一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
阅读：693发布：2023-03-13
专利汇可以提供一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种蛋白延时表达 开关 ，通过组合使用生长期启动子PrpsL和C末端降解标签SsrA，可以自动控制靶蛋白在细胞培养后期开启表达，且不需要借助人为控制和外源添加诱导剂。引入该蛋白延时表达开关构建的生产 葡萄糖 二酸的基因工程菌，能够控制目的蛋白肌醇-1- 磷酸 合成酶(INO1)仅当细胞 密度 达到一定程度后才开启表达，对于提高葡萄糖二酸合成效率具有重要价值，对于在 微 生物 发酵 生产葡萄糖二酸方面，也提供新的方法以及思路。，下面是一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用专利的具体信息内容。
1.一种蛋白延时表达开关，其特征在于，通过组合使用生长期启动子PrpsL和C末端降解标签SsrA，可以自动控制靶蛋白在细胞培养后期开启表达；所述SsrA包括LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD；所述PrpsL的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；所述LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的蛋白延时表达开关，其特征在于，所述靶蛋白为红色荧光蛋白mKate2或肌醇-1-磷酸合成酶INO1,由Ptet启动子控制表达。
3.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主菌，引入权利要求1所述蛋白延时表达开关控制靶蛋白的表达，优选地，所述大肠杆菌敲除了D-半乳糖醛酸异构酶基因uxaC和D-葡糖二酸脱水酶基因gudD，更优选地，所述大肠杆菌为敲除了基因uxaC和gudD的E.coli MG1655。
4.如权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括(1)构建重组表达载体，所述表达载体为p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh，优选p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh；(2)将所述表达载体转化至大肠杆菌；(3)培养转化的大肠杆菌得到基因工程菌。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中表达载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh的构建方法为：
(a)合成生长期启动子PrpsL序列，替换载体pTet-1中原有的Ptet启动子，获得的质粒命名为p15A-PrpsL；
(b)以商业化质粒pdCas9-bacteria为载体扩增基因tetR，并在tetR蛋白的C末端融合上降解标签SsrA，将融合有降解标签的tetR-SsrA插入至p15A-PrpsL中获得质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA；
(c)将合成的启动子Ptet片段、B0034RBS片段、以酿酒酵母基因组为模板扩增的基因INO1片段,采用多片段同源重组的方式插入p15A-PrpsL-tetR-SsrA中，构建质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1；
(d)合成MIOX和Udh两种路径酶的片段，并将片段与组成型启动子PTrc共同融合插入载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1中，构建出质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh。
6.一种生产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，以权利要求2-4任一项所述的基因工程菌为发酵微生物，以葡萄糖为碳源进行发酵。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为M9无机盐培养基，所述发酵条件为30℃，200-220rpm，初始OD600为0.04-0.1，发酵40-50h；或发酵条件为30℃，480-
530rpm，接种量为5-10％，通气量为1-2vvm，发酵40-50h。
8.权利要求1或2所述的蛋白延时表达开关或权利要求3-5任一项所述的基因工程菌在制备葡萄糖二酸或含有葡萄糖二酸产品中的应用。
9.权利要求1或2所述的蛋白延时表达开关在制备目的蛋白或在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
技术领域
背景技术
[0002] 为满足全球范围内对可持续发展的需求。过去十年，微生物细胞工厂是生产高价值化合物(如生物燃料，可再生材料和医药中间体)的重要工具。代谢工程改造微生物细胞工厂是调节代谢流的重要手段。使用传统基因敲除和基因过表达等静态调控策略可能会损害细胞活力并降低细胞的发酵参数，如生产强度、得率和产量。相反，动态调控策略正在成为提高微生物合成效率的新策略，例如蛋白延时表达开关。
[0003] 目前常用的蛋白延时表达开关设计主要由两种思路：第一种思路需要借助异源群体感应QS系统，即细胞在低密度时，由于自诱导物AHL的积累浓度较低，受体蛋白LuxR难以结合到启动子PLux上行使激活转录的功能，而当细胞密度持续增加，AHL浓度积累到一定阈值时，AHL会与LuxR结合，并进一步结合到启动子PLux上，激活转录活动，实现针对靶蛋白的延时表达(ACS Synth Biol,2017,6(3):463-470.)。第二种思路需要借助生物传感器系统，即细胞的信号分子(例如粘康酸)浓度较低时，传感器(例如粘康酸响应启动子)的转录活动不启动，仅当细胞积累足够浓度信号分子时，传感器才能开启功能，实现针对靶蛋白的延时表达(Nat Commun,2018,9(1):3043.)。
[0004] 总体而言，目前的蛋白延时表达开关，普遍需要借助响应代谢物浓度的转录因子、响应细胞密度的效应蛋白等异源蛋白的参与。这些系统需要引入异源蛋白或者筛选出针对特定信号分子的传感器元件，设计较为复杂。此外，在应用上述设计时，需要精细优化系统，工作量较大。因此，如何设计出一种更为精简有效的蛋白延时表达开关是本领域技术人员亟需解决的难题。
[0005] 葡萄糖二酸(Glucaric acid，简称GA)是一种无毒的葡萄糖衍生物，是葡萄糖的C6位羟基和醛基发生氧化作用生成了羧基从而形成的二元酸。葡萄糖二酸及其衍生物具有广泛的应用价值，它可以降低胆固醇、治疗糖尿病、预防癌症等，同时，在合成生物可降解的聚合物、羟基化尼龙等新型材料方面也有大量的应用，曾被美国能源部确定为“最具价值的生物炼制产品”之一。
[0006] 目前，葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物为催化剂的共催化氧化等。此方法投入高、得率低，同时产生的废气废液对环境造成一定的污染。由于化学法存在的局限性，生物法制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。
[0007] 麻省理工的Prather团队在大肠杆菌中成功构建了葡糖二酸的代谢途径，首次实现微生物代谢合成葡糖二酸(Metab Eng 2010,12(3),298.)。在此途径中，大肠杆菌利用自身的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶系统转化葡萄糖为葡萄糖-6-磷酸，接着肌醇-1-磷酸合成酶(INO1)催化葡萄糖-6-磷酸转化为肌醇-1-磷酸，肌醇-1-磷酸经自身的磷酸化酶水解去磷酸化生成肌醇，肌醇经肌醇加氧酶(MIOX)转化为D-葡萄糖醛酸，后者经糖醛酸脱氢酶(Udh)的催化最终转化为葡糖二酸。通过表达不同生物来源的INO1、MIOX和udh基因，5步反应即实现大肠杆菌中葡萄糖到葡糖二酸的转化。
[0008] 在生产葡萄糖二酸的过程中，直接表达INO1会抢夺用于细胞生长的底物葡萄糖-6-磷酸，破坏细胞内源代谢网络，降低细胞生长性能，延长发酵周期，最终降低葡萄糖二酸的产量，而且还需要人为参与控制并添加昂贵的诱导剂。因此，对INO1的表达进行延时调控，使胞内代谢流在细胞生长前期仅用于细胞快速生长，当细胞浓度达到一定阈值后，再自动开启INO1的表达合成肌醇很有必要。
发明内容
[0009] 本发明提供了一种更为精简有效的蛋白延时表达开关，仅依靠巧妙组合大肠杆菌细胞内已有元件(启动子和蛋白降解标签)即可实现针对目标蛋白的延时表达，该蛋白延时表达开关对于降低细胞负荷、减少实验工作量具有重要意义。同时申请人将该蛋白延时表达开关应用到葡萄糖二酸的生产中，通过利用蛋白延时表达开关，使胞内代谢流在细胞生长前期仅用于细胞快速生长，当细胞浓度达到一定阈值后，再自动开启INO1的表达合成肌醇，这种设计避免了人为参与控制和昂贵诱导剂的使用，可以有效缩短发酵周期，对于提高葡萄糖二酸合成效率或者生产类似化学品具有重要价值。
[0010] 本发明的第一个目的是提供一种蛋白延时表达开关，该系统通过组合使用生长期关联启动子PrpsL和C末端降解标签SsrA，实现对靶蛋白的动态表达；
[0011] 所述C末端降解标签SsrA包括LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD；
[0012] 所述PrpsL的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；
[0013] 所述LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6所示。
[0014] 在优选的实施方案中，所述靶蛋白为红色荧光蛋白mKate2或肌醇-1-磷酸合成酶INO1，由Ptet启动子(SEQ ID NO.7)控制表达。
[0015] 本发明的第二个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌，引入上述蛋白延时表达开关控制靶蛋白的表达，优选地，所述大肠杆菌敲除了D-半乳糖醛酸异构酶基因uxaC和D-葡糖二酸脱水酶基因gudD，更优选地，所述大肠杆菌为敲除了基因uxaC和基因gudD的E.coli MG1655。
[0016] 本发明所述的基因工程菌的具体代谢路径如图1所示。当菌株处于对数生长期时，生长期启动子由于具有高水平转录的特征，阻遏蛋白tetR尽管具有降解标签，但因tetR合成量大于降解量，胞内仍可以积累tetR，该阻遏蛋白tetR会抑制INO1的表达，使葡萄糖二酸的生产路径暂时关闭，保证细胞正常的生理代谢功能。在进入稳定期后，由于生长期启动子的转录活性大幅下调，tetR的合成速率小于降解速率，因此tetR逐渐被降解，对INO1的抑制逐渐被减弱，INO1逐渐开启表达，进行葡萄糖二酸的生产，实现靶蛋白的延时表达效果。
[0017] 本发明的第三个目的是提供上述基因工程菌的构建方法，包括(1)构建重组表达载体，所述表达载体为p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh，优选p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh；(2)将所述表达载体转化至大肠杆菌；(3)培养转化的大肠杆菌得到基因工程菌。
[0018] 在优选的实施方案中，所述步骤(1)中表达载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh的构建方法为：
[0019] (a)所用的载体pTet-1(GenBank accession number：MK234848)为工程化载体，将合成的生长期启动子PrpsL序列(SEQ ID NO.1)，替换载体pTet-1中原有的Ptet启动子(SEQ ID NO.7)，获得的质粒命名为p15A-PrpsL；
[0020] (b)以商业化质粒pdCas9-bacteria(Addgene Plasmid#44249)为载体扩增基因tetR，并在tetR蛋白的C末端融合上降解标签SsrA(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5)，将融合有降解标签的tetR-SsrA插入至p15A-PrpsL中获得质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA；
[0021] (c)将合成的启动子Ptet片段(SEQ ID NO.7)、B0034RBS片段(SEQ ID NO.9)、以酿酒酵母基因组为模板扩增的基因INO1片段(SEQ ID NO.12)，采用多片段同源重组的方式插入p15A-PrpsL-tetR-SsrA中，构建质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1；
[0022] (d)合成MIOX(SEQ ID NO.10)和Udh(SEQ ID NO.11)两种路径酶的片段，并将片段与组成型启动子PTrc(SEQ ID NO.8)共同融合插入载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1中，构建出质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh。
[0024] 在优选的实施方案中，所述的发酵培养基包括M9无机盐培养基；所述的发酵条件为30℃，200-220rpm，初始OD600为0.04-0.1，发酵40-50h；或发酵条件为30℃，480-530rpm，接种量为5-10％，通气量为1-2vvm，发酵40-50h。
[0025] 本发明的第五个目的是提供上述蛋白延时表达开关或上述基因工程菌在制备葡萄糖二酸或含有葡萄糖二酸产品中的应用。
[0026] 本发明的第六个目的是提供上述蛋白延时表达开关在制备目的蛋白或在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0027] 相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0028] 1、本发明提供了一种蛋白延时表达开关，该蛋白延时表达开关较已有的蛋白延时表达开关设计更为简单，仅依靠理性组合大肠杆菌本源的启动子和降解标签即可实现针对靶蛋白的动态表达，且不需要借助人为控制和外源添加诱导剂，同时靶蛋白的选择范围较为广泛，可为生产有毒蛋白提供新的思路。
[0029] 2、将该方法运用到葡萄糖二酸的生产中，可以实现INO1的延时表达，即当菌株处于对数生长期时，tetR正常表达，阻遏蛋白会抑制INO1的表达，使葡萄糖二酸的生产路径暂时关闭，菌株正常生长；细胞进入稳定期后，阻遏蛋白对INO1的抑制逐渐被减弱，合成目的蛋白肌醇-1-磷酸合成酶，最终实现葡萄糖二酸的生产，该方法对于提高葡萄糖二酸合成效率具有重要价值，对于在微生物发酵生产有机酸方面，也可以提供新的方法以及思路。
[0030] 3、本发明所述的基因工程菌在发酵生产中，选择INO1为靶蛋白，尽管MIOX和Udh被设定为组成型表达，但是由于大肠杆菌中不存在肌醇-1-磷酸的合成路径，因此在细胞快速生长期，碳流主要用于细胞生长，仅当细胞进入稳定期后，INO1自动表达，代谢流才用于葡萄糖二酸的生产。整个生产过程中路径酶的表达不需要借助人为控制和外源添加昂贵诱导剂，降低了生产成本和下游纯化成本；在不添加肌醇的情况下，引入本发明蛋白延时表达开关的大肠杆菌MG1655利用葡萄糖为底物，葡萄糖二酸产量达到1.6g/L，具有较好的应用前景。附图说明
[0031] 图1：本发明所述的基因工程菌代谢路径示意图；
[0032] 图2：实施例1中大肠杆菌中5种降解标签降解速率柱状图；
[0033] 图3：实施例2中含红色荧光蛋白mKate2测试菌株构建示意图；
[0034] 图4：实施例2中含蛋白延时表达开关菌株G1-G5以及对照组G6(添加/不添加诱导剂脱水四环素ATC)的荧光蛋白的过程曲线；
[0035] 图5：实施例4中含蛋白延时表达开关葡萄糖二酸生产菌株G7-G11(分别含有降解标签LAA、DAS+4、DAS+8、GSD或DAS)，Control组菌株G12和空质粒菌株G13，在摇瓶水平发酵中葡萄糖二酸(GA)的产量柱状图以及OD柱状图。
具体实施方式
[0037] 以下将结合具体实施方式详细说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。
[0038] 以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法，并实现相应的结果。
[0039] 本实施例中所使用的酶(包括BamHI限制性内切酶、XhoI限制性内切酶等)、DNA Marker及相关试剂盒均购于大连Takara Bio公司，实施例中所使用的引物合成及测序服务在苏州金唯智科技有限公司完成。质粒构建采用经典分子生物手段进行，多片段重组实验所使用的同源重组试剂盒购置于南京诺唯赞生物科技有限公司。
[0040] 荧光过程曲线测定：控制环境温度30度，在细胞培养过程中连续取样1mL，稀释至细胞密度OD600＝0.3，采用SpectraMax M3微孔板酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)进行测定。
[0042] 本实施例所用的发酵培养基为M9无机盐培养基，成分包含葡萄糖40g/L、微量元素液1mL/L、灭菌后补加MgSO4·7H2O 0.25g/L。微量元素液的配置方法为FeCl3·6H2O 2.4g/L、CoCl2·6H2O 0.3g/L、CuCl20.15 g/L、ZnCl2·4H2O 0.3g/L、NaMnO4 0.3g/L、H3BO3 0.075g/L、MnCl2·4H2O 0.5g/L，溶于0.1M HCl中配制。
[0043] 发酵样品制备：取发酵液样品，12,000rpm离心5min，取上清液稀释10倍后，过0.22μm水系膜过滤，滤液作为用来液相色谱分析。
[0044] 葡萄糖二酸含量的测定：高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器)，采用伯乐Aminex HPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度0.005M的H2SO4，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温35℃，在紫外检测波长210nm下检测。
[0045] 实施例1降解标签强度的表征
[0046] 对于降解标签的降解速率的测定，利用常规CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除E.coli MG1655菌株的蛋白酶基因ClpP，构建蛋白酶缺陷型菌株。同时将编码本源的ClpP蛋白酶的基因插入于质粒pTet-1质粒中，构建诱导型蛋白酶质粒。分别将5种不同降解标签SsrA(LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD)融合到绿色荧光蛋白GFP(SEQ ID NO.14)的C末端，并插入商业型质粒PTrcHisA中，构建报告质粒。
[0047] 将报告质粒和蛋白酶质粒采用热激转化法，共转化至蛋白酶缺陷型菌株中，并在含有10mM乳糖的50mL LB体系中培养。当细胞密度OD600达到0.6时，用200ng/mL脱水四环素ATC诱导ClpP蛋白酶表达。每隔0.5h，取样200μL，测定OD600和荧光强度，单位时间细胞的荧光密度下降值被规定为降解速率。本发明评价了5种蛋白质C末端降解标签SsrA，所得结果可见图2。如图2所示，与不含有降解标签的no-tag组相比，蛋白质C末端融合降解标签SsrA的蛋白，其降解速率都大幅提高。
[0048] 实施例2蛋白延时表达开关的构建及其评估
[0049] 构建p15A-PrpsL-tetR-SsrA，其具体步骤如下：
[0050] (1)所用的载体pTet-1(GenBank accession number：MK234848)为工程化载体，将合成的生长期启动子PrpsL序列(SEQ ID NO.1)，替换载体pTet-1中原有的Ptet启动子(SEQ ID NO.7)，获得的质粒命名为p15A-PrpsL；
[0051] (2)以商业化质粒pdCas9-bacteria(Addgene Plasmid#44249)为载体扩增基因tetR，并在tetR蛋白的C末端融合上降解标签SsrA(LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD，SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6)，将融合有降解标签的tetR-SsrA插入至p15A-PrpsL中获得质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA；
[0052] 将合成的含有Ptet启动子序列(SEQ ID NO.7)、B0034RBS序列(SEQ ID NO.9)和红色荧光蛋白mKate2序列(SEQ ID NO.13)，利用多片段重组试剂盒，采用多片段同源重组的方式分别插入含有五种降解标签的质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA中，依次构建出p15A-PrpsL-tetR-LAA-Ptet-mKate2、p15A-PrpsL-tetR-DAS-Ptet-mKate2、p15A-PrpsL-tetR-DAS+4-Ptet-mKate2、p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-mKate2、p15A-PrpsL-tetR-GSD-Ptet-mKate2质粒，含红色荧光蛋白mKate2测试菌株构建示意图如图3所示。同时，构建了不含有ssrA降解标签的对照组，即将B0034RBS序列和红色荧光蛋白mKate2序列分别插入Ptet-1质粒中，构建了重组质粒Ptet-mKate2。
[0053] 将上述获得的系列重组质粒采用热激转化法导入感受态细胞E.coli JM109(购自上海泽叶生物科技有限公司)中，获得共6株评估菌株，命名为G1-G6，具体见下表1。
[0054] 表1荧光测试菌株的构建情况
[0055]
[0056]
[0057] 在LB培养基中，使用SpectraMax M3微孔板酶标仪对上述菌株G1-G6进行连续荧光测定，其中，对照菌株G6分别在添加/不添加诱导剂脱水四环素ATC的条件下进行测定，得到下表2所述结果，具体荧光过程曲线见图4。在无诱导剂脱水四环素ATC添加的情况下，在菌株对数生长期前期，荧光蛋白的积累量非常低，而当菌株进入对数生长期后期，荧光蛋白的积累量快速增加，最佳组合为含有启动子PrpsL和LAA降解标签的G1菌株，其最大荧光密度值达到了对照组的85％(表2)，而对照菌株G6在无诱导剂脱水四环素ATC添加的情况下不能正常表达mKate2蛋白。上述结果表明，在不添加诱导剂的条件下，红色荧光蛋白在引入蛋白延时开关的大肠杆菌中实现了延时表达。
[0058] 表2六种菌株的荧光结果
[0059]
[0060] 实施例3葡萄糖二酸基因工程菌株的构建
[0061] 选择E.coli MG1655(购自上海泽叶生物科技有限公司)为底盘工程菌，为了防止葡萄糖二酸的水解，参考文献Proc Natl Acad Sci U S A,2018,115(12):2964-2969中的方法，利用常规CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除宿主菌的D-半乳糖醛酸异构酶基因uxaC和D-葡糖二酸脱水酶基因gudD，获得G13菌株。
[0062] 1)构建重组表达载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh：
[0063] (a)所用的载体pTet-1(GenBank accession number：MK234848)为工程化载体，合成生长期启动子PrpsL序列(SEQ ID NO.1)，替换载体pTet-1中原有的Ptet启动子，获得的质粒命名为p15A-PrpsL；
[0064] (b)以商业化质粒pdCas9-bacteria(Addgene Plasmid#44249)为载体扩增基因tetR，并在tetR蛋白的C末端融合上降解标签SsrA(LAA、DAS、DAS+4、DAS+8或GSD，SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6)，将融合有降解标签的tetR-SsrA插入至p15A-PrpsL中获得五种质粒(p15A-PrpsL-tetR-LAA、p15A-PrpsL-tetR-DAS、p15A-PrpsL-tetR-DAS+4、p15A-PrpsL-tetR-DAS+8、p15A-PrpsL-tetR-GSD)；
[0065] (c)将合成的启动子Ptet片段、B0034RBS片段、以酿酒酵母基因组为模板扩增的基因INO1(SEQ ID NO.12)片段采用多片段同源重组的方式插入步骤(a)构建的五种质粒载体中，获得质粒p15A-PrpsL-tetR-LAA-Ptet-INO1、p15A-PrpsL-tetR-DAS-Ptet-INO1、p15A-PrpsL-tetR-DAS+4-Ptet-INO1、p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1、p15A-PrpsL-tetR-GSD-Ptet-INO1；
[0066] (d)合成MIOX(SEQ ID NO.10)和Udh(SEQ ID NO.11)两种路径酶的片段，并将上述两个片段与组成型启动子PTrc(SEQ ID NO.8)采用多片段同源重组的方法插入步骤(c)构建的五种质粒载体中，最终共构建出五种生产葡萄糖二酸所需的质粒p15A-PrpsL-tetR-LAA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh、p15A-PrpsL-tetR-DAS-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh、p15A-PrpsL-tetR-DAS+4-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh、p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh、p15A-PrpsL-tetR-GSD-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh。
[0067] 2)同时，为了证明蛋白延时表达开关的优势，设计构建了组成型表达INO1、MIOX、Udh等三种路径酶的质粒p15A-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh：
[0068] (a)将INO1基因片段，采用酶切连接的方法(XhoI+BamHI)插入载体pTet-1中，获得的质粒命名为p15A-Ptet-INO1；
[0069] (b)采用多片段同源重组的方式将组成型启动子PTrc、MIOX基因片段、Udh基因片段同时组装到质粒p15A-Ptet-INO1中，获得新质粒p15A-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh。
[0070] 3)分别将步骤1)获得的表达载体p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh、步骤2)获得的质粒p15A-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh转化至大肠杆菌并混合培养得到目标基因工程菌：
[0071] 从LB平板上挑取新活化的G13单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃，过夜培养。将该菌株悬液以1％的接种比例，转接至25mL液体培养基中，37℃，振荡培养3h至OD600＝0.5。
[0072] 将菌液转入50mL离心管中，冰上静置10min。4℃，4000rpm离心5min，弃上清，使用预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上静置20min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，加入2mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上静置10min，按照每个离心管分装0.1mL感受态细胞，完成菌株G13的感受态细胞的制备。
[0073] 每0.1mL感受态细胞中加入10ng质粒p15A-PrpsL-tetR-SsrA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh，混匀后冰上放置30min。将离心管中含有的感受态细胞放置于42℃水浴90s，将离心管快速转移至冰浴，静置3min。每管加入0.8mL液体LB培养基，37℃，振荡复苏1h后均匀涂于含有终浓度100mg/L氨苄青霉素的LB平板中，37℃，静置培养。获得的菌株G7-G12的详情可见下表3。
[0074] 表3葡萄糖二酸生产菌株的构建
[0075] 菌株编号 生长期启动子 SsrA 重组质粒G7 PrpsL LAA p15A-PrpsL-tetR-LAA-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G8 PrpsL DAS+4 p15A-PrpsL-tetR-DAS+4-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G9 PrpsL DAS+8 p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G10 PrpsL GSD p15A-PrpsL-tetR-GSD-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G11 PrpsL DAS p15A-PrpsL-tetR-DAS-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G12(Control组) 无 无 p15A-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G13(空质粒) 无 无 无
G8 PrpsL DAS+4 p15A-PrpsL-tetR-DAS+4-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G9 PrpsL DAS+8 p15A-PrpsL-tetR-DAS+8-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G10 PrpsL GSD p15A-PrpsL-tetR-GSD-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G11 PrpsL DAS p15A-PrpsL-tetR-DAS-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G12(Control组) 无 无 p15A-Ptet-INO1-PTrc-MIOX-Udh
G13(空质粒) 无 无 无
[0076] 实施例4葡萄糖二酸基因工程菌株在摇瓶中的葡萄糖二酸生产情况
[0077] 分别测试实施例3制备的基因工程菌株G7-G11、Control菌株G12和空质粒菌株G13在摇瓶中的葡萄糖二酸生产情况。种子在25mL的LB培养基中37℃培养过夜，然后以2％的接种量转接至50/250mL的M9无机盐培养基，控制初始OD600为0.04-0.1。30℃，200rpm培养，所有菌株培养阶段均未添加诱导剂，发酵周期为48h。取样测定细胞密度OD600和胞外代谢物葡萄糖二酸的浓度。所得摇瓶发酵结果如图5所示，空质粒菌株G13由于没有葡萄糖二酸合成路径，只能积累细胞生物量，OD600达到5.71，但无法检测到葡萄糖二酸。直接表达三种路径酶的G12菌株由于葡萄糖二酸路径抢夺细胞生长所需碳流，导致细胞生长受到严重抑制，OD600仅为0.96，最终葡萄糖二酸产量<0.1g/L。相比之下，引入蛋白延时表达开关的动态表达菌株G7-G11，葡萄糖二酸GA产量提高了6.5到12.7倍，生物量增加了3.3到5.0倍，其中，菌株G9(含有DAS+8降解标签)可以积累1.16g/L葡萄糖二酸，OD600为3.68。
[0078] 实施例5葡萄糖二酸基因工程菌株在发酵罐中葡萄糖二酸生产情况
[0079] 取实施例5中的G9菌在5L发酵罐中进行发酵培养。首先，接种菌株G9到50毫升，含有30mg/L氯霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm条件下培养12h。然后，收集种子液并离心弃上清，使用初始葡萄糖浓度为25g/L的M9无机盐培养基重悬，并以5％的初始接种量，接种至含有2L M9无机盐培养基的发酵罐中，发酵全程采用自动流加30％氨水和2M盐酸的方式维持pH值在7，培养温度恒定30℃，转速500rpm，通气量1vvm，发酵周期为48h。当发酵进行至24h时，加入20g/L葡萄糖，共补加100g葡萄糖。如图6所示，发酵结束时，葡萄糖二酸积累量达1.6g/L。
[0081] 表4生长期启动子的核苷酸或降解标签的氨基酸序列
[0082]
[0083]
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