新型酿酒酵母菌株
阅读：827发布：2020-05-11
专利汇可以提供新型酿酒酵母菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述一种用于产生酿酒 酵母 菌株的方法，这种 酿酒酵母 菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木 酮 糖激酶的基因并且具有改进的 乙醇 产量、改进的木糖转化率、降低的木糖醇产量以及改进的 抑制剂 耐受性。该方法包括以连续模式，用一种基本上仅包含木糖作为 碳 源的培养基，在25°C-38°C、优选地30°C-35°C的 温度 以及0.040vvm-0.055vvm的气流下，培养一种酿酒酵母菌株，增加稀释率来维持恒定细胞 水 平，所述细胞水平通过光学 密度 或等效分析手段测定在1.5-3.0范围内，并且向这些细胞中加入至少一种抑制剂并且逐渐地增加所述抑制剂的加入量。此外，描述通过根据本 发明 的方法所获得的多种酿酒酵母菌株。，下面是新型酿酒酵母菌株专利的具体信息内容。
1.一种具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量的酿酒酵母菌株，其中所述菌株是保藏号为CBS 128138的Taurus 03。
2.一种具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率、降低的木糖醇产量以及增加的抑制剂耐受性的酿酒酵母菌株，其中所述菌株是保藏号为CBS128139的Taurus 04。
3.一种具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率、降低的木糖醇产量以及增加的抑制剂耐受性的酿酒酵母菌株，其中所述菌株是保藏号为CBS128140的Taurus 07。
4.一种根据权利要求1-3中任一项所述的菌株用于将木质纤维原料发酵为乙醇的用途。
5.一种根据权利要求1-3中任一项所述的菌株用于将玉米芯水解产物和甘蔗渣水解产物发酵为乙醇的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述甘蔗渣水解产物的浓度为20％、50％或75％。
7.一种根据权利要求1-3中任一项所述的菌株用于同时糖化和发酵(SSF)工艺中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，用于玉米芯浆料、桦树浆料和小麦秸秆浆料的发酵。
新型酿酒酵母菌株
[0001] 本发明技术领域
[0002] 本发明涉及一种用于产生酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率、降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性。本发明另外涉及通过根据本发明的方法可获得的多种酿酒酵母菌株。
背景技术
[0003] 关于使用石油作为汽车燃料的环境问题以及还有当今油井将来将被耗尽的危险已引起了关于使用石油的替代方案的深入研究。已发现乙醇是一种石油的良好替代物，因为它在很大程度上可以代替石油使用而不会引起内燃机的重大改变。现今可以在对发动机作非常小的调节或甚至在根本不对发动机作任何调节的情况下使用乙醇代替一些燃料。
[0004] 酵母菌属（Saccharomyces）菌株广泛用于供酿造、蒸馏、烘烤以及不同的其他应用的工业中。鉴于酿酒酵母将糖（如葡萄糖和蔗糖）转化为生物质并且将这些糖发酵为乙醇的能力，酿酒酵母是工业应用中使用最广泛的微生物之一。鉴于酿酒酵母菌株相当迅速地将糖转化成乙醇的能力并且由于酿酒酵母与细菌和其他酵母相比对发酵抑制剂和乙醇具有更佳耐受性，酿酒酵母菌株被用于燃料工业中。WO2005/111214披露了具有增加的在抑制剂（如糠醛和5-甲氧基糠醛）存在下产生乙醇的能力的酿酒酵母菌株。
[0005] 与细菌和若干个酵母种类不同，野生型酿酒酵母不能使用戊糖（如木糖和阿拉伯糖）作为碳源。酿酒酵母利用丰富碳源（如来自其他工艺的侧 流和废料，如来自例如玉米和甘蔗渣的农业废料以及来自例如造纸的废料）生长的能力具有巨大的环境价值以及还有经济价值。农业废弃物包含相当大部分的半纤维素，这种半纤维素包含许多不同的糖单体。举例来说，除葡萄糖以外，这些糖单体还可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖以及阿拉伯糖。木糖是含量最大的糖单体并且因此代表一种用于使用酵母制造乙醇的重要碳源，提供了巨大的经济和环境优点。
[0006] 提供使用木糖作为碳源的能力的基因编码酶先前已被引入酿酒酵母中。EP 1 282686披露了具有被并入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且已经受特异性突变的重组酿酒酵母菌株。所述菌株具有将木质纤维素原料发酵为乙醇的能力。EP 1 282 686中所保藏的菌株是CBS102679（TMB3400，Taurus01）并且在现有技术中总体上被认为是有效的。由菌株CBS102679产生的乙醇已被认为与其他现有技术重组酵母相比是非常好的，但还产生所不希望的副产物木糖醇。因此，鉴于当今社会逐渐增加的环境问题，在本领域内仍需要提供具有甚至更佳乙醇产量、更佳木糖转化率以及更低木糖醇产量的新型酿酒酵母菌株。此外，希望提供具有甚至更佳抑制剂耐受性的菌株。
[0007] 发明概述
[0008] 因此，本发明的目的是解决上述问题并且提供具有更佳木糖转化率、更佳乙醇产量、更低副产物木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性的新颖酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株具有基本上仅使用木糖作为碳源来产生乙醇的能力。
[0009] 根据本发明的一个第一方面，使用一种用于产生酿酒酵母菌株的方法来解决这一问题，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量，这种方法包括以下步骤：
[0010] a)以连续模式，用一种基本上仅包含木糖作为碳源的培养基，在25°C-38°C、优选地30°C-35°C的温度以及0.01vvm-0.06vvm的气流下， 培养具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因的酿酒酵母细胞，并且增加稀释率以维持恒定细胞水平，所述细胞水平通过光学密度或等效分析手段测定在1.5-3.0范围内，[0011] b)并且添加至少一种抑制剂到这些细胞中并且逐渐增加所述抑制剂的添加。
[0012] 重要步骤是维持生物反应器中的细胞水平恒定。当已进化出改进的细胞时，这些改进的细胞可以以通过稀释率设定的特定生长速率更佳地利用底物，改进的结果是将形成更多个细胞。这意味着为保持选择压力，需要生长速率增加，生长速率增加是通过增加稀释率来获得的。
[0013] 根据本发明的一个实施例，步骤a)的该培养基包含15g/l-25g/l的木糖、优选地约20g/l的木糖。
[0014] 在又一个实施例中，该方法另外包括步骤
[0016] 温度的增加丰富了针对应力具有更高耐受性的细胞的数目。
[0017] 所用气流取决于所用酵母菌株的特性。在呼吸道代谢情况下，要求更多空气，例如在木糖代谢情况下。一旦乙醇产生已开始，则要求更少的空气并且反而可能为了使乙醇代谢的选择压力增加而减少。
[0018] 木糖消耗能力可能被视为由两种组成部分构成，输入速率以及在何种浓度下可以有效地进行输入，即对木糖的亲和力。当木糖为唯一碳源时，输入速率与生长速率紧密相关，即木糖曲线降低的有多快。如果木糖曲线到达接近于零，即所有木糖均已被使用，那么木糖亲和力为良好的。
[0019] 对于有效的木糖转化能力，另外应将所输入的木糖的碳导入乙醇中而不是木糖醇中并且尽可能少的导向细胞形成。本发明的菌株具有改进的输入速率与木糖亲和力两者。
[0020] 在另一个实施例中，将改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量与以CBS102679（TMB3400，Taurus01）保藏的菌株相比。 在另一个实施例中，如上述方法的步骤a)中所用的这些细胞为如所保藏的CBS102679的菌株的细胞。在步骤a)中用作起始材料的所述酿酒酵母细胞具有被引入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，以使这种酵母能够发酵木糖。这些基因可以从可以分离这些基因的任何来源获得。举例来说，编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶的基因可以从树干毕赤酵母（Pichia stipitis）获得，而编码木酮糖激酶的基因可以从酿酒酵母获得。
[0021] 在一个实施例中，该方法另外包括步骤
[0022] d)从步骤b)或从步骤c)选择具有木糖转化能力以及抑制剂耐受性的细胞。
[0023] 根据另一个实施例，在具有木糖作为基本上唯一碳源和/或所述至少一种抑制剂或任何其他抑制剂的琼脂板上进行该选择。也有可能在具有任何碳源以及所述至少一种抑制剂或任何其他抑制剂的琼脂板上进行选择。因此，这种菌株可以对付具有不同类型抑制剂的环境，这些抑制剂不仅仅是用于本发明方法中以便使菌株具有抑制剂耐受性的特定一者。
[0024] 为获得改进的抑制剂耐受性木糖发酵酵母菌株，重要的是保持木糖转化的选择压力与抑制剂耐受性两者。因为葡萄糖是一种优选的酿酒酵母碳源，所以这种糖的存在抑制了木糖的选择压力。这已在获得抑制剂耐受性的同时降低木糖转化能力的一些实验中被注意到。因此，大多数类型的水解产物（典型地包含大量葡萄糖）不能用于根据本发明的方法中。因此，为了产生本发明的一种菌株，应提供一种实验室培养基（基本培养基或合成培养基），这种培养基具有木糖作为在抑制剂（如合成混合物）存在下的基本上唯一碳源或作为主要降解的水解产物，这种水解产物的抑制剂含量高而糖含量低，重要的是葡萄糖和甘露糖的水平应非常低。
[0026] 本发明另外涉及一种酿酒酵母菌株，这种酿酒酵母菌株具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量，其中所述菌株是保藏号为CBS128138的Taurus03。
[0027] 在另一个实施例中，本发明还涉及一种酿酒酵母菌株，这种酿酒酵母菌株具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性，其中所述菌株是保藏号为CBS128139的Taurus04。
[0028] 在一个实施例中，本发明还涉及一种酿酒酵母菌株，这种酿酒酵母菌株具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性，其中所述菌株为保藏号为CBS128140的Taurus07。
[0029] 本发明的所有菌株均已保藏在荷兰3584CT乌特勒支市乌普萨拉8号的真菌生物多样性中心（CBS）（Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS),Uppsalalaan8,3584CT Utrecht,the Netherlands）。
[0030] 保藏号为CBS128138的酿酒酵母Taurus03已于2010年10月26日保藏。
[0031] 保藏号为CBS128139的酿酒酵母Taurus04、保藏号为CBS128140的酿酒酵母Taurus07已于2010年10月26日保藏。在此也提到的酿酒酵母Taurus10CBS128141已于2010年11月2日保藏。
[0032] 本发明的另一个实施例是通过本发明方法获得的一种菌株用于将木质纤维素原料发酵为乙醇的用途。所用的木质纤维素原料可以是可供使用的任何类别。实例为农业残余物，包括玉米秸秆和甘蔗渣；木材残余物，包括锯木厂和造纸厂丢弃物；以及城市用纸废弃物。
[0033] 本发明的另一个实施例是通过本发明方法获得的一种菌株在同时糖化和发酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）工艺中的用途。
[0035] 现将通过实例参考所附图式详细描述本发明。
[0036] 图1：实例1中描述的在使用基本培养基的连续培养中在适应期间由稀 释率反映-1的生长特性的改进。在第一部分（蓝线，起始于0.025稀释率，h ）中使用木糖作为唯一碳-1
源，而在第二部分（红线，起始于0.05稀释率，h ）中将温度增加到35°C并且以增加的水-1
平将甘蔗渣（绿线，起始于0稀释率，h ）掺混到培养基中。
源，而在第二部分（红线，起始于0.05稀释率，h ）中将温度增加到35°C并且以增加的水-1
平将甘蔗渣（绿线，起始于0稀释率，h ）掺混到培养基中。
[0037] 图2：实例2中描述的在使用基本培养基的反复摇瓶培养中在适应期间最大特定生长速率的改进。第一部分（菱形）具有20g/l的木糖而第二部分（方形）具有5g/l。在来自第10轮的第二部分中，展示系列D。
[0038] 图3：在使用基本培养基以及木糖作为唯一碳源的摇瓶培养中的木糖消耗（方形）以及乙醇（叉号）和细胞（菱形）形成。细胞浓度以650nm下的光学密度（OD）形式评估。图3a为Taurus02，图3b为Tarurus03，图3c为Taurus07，图3d为Taurus04，图3e为Taurus08，图3f为Taurus09，图3g为Taurus10。
[0039] 图4：在使用基本培养基的厌氧生物反应器培养中的葡萄糖（方形）和木糖（三角形）消耗以及生物质（菱形）、乙醇（叉号）和木糖醇（星形）的形成。代表性培养一式两份展示。图4a为Taurus01，图4b为Tarurus03，图4c为Taurus09，图4d为Taurus10。
[0040] 图5：在使用玉米芯液的厌氧摇瓶培养中由第一代木糖菌株（Taurus03（菱形）和Taurus09（三角形））进行的木糖消耗，分别与由这些菌株进化的第二代木糖菌株（Taurus04（方形）和Taurus10（叉号））相比较。
[0041] 图6：在利用7.5%WIS的桦树浆料以及5FPU/g WIS的纤维素降解酶的SSF实验中，底物葡萄糖（菱形）、木糖+甘露糖+半乳糖（方形，Xyl-Man-Gal），产物乙醇（圆圈）、木糖醇（叉号），以及呋喃抑制剂HMF（星形）和糠醛（三角形）的浓度曲线。图6a为Taurus01并且6b为Taurus03。
[0042] 图7：在2h后起始的使用Taurus04并且使用葡萄糖进料的玉米芯液的分批进料发酵中，葡萄糖（菱形）、半乳糖（三角形）、木糖（方形）、乙醇（黑色圆圈）以及木糖醇（橙色圆圈）的总量的曲线。
[0043] 图8：在具有12种抑制剂的混合物的YPD琼脂板上测试的连续稀释系 列。每一个圆圈对应于一次稀释并且越向右稀释倍数越大。
[0044] 图9：在摇瓶培养中使用酿酒酵母Taurus03、Taurus04、Taurus07以及Taurus10的甘蔗渣水解产物的厌氧发酵。
[0045] 图10：利用小麦秸秆浆料使用Taurus07的SSF（同时糖化和发酵）实验。
[0046] 图11：在一种工业示范规模发酵设备中，在玉米芯残余浆料的水解产物中（图11a）以及在玉米芯残余浆料结合SSF工艺中（图11b）使用酿酒酵母菌株Taurus04的发酵。
[0047] 图12：在菌株Taurus01、Taurus03、Taurus04、Taurus07、Taurus09以及Taurus10利用木糖生长期间对不同浓度的乙酸盐和HMF的耐受性。
[0048] 图13：使用Taurus04的C5发酵中的糖消耗（图13a），使用Taurus04的经过水解的C6固体的发酵中的消耗/产生曲线（图13b）以及使用Taurus04的经过水解的C6固体的发酵中的消耗/产生曲线（图13c）。
[0049] 图14：使用Taurus04菌株的C5材料和C6固体的同时糖化和发酵
[0050] 优选实施方式的详细描述
[0051] 当进行本发明的实验时，除非另外指明，否则使用常规微生物工艺。此类工艺为本领域普通技术人员已知的并且在文献中已有充分解释。
[0052] 此外，本申请中使用的所有技术术语均具有普通技术人员通常所理解的含义。
[0053] 在例如植物生物质中木糖丰富以及使用酵母（如酿酒酵母）利用木糖作为碳源产生乙醇的可能性已引起这一技术领域内的深入研究。然而，木糖转化率有时不良，从而导致不良的乙醇产量。此外，副产物木糖醇的产量已相当大。
[0054] 本发明的诸位发明人已鉴于上述问题出人意料地开发出具有更有效的木糖转化以及因此更佳乙醇产量的改进的酿酒酵母菌株。此外，已观察到更低的副产物木糖醇产量。此外，这些改进的菌株已针对在许多木质纤维 水解产物中发现的多种抑制剂具有更佳耐受性。
[0055] 应注意，能够使用木糖作为基本上唯一碳源的菌株也能够利用其他糖生长。短语“基本上唯一碳源”的含义意味着还可以存在痕量的其他糖。可以存在葡萄糖并且它通常首先被酿酒酵母转化，因为它对酵母来说是优选的糖。此后，使用木糖作为碳源。
[0056] 已使用已为人所知的保藏号为CBS102679的称为XYLUSM125、TMB3400或Taurus01的酿酒酵母菌株实现了酿酒酵母的这些所希望的特征。在这一菌株中，已引入了编码提供使用木糖作为基本上唯一碳源的能力的酶类的基因。作为一个替代方案，根据本发明可以使用具有使用木糖作为基本上唯一碳源的能力的其他酿酒酵母菌株。本发明的这些菌株可以以工业菌株以及实验室菌株的形式执行功能，即使工业菌株为优选的。工业菌株与实验室菌株相比更不好确定，因为它具有每一染色体的若干个拷贝。因此，如已根据本发明进行的操作工业菌株与操作实验室菌株相比是一项更大的挑战。
[0057] 根据本发明的具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性的菌株是使用非重组方法获得的。这意味着不利用重组DNA技术来获得具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性的菌株。然而，使用重组DNA技术来获得例如可以用作根据本发明的起始材料的菌株TMB3400（Taurus01）。根据本发明的重组DNA技术是指活体外操作遗传信息的多种技术，而非重组方法并不利用这种活体外操作。
[0058] 根据本发明，已实现了所希望的特征，因为在酿酒酵母的培养中在特定条件期间突变被选择（通常在生长期间发生并且可能因紫外辐射而增加）并且富集，即定向进化/适应或进化工程。定向进化的程序可以划分成三个步骤：首先使突变发生，此后通过在培养中施加选择压力来选择所希望的性状，以及最后根据图谱特性筛选/表征所获得的菌株。
[0059] 在正常生长期间出现突变，因为在DNA被复制并且转移到下一代中的复制过程期间在遗传密码中可能发生一些错误。突变发生的机率可以因某 些化学品或紫外辐射而增加。这些突变可以改变细胞蛋白的特性，使得有机体存活的可能性增加或降低。
[0060] 术语“选择”是指“适应”过程，在该过程中，具有改进的所希望的特征的细胞在群体中富集。这是通过在培养中通过设计生长条件使得所希望的特性对微生物的存活和性能有益来施加选择压力而实现的，这种选择压力可以选自大量不同的条件。至于本发明，选择压力可以通过使木糖作为基本上唯一碳源、使抑制剂存在或增加温度来实现。另外，通过培养模式实现不同的选择压力。温度增加可以使具有更高整体应力耐受性的细胞富集。非常重要的是选择和施加允许逐渐形成所希望的特性的适当选择压力。在相同适应中或在后续培养中，可以一起施加某些选择压力。典型地，根据本发明，可以在液体培养基中或在琼脂板上进行培养。在液体培养中，在适应进展期间改进的细胞的比例增加并且被视为混合群体的性能的改进，至于本发明，这种改进由改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量来反映。
[0061] 重要的是，应在许多代期间继续进行适应，以允许出现适合的突变并且在细胞群体中富集。当在琼脂板上进行选择时，典型地在足以使得细胞具有生长并且形成菌落的能力的时间期间培育细胞。在琼脂板上出现的更大的菌落指示具有改进的在所施加的条件下生长的能力的细胞，相比较而言，更小的菌落显示较差的能力。
[0062] 在本文中，短语“新一代”意味着如本领域普通技术人员所理解的细胞已分成两个新的细胞并且这两个新的细胞代表新一代。在本文中，细胞继续生长许多代并且直到与前几代相比在新一代中不再能观察到任何表型变化，即表型变化保持恒定。表型变化的实例为例如细胞的最大特定生长速率。这可以通过测量光学密度来测量。其他可以观察到的表型变化为例如乙醇生产率、木糖转化率以及副产物木糖醇的产量。当这些组成部分保持在恒定水平时，不再观察到表型变化。
[0063] 此外，术语“筛选”是指一种以可比较方式将细胞的性能表征的过程。筛选方法应显示反映细胞的所希望特性的性能并且可以在琼脂板上或在液体培养基中进行。因此，可以识别具有改进的所希望特征的细胞并且用 于其他特性的进一步表征。
[0064] 因此，根据本发明，提供了一种用于产生酿酒酵母菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量以及改进的抑制剂耐受性。
[0065] 此外，提供了通过根据本发明的该方法可获得的多种酿酒酵母菌株。
[0066] 下文为用于获得根据本发明的改进的酿酒酵母菌株的实例。所有工作均以菌株TMB3400（Taurus01）起始，该菌株先前已显示非常好的关于木糖转化能力的性能以及相当低的木糖醇产量（松德雷格（Sonderegger）等人，2006，哈恩-哈格达尔等人，2007）。然而，如先前所陈述，也可以使用其他酿酒酵母菌株，只要它具有发酵木糖的能力即可。通过本发明，已出人意料地有可能产生关于木糖转化和乙醇产生甚至更有效的酿酒酵母菌株。还已观察到更低的副产物木糖醇产量。因此，如根据本发明所获得的菌株可以用于发酵不同的木质纤维材料或来自玉米或甘蔗渣的废料，这些材料除葡萄糖以外还包含相当大量的木糖。有待于用于此类发酵工艺中的更有效的菌株将具有巨大的经济价值和环境价值。
[0067] 如在实验部分中将可见，本发明的菌株与现有技术菌株相比已显示出关于乙醇产生、木糖消耗、木糖醇产生以及抑制剂耐受性的优越性。
[0068] 实例1
[0069] 使用连续培养的木糖转化能力以及抑制剂和温度耐受性的改进
[0070] 使用菌株Taurus01起始定向适应系列并且在一个生物反应器（1l中约750ml工作体积，瑞典贝拉奇生物技术公司（Belach Bioteknik AB,Sweden））中在连续培养中进行，这个生物反应器具有与根据威尔顿（Verduyn）所用相比具有2倍高痕量金属溶液以及0.1ml/l的PEG P2000作为消泡剂（在生物反应器培养中）的基本培养基（威尔顿等人，1992）。用2M NaOH将pH值控制在5.0并且将搅拌器速度设定在350rpm。为起始培养，将50ml具有20g/l木糖和20g/l葡萄糖的接种物（在250ml振 荡培养瓶（baffled shake flask）中，培育24h-36h，30°C，在180rpm下振荡）添加到生物反应器（具有基本培养基以及20g/l木糖和20g/l葡萄糖，总体积800ml，无气体流入）中。进行培养持续15h-20h，然后起始连续模式，其中使仅具有20g/l木糖作为碳源的培养基流入并且以一根溢流管测定流出量。在培养结束时测定精确培养物体积并且为740ml-780ml。在每一工作日测量650nm下的光学密度（OD）作为细胞密度的一个量度。定期获取用于测量细胞外代谢物的样本（也来自培养基烧瓶）以及有待冷冻保存（添加1ml细胞悬浮液到0.5ml无菌60%甘油中，储存在-80°C下）的细胞的等分试样。使用HPLC（戴安公司（Dionex），Ultimatum3000，在
35°C下折射率检测（RI detection），在210nm下紫外检测，在45°C下的来自伯乐公司（BioRad）的管柱；AminexHPX-87H和30mm×4.6mm阳离子-H麦克洛-加德（micro-guard），洗脱剂5mM H2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物。使用一个显微镜用眼睛定期检查培养物，发现不存在污染。
35°C下折射率检测（RI detection），在210nm下紫外检测，在45°C下的来自伯乐公司（BioRad）的管柱；AminexHPX-87H和30mm×4.6mm阳离子-H麦克洛-加德（micro-guard），洗脱剂5mM H2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物。使用一个显微镜用眼睛定期检查培养物，发现不存在污染。
[0071] 适应的第一部分是在30°C以及35ml/min的气流下进行。目的是将OD保持在2-2.5的值。OD水平增加指示生长特性的改进并且因此可以增加流速以施加更高的选择压力。相对应地，如果见到OD水平降低，那么选择压力过高并且因此需要降低流速。因此，流速增加（或根据稀释率重新计算）是细胞性能增加的一个量度。15代之后，将反应器中的温度增加到35°C-45°C持续24h，并且从培养物中回收细胞，保存冷冻的等分试样并且将一个样本在一个木糖琼脂板（20g/l木糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物以及20g/l琼脂）上划线。将该温度处理后所获得的一个菌株命名为Taurus02。使用来自琼脂板的细胞起始新的连续培养。进行培养持续77代，在这期间可见稀释率增加（图1）并且将最后的菌株命名为Taurus03。因此，这一菌株属于第一代木糖菌株。
[0072] 适应系列的第二部分是在13ml/min的气流下进行并且施加另外的选择压力。首先，将生物反应器中的温度增加到35°C（分批与连续阶段均如此）并且其次以增加的水平将有毒甘蔗渣掺混到培养基中。使用预处理（使用2%SO2，约190°C）制备这种甘蔗渣水解产物（在瑞典SEKAB E-技术公 司（SEKAB E-technology,Sweden）），这种预处理进行较长时间（停留时间13min-15min），产生具有低糖水平（4g/l葡萄糖、5g/l木糖、0.4g/l半乳糖）以及高抑制剂含量的略有降解的水解产物。在每次制备培养基时，用5M NaOH将有待使用的等分试样的水解产物的pH值调节到5.0。首先在仅含木糖的基本培养基上进行培养持续21代以允许细胞适应更高的温度。接着进行培养持续总共120代。在培养进展期间可见稀释率增加，但当增加培养基中的甘蔗渣含量时生长更慢，并且因此需要降低稀释率（图1）。然而，随着这些代的持续进行，在某一甘蔗渣含量下可见稀释率提高（图1）。
[0073] 在定向进化方案结束时，获得第二代木糖菌株并且进行进一步表征。将倒数第三个菌株命名为Taurus04并且使用最后两个菌株（命名为Taurus05和Taurus06）来选择在适应期间所获得的异质细胞群体的特殊抑制剂耐受性克隆。用无菌水以十倍稀释系列稀释细胞的样本。将每一稀释液10μl滴在一个具有12种所选抑制剂的合成混合物的琼脂板（20g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、20g/l琼脂）上。这些抑制剂是以如下浓度存在：2.5g/l羟甲基糠醛、0.82g/l糠醛、4.7g/l乙酸、0.9g/l甲酸、1.8g/l乙酰丙酸、0.10g/l香草醛（vanillin）、0.03g/l松柏醛（coniferyl aldehyde）、0.75mg/l肉桂酸、15mg/l氢醌、82mg/l丁香醛（syringaldehyde）、15mg/l4-羟基苯甲酸以及15mg/l4-羟基-3-甲氧基苯基丙酮（愈创木基丙酮（guaiacyl acetone））。培育这些板直到可见一些更大的菌落。将来自这些菌落的细胞（一个菌落为Taurus05，3-4个菌落为Taurus06）在甘蔗渣板（50%有毒甘蔗渣、20g/l葡萄糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、20g/l琼脂）上再划线并且在30°C下培育两天并且在室温下培育四天。将若干个更大的菌落在新的甘蔗渣板上再划线并且再培育2+4天。将来自这些板的每一菌株的六个最大菌落分别在木糖基本培养基板上划线。在30°C下培育七天后，使用每一菌株的9-10个最大菌落在富含木糖的培养基（20g/l木糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物）中起始小型培养（10ml于50ml离心管中），使这些菌落生长过夜并且随后用于制备冷冻的细胞储备液，产生命名为Taurus07和Taurus08的菌株。
[0074] 实例2
[0075] 使用反复摇瓶培养的木糖转化能力的改进
[0076] 使用从TMB3400（Taurus01）发展成的Taurus02菌株作为使用重复分批培养的定向适应方案的起始菌株。在摇瓶培养中，在30°C以及180rpm的搅拌下在具有50ml基本木糖培养基（威尔顿等人，1992）的100ml烧瓶中进行培养，该基本木糖培养基具有pH5.5以及与根据威尔顿所用相比2倍高痕量的金属溶液。适应方案的第一部分是在培养基中使用20g/l木糖进行。进行每一次培养直到当生长开始停止时650nm下的光学密度（OD）达到1.8-3的值，接着将细胞的等分试样转移到下一轮的具有新鲜培养基的烧瓶中，得到0.07的起始OD。在第7轮中，性能被改进到一定程度，使得第8轮的起始OD降低到0.06，第9-10轮为0.05并且第11-13轮为约0.02。总共进行13次培养，在适应方案期间允许
73代并且将这些轮中7轮的细胞冷冻保存（将1ml细胞悬浮液添加到0.5ml无菌60%甘油中，储存在-80°C下）。在这些培养之后测量OD并且由这些OD计算最大特定生长速率（图
2）并且测量每一次培养在开始时以及在转移到下一轮时的细胞外代谢物。使用HPLC（戴安公司，Ultimatum3000，在35°C下折射率检测，在210nm下紫外检测，在45°C下的来自伯乐公司的管柱；AminexHPX-87H和30mm×4.6mm阳离子-H麦克洛-加德，洗脱剂5mMH2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物，并且这些结果显示转移时木糖水平相当高，约12g/l-16g/l，并且因此对下一部分进行该适应。将最后的菌株命名为Taurus09并且因此与Taurus03一起为另一种第一代木糖菌株。这一菌株在适应条件下具有改进约三倍的最大特定生长速率（图2）。
73代并且将这些轮中7轮的细胞冷冻保存（将1ml细胞悬浮液添加到0.5ml无菌60%甘油中，储存在-80°C下）。在这些培养之后测量OD并且由这些OD计算最大特定生长速率（图
2）并且测量每一次培养在开始时以及在转移到下一轮时的细胞外代谢物。使用HPLC（戴安公司，Ultimatum3000，在35°C下折射率检测，在210nm下紫外检测，在45°C下的来自伯乐公司的管柱；AminexHPX-87H和30mm×4.6mm阳离子-H麦克洛-加德，洗脱剂5mMH2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物，并且这些结果显示转移时木糖水平相当高，约12g/l-16g/l，并且因此对下一部分进行该适应。将最后的菌株命名为Taurus09并且因此与Taurus03一起为另一种第一代木糖菌株。这一菌株在适应条件下具有改进约三倍的最大特定生长速率（图2）。
[0077] 根据菌株Taurus09在具有5g/l木糖的培养基中差的性能，与在独立培养中均选择为10g/l相比，在适应的第二部分中将木糖浓度选择为5g/l。在这一适应中，在OD2.8-3下进行细胞转移并且起始OD为0.1（除了起始OD为0.01的最初四轮）并且如前所述追踪OD和代谢物。在对应于47代的9轮期间继续进行适应。因为在此时看到的特定生长速率改进有限（图2），所以将培养物分成四个部分。两个部分用紫外光照射以增加突变数，并且两个部分不经任何处理就转移到下一轮中。对于紫外处理，使用具有 基本木糖培养基的琼脂板，并且将细胞铺展于4个经过干燥的琼脂板上。使用来自紫外线产品有限公司（Ultra-Violet Products Ltd.）的一个TFM-26V、P/N95-0422-02、25瓦高效紫外透照器使两个板暴露于紫外光，其中波长为302nm，设定于高强度，持续60秒并且两个板持续90秒。立即从这些板中收集细胞并且用于起始适应系列中的新的培养。将暴露60与90秒的细胞一起用于新的摇瓶培养中。将紫外处理和未经处理的细胞均用于在正常条件和氧气有限的条件下起始培养，参见下表。
[0078]
[0079] 这些氧气有限的条件是通过使用一个特殊摇瓶来实现的。这种氧气有限的烧瓶是由一个具有多个档板以及两个臂的250ml摇瓶构成。一个空气过滤器（来自伊孚森公司（INFORS HT）的过滤器21978）与这些臂之一连接，并且一根在外部末端具有一个注射器的橡胶管与另一个臂连接用于取样。所有开口均以石蜡膜密封。将这些适应系列进行14-15轮，除了在第二轮中细胞死亡的系列B。在这一最后部分期间所获得的代的数目为系列A83，系列C68以及系列D89。在适应继续进行期间定期冷冻保存细胞（如上文所描述制备）。系列D的最后的菌株显示最佳性能并且被选择为第二代木糖菌株并且命名为Taurus10。这一菌株在适应中在低木糖水平下具有改进约5倍的最大特定生长速率（图2）。
[0080] 实例3
[0081] 在不同条件下菌株关于木糖发酵能力的表征
[0082] a)使用基本培养基并且木糖作为唯一碳源的摇瓶培养
[0083] 所应用的第一类型的表征是使用基本培养基并且仅木糖作为碳源的摇瓶培养。在100ml烧瓶中的50ml培养基中进行培养并且通过添加来自冷冻的储备液的细胞起始，获得
0.01的OD。在30°C以及180rpm（这在这些烧瓶中产生半好氧条件）下培育培养物，并且追踪细胞和代谢物浓度。
0.01的OD。在30°C以及180rpm（这在这些烧瓶中产生半好氧条件）下培育培养物，并且追踪细胞和代谢物浓度。
[0084] 进行这种类型表征的菌株：
[0085] · Taurus02
[0086] · Taurus03
[0087] · Taurus07
[0088] · Taurus08
[0089] · Taurus09
[0090] · Taurus10
[0091] 来自两种类型的定向进化方案的第一代木糖菌株（Taurus03和Taurus09）已实现了更快的最大特定生长速率，而第二代木糖菌株仅稍有改进（表1，图3）。这些菌株具有向乙醇产生偏移的代谢类型并且因此形成更少的细胞。因此，可以推断出，另外考虑到所有改进的菌株均可以使用更大部分的木糖，木糖发酵更有效。在这方面的最佳菌株Taurus10可以使用超过90%的木糖并且因此这一菌株产生最高乙醇水平4.2g/l。在抑制剂耐受性菌株Taurus07与Taurus08之间未发现木糖发酵差异。
[0092] 表1.在使用基本培养基并且木糖作为唯一碳源的摇瓶培养期间的生长速率、产量、木糖的残余水平以及最大乙醇浓度。Taurus02、Taurus07、Taurus10以一式两份培养形式进行，Taurus03为一式三份，并且这些培养的结果以一个范围的形式给出。
[0093]
[0094]
[0095] 所有菌株均以低水平（每消耗一克木糖<0.06g）形成木糖醇
[0096] b)使用矿质培养基并且葡萄糖和木糖作为碳源的厌氧生物反应器培养
[0097] 在一种工业设置中，厌氧性能非常重要并且因此在此类型的培养中进行表征。因为细胞不能以厌氧方式仅仅利用木糖作为碳源来生长（图4），所以使用葡萄糖与木糖的混合物。
[0098] 通过将100μl来自储备培养物的冷冻细胞添加到包含20g/l葡萄糖和20g/l木糖的100ml基本培养基中来制备预培养物。接着在30°C下以好氧方式培育培养物48h，然后对生物反应器进行接种。将生物反应器中用于厌氧培养的培养基补充以0.1ml/l消泡剂（聚丙二醇P2000）、10mg/l麦角固醇以及0.42g/l吐温80（Tween80）。使用工作体积为两升的生物反应器（瑞典贝拉奇生物技术公司）并且通过以0.4l/min将氮气通过发酵器来实现厌氧条件。将温度控制在30°C，用2M NaOH使pH值为5.0，并且搅拌器速度为500rpm。接着添加来自预培养物的细胞，以在生物反应器中达到0.01的起始OD650。在发酵过程期间定期测量OD与干细胞重量两者并且收集细胞外代谢物样本。每一菌株进行一式两份培养，这些培养得到非常类似的结果。
[0099] 进行这种类型表征的菌株：
[0100] · Taurus01
[0101] · Taurus03
[0102] · Taurus09
[0103] · Taurus10
[0104] 还是在厌氧条件期间，对于所有改进的菌株来说木糖发酵均更有效（表2，图4）。两者均可见木糖消耗速率增加并且所有木糖均可以被改进的菌株所消耗。特别是，菌株Taurus10显示快速消耗。伴随由我们的菌株实现的改进的乙醇形成还可见降低的副产物木糖醇的形成。对于Taurus03，木 糖醇产量降低多达40%。
[0105] 表2.在厌氧培养中在具有木糖和葡萄糖作为碳源的基本培养基上的产量和木糖消耗。给出一式两份培养的最大偏差。
[0106]
[0107] 本发明的菌株（Taurus03、Taurus09以及Taurus10）与众所周知的Taurus01相比具有更高的乙醇浓度以及更低的木糖醇产量。
[0108] c)在摇瓶培养中玉米芯液的厌氧发酵
[0109] 关于表征中的下一步骤，通过研究在玉米芯水解产物中的发酵来评估实际工业底物中的性能。通过以SO2形式添加的稀酸预处理并且由瑞典SEKAB E-技术公司制成玉米芯。过滤预处理的浆料以获得液体部分。
[0110] 在预培养中，如b中所描述使细胞在具有葡萄糖和木糖的基本培养基上生长，24h后将一些玉米芯液补充到摇瓶中并且使其再培育18h。通过离心收集细胞。为进行发酵，使用补充有0.5g/l(NH4)2HPO4的玉米芯液作为培养基并且将pH值设定为6.0。添加从预培养物中收集（通过离心）的细胞，得到每升3g干重的近似起始细胞密度。使用50ml培养基在100ml摇瓶中在30°C以及180rpm下进行培养物的培育，并且通过使用以甘油填充的气塞获得厌氧条件。在0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h以及96h后获取代谢物样本。
[0111] 进行这种类型表征的菌株：
[0112] · Taurus03
[0113] · Taurus04
[0114] · Taurus09
[0115] · Taurus10
[0116] 表3和图5中的数据清楚地展示第二代木糖菌株Taurus04和Taurus10在96h后与它们各自的亲本菌株Taurus03和Taurus09相比产生更高的最终乙醇浓度和木糖转化率。尽管木糖转化率大，但副产物木糖醇的产量保持在低水平（图5）。
[0117] 表3.在利用玉米芯液的厌氧摇瓶培养中的产物产量、木糖消耗以及最终乙醇水平。进行单一培养。
[0118]
[0119] d)利用玉米芯和桦树浆料的 SSF（同时糖化和发酵）实验
[0120] 乙醇产生的另一种典型工艺为SSF工艺。在这一工艺中，水解酶与酵母一起添加，以同时实现预处理的浆料中的纤维素的分解以及单体糖的发酵。在该工艺中，已使用底物和工艺步骤来尽可能地模拟一种工业情形。在通气的分批进料培养物中进行细胞繁殖。用于繁殖的预培养是在150ml摇瓶中在具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的50ml基本培养基（pH6.0）中进行。以一小部分（100μl冷冻的细胞）起始该预培养并且在一个旋转振荡器中在30°C下进行最佳24h（18h-36h）。在该批次中，培养基（500ml）包含50g/l糖蜜以及23.5g/l(NH4)2SO4、3.0g/l KH2PO4、2.25g/lMgSO4·7H2O以及99μg/l生物素、360ppm维他忽布（Vitahop）（用于抑制细菌的蛇麻子提取物）以及1.2ml/l消泡剂（基于硅，诺普科ENA-309 （Nopcomaster ENA-309），诺普科纸业技术公司（Nopco Paper Technology AB））。添加整个预培养物以起始培养（在莱布孚森生物反应器（Labfors bioreactor）中，伊孚森公司（Infors AS），这一培养是在以下条件下进行：以1vvm通气，用3M NaOH将pH值调节到
5.0，并且搅拌速度为700。进行该批次直到糖被用完（约8h-10h）并且接着起始进料。在即将进行的SSF中使用包含材料的水解产物的进料（pH值调节到5，稀释到对应于7.5%WIS），并且包括糖蜜，从而产生75g/l的总己糖浓度。当分批进料阶段起始时，将搅拌器速度增加到1000rpm并且通气增加到以最终体积体计1.0vvm。进料以0.1h-1的恒定速率增加并且进行20h，从而产生1.5l的最终体积。通过离心（在1800×g下8min）收集细胞并且再悬浮于无菌0.9%NaCl中。利用7.5%WIS并且补充有0.5g/l(NH4)2HPO4、125ppm维他忽布以及
0.4ml/l消泡剂（与繁殖中的相同）的已预处理的木质纤维素材料的浆料（pH5.0，用NaOH调节）进行SSF部分（总培养基1.5kg）。添加已再悬浮于0.9%NaCl中的细胞，得到每升3g干重的最初细胞浓度，并且添加酶（NS-22074或Cellic C-tec2，诺维信（Novozymes）），得到
5FPU/gWIS以起始该工艺。将发酵器（不含档板，莱布孚森）控制在35°C，用3M NaOH将pH值调节到5.0，搅拌器速度为约300rpm-400rpm，并且所有入口均被封闭而穿过冷凝器的出口打开。至少在以下时间获取用于代谢物分析的样本：0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h以及
96h。
5.0，并且搅拌速度为700。进行该批次直到糖被用完（约8h-10h）并且接着起始进料。在即将进行的SSF中使用包含材料的水解产物的进料（pH值调节到5，稀释到对应于7.5%WIS），并且包括糖蜜，从而产生75g/l的总己糖浓度。当分批进料阶段起始时，将搅拌器速度增加到1000rpm并且通气增加到以最终体积体计1.0vvm。进料以0.1h-1的恒定速率增加并且进行20h，从而产生1.5l的最终体积。通过离心（在1800×g下8min）收集细胞并且再悬浮于无菌0.9%NaCl中。利用7.5%WIS并且补充有0.5g/l(NH4)2HPO4、125ppm维他忽布以及
0.4ml/l消泡剂（与繁殖中的相同）的已预处理的木质纤维素材料的浆料（pH5.0，用NaOH调节）进行SSF部分（总培养基1.5kg）。添加已再悬浮于0.9%NaCl中的细胞，得到每升3g干重的最初细胞浓度，并且添加酶（NS-22074或Cellic C-tec2，诺维信（Novozymes）），得到
5FPU/gWIS以起始该工艺。将发酵器（不含档板，莱布孚森）控制在35°C，用3M NaOH将pH值调节到5.0，搅拌器速度为约300rpm-400rpm，并且所有入口均被封闭而穿过冷凝器的出口打开。至少在以下时间获取用于代谢物分析的样本：0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h以及
96h。
[0121] 进行这种类型表征的菌株：
[0122] · Taurus01
[0123] · Taurus03
[0124] · Taurus04
[0125] · Taurus10
[0126] 在利用7.5%WIS的玉米芯浆料（在部分c中所描述的全部浆料）的SSF工艺中，同样清楚地可见在此类工艺中也可见本发明菌株的改进的木糖消耗能力（表4）。此外，也如在其他类型的表征中所见，木糖醇的副产物形成降低（图6）。
[0127] 表4.在利用7.5%WIS的玉米芯浆料以及5FPU/g WIS的纤维素降解酶的SSF实验中的木糖消耗和木糖醇形成。进行一式两份培养并且追踪96h。
[0128]
[0129] SSF表征也是使用另一种类型的材料桦树来进行，桦树是一种木糖含量高的木质纤维材料。将桦树木屑用稀酸（约1%SO2，190°C，并且停留时间为5min，在SEKAB E-技术公司进行）预处理。使预处理浆料在7.5%WIS下运作，并且在这种材料情况下也可见改进的木糖消耗（图6）。
[0130] e)玉米芯的分批进料发酵
[0131] 因为木糖消耗是在葡萄糖抑制下进行（也参见图4，葡萄糖耗尽之后木糖消耗起始），所以设计另一种设置用于发酵水解产物。在发酵中使用玉米芯液（在部分c中所描述），并且在葡萄糖耗尽之后起始葡萄糖进料。
[0132] 以与上文所描述的SSF工艺相同的方式产生细胞。将细胞装入800ml由玉米芯液和如用于SSF工艺的营养物组成的浓缩培养基中。在分批进料结束时玉米芯液、营养物以及细胞的浓度对应于类似的SSF工艺。在该实验中，将玉米芯液稀释到对应于7.5%的WIS含量。添加细胞并且在培养的其余部分期间在2h后开始将葡萄糖溶液以5.53ml/h馈入反应器中。在0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h以及72h后获取代谢物样本。
[0133] 进行这种类型表征的菌株：
[0134] · Taurus04
[0135] 这种设置非常成功，几乎所有木糖均被消耗（图7）并且在72h期间形成超过25g乙醇并且在此时尚未停止产生。
[0136] f)在琼脂板上的抑制剂耐受性测试
[0137] 使来自使用连续培养的定向进化方案的第二部分的菌株适应以增加它们的抑制剂耐受性。因此，使用板分析（plate assay）来评估这些菌株的抑制剂耐受性。
[0138] 用无菌蒸馏水稀释来自冷冻的样本的细胞样本以得到为1的OD。使用蒸馏水从这一稀释液进行十倍稀释系列，并且将每一稀释液10μl滴在一个具有上文在实例1中所描述的12种化合物的抑制剂混合物的YPD（丰富培养基、酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖）琼脂板上。在30°C下培育这些板至少2天，以允许细胞生长并且清楚可见。
[0139] 进行这种类型表征的菌株：
[0140] · Taurus03、Taurus04、Taurus05、Taurus06
[0141] 如图8中所见，与亲本菌株Taurus03相比，适应的菌株在更稀的样本（第2列）中展示更佳生长。
[0142] g)在摇瓶培养中甘蔗渣水解产物的厌氧发酵
[0143] 还在甘蔗渣水解产物的发酵中研究在实际工业底物中的性能。
[0144] 对于预培养，将100μl来自储备培养物的冷冻的细胞添加到具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的100ml基本培养基中。将培养物在30°C下以好氧方式培育并且24h后补充一些甘蔗渣水解产物到摇瓶中并且使其再培育6,5h。通过离心收集细胞。对于发酵测试，将不同浓度的甘蔗渣水解产物（20%、50%以及75%）补充以酵母提取物（10g/l）并且将pH值设定到6.0。添加从预培养物中收集的细胞，得到每升3g干重的近似起始细胞密度。使用
50ml培养基在100ml摇瓶中在30°C以及180rpm下进行发酵测试，并且通过使用以甘油填充的气塞获得厌氧条件。在该工艺期间追踪20%水解产物发酵的OD并且在650nm下测量。
50ml培养基在100ml摇瓶中在30°C以及180rpm下进行发酵测试，并且通过使用以甘油填充的气塞获得厌氧条件。在该工艺期间追踪20%水解产物发酵的OD并且在650nm下测量。
[0145] 进行这种类型表征的菌株：
[0146] · Taurus03、Taurus04、Taurus07、Taurus10
[0147] 表5、表6和表7以及图9展示第二代木糖菌株Taurus04和Taurus07与它们的亲本菌株Taurus03相比生长得更快并且提供更高的乙醇产量、更 高的木糖转化率以及更少的木糖醇形成。此外，还比较从亲本菌株Taurus09获得的Taurus10。尽管木糖转化率大，但副产物木糖醇的产量在所有情况下均保持在低水平。当水解产物稀释到20%时，在所有情况下木糖转化率均高于99%，参见图9。
[0148] 表5.在利用20%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
[0149]
[0150] 表6.在利用50%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
[0151]
[0152] 表7.在利用75%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
[0153]
[0154]
[0155] h)利用小麦秸秆浆料的 SSF（同时糖化和发酵）实验
[0156] 乙醇产生的另一种典型工艺为SSF工艺。在这一工艺中，水解酶与酵母一起添加，以同时实现预处理的浆液中的纤维素的分解以及单体糖的发酵。在该工艺中，使用底物和工艺步骤来尽可能地模拟一种工业情形。
[0157] 在通气的分批进料培养物中进行细胞繁殖。用于繁殖的预培养是在150ml摇瓶中在具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的50ml基本培养基（pH6.0）中进行。以一小部分（100μl冷冻的细胞）起始该预培养并且在一个旋转振荡器中在30°C下进行最佳24h（18h-36h）。在该批次中，培养基（500ml）包含50g/l糖蜜以及23.5g/l(NH4)2SO4、3.0g/l KH2PO4、2.25g/lMgSO4·7H2O以及99μg/l生物素、360ppm维他忽布（用于抑制细菌的蛇麻子提取物）以及1.2ml/l消泡剂（基于硅，诺普科ENA-309，诺普科纸业技术公司）。添加整个预培养物以起始培养（在莱布孚森生物反应器中，伊孚森公司），这一培养是在以下条件下进行：以1vvm通气，用3M NaOH将pH值调节到5.0，并且搅拌速度为700。进行该批次直到糖被用完（约
8h-10h）并且接着起始进料。在即将进行的SSF中使用包含材料的水解产物的进料（pH值调节到5，稀释到对应于5%WIS），并且包括糖蜜，从而产生75g/l的总己糖浓度。当分批进料阶段起始时，将搅拌器速度增加到1000rpm并且通气增加到以最终体积体计1.0vvm。进料-1
以0.1h 的恒定速率增加并且进行20h，从而产生1.5l的最终体积。通过离心（在1800×g下8min）收集细胞并且再悬浮于无菌0.9%NaCl中。
8h-10h）并且接着起始进料。在即将进行的SSF中使用包含材料的水解产物的进料（pH值调节到5，稀释到对应于5%WIS），并且包括糖蜜，从而产生75g/l的总己糖浓度。当分批进料阶段起始时，将搅拌器速度增加到1000rpm并且通气增加到以最终体积体计1.0vvm。进料-1
以0.1h 的恒定速率增加并且进行20h，从而产生1.5l的最终体积。通过离心（在1800×g下8min）收集细胞并且再悬浮于无菌0.9%NaCl中。
[0158] 利用5%WIS并且补充有0.5g/l(NH4)2HPO4、125ppm维他忽布以及0.4ml/l消泡剂（与繁殖中的相同）的已预处理的木质纤维素材料的浆料（pH5.0，用3M NaOH调节）进行SSF部分（总培养基1.5kg）。添加再悬浮于0.9%NaCl中的细胞，得到每升3g干重的最初细胞浓度，并且添加酶（Cellic C-tec2，诺维信），得到10FPU/g WIS以起始该工艺。将发酵器（不含档板，莱布孚森）控制在35°C，用3M NaOH将pH值调节到5.0，搅拌器速度为约300rpm-400rpm，并且所有入口均被封闭而穿过冷凝器的出口 打开。至少在以下时间获取用于代谢物分析的样本：0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h、96h以及137h。
[0159] 进行这种类型表征的菌株：
[0160] · Taurus07
[0161] 在利用5%WIS的小麦秸秆浆料的SSF工艺中，同样清楚地可见在此类工艺中也可见本发明菌株的改进的木糖消耗能力。此外，也如在其他类型的表征中所见，木糖醇的副产物形成降低，参见图10。
[0162] 表8.在5%WIS的小麦秸秆浆料以及10FPU/g WIS纤维素降解酶的SSF实验中的可溶性木糖消耗百分比和木糖醇形成。
[0163]
[0164] i)在一个工业示范规模发酵设备中使用酿酒酵母菌株 Taurus04的评估和发酵[0165] 酵母培养
[0166] 酵母培养Taurus04是在三个步骤中繁殖，并且培养物体积增加。在第三步骤中，在10m3的培养槽中繁殖酵母。使用基于糖蜜的培养基以分批进料方式进行繁殖。该繁殖提供足以用于下文所描述的SSF工艺以及水解产物发酵的量的酵母生物质。
[0167] 在分批期间繁殖步骤的产量为0.25g/g并且在分批进料期间为0.36g/g。在整个繁殖期间乙醇浓度为0g/l，由发酵的观点来看这是最佳的。如果在培养基中发现乙醇，那么酵母细胞的产量降低，这是不希望的。因此，酵母Taurus04在大的规模中繁殖良好。
[0168] 玉米芯的预处理
[0169] 原材料为由匈牙利（Hungary）提供的玉米芯残余物。该材料的干重为约85%。用稀硫酸作为催化剂以下文所示的工艺参数预处理该原材料，以便提供浆料。
[0170]
[0171] 在两项实验中，在开始时添加小于200kg滤液/浆料。最初还将水和酵母浆料添加到每一发酵器中。还添加一些其他化学品，这些化学品与工艺参数一起显示于下文中。
[0173] 在第一项实验（水解产物发酵）中，过滤浆料并且仅使用液体部分。在该实验期间，添加全部2840升滤液和约1144升额外的液体。在该实验的最初24h期间持续添加滤液。
[0174] 最初添加对应于5.3FPU/g WIS（水不溶性固体）的酶，以水解寡聚碳水化合物。酵母浓度为约5g/l（以干重计算，DS）。
[0175] 结果：观察到木糖完全消耗。10%的木糖转化为乳酸和木糖醇，并且其余90%的木糖已转化为乙醇。乙醇的最终浓度为10,9g/l，参见图11a。
[0176] 抑制剂HMF和糠醛已被酵母脱毒，并且在整个实验中这些抑制剂的浓度为0g/l。还观察到，在最初24h期间随着浆料的进给，葡萄糖与木糖两者均以相同的速率被消耗，并且此后所产生的乙醇一定来源于木糖，因为己糖已被消耗。
[0177] 在第二项实验（SSF工艺）中，添加整个浆料。添加2844kg浆料和1092升液体。另外，还添加对应于15FPU/g WIS的酶活性的酶。酵母浓度为 5.0g/l（TS）。
[0178] 结果：在第二项实验中，在整个实验期间葡萄糖和甘露糖的浓度接近于0g/l，乳酸的浓度也是如此。酵母稳定地消耗木糖达约100h。己糖与木糖两者的有效发酵产生39.4g/l的乙醇最终浓度，这对应于木糖形成乙醇的约40%的转化率，参见图11b。
[0179] j)在利用木糖生长期间菌株 Taurus01、Taurus03、Taurus04、Taurus07、Taurus09以及Taurus10对乙酸盐和 HMF的耐受性
[0180] 实验细节：
[0181] 制备50g/l或100g/l并且pH值为5.0的木糖培养基，该培养基包含10g/l酵母提取物、100mM邻苯二甲酸钾以及不同水平的乙酸盐和HMF。添加呈乙酸钠形式的乙酸盐，产生0g/l、4g/l、7g/l或10g/l（零、低、中以及高）的乙酸水平。添加0g/l、2g/l或5g/l（零、低以及高）的HMF。将所有化合物均溶解于一定量的水中，调节pH值，然后稀释到最终体积并且将溶液过滤灭菌。对无菌培养基测量pH值并且该pH值介于4.94-5.15之间。所有组合均产生24种不同类型的培养基。将培养基标记为针对50g/l木糖的1-12以及针对100g/l木糖的13-24。将这些乙酸盐水平分为三组，针对零、低、中以及高水平分别编号为
1-3、4-6、7-9、10-12（并且针对高木糖作相应的编号）。在三组中的每一组内，将HMF水平从零增加到低和高（例如1、2、3）。以上所述可见于图10中。然而，该图不展示不存在HMF或乙酸盐浓度时的情况。此外，测试11和12的图未展示在图10中，因为对于菌株来说环境毒性过大。
1-3、4-6、7-9、10-12（并且针对高木糖作相应的编号）。在三组中的每一组内，将HMF水平从零增加到低和高（例如1、2、3）。以上所述可见于图10中。然而，该图不展示不存在HMF或乙酸盐浓度时的情况。此外，测试11和12的图未展示在图10中，因为对于菌株来说环境毒性过大。
[0182] 使用YPDX培养基进行接种物培养并且生长约24h。通过离心收集细胞并且再悬浮于无菌mQ水中。测定生物质浓度，并且通过用无菌mQ水稀释来制备每升约3g干重的细胞悬浮液。
[0183] 在生物栅（BioScreen）（芬兰生长曲线公司（Growth Curves OY,Finland））中在30°C下在连续振荡下，用170μl培养基和30μl细胞悬浮液一式三份进行发酵持续72h，产生每升0.46g干重的起始细胞浓度。该生物栅的条件为半好氧的。在培养结束时，将来自一式三份培养物的培养基混合并且 过滤用于HPLC分析（在伯乐HPX87H柱上），以便测定发酵产物、HMF、乙酸盐以及木糖。
[0184] 结果：
[0185] 测定木糖消耗、乙醇产量以及生长特性，并且菌株Taurus07在具有更高HMF水平以及更高乙酸盐水平的更具挑战性的条件下显示更佳的性能，参见图12。高木糖水平对在更高HMF水平下具有问题的细胞施加额外应力。
[0186] k)使用 Taurus04菌株的对 C5材料的发酵
[0187] 将C5液体稀释到木糖浓度为50g/L-60g/L。根据该液体中的木糖浓度进行稀释。将液体的pH值调节到5.5（用KOH）。将液体分配到125mL厄伦美厄烧瓶（Erlenmeyer flask）中，每一烧瓶60mL液体。添加5ppm的抗菌素（青霉素G（penicillin G）或维吉霉素（virginiamycin））以防止细菌污染。添加0.06g/L（1mM）的尿素以及0.5g/L的酵母提取物（提供营养）。以每升0.5g干酵母接种酵母。在32°C下（在125rpm的振荡水浴中）培育烧瓶。
[0188] 木糖被有效地消耗，48h后剩余小于20%木糖。在发酵的大部分期间产生乙醇，64h后达到最大水平10.1g/l。这产生了每消耗一克糖0.34g乙醇的乙醇产量（从开始到64h）。仅在木糖阶段期间（即从时间17h到64h）的乙醇产量为每消耗一克木糖0.30g乙醇，参见图13a。
[0189] l)使用 Taurus04的经过水解的 C6固体的发酵
[0190] 关于细胞在接种物中的最初适应，将30ml经过离心并且灭菌过滤的C6水解产物添加到培养物中（以与关于C5发酵相同的方式，5h培育时间）。关于C5发酵，用10M KOH调节pH值，并且将尿素和酵母提取物溶解于pH值已调节的水解产物中，以尽可能少地稀释水解产物（水解后剩余的颗粒并不取走）。主要培养中的起始细胞浓度为每升0.5g干重。
[0191] 糖被有效地消耗。在小于24h后所有葡萄糖均被用完并且再48h后超过85%的木糖被消耗。乙醇主要在最初48h期间产生，46h后达到最大水平22.8g/l。这产生了每消耗一克糖0.39g乙醇的乙醇产量（从开始到46h）。 仅在木糖阶段期间（即从时间22h到46h）的乙醇产量为每消耗一克木糖0.34g乙醇，参见图13b。
[0192] m)使用 Taurus04菌株的 C5材料和 C6固体的同时糖化和发酵
[0193] 在具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的YP培养基中以分批进料培养形式进行细胞繁殖。用5M KOH将由C5液体组成的进料调节到pH5.0，并且补充40g/l蔗糖。通过离心收集细胞并且再悬浮于水中。
[0194] 以具有15%总C6固体的浆料的最终量为1500g制备用于SSF实验的培养基。因为C6材料包含30%固体和70%水分，所以将750g C6材料与750g C5部分混合并且用10M KOH将pH值调节到5.5。因为材料中木糖和乙酸的水平过低而不能代表适当条件，所以将64.5g木糖和3g乙酸溶解于浆料中，分别得到约57g/l和4g/l的总浓度。添加0.06g/l的尿素、5ppm的青霉素以及0.2ml/l的消泡剂（聚乙二醇）。在莱布孚森发酵器（伊孚森公司）中SSF培养的条件为温度32°C，用5M NaOH将pH值控制在5.5，搅拌器速度为600rpm，并且封闭气体入口。通过添加细胞以得到每升1g干重以及每克纤维素50mg粗提取物的Cellic Ctec2酶（诺维信）来起始培养。通过细胞外培养基的取样（在14500rpm下离心，2min，然后如上文所描述过滤并且分析）追踪培养120h。
[0195] 如图14中所示，在工艺的120h后剩余20g/l木糖，这对应于70%已溶解的木糖被酵母消耗。在发酵结束时，木糖醇浓度为9g/l，并且因此一些木糖未转化为乙醇。由于纤维素分解酶的作用在工艺的最初6h期间葡萄糖略有增加，但在工艺的后期未发现葡萄糖累积。这一事实表明酵母正良好地消耗葡萄糖，并且酶促水解可能是一个限制因素。最终乙醇浓度为38.1g/l。根据15%总固体的初始负载量，在1.5l浆料中有228.75g总糖潜在地可供使用。因此，以总可供使用的糖计，所产生的乙醇对应于理论产量的48%的产量，图14。
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