染，用0.5μg/ml PVX接种表达C末端缺失突变蛋白(W237终止子)的转基因系145-13和147-19 的纯合后代(R2代)，在接种后第12天计数损伤数。如以上表VIII所示，来自145-13 和147-19转基因系的植株在其接种叶上的损伤数明显少于野生型植株。在接种后 第12天，分别只有20％和30％来自转基因系147-19和145-13的植株表现出系统 性症状以及经ELISA检测含有PVX抗原，但是90％对照植株被PVX感染。接种 后21天，来自147-19和145-13系的植株中表现出系统性症状的百分比有所上升。 正如以前实验中的观察结果，表达PAP-v和PAP的转基因系的后代能免受PVX 感染。表达C末端缺失突变蛋白(W237终止子)、PAP或PAP-v的被感染植株与 被感染的野生型或表达活性位点突变蛋白(E176V)的转基因植株相比，表现出较 轻的症状。在接种后第21天，使用ELISA来定量转基因植株和野生型植株中的 病毒抗原水平。来自147-19、145-13和33617-11系的植株中的PVX抗原水平低 于野生型植株。在接种后4周进行评价时，被感染植株的百分比没有改变。

在其它实验中，总共分析了6个不同的表达C末端缺失突变蛋白的转基因系 对PVX感染的易感性，其中4个系表现出对PVX感染的抗性(数据未显示)。

实施例7

表达PAP和PAP突变蛋白的转基因植物内的抗真菌性的分析

使用的是表达PAP、PAP突变蛋白的转基因烟草系的苗和野生型烟草的苗。 在出苗4周后，将苗转移到培育室中，于25℃、80％相对湿度和16小时光照周 期下种植在无菌土中。利用三亲本交配法将含有嵌合PAP基因的重组构建物引入 根瘤土壤杆菌。含有经修饰PAP基因的土壤杆菌被用于转化红花烟草。使耐卡那 霉素的R2代转基因植株自体授粉，并在实验中使用R3代的苗。使用的是来自 33617(表达野生型PAP)、NT144(表达活性位点突变型PAP)、NT145和 NT147(都表达C末端缺失突变型PAP)系的转基因植物。

将4周龄的转基因苗和对照苗移植到无菌土中，用由土壤携带的真菌病原体 茄属丝核菌接种。对病害症状的发展进行2周的观察，计算苗死亡的比率。将在 真菌感染后存活的植株移植到单个盆中，并组织取样以进行以后的分析。

在用茄属丝核菌接种后，对照烟草苗迅速被真菌病原体侵害。病害发展迅速， 在接种后6天中感染了30％以上的对照苗。相反，转基因系1对感染的易感性明 显较低。接种后6天，只有9.5％来自野生型PAP系的苗、约20％来自C末端截 短的PAP系的苗和23％来自活性位点突变蛋白系的苗被感染。在以下表IX中列 出了在不同时刻的存活苗数量。全部转基因系均表现出延迟了病症的出现以及较 低的死亡率。

表IX

被茄属丝核菌感染的转基因烟草PAP系内的病害进展     烟草系     接种后存活的苗数   第0天(％)    第6天(％)    第10天(％)    第14天(％)     野生型     40(100)     27(67.5)     25(62.5)     25(62.5)     33617-11     42(100)     38(90.5)     35(83.3)     34(81.0)     145-15-3     37(100)     29(78.4)     26(70.3)     23(62.2)     147-19-25     39(100)     32(82.1)     29(74.4)     28(71.8)     144-12-3     39(100)     30(76.9)     29(74.4)     29(74.4)

在使用不同的另一茄属丝核菌菌株的实验中，病害发展迅速，在5天内杀死 了大部分幼苗。以下表X列出了在感染土壤中种植2周后存活的苗数。值得注意 的是，虽然对照植物在评价的时候并没有死亡，但是它们被极度矮化，而且表现 出十分严重的病症。相反，表达截短的PAP的转基因系的幼苗表现出的组织损伤 少得多。

表X

在茄属丝核菌抗性测试中具有不同的

PAP基因的转基因烟草系的存活 烟草系(Samsun)    种植的苗数    接种14天后    接种14天后

                           存活苗的数量   存活苗的％

对照(n)          20             2            10

对照(N)          20             0             0

33617-11         20             8            40

144-12           20             5            25

145-15           20             1             5

147-19           20             5            25 对存活植株的分析

进行转基因系的总细胞蛋白分析，即用MiniPROTEAN II电泳槽(Bio-Rad)在 10％SDS-PAGE上分离蛋白质样品，按制造商的说明使用Bio-Rad半干电泳转移 器将蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上。使用PAP IgG或PR1a单克隆抗体进行 Western印迹分析。使用DuPont Renaissance试剂盒通过增强化学发光进行检测。

对转基因植株细胞提取物的Western印迹分析显示，PAP基因在全部经真菌 感染后存活的植株中都表达。各植株产生的PAP的量不同。此外，由同一植株分 离质外体液，通过硝酸银染色非变性凝胶来分析胞外蛋白。在表达商陆抗病毒蛋 白基因的植株中检测到了病理相关蛋白(PR)的表达。Western印迹分析还显示， 在存活植株内，PR1a的表达水平增高。

在表达商陆抗病毒蛋白的转基因烟草系中观察到真菌病症的明显减少。如表 IX和X所示，PAP转基因系在被茄属丝核菌感染后表现出较高的存活苗百分 比。此外，在转基因PAP系中，以幼苗死亡率为代表的病害进程明显较慢。表达 野生型PAP的转基因系33617以及含有PAP突变形式即NT144-12(表达活性位点 突变型PAP)、NT145-15和NT147-19(表达缺失了25个C末端氨基酸的PAP 截短形式)的转基因烟草系都表现出对真菌感染的抗性。

突变型PAP基因在烟草内的表达被证明绝对没有可测的表型影响，但却意外 可造成了几种病理相关蛋白的组成型表达。已知在被诱导的基因中有些具有抗真 菌活性。基于这一发现，而且不限于任何特定的作用理论，申请人认为表达本发 明突变型PAP基因的烟草系对茄属丝核菌感染的抗性可以用宿主防御基因的作 用来解释，而表达PAP的植株内对真菌感染的抗性可能是由于在转基因烟草中组 成型表达的PAP转基因和许多宿主基因的双重作用。申请人还认为，对这些植物 防御基因的诱导还具有保护转基因植株抗其它病原体例如细菌性病原体的作 用。

实施例8

通过在酵母中的染色体诱变和选择分离新的PAP突变蛋白 A.PAP突变蛋白的分离

利用染色体诱变和选择来分离允许细胞在PAP存在下生长的酵母突变株。酿 酒酵母内PAP的组成型表达一般是致死性的。所以，将PAP基因置于半乳糖诱 导型GAL1启动子的调控下。这能够使得携带了含PAP基因的质粒的细胞在PAP 表达被抑制的葡萄糖上正常生长，但在PAP被表达的半乳糖上杀死已生长的细 胞。我们还首次利用诱导型PAP表达系统和PAP对正常酵母细胞的毒性来分离 了能够在PAP存在下生长的突变株。带有含野生型PAP基因质粒(NT123)的酵母 细胞被培养到对数期早期，pH7.0，密度为1×108细胞/ml。取3份1ml的培养 物用于诱变。用5μl或25μl乙基甲磺酸(EMS)进行诱变。保留一份不诱变的作为 检测自发突变频率的对照。加入EMS后，细胞在30℃培养1小时，加以轻微的 振荡。加入5％硫代硫酸钠终止诱变。然后在30℃将细胞平板培养在含有2％葡 萄糖的尿嘧啶缺陷培养基上。根据平板上由诱变细胞生长出的集落数与非诱变的 对照之比，5μl和25μl EMS分别杀死了35％和98％细胞。这些集落被影印到含 有2％半乳糖的尿嘧啶缺陷培养基上平板培养，并筛选出在PAP存在下能够生长 的集落。筛选了约13,500个集落，获得9个能够在半乳糖培养基上生长的集落。

对突变株进行了测试，以检验突变是染色体连锁的还是质粒连锁的。在突变 株上进行质粒的分离，即在非选择性培养基(YEPD)上将细胞传代约50代，将它 们平板培养在YEPD上，然后影印平板培养这些因丢失了质粒而不能再在尿嘧啶 缺陷培养基上生长的细胞。用新鲜的NT123质粒转化这些经质粒分离的细胞，并 检测它们在含有2％半乳糖的尿嘧啶缺陷培养基上生长的能力。保留了在半乳糖 培养基上生长能力的突变株是染色体突变株，而不能在半乳糖上生长的突变株带 有质粒携带的突变。

进一步定性这些质粒携带的突变体，即对取自表达这些质粒的细胞的全部细 胞提取物进行免疫印迹分析。该分析揭示，7个质粒突变株中有2个表达截短的 PAP。另外5个不表达任何PAP蛋白。对表达截短的PAP的2个突变株进行测 序，以确定突变的位置。一个突变株，NT185在C末端具有一个点突变，即将 Lys210(AAG)变成了终止密码子(TAG)，造成约3.5KD的缺失。另一突变株， NT187在N末端将Try16(TAC)变成了终止密码子(TAG)，从而能在Met39处重新 起始，由此形成一个24.8KD的蛋白质。 B.大肠杆菌表达载体的构建

为了在大肠杆菌细胞内表达N末端缺失的成熟PAP，用BstYI和HindIII限 制酶消化NT187质粒DNA，并用Gene Clean试剂盒(Bio 101)纯化该830bp的片 段。将纯化的片段连接到经BamHI和HindIII消化后用碱性磷酸酶处理过的大肠 杆菌表达载体pQE31(QIAGEN Inc.)上。形成的质粒NT190在大肠杆菌表达载体 pQE31内含有N末端缺失突变型PAP。 C.大肠杆菌内PAP突变蛋白的表达

从大肠杆菌DH5α细胞中分离NT190，并转化到表达宿主，大肠杆菌 M15(pREP4)中。含有NT190的M15细胞在50ml含有2％葡萄糖、100μg/ml氨 苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中于35℃通宵剧烈振荡培养。第二天， 接种大量培养物(500ml LB培养基，其中含2％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和 50μg/ml卡那霉素)，并在37℃剧烈振荡培养，直至A600达0.9。加入最终浓度为 2mM的IPTG，培养物在37℃培养5小时。在4,000Xg离心10分钟以收集细胞， 保存在-70℃。 D.N末端缺失的PAP的纯化

融解1g大肠杆菌细胞重悬在5ml缓冲液A(6M盐酸胍，0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl，pH8.0)中，并在室温下搅拌1小时。大肠杆菌裂解物在4℃以10,000xg 离心15分钟，并收集上清液。加入预先在缓冲液A中平衡过的50％Ni-琼脂糖 树脂浆(QIAGEN Inc.)2ml。在室温下搅拌45分钟后，将树脂小心地上样在 poly-prep色谱柱(Bio-Rad)上。柱用20倍柱体积的缓冲液A和10倍柱体积的缓冲 液B(8M尿素、0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl，pH8.0)洗涤。用20倍柱体积的缓 冲液C(8M尿素、0.1M磷酸钠和0.01M Tris-HCl，pH6.3)洗出不与树脂结合的蛋 白质。最后，用含有250mM咪唑的缓冲液C洗脱结合蛋白，并用SDS-PAGE和 Western印迹分析进行分析。 E.N末端缺失的PAP的抗病毒活性

为了确定N末端缺失的PAP是否具有抗病毒活性，在有或无纯化自大肠杆菌 的N末端缺失突变蛋白存在下，用1μg/ml PVX接种野生型烟草植株。利用ELISA 和SDS-PAGE测定PAP浓度。在有或无1μg/ml PVX存在下用15ng/μl和1.5ng/μl 突变型PAP涂在烟草叶上。如表XI所示，在1.5或15ng/μl N末端缺失的PAP 存在下接种PVX的烟草植株与无突变型PAP存在下接种PVX的烟草植株相比， 在其接种叶上表现出较少的损伤。而且，如表XII所示，在15ng/μl突变型PAP 存在下接种PVX的植株都不表现出PVX系统性症状，在1.5ng/μl突变型PAP 存在下接种PVX的植株只有13％表现出系统性PVX症状，而在单纯缓冲液存在 下接种PVX的植株100％地表现出系统性PVX症状。以上结果表明，外源性地 施用N末端缺失的PAP可保护烟草抗PVX感染，因而是抗病毒的。

表XI

外源性施用了N末端缺失的PAP的烟草植株对PVX的易感性   施用的蛋白质a(ng/μl)      PVX(μg/ml)    平均损伤数b

     无                        1           20+/-16

  PAP(1.5)                     1           2+/-2

  PAP(15)                      1           2+/-2 a在1.5或15ng/μlN末端缺失的PAP存在下用50μl(1μg/ml)PVX接种每棵植株的 2片叶。在仅有缓冲液存在下(“无”)用PVX接种12棵植株，在50μl 1.5或15ng/μl 突变型PAP存在下用PVX接种8棵植株。 b在接种后第7天计数损伤数。给出平均值+/-标准偏差。

表XII

在外源性施用的N末端缺失的PAP存在下，

表现出系统性病症的植株的百分比

施用的蛋白质a       PVX        表现出系统性病症的植株

(ng/μl)           (μg/ml)          的百分比b

   无                 1                100

 PAP(1.5)             1                13

 PAP(15)              1                0 a在1.5或15ng/μl N末端缺失的PAP存在下用50μl(1μg/ml)PVX接种每棵植株的 2片叶。在仅有缓冲液存在下(“无”)用PVX接种12棵植株，在50μl 1.5或15ng/μl 突变型PAP存在下用PVX接种8棵植株。 b在接种后第11天评价系统性症状。

在此将申请人于1995，7，11申请的的未审定的专利申请08/500,611和 500,694全文作为参考。

工业实用性

当本发明的突变型PAP在植物内被表达时可提供对病毒和真菌的广谱抗性。 它们只需要很少数量的转基因就可以有效地提供这种抗性。而且，突变型PAP基 本上没有植物毒性和细胞毒性，因而与使用野生型PAP相比具有突出而且超乎意 料的优越性。能够表达本发明突变型PAP的转基因植物对多种病原体具有明显更 强的抗性，其中包括病毒、真菌、细菌、线虫和害虫，所以具有相当高的作物产 量。

说明书中提及的所有文献和专利申请都代表本发明所属领域技术人员的研究 水平。所有文献和专利申请都作了相同程度的引用，都具体、单独进行了参考性 引述。

对本领域技术人员来说，本发明的多种修改形式是显而易见的。这些修改都 在后文权利要求的范围之内。

                           序列表 (1)一般信息：

(i)申请人：Rutgers，The State University

                 Piscataway，NJ 08855

(ii)发明名称：商陆抗病毒蛋白突变体

(iii)序列数量：2

(iv)通讯地址：

    (A)地址：Lerner，David，Littenberg，Krumholz&Mentlik

    (B)街道：600 South Avenue West

    (C)城市：Westfield

    (D)州：NJ

    (E)国家：USA

    (F)邮编：07090-1497

(v)计算机可读形式：

    (A)记录介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：Patentln Release#1.0，#1.25版

(vi)本申请资料：

    (A)申请号：PCT

    (B)申请日：11-7-1996

(vii)在先申请资料：

    (A)申请号：US 08/500,611

    (B)申请日：11-7-1995

(vii)在先申请资料：

    (A)申请号：US 08/500,694

    (B)申请日：11-7-1995

(viii)律师/代理人信息：

    (A)姓名：Foley，Shawn P.

    (C)参考/卷宗号：OCIRS 3.4-034CIP

(ix)电讯信息：

    (A)电话：908-654-5000

    (B)传真：908-654-7866

    (C)电传：139-125 (2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：1379碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线性

(ix)特征：

    (A)名称/符号：CDS

    (B)位置：225..1163

(ix)特征：

    (A)名称/符号：突变

    (B)位置：置换(233，″a″)

(ix)特征：

    (A)名称/符号：突变

    (B)位置：置换(349，″g″)

(ix)特征：

    (A)名称/符号：突变

    (B)位置：置换(435，″c″)

(xi)SEQ ID NO：1的序列描述： CTATGAAGTC GGGTCAAAGC ATATACAGGC TATGCATTGT TAGAAACATT GATGCCTCTG     60 ATCCCGATAA ACAATACAAA TTAGACAATA AGATGACATA CAAGTACCTA AACTGTGTAT     120 GGGGGAGTGA AACCTCAGCT GCTAAAAAAA CGTTGTAAGA AAAAAAGAAA GTTGTGAGTT     180 AACTACAGGG CGAAAGTATT GGAACTAGCT AGTAGGAAGG GAAG ATG AAG TCG ATG      236

                                             Met Lys Ser Met

                                               1 CTT GTG GTG ACA ATA TCA ATA TGG CTC ATT CTT GCA CCA ACT TCA ACT       284 Leu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala Pro Thr Ser Thr   5                  10                  15                  20 TGG GCT GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGC       332 Trp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile Ser

             25                  30                  35 AAA TAC GCC ACT TTT CTG AAT GAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCA       380 Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro

         40                  45                  50 AGT TTA AAA TGC TAT GGA ATA CCA ATG CTG CCC AAT ACA AAT ACA AAT       428 Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn

     55                  60                  65 CCA AAG TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA AAT AAA AAA ACC ATC       476 Pro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn Lys Lys Thr Ile

 70                  75                  80 ACA CTA ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGT TAT TCT GAT       524 Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp  85                  90                  95                 100 CCC TTT GAA ACC AAT AAA TGT CGT TAC CAT ATC TTT AAT GAT ATC TCA       572 Pro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser

            105                 110                 115 GGT ACT GAA CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT GCC AAT       620 Gly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn

        120                 125                 130 TCT CGT GTT AGT AAA AAC ATA AAC TTT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTG       668 Ser Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu

    135                 140                 145 GAA TCA AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAG GTC CAA CTG GGA ATT       716 Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln Leu Gly Ile

150                 155                 160 CAA ATA CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ATG TCA TTC       764 Gln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly Val Met Ser Phe 165                 170                 175                 180 ACT GAG AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA TTG GTA GCC ATA CAA ATG GTA       812 Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val

            185                 190                 195 TCA GAG GCA GCA AGA TTC AAG TAC ATA GAG AAT CAG GTG AAA ACT AAT       860 Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn

        200                 205                 210 TTT AAC AGA GCA TTC AAC CCT AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG CAA GAG       908 Phe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gln Glu

    215                 220                 225 ACA TGG GGT AAG ATT TCA ACA GCA ATT CAT GAT GCC AAG AAT GGA GTT       956 Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val

230                 235                 240 TTA CCC AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG ATA      1004 Leu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp Ile 245                 250                 255                 260 GTG TTG AGA GTG GAT GAA ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TAC      1052 Val Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr

            265                 270                 275 GTT GGT GGG AGC TGT CAG ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCT      1100 Val Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Ala Met Phe Pro

        280                 285                 290 CAA CTT ATA ATG TCT ACT TAT TAT AAT TAC ATG GTT AAT CTT GGT GAT      1148 Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val Asn Leu Gly Asp

    295                 300                 305 CTA TTT GAA GGA TTC TGATCATAAA CATAATAAGG AGTATATATA TATTACTCCA      1203 Leu Phe Glu Gly Phe

310 ACTATATTAT  AAAGCTTAAA  TAAGAGGCCG  TGTTAATTAG  TACTTGTTGC  CTTTTGCTTT         1263 ATGGTGTTGT  TTATTATGCC  TTGTATGCTT  GTAATATTAT  CTAGAGAACA  AGATGTACTG         1323 TGTAATAGTC  TTGTTTGAAA  TAAAACTTCC  AATTATGATG  CAAAAAAAAA  AAAAAA             1379 (2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：313氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)SEQ ID NO：2的序列描述： Met Lys Ser Met Leu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala   1               5                  10                  15 Pro Thr Ser Thr Trp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser

         20                  25                  30 Thr Thr Ile Ser Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu

     35                  40                  45 Ala Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn

 50                  55                  60 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn  65                  70                  75                  80 Lys Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met

             85                  90                  95 Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe

        100                 105                 110 Asn Asp Ile Ser Gly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys

    115                 120                 125 Pro Asn Ala Asn Ser Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg

130                 135                 140 Tyr Pro Thr Leu Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val 145                 150                 155                 160 Gln Leu Gly Ile Gln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly

            165                 170                 175 Val Met Ser Phe Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala

        180                 185                 190 Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln

    195                 200                 205 Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu

210                 215                 220 Asn Leu Gln Glu Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala 225                 230                 235                 240 Lys Asn Gly Val Leu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly

            245                 250                 255 Ala Lys Trp Ile Val Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala

        260                 265                 270 Leu Leu Asn Tyr Val Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn

    275                 280                 285 Ala Met Phe Pro Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val

290                 295                 300 Asn Leu Gly Asp Leu Phe Glu Gly Phe 305                 310