技术领域：
[0001] 本
发明涉及
酿酒酵母及酿酒技术领域，特别涉及一种产香酵母及产香酵母在枸杞果酒中的应用。背景技术：
[0002]
发酵枸杞酒的
酿造是一个复杂的
微生物学过程，微生物的代谢产物直接影响着酒的色泽、口感、香气，枸杞中有效成分的保留。在影响果酒品质的众多因素中，枸杞品种、发酵工艺、发酵设备以及发酵微生物这四方面因素的相互作用最终决定了枸杞酒的品质。工业生产中，当枸杞品种和发酵工艺、发酵设备一旦确定，获得优良品质的发酵枸杞酒，所选用的酵母就变得至关重要，选用特定的产香酵母进行枸杞果酒的发酵和酿造工艺的重新设定也变得至关重要，所以将特定的产香酵母应用到枸杞果酒的酿造中的酿造工艺技术需要有待进一步的研发。发明内容：
[0003] 有鉴于此，有必要提供一种产香酵母。
[0004] 还要必要提供一种产香酵母酿造枸杞果酒的方法。
[0005] 一种产香酵母，产香酵母菌株是一种通过枸杞种植园或枸杞果酒生产场所取样，将样品在YDP培养基中培养，然后进行分离、筛选和纯化获得的纯种的产香酵母菌株GF-85。
[0006] 产香酵母培养过程中，培养液包括重量百分比为93％～96％的YDP培养基、重量百分比为1％～3％的
葡萄糖、重量百分比为1％～3％的蛋白胨和重量百分比为1％的酵母粉，如果产香酵母为固体酵母，培养液中加入重量百分比为2％～3％的琼脂；
[0007] 产香酵母培养用样品是针对不同时节、枸杞不同树龄、不同从枸杞树品种的果园
土壤、枸杞鲜果中采取的样品；
[0008] 果园土壤及枸杞鲜果表面和干枸杞表面酵母的分离纯化和保藏的过程为：增菌，取5.0g样品于45ml YPD液体培养基中，在
温度为28℃，转速为200r/min摇瓶培养24～48h，直至液体培养基变浑浊，镜检有活菌存在后进一步分离纯化；计数，将增菌培养好的浑浊菌液摇匀，用灭菌生理盐
水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释，菌液逐级稀释后选择10-5、10-6和10-7三个梯度，分别吸取0.1ml样品稀释液均匀涂布于加有30mg/L亚
硫酸钠以抑制细菌生长的YPD培养基平板上，在温度为28℃的环境下培养48h；分离，选取2天后生长于YPD培养基上的单个菌落，观察其菌落形态、编号并进行镜检；美兰
染色观察菌落是否为纯菌落，描述细胞形态，是否有
真菌丝、真菌丝是否有隔离；选取具有酵母菌特征的菌株保存，同时采集图像；第一次镜检不纯的菌落在
酸化PDA培养基上划线培养，直到镜检为纯菌落时，与第一次镜检为纯菌的菌落全部再次划线培养，培养2天后取单菌落镜检观察，仍然为纯菌的斜面划线保存；保藏，镜检为纯种后进行斜面保藏，每隔2个月转接一次；同时进行甘油-
40℃菌种长期保藏；
[0009] 枸杞自然发酵酵母菌的分离纯化和保藏的过程为：自然发酵液中酵母的分离，无菌状态下称量约100g成熟的枸杞鲜果，然后将枸杞鲜果放入无菌的500ml锥形瓶中，用无菌的研锤捣碎，用
封口膜封好，置于28℃培养，每隔2小时观察一次；计数，在发酵前、中、后三个时期，分别提取汁液用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释，菌液逐级稀释后选择10-5，10-6和10-7三个梯度，分别吸取0.1ml样品稀释液均匀涂布于酸化PDA培养基上，在温度为28℃的环境下培养48h；分离，选取2天后生长于PDA培养基上的单个菌落，观察其菌落形态、编号并进行镜检；美兰染色观察菌落是否为纯菌落，描述细胞形态，是否有真菌丝、真菌丝是否有隔离；选取细胞较大的、具有酵母菌特征的菌株保存，同时采集图像；第一次镜检不纯的菌落在酸化PDA培养基上划线培养，直到镜检为纯菌落时，与第一次镜检为纯菌的菌落全部再次划线培养，培养2天后取单菌落镜检观察，仍然为纯菌的斜面划线保存；保藏，镜检为纯种后进行斜面保藏，每隔2个月转接一次；同时进行甘油-40℃菌种长期保藏。
[0010] 果园土壤及枸杞鲜果表面和干枸杞表面酵母的分离纯化和保藏的过程和枸杞自然发酵酵母菌的分离纯化和保藏的过程中所用的PDA培养基的制备过程为：土豆去皮洗净，称取200g
马铃薯切成小
块，加水煮沸后，继续煮20分钟～30分钟，然后用玻璃棒戳破，用双层纱布过滤，加热，再根据实际实验需要向煮熟的土豆中加入1克～10克琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，然后冷却后在补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，在温度为121℃的环境下灭菌18分钟～22分钟，然后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
[0011] 一种采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法，包括以下工艺步骤：
[0012] 步骤一，鉴定产香酵母GF-85的归属，然后接种产香酵母GF-85，并记录产香酵母GF-85发酵时间，测评其耐酒精、耐糖、耐二
氧化
碳的性能；接种产香酵母GF-85到BIGGY培养基上，培养并观察培养基
颜色对产
硫化氢做定性检测，选出发酵性能较好的菌株测定生长曲线；
[0013] 步骤二，将枸杞干果清洗沥干水分，加入枸杞干果重量的10倍的纯净水制成枸杞果汁，然后分离提取枸杞果汁；
[0014] 步骤三，将枸杞果汁入罐并添加果胶酶和二氧化硫进行发酵；
[0015] 步骤四，按照产香酵母GF-85的生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85，并接入枸杞发酵醪液中；
[0016] 步骤五，接入产香酵母GF-85后，在添加提前活化好的酿酒酵母启动酒精发酵；
[0017] 步骤六，酒精发酵启动48小时后，再次补糖，补充添加营养剂继续发酵直到含糖量小于4g/L,发酵结束分离酒脚；
[0018] 步骤七，最后澄清过滤、杀菌、瓶装。
[0019] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法的步骤一中，根据产香酵母GF-85在WL培养基上生长的不同菌落形态及颜色来鉴定酵母菌归属，利用带有杜氏管的YDP液体培养基分别加入重量百分比为2％酒精、重量百分比3％葡萄糖和重量百分比为2％的亚硫酸，接种定量的产香酵母GF-85，记录其发酵时间，测评其耐酒精、耐糖、耐二氧化硫的性能；接种GF-85到BiGGY培养基上，培养并观察培养基颜色对产硫化氢做定性检测；选出发酵性能较好的菌株测定生长曲线。
[0020] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法的步骤二中，采用成熟度良好的宁夏中宁枸杞干果，粒选剔除生靑果和霉烂果并用纯净水喷淋冲洗、沥干，加入枸杞干果重量的10倍纯净水制成果浆并提汁。
[0021] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法的步骤三中，枸杞汁入罐后向罐中添加30～50g/吨果胶酶、40～60ppm的6％二氧化硫。
[0022] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法的步骤四中，首先对罐中的成分进行调整，加入白砂糖和
柠檬酸调整枸杞发酵醪液成分使枸杞醪液的含糖量达到150g/l，PH值为3.5～4，然后按照产香酵母GF-85的生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85，并接入枸杞发酵醪液中。
[0023] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法的步骤五中，接入产香酵母0-4天后再按照200g/t的添加量添加提前活化好的AC商用酿酒酵母启动酒精发酵,产香酵母GF-85是在商用酿酒酵母AC接入前2天接入的，接入量与AC酵母接种量为1:1。
[0024] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法中的步骤六中，酒精发酵启动48小时后再次加入70g/l的白砂糖并添加发酵助剂100g/吨，监测比重变化，待比重降至0.996，糖含量≤4g/l发酵结束分离酒脚。
[0025] 上述采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法中的步骤七中，利用皂土和明胶复合下胶，依次倒入，边倒边搅匀，在18℃～22℃澄清放置15d，用0.45μm微孔滤
膜过滤，过滤后将酿造好的枸杞果酒与商用酵母AC单菌种发酵的枸杞果酒对比品评和理化指标。
[0026] 上述枸杞果酒的酿造方法中所用的产香酵母GF-85也可用其他果香酵母替代。
[0027] 本发明开发出了一种新型的产香酵母GF-85，该菌株适用于多数品种的枸杞果发酵，利于枸杞果酒香气的改善，品质的提升。将本发明提供的产香酵母应用到枸杞果酒的酿造中，大大提高了枸杞果酒的品质。与未添加产香酵母GF-85的枸杞果酒相比，枸杞果酒所含物质的种类增加16种，其中脂类物质增加8种，丰富了产品的香气。
[0028] 产香酵母菌是指存在于酒精发酵初期2-3天,随后便由于
乙醇毒性而消亡,而后,酿酒酵母菌开始繁殖,直至成为酒精发酵过程中的单一菌株。尽管产香酵母菌仅仅在酒精发酵初期存在,但是却对枸杞果酒的品质具有重要影响,对枸杞果酒的感官
质量做出了重大贡献，且产香酵母菌具有产多种胞外
水解酶的能
力。这些酶可以
加速酒的澄清和过滤、利于果汁色素的浸提以及芳香物质的释放和酒体的
稳定性。高品质的枸杞果酒很大程度取决于香气和口感，而香气的主要来源是枸杞本身和发酵过程中产生的香气，但是相比较其他的果酒原料，枸杞果酒所用的原料自身的果香并不突出加之枸杞果酒酿造前需对枸杞果表面进行清洗，损失了枸杞果表面的产香酵母，且在后期工艺处理未对这一缺失进行弥补，导致生产的枸杞果酒酒体单薄、香气特征不明显、
风格不突出等问题影响枸杞果酒的品质。因此，本发明在果酒酿造过程中添加合适的产香酵母，以弥补其
缺陷提高枸杞果酒的质量。
附图说明：
[0029] 图1为产香酵母GF-85。具体实施方式：
[0030] 本发明提供的产香酵母菌株是一种通过枸杞种植园或枸杞果酒生产场所取材经过培养、分离、筛选和纯化获得的纯种的产香酵母菌株GF-85，该菌株在WL培养基上的菌落颜色为深绿色；菌落形态平坦，表面光滑、不透明，黄油状；
显微镜下为梭形菌落，其细胞形态见图附图1。对该菌株进行产硫化氢实验，在BIGGY培养基上培养60h呈无色，颜色越浅硫化氢越少；经耐受性实验得出：在二氧化硫浓度在250mg/l以下、糖浓度在300g/l以下，温度35摄氏度以下的各种环境中发酵48小时，酵母生长旺盛。
[0031] 本发明中，产香酵母菌株的样品的具体采集过程为：
[0032] 针对不同时节、枸杞不同树龄、不同从枸杞树品种的果园土壤、枸杞鲜果进行
采样。表一为采样信息，其中每一个编号均分为土样、枸杞样及自然发酵样三种。通过对菌种资源的探寻，为枸杞发酵果酒专用酵母菌株的筛选奠定
基础，同时酵母菌种的筛选亦可在除酿酒以外的其他领域得到应用。
[0033] 表一，枸杞样品相关信息
[0034]
[0035] 本发明中对产香酵母分离纯化的具体过程为：
[0036] 配备培养基，所用培养基为YDP培养基，YDP培养基按重量百分比为葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％和蒸馏水配置，自然PH值，121℃高压灭菌20min；固体培养基则加入2％琼脂粉。
[0037] 所用的PDA培养基的具体配备过程为：土豆去皮洗净，称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂，煮沸20分钟～30分钟，能被玻璃棒戳破即可，用双层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加1g～10g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后在补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，在温度为121℃下灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。
[0038] 具体的实验方法为：
[0039] 一，土壤及枸杞果表面和干枸杞表面酵母的分离：
[0040] 增菌，取5.0g样品于45ml YPD液体培养基中，28℃、200r/min摇瓶培养24～48h或更长时间，直至液体培养基变浑浊，镜检有活菌存在后进一步分离纯化。
[0041] 计数，将增菌培养好的浑浊菌液摇匀，用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释。菌液逐级稀释后选择10-5、10-6、10-7、三个梯度，分别吸取0.1ml样品稀释液均匀涂布于加有30mg/L亚硫酸钠的YPD培养基平板上，28℃培养48h，亚硫酸钠用于抑制细菌的生长。
[0042] 分离，选取2天后生长于YPD培养基上的单个菌落，仔细观察其菌落形态、编号并进行镜检。美兰染色观察菌落是否为纯菌落，描述细胞形态，是否有真菌丝、真菌丝是否有隔离。选取细胞较大的、具有酵母菌特征的菌株保存，同时采集图像。第一次镜检不纯的菌落在酸化PDA培养基上划线培养，直到镜检为纯菌落时，与第一次镜检为纯菌的菌落全部再次划线培养，培养2天后取单菌落镜检观察，仍然为纯菌的斜面划线保存。为了进一步验证单个菌落的纯度，可将单个菌落第三次划线。
[0043] 保藏，镜检为纯种后进行斜面保藏，每隔2个月转接一次；同时进行甘油-40℃菌种长期保藏。
[0044] 二，枸杞自然发酵酵母菌的分离：
[0045] 自然发酵液中酵母的分离，无菌状态下称量约100g新鲜成熟度好的枸杞，放入无菌的500ml锥形瓶中，用无菌的研锤捣碎，用封口膜封好，置于28℃培养，每隔2小时观察一次。
[0046] 计数，在发酵前、中、后三个时期，分别提取汁液用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释，菌液逐级稀释后选择10-5，10-6，10-7三个梯度，分别吸取0.1ml样品稀释液均匀涂布于酸化PDA培养基上，28℃培养48h。
[0047] 分离，选取2天后生长于PDA培养基上的单个菌落，仔细观察其菌落形态、编号并进行镜检。美兰染色观察菌落是否为纯菌落，描述细胞形态，是否有真菌丝、真菌丝是否有隔离。选取细胞较大的、具有酵母菌特征的菌株保存，同时采集图像。第一次镜检不纯的菌落在酸化PDA培养基上划线培养，直到镜检为纯菌落时，与第一次镜检为纯菌的菌落全部再次划线培养，培养2天后取单菌落镜检观察，仍然为纯菌的斜面划线保存。为了进一步验证单个菌落的纯度，可将单个菌落第三次划线。
[0048] 保藏，镜检为纯种后进行斜面保藏，每隔2个月转接一次；同时进行甘油-40℃菌种长期保藏。
[0049] 测定产香酵母GF-85的生长曲线，其在发酵5小时后酵母大量繁殖并在18小时达到最大值。经酵母菌的ITS区分子鉴定，属于葡萄汁有孢汉逊酵母，鉴定序列结果为：GTTGCTCGAGTTCTTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGAAGATGTGCGCTTAATTGCGCTGCTTCTTTAGAGTGTCGCAGTGAAAGTAGTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGCTACACACATTGGAGTTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCGAAAGGTTCAAGGCAAAAAACAAACACAAACAATTTTATTTTATTATAATTTTTTAAACTAAACCAAAATTCCTAACGGAAATTTTAAAATAATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTTTTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAAAGATAATTTATTATTTTTTGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAATTGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCGCTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAACGTACCTTAGGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAA。
[0050] 产香酵母培养过程中，培养液包括重量百分比为93％～96％的YDP培养基、重量百分比为1％～3％的葡萄糖、重量百分比为1％～3％的蛋白胨和重量百分比为1％的酵母粉，如果产香酵母为固体酵母，培养液中加入重量百分比为2％～3％的琼脂。
[0051] 本发明提供了三种产香酵母GF-85在枸杞果酒中的三种应用方式。
[0052] 应用方式一，采用产香酵母GF-85酿造枸杞果酒的方法，包括以下工艺步骤：
[0053] 步骤一，根据产香酵母GF-85在WL培养基上生长的不同菌落形态及颜色来鉴定酵母菌归属，利用带有杜氏管的YDP液体培养基分别加入重量百分比为2％酒精、重量百分比3％葡萄糖和重量百分比为2％的亚硫酸，接种定量的产香酵母GF-85，记录其发酵时间，测评其耐酒精、耐糖、耐二氧化硫的性能；接种GF-85到BiGGY培养基上，培养并观察培养基颜色对产硫化氢做定性检测；选出发酵性能较好的菌株测定生长曲线；
[0054] 步骤二，采用成熟度良好的宁夏中宁枸杞干果，粒选剔除生靑果和霉烂果并用纯净水喷淋冲洗、沥干，加入枸杞干果重量的10倍纯净水制成果浆并提汁；
[0055] 步骤三，将枸杞果汁入罐并添加果胶酶和二氧化硫进行发酵；枸杞汁入罐后向罐中添加30～50g/吨果胶酶、40～60ppm的6％二氧化硫；
[0056] 步骤四，按照产香酵母GF-85的生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85，并接入枸杞发酵醪液中；首先对罐中的成分进行调整，加入白砂糖和柠檬酸调整枸杞发酵醪液成分使枸杞醪液的含糖量达到150g/l，PH值为3.5～4，然后按照产香酵母GF-85的生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85，并接入枸杞发酵醪液中；
[0057] 步骤五，接入产香酵母GF-85后，在添加提前活化好的酿酒酵母启动酒精发酵；接入产香酵母0-4天后再按照200g/t的添加量添加提前活化好的AC商用酿酒酵母启动酒精发酵；产香酵母GF-85是在商用酿酒酵母AC接入前2天接入的，接入量与AC酵母接种量为1:1；
[0058] 步骤六，酒精发酵启动48小时后，再次补糖，补充添加营养剂继续发酵直到含糖量小于4g/L,发酵结束分离酒脚；酒精发酵启动48小时后再次加入70g/l的白砂糖并添加发酵助剂100g/吨，监测比重变化，待比重降至0.996，糖含量≤4g/l发酵结束分离酒脚；
[0059] 步骤七，最后澄清过滤、杀菌、瓶装，利用皂土和明胶复合下胶，依次倒入，边倒边搅匀，在18℃～22℃澄清放置15d，用0.45μm微孔滤膜过滤，过滤后将酿造好的枸杞果酒与商用酵母AC单菌种发酵的枸杞果酒对比品评和理化指标。
[0060] 上述枸杞果酒的酿造方法中所用的产香酵母GF-85也可用其他果香酵母替代。
[0061] 上述枸杞果酒的酿造方法中所用的设备包括LDZX-50FBS型高压灭菌锅，BCN-1360型微生物超净
工作台，DNP-9272-1A型恒温恒湿
培养箱，BP121S
电子天平，DCB-476FDGJ型海尔
冰箱，HH.B.11.500型电热恒温水浴箱，XS-212-202型
光学显微镜，BPG-9240A型干燥箱，722S型可见光分光光度计，FD-2型密封式恒温可调电炉，FP-C4027型移液枪。
[0062] 应用方式二，产香酵母菌株GF-85的筛选及应用包括以下步骤：
[0063] 分离纯化：分别从枸杞果园土壤、枸杞鲜果表面、自然发酵枸杞液、枸杞
酒糟分离酵母菌，经纯化后，进行保藏。同时对分离酵母菌进行三级筛选。菌种来源于宁夏中宁枸杞种植园，宁杞一号枸杞自然发酵液中，经过培养、分离、三级筛选、纯化获得的。对该菌株进行产硫化氢实验，在BIGGY培养基上培养60h呈无色(颜色越浅硫化氢越少)；经耐受性实验得出：在二氧化硫浓度在250mg/l以下、糖浓度在300g/l以下，温度35摄氏度以下的各种环境中发酵48小时，酵母生长旺盛。测定产香酵母GF-85的生长曲线，其在发酵5小时后酵母大量繁殖并在18小时达到最大值。经酵母菌的ITS区分子鉴定，属于葡萄汁有孢汉逊酵母，鉴定序列结果为：GTTGCTCGAGTTCTTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGAAGATGTGCGCTTAATTGCGCTGCTTCTTTAGAGTGTCGCAGTGAAAGTAGTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGCTACACACATTGGAGTTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCGAAAGGTTCAAGGCAAAAAACAAACACAAACAATTTTATTTTATTATAATTTTTTAAACTAAACCAAAATTCCTAACGGAAATTTTAAAATAATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTTTTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAAAGATAATTTATTATTTTTTGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAATTGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCGCTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAACGTACCTTAGGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAA
[0064] 生理生化鉴定：根据酵母菌在WL培养基上生长的不同菌落形态及颜色来鉴定酵母菌归属。
[0065] 发酵性能研究：利用带有杜氏管的YDP液体培养基分别加入酒精、葡萄糖、亚硫酸等使之形成一定的浓度，接种定量的产香酵母，记录其实发酵时间，测评其耐酒精、耐糖、耐二氧化硫的性能；接种GF-85到BiGGY培养基上，培养并观察培养基颜色对产硫化氢做定性检测；选出发酵性能较好的菌株测定生长曲线。
[0066] 浸提：采用成熟度良好的宁夏中宁枸杞干果，粒选剔除生靑果和霉烂果并用纯净水喷淋冲洗、沥干，加入10倍纯净水复水提汁；
[0067] 预处理：枸杞汁入罐并添加30-50g/吨果胶酶、40-60ppm的6％二氧化硫。
[0068] 成分调整：加入白砂糖和柠檬酸调整枸杞发酵醪液成分使含糖量达到150g/l，PH值在3.5-4.0.
[0069] 产香发酵：按照GF-85生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85接入枸杞发酵醪液中
[0070] 酒精发酵：接入产香酵母0-4天后再按照200g/t添加提前活化好的AC商用酿酒酵母启动酒精发酵。产香酵母与商用酿酒酵母AC同时接入，接入量为AC酵母接种量的3倍。
[0071] 二次补糖：酒精发酵启动48小时后再次加入70g/l的白砂糖并添加发酵助剂100g/吨，监测比重变化，待比重降至0.996，糖含量≤4g/l发酵结束分离酒脚。
[0072] 澄清过滤：利用皂土和明胶复合下胶，依次倒入，边倒边搅匀，在18-22℃澄清放置15d，用0.45μm微孔滤膜过滤。
[0073] 与商用酵母AC单菌种发酵的枸杞果酒对比品评和理化指标。
[0074] 应用方式三，一种产香酵母GF-85及其在枸杞果酒酿造中的应用，其特征主要在于该菌株的筛选及应用包括以下步骤：
[0075] 分离纯化：分别从枸杞果园土壤、枸杞鲜果表面、自然发酵枸杞液、枸杞酒糟分离酵母菌，经纯化后，进行保藏。同时对分离酵母菌进行三级筛选。菌种来源于宁夏中宁枸杞种植园，宁杞一号枸杞自然发酵液中，经过培养、分离、三级筛选、纯化获得的。该菌株在WL培养基上的菌落颜色为深绿色；菌落形态平坦，表面光滑、不透明，黄油状；显微镜下为梭形菌落。对该菌株进行产硫化氢实验，在BIGGY培养基上培养60h呈无色(颜色越浅硫化氢越少)；经耐受性实验得出：在二氧化硫浓度在250mg/l以下、糖浓度在300g/l以下，温度35摄氏度以下的各种环境中发酵48小时，酵母生长旺盛。测定产香酵母GF-85的生长曲线，其在发酵5小时后酵母大量繁殖并在18小时达到最大值。经酵母菌的ITS区分子鉴定，属于葡萄汁有孢汉逊酵母，鉴定序列结果为：GTTGCTCGAGTTCTTGTTTAGATCTTTTACAATAATGTGTATCTTTATTGAAGATGTGCGCTTAATTGCGCTGCTTCTTTAGAGTGTCGCAGTGAAAGTAGTCTTGCTTGAATCTCAGTCAACGCTACACACATTGGAGTTTTTTTACTTTAATTTAATTCTTTCTGCTTTGAATCGAAAGGTTCAAGGCAAAAAACAAACACAAACAATTTTATTTTATTATAATTTTTTAAACTAAACCAAAATTCCTAACGGAAATTTTAAAATAATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATACTCGTGAATCATTGAATTTTTGAACGCACATTGCGCCCTTGAGCATTCTCAGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAAAGATAATTTATTATTTTTTGGTTGTGGGCGATACTCAGGGTTAGCTTGAAATTGGAGACTGTTTCAGTCTTTTTTAATTCAACACTTAGCTTCTTTGGAGACGCTGTTCTCGCTGTGATGTATTTATGGATTTATTCGTTTTACTTTACAAGGGAAATGGTAACGTACCTTAGGCAAAGGGTTGCTTTTAATATTCATCAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAA
[0076] 生理生化鉴定：根据酵母菌在WL培养基上生长的不同菌落形态及颜色来鉴定酵母菌归属。
[0077] 发酵性能研究：利用带有杜氏管的YDP液体培养基分别加入酒精、葡萄糖、亚硫酸等使之形成一定的浓度，接种定量的产香酵母，记录其实发酵时间，测评其耐酒精、耐糖、耐二氧化硫的性能；接种GF-85到BiGGY培养基上，培养并观察培养基颜色对产硫化氢做定性检测；选出发酵性能较好的菌株测定生长曲线。
[0078] 浸提：采用成熟度良好的宁夏中宁枸杞干果，粒选剔除生靑果和霉烂果并用纯净水喷淋冲洗、沥干，加入10倍纯净水复水提汁；
[0079] 预处理：枸杞汁入罐并添加30-50g/吨果胶酶、40-60ppm的6％二氧化硫。
[0080] 成分调整：加入白砂糖和柠檬酸调整枸杞发酵醪液成分使含糖量达到150g/l，PH值在3.5-4.0。
[0081] 产香发酵：按照GF-85生长曲线菌株达到对数期最高点所需的时间提前活化好所需的产香酵母GF-85接入枸杞发酵醪液中。
[0082] 酒精发酵：接入产香酵母0-4天后再按照200g/t添加提前活化好的AC商用酿酒酵母启动酒精发酵。产香酵母是在商用酿酒酵母AC接入前4天接入的，接入量与AC酵母接种量为1:1。
[0083] 二次补糖：酒精发酵启动48小时后再次加入70g/l的白砂糖并添加发酵助剂100g/吨，监测比重变化，待比重降至0.996，糖含量≤4g/l发酵结束分离酒脚。
[0084] 澄清过滤：利用皂土和明胶复合下胶，依次倒入，边倒边搅匀，在18-22℃澄清放置15d，用0.45μm微孔滤膜过滤。
[0085] 与商用酵母AC单菌种发酵的枸杞果酒对比品评和理化指标。
