经遗传修饰的微生物的生成方法
阅读：349发布：2023-03-08
专利汇可以提供经遗传修饰的微生物的生成方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了经遗传修饰的 微 生物 的生成方法，例如经遗传修饰的 酵母 菌株，所述微生物的一个或多个 信息素 应答基因和一个或多个孢子形成基因中含有功能性的破坏，以及由此方法产生的经遗传修饰的酵母细胞，如经遗传修饰的二倍体和单倍体酵母细胞，其缺乏孢子形成能 力 和内源性交配能力。，下面是经遗传修饰的微生物的生成方法专利的具体信息内容。
1.一种经遗传修饰的二倍体酵母细胞，包含：
(a)在至少一个孢子形成基因中的功能性破坏；
(b)在至少一个信息素应答基因中的功能性破坏；和
(c)整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；
其中所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍；而且其中所述经遗传修饰的二倍酵母细胞除其交配型等位基因以外是纯合的。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的二倍体酵母细胞，其中所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞为异宗配合的。
3.一种经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，包含：
(a)在至少一个孢子形成基因中的功能性破坏；
(b)在至少一个信息素应答基因中的功能性破坏；和
(c)整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；
其中所述经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍。
4.根据权利要求3所述的经遗传修饰的单倍体酵母细胞，进一步包含编码功能性同宗配合蛋白的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的经遗传修饰的单倍体酵母细胞，进一步包含至少一个重组质粒，所述重组质粒编码在所述经遗传修饰的单倍体酵母细胞中被功能性破坏的所述至少一个信息素应答基因的功能性拷贝。
6.根据权利要求1-5任一项所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述的经遗传修饰的酵母细胞是酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）。
7.根据权利要求1或3所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述至少一个孢子形成基因选自下组：IME1,IME2,NDT80,SPO11,SPO20,AMA1,HOP2和SPO21。
8.根据权利要求1或3所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述至少一个信息素应答基因选自下组：STE5，STE4，STE18，STE12，STE7和STE11。
9.根据权利要求7所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含IME1基因的功能性破坏。
10.根据权利要求8所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含STE5基因的功能性破坏。
11.根据权利要求1或3所述的经遗传修饰的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含IME1基因和STE5基因的功能性破坏。
12.根据权利要求5所述的经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中所述酵母细胞包含STE5基因的功能性破坏和编码功能性STE5蛋白的重组质粒。
13.一种具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的遗传修饰二倍体酵母细胞的生成方法，包括：
(a)用至少一个质粒转化第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，所述质粒编码的蛋白能够互补于所述第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞中的内源性交配障碍，其中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列，且其中所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，具有与所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞相反的交配型，并且包含整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列；
(b)将所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞与所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配，从而形成经遗传修饰的二倍体酵母细胞；并且
(c)从所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞中清除所述一个或多个质粒，其中，所述生成的经遗传修饰的二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列的两个拷贝；
其中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于至少一个信息素应答基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍；而且其中所述生成的经遗传修饰的二倍酵母细胞除其交配型等位基因以外是纯合的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤（a）包括用至少一个质粒转化第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，所述质粒编码在所述第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞中功能性破坏的所述至少一个信息素应答基因的功能性拷贝。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述信息素应答基因选自下组：
STE5,STE4,STE18,STE12,STE7和STE11。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述信息素应答基因选自下组：
STE5,STE4,STE18,STE12,STE7和STE11。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述信息素应答基因是STE5。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述信息素应答基因是STE5。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于至少一个孢子形成基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述孢子形成基因选自下组：IME1,IME2,NDT80,SPO11,SPO20,AMA1,HOP2和SPO21。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述孢子形成基因是IME1。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于STE5基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍，并且由于IME1基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞是通过在第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的种群中诱导交配型转换而得到。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞是异宗配合的，并且其交配型转换的诱导是通过用编码功能性同宗配合蛋白的重组质粒转化所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中所述同宗配合蛋白的表达能够诱导所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的交配型转换。
25.根据权利要求13所述的方法，其中所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞是酿酒酵母细胞。
26.以权利要求13-25任一项的方法生成的具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的二倍体酵母细胞。
27.一种具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的经遗传修饰的异宗配合的二倍体酵母细胞的生成方法，包括：
(a)用编码功能性同宗配合蛋白的质粒转化第一经遗传修饰的异宗配合的单倍体酵母细胞的种群，以生成第一经遗传修饰的的单倍体酵母细胞，其中所述同宗配合蛋白的表达能够诱导所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞转换交配型，从而获得与第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配型相反的第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，
其中，所述第一经遗传修饰的异宗配合的单倍体酵母细胞包含整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列以及STE5基因和IME1基因中的功能性破坏；
(b)用编码STE5基因的质粒转化所述第一和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，所述转化使得所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞与所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配，从而生成经遗传修饰的二倍体酵母细胞；并且，
(c)从所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞中清除所有的质粒，以生成经遗传修饰的异宗配合的二倍体酵母细胞，
其中，所述生成的经遗传修饰的异宗配合的二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列的两份拷贝；而且
其中所述生成的经遗传修饰的二倍酵母细胞除其交配型等位基因以外是纯合的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的异宗配合二倍体酵母细胞是酿酒酵母细胞。
29.由权利要求27或28所述的方法生成的具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的异宗配合的二倍体酵母细胞。
经遗传修饰的微生物的生成方法
[0002] 本申请提供的方法和组合物总体上涉及微生物的工业应用，例如酵母。本申请提供了一种经遗传修饰的微生物，所述修饰能显著降低微生物在自然界散播的风险，尤其是其重组的DNA序列在自然界的散播。还提供了生产和利用所述经遗传修饰的微生物的方法。2.背景技术
[0003] 重组DNA技术的发展使得可以利用原核生物和真核生物来大量生产工业上有用的产品。在真核生物中，酵母(特别是，属于酵母菌属(Saccharomyces)的酵母)被广泛用于生产发酵产品。一般而言，酵母能够快速生长，并可以在比细菌更高的密度下培养，而且不需要在工业条件下的无菌环境。此外，酵母比细菌更易于从培养基中分离，大大简化了产物的分离和纯化过程。由于这些特性，酵母(特别是带有重组DNA序列的经遗传修饰的酵母)被用作表达有用产物的宿主，并且此类酵母的应用也已经建立。但是，在工业中应用经遗传修饰的酵母存在潜在的环境风险，因为这些酵母和/或它们含有的重组DNA序列的散播可能对生态系统带来不可预知的影响。因此，需要有一种酵母，其适用于工业应用，但是其在自然界中散播和繁殖的风险降低，特别是其重组DNA序列在自然界中的散播的风险降低。
[0004] 3.发明概述
[0005] 本申请提供了一种具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的经遗传修饰的微生物的生成方法，例如经遗传修饰的酵母菌株的生成方法。本申请提供的方法包括，在经遗传修饰的单倍体微生物细胞，如酵母细胞中，功能性破坏一个或多个孢子形成基因和/或一个或多个信息素应答基因，以及诱导所述经遗传修饰的单倍体微生物细胞形成稳定的二倍体，由于缺乏孢子形成能力和/或交配能力，该二倍体不能有效地进行有性繁殖并且其生命周期被限制在二倍体状态。按照本申请提供的方法进行遗传修饰的微生物，如酵母菌株，具有工业用途，如用于工业发酵，并且可提供的优势有，在自然界中通过与野生型微生物交配而导致散播和繁殖的风险显著降低。
[0006] 一方面，本申请提供的经遗传修饰的酵母细胞包含：在一个或多个孢子形成基因中的功能性破坏，其中由于所述一个或多个孢子形成基因的所述破坏，使得所述酵母细胞缺乏孢子形成能力；在一个或多个信息素应答基因中的功能性破坏，其中由于所述一个或多个信息素应答基因的所述破坏，使得所述酵母细胞缺乏内源性的交配能力；以及一个或多个整合的异源目标核苷酸序列。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是异宗配合的(ho)。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是二倍体细胞，其中一个或多个孢子形成基因的两个拷贝和/或一个或多个信息素应答基因的两个拷贝都被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的二倍体细胞除其交配型等位基因以外是纯合的。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是单倍体细胞。在一些实施方式中，经遗传修饰的单倍体细胞进一步含有编码同宗配合(HO)蛋白质的重组质粒。在一些实施方式中，经遗传修饰的单倍体细胞包含一个或者多个重组质粒，其编码一个或多个信息素应答基因，所述信息激素应答基因在所述酵母细胞中被功能性破坏。
[0007] 在一些实施方式中，可用于实践本申请提供的方法的经遗传修饰的酵母细胞是酿酒酵母细胞。在一些实施方式中，酿酒酵母细胞是Baker’s酵母、Mauri、Santa Fe、CBS7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1或AL-1菌株。在一些具体的实施方式中，酿酒酵母细胞是PE-2菌株。另外一些具体的实施方式中，酿酒酵母细胞是CAT-1菌株。
[0008] 在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞中，被破坏的一个或多个孢子形成基因选自下组：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些具体的实施方式中，IME1基因被破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞中，被破坏的一个或多个信息素应答基因选下组：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些具体的实施方式中，STE5基因被破坏。在一些具体的实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞包含STE5基因和IME1基因两者的功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母的单倍体细胞包含基因STE5的功能性破坏和编码STE5蛋白的重组质粒。
[0009] 另一方面，本申请提供了具有孢子形成障碍和交配能力障碍的二倍体酵母菌株的产生方法。在一些实施方式中，所述方法包括：(a)获得第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中所述经遗传修饰的单倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且含有整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；(b)获得第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，具有与所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞相反的交配型，并且含有整合在染色体上的编码所述目标蛋白质的异源核苷酸序列；(c)用一个或多个质粒转化第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，所述质粒编码的蛋白能够互补于所述第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞的内源性交配障碍；(d)将所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞与第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配，从而形成经遗传修饰的二倍体酵母细胞；并且(e)从所述经遗传修饰的二倍体酵母细胞中清除所述一个或多个质粒，其中产生的经遗传修饰的二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍。
[0010] 在一些实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于一个或多个信息素应答基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍。在一些这样的实施方式中，步骤(c)包括用一个或多个质粒转化所述第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，该质粒编码在所述第一或第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞中被功能性破坏的所述信息素应答基因的功能性拷贝。在一些实施方式中，所述一个或多个信息素应答基因选自下组：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于STE5基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍。
[0011] 在一些实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于一个或多个孢子形成基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。在一些这样的实施方式中，所述一个或多个孢子形成基因选自下组：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于IME1基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。在具体的实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞和所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞由于STE5基因被功能性破坏而具有交配障碍，并且由于IME1基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。
[0012] 在一些实施方式中，所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞是通过在第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的种群中诱导交配型转换而得到。在某些这样的实施方式中，所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞是异宗配合的(ho)，而所述种群的交配型转换的诱导是通过用编码同宗配合(HO)蛋白的重组质粒转化经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中所述HO蛋白的表达能诱导经遗传修饰的单倍体酵母细胞转换交配型。
[0013] 在其他实施方式中，所述第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞是通过在所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞中利用重组DNA技术改变其交配型位点而得到。在一些实施方式中，用整合构建体转化所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞，该整合构建体包含作为整合序列的侧接有同源序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的交配型不同于第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的交配型，所述同源序列同源于与第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞中的交配型位点侧接的核苷酸序列。通过同源重组将整合序列整合后，由插入序列编码的交配型位点替换了第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞中的交配型位点，从而产生第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞。在一些实施方式中，用编码α交配型(MAT alpha)的整合构建体，将第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的交配型从a转换为α。在一些实施方式中，整合构建体包含SEQ ID NO：155。在其他实施方式中，用编码a交配型(MATA)的整合构建体，将第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的交配型从α转换为a。在一些实施方式中，整合构建体包含SEQ ID NO：156。
[0014] 在另一方面，本申请提供了一种具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的异宗配合(ho)二倍体酵母细胞的生成方法，该方法包括：(a)获得第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，其中所述第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞包含(i)整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；和(ii)在STE5基因和IME1基因中的功能性破坏；(b)用含有编码同宗配合(HO)蛋白的多核苷酸的质粒转化第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞的种群，其中所述HO蛋白的表达能诱导第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞转换交配型，从而获得第二经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，其中所述第二经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞的交配型与所述第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞相反，并且包含：(i)整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列；和(ii)在STE5基因和IME1基因中的功能性破坏；(c)用编码STE5基因的质粒转化所述第一和第二经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞；(d)将第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞与第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配，从而形成经遗传修饰的二倍体酵母细胞；并且(e)从经遗传修饰的二倍体酵母细胞中消除所有的质粒，其中获得的遗传学修饰的异宗配合二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍。
[0015] 本申请还提供了由本申请所述方法生成的经遗传修饰的异宗配合酵母细胞，其缺乏孢子形成和内源性交配能力。
[0017] 图1显示第I阶段破坏构建体的结构和通过同源重组整合了破坏序列后的靶位点的结构。
[0018] 图2显示第II阶段破坏构建体的结构和通过同源重组整合了破坏序列后的靶位点的结构。
[0019] 图3显示第III阶段破坏构建体的结构和通过同源重组整合了破坏序列后的靶位点的结构。
[0020] 图4显示第I阶段标记物循环构建体的结构和通过同源重组整合了该构建体后的靶位点的结构。
[0021] 图5显示第II阶段标记物循环构建体的结构和通过同源重组整合了该构建体后的靶位点的结构。
[0022] 图6显示第III阶段标记物循环构建体的结构和通过同源重组整合了该构建体后的靶位点的结构。
[0023] 图7显示STE5破坏构建体的结构和通过同源重组整合了破坏序列后的靶位点的结构。
[0024] 图8显示IME1破坏构建体的结构和通过同源重组整合了破坏序列后的靶位点的结构。
[0025] 图9比较了经遗传修饰的具有内源性交配障碍的单倍体Y1915细胞和经遗传修饰的内源性交配正常的Y1912细胞的交配能力。
[0026] 图10比较了经遗传修饰的具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的二倍体Y1979细胞和无遗传修饰的孢子形成正常和内源性交配正常的Y1198细胞的孢子形成能力。
[0028] 5.1术语
[0029] 在本申请中，术语“异源”指自然界中通常没有的。术语“异源核苷酸序列”指在自然界的某给定细胞中通常没有的核苷酸序列。由此，异源核苷酸序列可以是：(a)对其宿主细胞而言是外来的(即对细胞而言是“外源的”)；(b)在宿主细胞中天然存在(即，“内源的”)，但是在该细胞中存在的数量反常(即，多于或少于在该宿主细胞中天然存在的数量)；或(c)在宿主细胞中天然存在，但是位于其天然位点之外。
[0030] 在本申请中，靶基因，例如信息素应答基因或孢子形成基因，“被功能性破坏”或“功能性破坏”，是指改变靶基因以降低在宿主细胞中靶基因编码的蛋白的活性。在一些实施方式中，宿主细胞中靶基因编码的蛋白的活性被消除。在一些实施方式中，宿主细胞中靶基因编码的蛋白的活性降低。为实现靶基因的功能性破坏，可以通过删除全部或部分基因，从而使基因表达消除或降低，或基因产物的活性消除或降低。实现靶基因的功能性破坏还可以通过突变基因的调控元件，例如基因的启动子，从而使表达消除或降低，或突变基因的编码序列，从而使基因产物的活性消除或降低。在一些实施方式中，靶基因的功能性破坏导致靶基因的全部开放阅读框被去除。
[0031] 在本申请中，“内源性交配”和“内源性交配能力”是指具有相反交配型，即a交配型和α交配型，的单倍体微生物细胞，在不存在异源基因表达，例如，信息素应答基因的异源拷贝的表达或任何能够诱导这些单倍体之间交配的基因的表达，的情况下形成二倍体细胞的能力。
[0032] 在本申请中，“内源性交配障碍”是指相对于野生型单倍体微生物细胞种群而言，微生物细胞的内源性交配能力被削弱到足以抑制该微生物细胞的单倍体在种群内交配的程度。在一些实施方式中，抑制包括，相对于野生型单倍体微生物细胞种群的交配率而言，单倍体微生物细胞种群的交配率降低至少10％、20％、30％、40％、50％，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0033] 在本申请中，“孢子形成障碍”是指相对于野生型二倍体微生物细胞种群而言，二倍体微生物细胞的孢子形成活性被削弱到足以抑制该微生物细胞二倍体在种群内形成孢子的程度。在一些实施方式中，抑制包括，相对于野生型二倍体微生物细胞种群而言，二倍体微生物细胞的种群的孢子形成率降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0034] 在本申请中，术语“互补”基因是指一种基因，其能够替代被功能性破坏的基因的功能，例如被功能性破坏的孢子形成基因或信息素应答基因。在一些实施方式中，互补基因和被破坏的基因的功能机制不必相同。在一些实施方式中，可以用异源基因互补被功能性破坏的靶基因，例如孢子形成基因或信息素应答基因，所述异源基因产生的蛋白同源于被破坏的基因所编码的蛋白，或者产生的蛋白所提供的表型通过其他机制产生例如孢子形成或交配。
[0035] 5.2经遗传修饰的微生物及其生成方法
[0036] 本申请提供了包含经遗传修饰的微生物例如经遗传修饰的酵母细胞(如经遗传修饰的酿酒酵母细胞)的组合物，以及生成该组合物的方法和材料，所述经遗传修饰的微生物在孢子形成和/或内源性交配能力上具有功能性障碍。本申请提供的方法中断了微生物的有性繁殖循环，以使微生物在自然界中的散播最小化，并且使得经遗传修饰的微生物和自然界中不缺乏散播能力的野生型微生物之间，遗传物质交换的可能性最小化。
[0037] 很多真菌细胞，例如酵母细胞，可有性繁殖也可无性繁殖。无性繁殖仅涉及一个母细胞，并且使得种群快速增长。与之相反地，有性繁殖涉及配子的生成和融合，通过细胞间的横向基因转移，更快地产生基因多样性。有性繁殖的真菌细胞在其生命周期中具有两种细胞状态，一种是二倍体细胞状态和另一种是单倍体细胞状态。二倍体真菌细胞通常很稳定，一般保持在二倍体状态，除非受到一种或多种的具体环境刺激(例如，营养饥饿)。当遇到一种或多种此类刺激时，二倍体细胞形成孢子，以产生四个单倍体的孢子(名为四分体)。当恢复到适宜环境时，这些单倍体孢子出芽产生四个单倍体细胞(两个是a交配型，两个是α交配型)，这些单倍体细胞可以和其他具有相反交配型的单倍体细胞交配，从而再次形成二倍体细胞。
[0038] 二倍体真菌细胞的孢子形成能力和单倍体真菌细胞的交配能力依赖于特定基因产物的功能。在酵母细胞中这些基因产物是孢子形成基因的产物，例如IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21基因，以及信息素应答基因产物，例如STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11基因。
[0039] 在一方面，本申请提供了经遗传修饰的单倍体真菌细胞，其具有孢子形成障碍和/或内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中至少一个孢子形成基因和/或至少一个信息素应答基因被功能性破坏。
[0040] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中一个或多个以下的孢子形成基因被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其NDT80基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SPO11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SPO20基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SPO21基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于一个的选自下组的孢子形成基因被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于二个的选自下组的孢子形成基因被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于三个的选自下组的孢子形成基因被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于四个的选自下组的孢子形成基因被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。
[0041] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中一个或多个以下的信息素应答基因被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于一个的选自下组的信息素应答基因被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、和STE11。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于二个的选自下组的信息素应答基因被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于三个的选自下组的信息素应答基因被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中多于四个的选自下组的信息素应答基因被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。
[0042] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中至少一个孢子形成基因和至少一个信息素应答基因被功能性破坏。
[0043] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SPO11基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SPO20基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE5基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE5基因被功能性破坏。
[0044] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP11基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP20基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE4基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE4基因被功能性破坏。
[0045] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP11基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP20基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE18基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE18基因被功能性破坏。
[0046] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP11基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP20基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE12基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE12基因被功能性破坏。
[0047] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP11基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP20基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE7基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE7基因被功能性破坏。
[0048] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME1基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中IME2基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中NDT80基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP11基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP20基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中AMA1基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中HOP2基因和STE11基因被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其中SOP21基因和STE11基因被功能性破坏。
[0049] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含一个或多个信息素应答基因的被功能性破坏的染色体拷贝和一个或多个重组质粒，所述质粒包含所述一个或多个信息素应答基因编码序列的功能性的染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE5基因以及重组质粒，所述质粒含有STE5基因编码序列的功能性的染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE4基因以及重组质粒，所述质粒含有STE4基因编码序列的功能性染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE18基因以及重组质粒，所述质粒含有STE18基因编码序列的功能性染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE12基因以及重组质粒，所述质粒含有STE12基因编码序列的功能性染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE7基因以及重组质粒，所述质粒含有STE7基因编码序列的功能性染色体外拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是单倍体酵母细胞，其包含功能性破坏的STE11基因以及重组质粒，所述质粒含有STE11基因编码序列的功能性染色体外拷贝的重组质粒。
[0050] 在另一方面，本申请提供了经遗传修饰的二倍体真菌细胞，其具有孢子形成障碍和/或内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列的两个拷贝。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中至少一个孢子形成基因的两个拷贝和/或至少一个信息素应答基因的两个拷贝都被功能性破坏。
[0051] 在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中一个或多个以下的孢子形成基因的两个拷贝都被功能性破坏：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中IME1基因的两个拷贝都被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中一个或多个以下的信息素应答基因的两个拷贝都被功能性破坏：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中STE5基因的两个拷贝都被功能性破坏。在其他一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中至少一个孢子形成基因的两个拷贝和至少一个信息素应答基因的两个拷贝都被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的真菌细胞是二倍体酵母细胞，其中IME1基因的两个拷贝和STE5基因的两个拷贝都被功能性破坏。
[0052] 在一些实施方式中，经遗传修饰的二倍体真菌细胞除了其交配型等位基因以外是纯合的。例如，如果经遗传修饰的二倍体真菌细胞形成孢子，则产生的四个单倍体真菌细胞除了交配型等位基因以外，在遗传上是完全相同的。在这样的情况下，两个单倍体细胞是a交配型而另外两个是α交配型。在一些实施方式中，经遗传修饰的二倍体真菌细胞不包含提供其抗生素化合物抗性的异源基因。
[0053] 本申请提供的经遗传修饰的二倍体真菌细胞具有多重安全保护，防止其含有的异源核苷酸序列出现不希望的繁殖。首先，二倍体真菌细胞通常非常稳定，并且在二倍体状态下不能与其他真菌细胞交配。其次，本申请提供的二倍体真菌细胞具有孢子形成能力障碍，因此，即使在适当的环境刺激下，也仅具有微乎其微的或者没有形成孢子的能力。第三，即使在罕见的情况下生成了孢子，产生的单倍体真菌细胞所具备的交配能力也是有障碍的。综上，本申请提供的经遗传修饰的真菌细胞所具有的孢子形成缺陷和交配缺陷的特性，显著地降低了异源核苷酸序列向野生型真菌细胞迁移的可能性。
[0054] 在另一方面，本申请提供了在此描述的经遗传修饰的二倍体真菌细胞的生产方法，在一些实施方式中，所述方法包括(a)获得第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞，其中所述第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且含有整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；(b)获得第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞，其中所述第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，具有与第一遗传修饰单倍体真菌细胞相反的交配型，并且含有整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列；(c)用一个或多个质粒转化所述第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞，所述质粒编码的蛋白能够互补于所述第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞的内源性交配障碍；(d)将所述第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞与第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞交配，从而形成经遗传修饰的二倍体酵母细胞；并且(e)从所述经遗传修饰的二倍体真菌细胞中清除一个或多个质粒，其中所述生成的经遗传修饰的二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列的两个拷贝。
[0055] 在一些实施方式中，第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞由于一个或多个信息素应答基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍。在一些实施方式中，本发明的方法中的步骤(c)包括，用一个或多个质粒转化第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞，所述质粒编码在所述第一或第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞中被功能性破坏的一个或多个信息素应答基因的功能性拷贝。在一些实施方式中，第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞是单倍体酵母细胞，并且一个或多个信息素应答基因选自下组：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些实施方式中，第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞是由于STE5基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍的单倍体酵母细胞。
[0056] 在一些实施方式中，第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞由于一个或多个孢子形成基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍。在一些实施方式中，第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞是单倍体酵母细胞，且一个或多个孢子形成基因选自下组：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些实施方式中，第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞是由于IME1基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍的单倍体酵母细胞。在具体的实施方式中，第一和第二经遗传修饰的单倍体真菌细胞是由于STE5基因被功能性破坏而具有内源性交配障碍，并且由于IME1基因被功能性破坏而具有孢子形成障碍的单倍体酵母细胞。
[0057] 在一些实施方式中，第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞是通过在第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞的种群中诱导交配型转换而得到。在一些实施方式中，第一经遗传修饰的单倍体真菌细胞是异宗配合(ho)的单倍体酿酒酵母细胞，并且所述异宗配合(ho)的单倍体酿酒酵母细胞的种群的交配型转换的诱导是通过用编码功能性同宗配合(HO)蛋白的重组质粒转化第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中HO蛋白的表达能够诱导单倍体酿酒酵母细胞转换交配型，从而生成第二经遗传修饰的单倍体酿酒酵母细胞。异宗配合(ho)的单倍体酿酒酵母细胞的特征在于，几乎不会发生自发的交配型转换(概率仅为10-6)。通过瞬时表达HO蛋白，单倍体酿酒酵母细胞发生自发的交配型转换的概率升高到每次细胞分裂时可发生一次，这提供了具有相反交配型的单倍体细胞种群，其能够互相交配从而产生二倍体酿酒酵母细胞。
[0058] 在另一方面，本申请提供了一种缺乏孢子形成和内源性交配能力的经遗传修饰的异宗配合(ho)二倍体酵母细胞的生成方法，该方法包括：(a)获得第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，其中所述第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞包含：(i)整合在染色体上的编码目标蛋白的异源核苷酸序列；和(ii)在一个或多个孢子形成基因和一个或多个信息素应答基因中的功能性破坏；(b)用编码同宗配合(HO)蛋白的质粒转化第一经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞的种群，以生成第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中HO蛋白的表达能够诱导第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞转换交配型，从而获得第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，其中第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞与第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配型相反，并且包含：(i)整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列；和(ii)在一个或多个孢子形成基因和一个或多个信息素应答基因中的功能性破坏；(c)用质粒转化第一和第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞，所述质粒编码在所述第一和第二单倍体酵母细胞中被功能性破坏的一个或多个信息素应答蛋白；(d)将第一经遗传修饰的单倍体酵母细胞与第二经遗传修饰的单倍体酵母细胞交配，从而形成经遗传修饰的二倍体酵母细胞，该细胞除交配型等位基因以外是纯合的；并且(e)从经遗传修饰的二倍体酵母细胞中消除所有的质粒，以生成经遗传修饰的异宗配合二倍体酵母细胞，其中生成的经遗传修饰的异宗配合二倍体酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍，并且包含整合在染色体上的编码所述目标蛋白的异源核苷酸序列的两个拷贝。[0056]虽然在本申请提供的并且在下面更为详细描述的方法中，各个步骤是以连续的顺序展现的，但是本领域技术人员会认可，在不扩大本发明的范围的前提下，若干步骤的顺序可以互换、合并或重复。因此，在一些实施方式中，经遗传修饰的异宗配合(ho)的缺乏孢子形成和内源性交配能力的二倍体酵母细胞的生成是通过首先用质粒转化经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，所述质粒编码在所述经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞中被功能性破坏的一个或多个信息素基因，然后用编码同宗交配(HO)蛋白的质粒转化该细胞。在其他实施方式中，经遗传修饰的异宗配合(ho)的缺乏孢子形成和内源性交配能力的二倍体酵母细胞的生成是通过同时用两个质粒转化经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞，一个质粒编码在所述经遗传修饰的异宗配合单倍体酵母细胞中被功能性破坏的一个或多个信息素基因，另一个编码同宗交配(HO)蛋白。
[0059] 5.2.1微生物的选择
[0060] 可用于实践本申请提供的方法的微生物包括真核单细胞生物，特别是真菌，尤其特别是酵母。
[0061] 在一些实施方式中，可用于本申请方法的酵母包括已经保藏在微生物保藏机构(如IFO，ATCC等)的酵母，和属于下列属的酵母：芽孢酵母属、神食酵母属、节束酵母属、Arxiozyma属、棉阿舒囊霉属、Babjevia属、本森顿酵母属、葡萄藻属、Botryozyma属、酒香酵母属、布勒弹孢酵母属、布勒担孢酵母属、假丝酵母属、固囊酵母属、棒孢酵母属、隐球酵母菌属、产黑色素酵母属(Cystofilobasidium)、德巴利酵母属、德克酵母属、拟双足囊菌属、芽生裂殖酵母属、Eeniella属、Endomycopsella属、Eremascus属、假囊酵母属、担孢酵母属、Fellomyces属、线黑粉酵母属、Galactomyces属、地霉属、季氏酵母属、有孢汉逊酵母属、汉逊酵母属、Hasegawaea属、Holtermannia属、Hormoascus属、生丝毕赤酵母属、伊萨酵母属、克勒克酵母属、Kloeckeraspora属、克鲁维酵母属、Kondoa属、Kuraishia属、克氏担孢酵母属、白冬孢酵母属、油脂酵母属、路德酵母属、马拉色菌酵母属、梅奇酵母属、木拉克酵母属、Myxozyma属、拿逊酵母属、Nakazawaea属、榛针孢酵母属、Ogataea属、卵孢酵母属、菅囊酵母属、Phachytichospora属、法夫酵母属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、类酵母属、复膜孢酵母属、Saitoella属、Sakaguchia属、Satumospora属、裂芽酵母属、殖酵母属、许旺酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属、原孢酵母属、冠孢酵母属、梗孢酵母属、Sterigmatosporidium属、Symbiotaphrina属、合轴酵母属、Sympodiomycopsis属、有孢圆酵母属、Trichosporiella属、丝孢酵母属、三角酵母属、Tsuchiyaea属、Udeniomyces属、Waltomyces属、威克酵母属、拟魏克酵母属、拟威尔酵母属、Yamadazyma属、亚罗酵母属、接合囊酵母属、接合酵母属、接合拟威尔酵母属和配合酵母菌属。
[0062] 在一些实施方式中，所述微生物是酿酒酵母、毕式酵母、粟酒裂殖酵母、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、乳酸克鲁维斯酵母(此前称为乳酸酵母)、马克思克鲁维酵母、Arxula adeninivorans或多形汉森酵母(现称为毕赤酵母)。在一些实施方式中，微生物是假丝酵母属菌株，如解脂耶氏酵母、吉利蒙假丝酵母、克鲁氏假丝酵母、拟热带假丝酵母或产朊假丝酵母菌。
[0063] 在具体的实施方式中，所述微生物是酿酒酵母。在一些实施方式中，所述微生物是选自下组的酿酒酵母菌株：Baker’s酵母、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1。在一些实施方式中，所述微生物是选自下组的酿酒酵母菌株：PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1和SA-1。在具体的实施方式中，所述酿酒酵母菌株是PE-2。在另一具体的实施方式中，所述酿酒酵母菌株是CAT-1。在另一具体的实施方式中，所述酿酒酵母菌株是BG-1。
[0064] 在一些实施方式中，所述微生物是适于工业发酵的微生物，例如生物乙醇发酵。在具体的实施方式中，所述微生物习惯于生存在高溶剂浓度、高温、广泛的底物利用、营养限制、由糖和盐产生的渗透压、酸度、亚硫酸盐以及细菌污染条件下或上述条件的组合，这些被认为是工业发酵环境中的应力状态。
[0065] 5.2.2微生物的遗传修饰
[0066] 采用重组质粒或染色体整合载体产生遗传修饰的微生物的方法是本领域的公知技术。例如，可参见：Sherman，F.，et al.，Methods Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1978)；Guthrie，C.，et al.(Eds.)Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol.194，Academic Press，San Diego(1991)；Sambrook et al.，2001，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；and Ausubel et al.，eds.，Current Edition，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY；上述文献公开的内容在此参考并入。
[0067] 在一些实施方式中，微生物被遗传修饰以包含一个或多个异源核苷酸序列，其编码新的代谢通路中的酶，即，该代谢通路产生的代谢产物在微生物中不会内源性产生。在其他实施方式中，微生物被遗传修饰以包含一个或多个异源核苷酸序列，其编码微生物内源代谢通路中的酶，即，该代谢通路产生的代谢产物在微生物中内源性产生。
[0068] 在一些实施方式中，本申请所述的方法需要应用重组质粒在微生物中瞬时表达特定的蛋白，如由信息素应答基因之一或HO编码的特定蛋白。适用于酵母细胞的重组质粒的示例性例子包括CEN/ARS和2μ质粒。
[0069] 在一些实施方式中，本申请的微生物不含有编码抗生素抗性的异源核苷酸序列。抗生素抗性标记物一般用于构建经遗传修饰的细胞。在本发明的这些实施方式中，抗生素抗性标记物被用于标记在微生物中引入的遗传修饰，在所有期望的遗传修饰被引入微生物以后，这些标记物被随之删除。可选择地，也可使用其他选择工具，用于构建经遗传修饰的微生物，例如营养缺陷型互补(如HIS3、LEU2、LYS1、MET15、TRP1、ADE2、URA3和LYS2)。
[0070] 5.2.3孢子形成基因和/或信息素应答基因的破坏
[0071] 本申请提供的方法包括在经遗传修饰的微生物细胞中功能性破坏一个或多个孢子形成基因和/或一个或多个信息素应答基因。在一些实施方式中，一个或多个孢子形成基因的破坏产生了缺乏孢子形成能力的经遗传修饰的微生物，特别是缺乏孢子形成能力的经遗传修饰的二倍体微生物。在一些实施方式中，一个或多个信息素应答基因被破坏，生成了具有内源性交配障碍的微生物细胞。在一些实施方式中，一个或多个孢子形成基因和/或一个或多个信息素应答基因被破坏，生成了具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的微生物细胞。
[0072] 在一些实施方式中，孢子形成基因或信息素应答基因的破坏是利用“破坏构建体”来实现的，破坏构建体引入微生物细胞后，能够特异性地破坏孢子形成基因或信息素应答靶基因，从而使得被破坏的基因丧失功能。在一些实施方式中，靶基因的破坏阻止了功能性蛋白的表达。在一些实施方式中，靶基因的破坏导致被破坏的基因表达无功能的蛋白。在一些实施方式中，通过同源重组，在靶基因位点内整合“破坏序列”，从而实现对孢子形成的靶基因或信息素应答的靶基因的破坏。在这样的实施方式中，破坏构建体包含破坏序列，其侧接有一对核苷酸序列，该核苷酸序列同源于靶基因位点的一对核苷酸序列(同源序列)。当靶基因的靶向部分被破坏构建体替换后，破坏序列阻止靶基因表达功能性的蛋白，或导致靶基因表达无功能的蛋白。
[0073] 可以采用本领域公知的标准的分子生物学技术，来构建能够破坏一个或多个孢子形成基因或信息素应答基因的破坏构建体。例如，可参见Sambrook et al.，2001，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY， 和 Ausubel et al.，eds.，Current Edition，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。在实施本申请所述的方法时，可以改变破坏构建体的多种参数，包括但不限于，同源序列的长度；同源序列的核苷酸序列；破坏序列的长度；破坏序列的核苷酸序列；和靶基因的核苷酸序列。在一些实施方式中，每一个同源序列的有效长度范围是50到
5000个碱基对。在具体的实施方式中，每一个同源序列的长度约为500个碱基对。有关基因靶向所需的同源性长度的讨论，可参见Hasty et al.，Mol Cell Biol 11：5586-91(1991)。
在一些实施方式中，同源序列包含靶基因的编码序列。在其他实施方式中，同源序列包含靶基因的上游或下游序列。在一些实施方式中，一个同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因编码序列5’端的核苷酸序列，而另一个同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因3’端的核苷酸序列。在一些实施方式中，破坏序列包含编码标记物的核苷酸序列，其能够用于选择包含破坏序列的微生物细胞。因此，在这样的实施方式中，破坏构建体具有双重功能，即，功能性破坏靶基因，并且提供选择标记物，用于鉴定靶基因被功能性破坏的细胞。在一些实施方式中，将终止密码子置于编码选择标记物的核苷酸序列的表达框内且位于其下游，以阻止翻译连读，避免产生具有靶基因编码的野生型蛋白的一定程度活性的融合蛋白。
在一些实施方式中，破坏序列的长度是一个碱基对。插入单个碱基对就足以破坏靶基因，因为在编码序列中插入单个碱基对能够造成移码突变，从而阻止功能性蛋白的表达。在一些实施方式中，破坏序列的核苷酸序列与位于同源序列之间的靶基因的核苷酸序列有单个碱基对的不同。通过用破坏序列替换靶基因序列中的核苷酸序列，可引入单碱基对替换，从而导致蛋白的关键位点的一个氨基酸被替换，并且表达无功能的蛋白。但是，应当认识到，采用非常短的破坏序列造成的破坏很容易通过自发突变回复为野生型序列，从而导致宿主菌株的交配能力和孢子形成能力恢复。因此，在具体的实施方式中，破坏序列长于一个到几个碱基对。另一个极端是，过长的破坏序列并不比长度适中的破坏序列具有任何优势，并且还可能降低转染或靶向的效率。在这里，过长的长度比在靶基因中选定的同源序列之间的距离长很多倍。因此，在某些实施方式中，破坏序列的长度可以是从2到2000个碱基对。在另外的实施方式中，破坏序列的长度近似地等于与破坏构建体中的同源序列相匹配的靶基因位点的区域之间的距离。
5000个碱基对。在具体的实施方式中，每一个同源序列的长度约为500个碱基对。有关基因靶向所需的同源性长度的讨论，可参见Hasty et al.，Mol Cell Biol 11：5586-91(1991)。
在一些实施方式中，同源序列包含靶基因的编码序列。在其他实施方式中，同源序列包含靶基因的上游或下游序列。在一些实施方式中，一个同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因编码序列5’端的核苷酸序列，而另一个同源序列包含的核苷酸序列同源于位于靶基因3’端的核苷酸序列。在一些实施方式中，破坏序列包含编码标记物的核苷酸序列，其能够用于选择包含破坏序列的微生物细胞。因此，在这样的实施方式中，破坏构建体具有双重功能，即，功能性破坏靶基因，并且提供选择标记物，用于鉴定靶基因被功能性破坏的细胞。在一些实施方式中，将终止密码子置于编码选择标记物的核苷酸序列的表达框内且位于其下游，以阻止翻译连读，避免产生具有靶基因编码的野生型蛋白的一定程度活性的融合蛋白。
在一些实施方式中，破坏序列的长度是一个碱基对。插入单个碱基对就足以破坏靶基因，因为在编码序列中插入单个碱基对能够造成移码突变，从而阻止功能性蛋白的表达。在一些实施方式中，破坏序列的核苷酸序列与位于同源序列之间的靶基因的核苷酸序列有单个碱基对的不同。通过用破坏序列替换靶基因序列中的核苷酸序列，可引入单碱基对替换，从而导致蛋白的关键位点的一个氨基酸被替换，并且表达无功能的蛋白。但是，应当认识到，采用非常短的破坏序列造成的破坏很容易通过自发突变回复为野生型序列，从而导致宿主菌株的交配能力和孢子形成能力恢复。因此，在具体的实施方式中，破坏序列长于一个到几个碱基对。另一个极端是，过长的破坏序列并不比长度适中的破坏序列具有任何优势，并且还可能降低转染或靶向的效率。在这里，过长的长度比在靶基因中选定的同源序列之间的距离长很多倍。因此，在某些实施方式中，破坏序列的长度可以是从2到2000个碱基对。在另外的实施方式中，破坏序列的长度近似地等于与破坏构建体中的同源序列相匹配的靶基因位点的区域之间的距离。
[0074] 在一些实施方式中，破坏构建体是线性DNA分子。在其他实施方式中，破坏构建体是环状DNA分子。在一些实施方式中，环状破坏构建体包含一对被破坏序列分隔的同源序列，如上文所述。在一些实施方式中，环状破坏构建体包含单个同源序列。当整合到靶基因位点上时，这样的环状破坏构建体变为线性，部分同源序列位于两端，破坏构建体中其余的区段插入并破坏靶基因，并且不替换靶基因的任何核苷酸序列。在具体的实施方式中，环状破坏构建体中的单个同源序列与位于靶基因编码序列内的序列同源。
[0075] 可以用本领域技术人员已知的不限的任何方法，将破坏构建体引入微生物细胞。这样的方法包括但不限于，使细胞从溶液中直接摄取该分子，或通过脂质体转染法促进摄取，采用例如，脂质体或免疫脂质体；颗粒介导的转染；等等。例如，可参见美国专利5,272,065；Goeddel et al.，eds，1990，Methods in Enzymology，vol.185，Academic Press，Inc.，CA；Krieger，1990，Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual，Stockton Press，NY；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY；and Ausubel et al.，eds.，Current Edition，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。转化酵母的具体方法是本领域的公知常识。参见Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USD 75：1292-3(1978)；Cregg et al.，Mol.Cell.Biol.5：3376-3385(1985)。示例性技术包括但不限于，原生质体法，电穿孔法，PEG1000介导的转化，和醋酸锂或氯化锂介导的转化。
[0076] 5.2.3.1信息素应答基因
[0077] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE5。STE5基因编码一种结构蛋白，其在通过酵母交配通路向丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)直接传递信号时是必需的。例如，可参见Good et al.，Cell Mar 20；136(6)：1085-97(2009)。代表性的酿酒酵母中的STE5核苷酸序列包括，Genbank登录号L23856以及本申请提供的SEQ ID NOS：17、45、73、101和129。代表性的酿酒酵母Ste5蛋白序列包括，Genbank登录号AAA35115，以及本申请提供的SEQ ID NOS：18、46、74、102和130。
[0078] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE4。STE4基因编码G蛋白的β亚基，其与Ste18p形成二聚体，以激活交配信号通路。酿酒酵母中的STE4基因的序列已有描述(Dujon et al.，Nature 387(6632Suppl)：98-102(1997))。代表性的酿酒酵母中的STE4核苷酸序列包括，Genbank登录号
NC_001147.5，以及本申请提供的SEQ ID NOS：19、47、75、103和131。代表性的酿酒酵母的Ste4蛋白序列包括，Genbank登录号NP_014855，以及本申请提供的SEQ ID NOS：20、48、76、
104和132。
NC_001147.5，以及本申请提供的SEQ ID NOS：19、47、75、103和131。代表性的酿酒酵母的Ste4蛋白序列包括，Genbank登录号NP_014855，以及本申请提供的SEQ ID NOS：20、48、76、
104和132。
[0079] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE18。STE18基因编码G蛋白γ亚基，其与Ste4p形成二聚体，以激活交配信号通路。酿酒酵母中的STE18基因的序列已有描述(Goffeau et al.，Science 274(5287)：546-547(1996))。代表性的酿酒酵母中的STE18核苷酸序列包括，Genbank登录号
NC_001147.5，以及本申请提供的SEQ ID NOS：21、49、77、105和133。代表性的酿酒酵母的Ste18蛋白序列包括，Genbank登录号NP_012619，以及本申请提供的SEQ ID NOS：22、50、
78、106和134。
NC_001147.5，以及本申请提供的SEQ ID NOS：21、49、77、105和133。代表性的酿酒酵母的Ste18蛋白序列包括，Genbank登录号NP_012619，以及本申请提供的SEQ ID NOS：22、50、
78、106和134。
[0080] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE12。STE12基因编码一种转录因子，其由MAP激酶信号级联放大激活，并且还激活与交配或假菌丝/侵袭生长通路相关的基因。酿酒酵母中的STE12基因的序列已有描述(Goffeau et al.，Science 274(5287)：546-547(1996))。代表性的酿酒酵母的STE12核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001140.5，以及本申请提供的SEQ ID NOS：23、51、79、107和135。代表性酿酒酵母的Ste12蛋白序列包括，Genbank登录号NP_011952，以及本申请提供的SEQ IDNOS：24、52、80、108和136。
[0081] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE7。STE7基因编码转导信号的MAP激酶，其参与信息素应答过程，其间磷酸化Fus3p。酿酒酵母中的STE7基因的序列已有描述(Teague et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.83(19)：7371-5(1986))。代表性的酿酒酵母的STE7核苷酸序列包括，Genbank登录号Z74207，以及本申请提供的SEQ ID NOS：25、53、81、109和137。代表性酿酒酵母的Ste7蛋白序列包括，Genbank登录号CAA98732，以及本申请提供的SEQ ID NOS：26、54、82、110和
138。
138。
[0082] 在一些实施方式中，采用本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的信息素应答基因是STE11。STE11基因编码转导信号的MEK激酶，其参与信息素应答过程和假菌丝/侵袭生长通路，其间磷酸化Ste7p。酿酒酵母中的STE11基因的序列已有描述(Johnston et al.，Nature 387(6632Suppl)，87-90(1997))。代表性的酿酒酵母的STE11核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001144.4，以及本申请提供的SEQ ID NOS：27、55、83、111和139。代表性酿酒酵母的Ste11蛋白序列包括，Genbank登录号NP_013466，以及本申请提供的SEQ ID NOS：28、56、84、112和140。
[0083] 5.2.3.2孢子形成基因
[0084] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是IME1。IME1基因编码一种转录因子，其激活早期减数分裂基因转录，为启动减数分裂所必需。酿酒酵母细胞的IME1基因序列已有报道。例如，可参见，Smith，H.E.，et al.，Mol.Cell.Biol.10(12)：6103-6113(1990)。代表性的酿酒酵母IME1核苷酸序列包括，Genbank登录号M37188，和本申请提供的SEQ ID NOS：1、29、57、85和113。代表性的酿酒酵母Ime1蛋白序列包括，Genbank登录号AAA86790，和本申请提供的SEQ ID NOS：2、30、58、86和114。
[0085] 在一些实施方式中，按照本发明提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是IME2。IME2基因编码参与激活减数分裂的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。酿酒酵母细胞的IME2基因序列已有报道。例如，可参见，EMBO J.15(9)，2031-2049(1996)。代表性的酿酒酵母IME2核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001142，和本申请提供的SEQ ID NOS：3、31、59、87和115。代表性的酿酒酵母Ime2蛋白序列包括，Genbank登录号NP_012429，和本申请提供的SEQ ID NOS：4、32、60、88和116。
[0086] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是NDT80。NDT80基因编码减数分裂特异性的转录因子，其为结束粗线期以及完全减数分裂重组所必需。Ndt80蛋白也激活中期孢子形成基因。酿酒酵母细胞的NDT80基因序列已有报道。例如，可参见，Goffeau et al.，Science 274(5287)：546-547(1996)。代表性的酿酒酵母NDT80核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001140，和本申请提供的SEQ ID NOS：5、33、61、89和117。代表性的酿酒酵母Ndt80蛋白序列包括，Genbank登录号NP_011992，和本发明提供的SEQ ID NOS：6、34、62、90和118。
[0087] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是SPO11。SPO11基因为减数分裂重组所必需。酿酒酵母细胞的SPO11基因序列已有报道。例如，可参见，Atcheson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(22)，8035-8039(1987)。
代表性的酿酒酵母SPO11核苷酸序列包括，Genbank登录号J02987，和本申请提供的SEQ ID NOS：7、35、63、91和119。代表性的酿酒酵母Spo11蛋白序列包括，Genbank登录号AAA65532，和本申请提供的SEQ ID NOS：8、36、64、92和120。
代表性的酿酒酵母SPO11核苷酸序列包括，Genbank登录号J02987，和本申请提供的SEQ ID NOS：7、35、63、91和119。代表性的酿酒酵母Spo11蛋白序列包括，Genbank登录号AAA65532，和本申请提供的SEQ ID NOS：8、36、64、92和120。
[0088] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是SPO20。SPO20基因编码减数分裂特异性的t-SNARE复合物的亚基，在孢子形成过程中其为形成前孢子体膜所必需。酿酒酵母细胞的SPO20基因序列已有报道。例如，可参见，Bowman et al.，Nature 387(6632 Suppl)，90-93(1997)。代表性的酿酒酵母SPO20核苷酸序列包括，Genbank登录号AF078740，和本申请提供的SEQ ID NOS：9、37、65、93和121。代表性的酿酒酵母Spo20蛋白序列包括，Genbank登录号NP_013730，和本申请提供的SEQ ID NOS：10、38、66、94和122。
[0089] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是AMA1。AMA1基因编码减数分裂后期促进复合物的激活剂。酿酒酵母细胞的AMA1基因序列已有报道。例如，可参见，Tettelin et al.，Nature 387(6632Suppl)：81-84(1997)。代表性的酿酒酵母AMA1核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001139.8，和本申请提供的SEQ ID NOS：11、39、67、95和123。代表性的酿酒酵母Ama1蛋白序列包括，Genbank登录号NP_011741，和本申请提供的SEQ ID NOS：12、40、68、96和124。
[0090] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是HOP2。HOP2基因编码减数分裂特异性的蛋白，其确保同源染色体间的结合。酿酒酵母细胞的HOP2基因序列已有报道。例如，可参见，Leu et al.，Cell 94(3)：375-386(1998)。代表性的酿酒酵母HOP2核苷酸序列包括，Genbank登录号AF_078740.1，和本申请提供的SEQ ID NOS：13、41、69、97和125。代表性的酿酒酵母的Hop2蛋白序列包括，Genbank登录号AAC31823，和本申请提供的SEQ ID NOS：14、42、70、98和126。
[0091] 在一些实施方式中，按照本申请提供的方法在酵母细胞中破坏的孢子形成基因是SPO21。SPO21基因编码纺锤体极体的减数分裂外斑块的组份，其参与修饰减数分裂外斑块，为前孢子体膜形成所必需。酿酒酵母细胞的SPO21基因序列已有报道。例如，可参见，Dujon et al.，Nature 387(6632Suppl)：98-102(1997)。代表性的酿酒酵母SPO21核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001147.5，和本申请提供的SEQ ID NOS：15、43、71、99和127。代表性的酿酒酵母Spo21蛋白序列包括，Genbank登录号NP_014550，和本申请提供的SEQ ID NOS：16、44、72、100和128。
[0092] 5.2.4二倍体的制备
[0093] 本申请提供的方法包括在单倍体细胞间诱导交配的步骤，所述细胞包含在一个或多个孢子形成基因中的功能性破坏和/或在一个或多个信息素应答基因中的功能性破坏。由所述交配生成的二倍体细胞是稳定的二倍体细胞，由于细胞的一个或多个孢子形成基因被功能性破坏，因而被限制于二倍体状态。
[0094] 为了从缺乏交配能力的单倍体细胞形成二倍体细胞，将交配障碍的单倍体细胞用“交配互补质粒”转化，即，包含可以互补于交配缺陷的异源基因的重组质粒，所述交配缺陷是由于一个或多个信息素应答基因被功能性破坏而导致。在单倍体细胞中瞬时表达的异源信息素应答基因可以暂时恢复细胞的交配功能，并且使相反交配型的单倍体细胞能够形成稳定的二倍体细胞。特别地，由此生成的稳定的二倍体细胞由于是从具有相同的经遗传修饰的种群中的单倍体产生，故除了交配型等位基因外是纯合的。
[0095] 因此，在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE5基因中的功能性破坏，用包含STE5编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE4基因中的功能性破坏，用包含STE4编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE18基因中的功能性破坏，用包含STE18编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE12基因中的功能性破坏，用包含STE12编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE7基因中的功能性破坏，用包含STE7编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。在一些实施方式中，单倍体细胞包含在STE11基因中的功能性破坏，用包含STE11编码序列的交配互补质粒转化单倍体细胞。
[0096] 表达载体的构建技术以及在含有表达载体的细胞中表达基因的技术是本领域的公知常识。例如，可参见，Sambrook et al.，2001，Molecular Cloning--ALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY 和Ausubel et al.，eds.，Current Edition，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。可以使用本领域技术人员公知的任何方法，将编码交配互补基因的质粒导入宿主细胞中。
[0097] 基于质粒的系统通常需要对质粒施加选择压力，以维持细胞内的外源DNA。酵母中的大多数质粒是相对不稳定的，因为每次有丝分裂后，酵母细胞通常会丢失细胞中10％的质粒。因此，在一些实施方式中，通过允许二倍体细胞经历足够的有丝分裂，使得质粒在种群中被有效稀释，由此筛选得到通过单倍体细胞交配生成的二倍体细胞，这些单倍体细胞包含编码交配互补基因的质粒，但其自身并不包含该质粒。可选择地，可以通过选择质粒的缺乏来筛选二倍体细胞，例如，通过筛选反选择标记物(例如，URA3)，或者将同样的菌落接种到选择性培养基及非选择性培养基上，然后选择在选择性培养基上不生长而在非选择性培养基上生长的菌落。
[0098] 在一些实施方式中，本申请提供的方法包括用编码同宗配合(HO)蛋白的重组质粒转化单倍体异宗配合(ho)酵母细胞的步骤，其中HO蛋白的表达能够诱导单倍体交配型的转换。酿酒酵母的HO基因的序列已有报道。例如，可参见，Russell et al.，Mol.Cell.Biol.6(12)：4281-4294(1986)。代表性的酿酒酵母HO核苷酸序列包括，Genbank登录号NC_001136，和本申请提供的SEQ ID NO：151。代表性的酿酒酵母HO蛋白序列包括，Genbank登录号NP_010054，和本申请提供的SEQ ID NO：152。
[0099] 6.实施例
[0100] 6.1实施例1：经遗传修饰的单倍体细胞的产生
[0101] 本实施例描述了一种产生经遗传修饰的单倍体酿酒酵母细胞的示例方法。
[0102] 第I阶段破坏构建体(图1；SEQ ID NO：141)包含作为破坏序列的编码选择标记物(hygA，提供对潮霉素B的抗性)的核苷酸序列；酿酒酵母MEV通路的两种酶(截短的HMG1编码序列，其编码截短的HMG-CoA还原酶，以及ERG13编码序列，其编码HMG-CoA合酶)，和酿酒酵母的另一种酶(ERG10编码序列，其编码乙酰乙酰-CoA硫解酶)，置于半乳糖诱导启动子(酿酒酵母基因GAL1和GAL10的启动子)的调控下；侧接有由酿酒酵母GAL80位点的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第I阶段的破坏构建体可以通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的GAL80位点，通过用其中的破坏序列替换GAL80的编码序列，从而功能性破坏GAL80位点。第I阶段破坏构建体克隆到TOPO Zero Blunt II克隆载体上(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生了质粒TOPO-第I阶段破坏构建体。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上生长的TOP10细胞中扩增该构建体。
[0103] 第II阶段破坏构建体(图2；SEQ ID NO：142)包含作为破坏序列的编码选择标记物(natA，提供对诺尔斯菌素的抗性)的核苷酸序列，以及酿酒酵母MEV通路中的一些酶(ERG12编码序列，其编码甲羟戊酸激酶，和ERG8编码序列，其编码磷酸甲羟戊酸激酶)，置于半乳糖诱导启动子(酿酒酵母基因GAL1和GAL10的启动子)的调控下；还有酿酒酵母GAL4基因的编码序列，置于GAL4oc启动子(GAL4启动子包含除去MIG1结合位点的突变，因此使启动子对葡萄糖的抑制不敏感)的调控下；侧接有由酿酒酵母LEU2位点的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第II阶段的破坏构建体可以通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的LEU2位点，通过用其中的破坏序列取代LEU2的编码序列，从而功能性破坏LEU2位点。第II阶段破坏构建体克隆到TOPO Zero Blunt II克隆载体上，产生了质粒TOPO-第II阶段破坏构建体。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上生长的TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中扩增该构建体。
[0104] 第III阶段破坏构建体(图3；SEQ ID NO：143)包含作为破坏序列的编码选择标记物(kanA，提供对G418的抗性)的核苷酸序列；酿酒酵母MEV通路的酶(ERG19编码序列，其编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)，以及酿酒酵母的两种酶，其参与将MEV通路的产物IPP转换为FPP(ERG20编码序列编码法尼基焦磷酸合酶，和IDI1编码序列编码异戊酸焦磷酸脱羟酶)，置于半乳糖诱导启动子(酿酒酵母基因GAL1、GAL10和GAL7的启动子)的调控下；还有酿酒酵母CTR3基因的启动子；侧接有酵母ERG9位点的上游和编码核苷酸序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第II阶段的破坏构建体可以通过同源重组整合到酿酒酵母宿主细胞基因组中的ERG9位点的上游，将天然的ERG9启动子替换为CTR3启动子，使得ERG9(角鲨烯合酶)的表达可以被铜调节。第III阶段破坏构建体克隆到TOPO Zero Blunt II克隆载体上，产生了质粒TOPO-第III阶段破坏构建体。在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上生长的TOP10细胞中扩增构建体。
[0105] 第I阶段标记物循环构建体(图4；SEQ ID NO：144)包含编码选择标记物(URA3，提供在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的能力)的核苷酸序列；A.annua的酶(FS编码序列，其编码金合欢烯合酶)，置于酿酒酵母GAL7基因的启动子的调控下；侧接有酿酒酵母GAL80位点的上游核苷酸序列和酿酒酵母HMG1基因的编码序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第I阶段标记物循环构建体可以通过同源重组整合到已经整合的第I阶段破坏序列中，从而使选择标记物hphA被替换为URA3。
[0106] 第II阶段标记物循环构建体(图5；SEQ ID NO：145)包含编码选择标记物(URA3，提供在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的能力)的核苷酸序列；A annua的酶(FS编码序列，编码金合欢烯合酶)，置于酿酒酵母GAL7基因的启动子的调控下；侧接有酿酒酵母LEU2位点的上游核苷酸序列和酿酒酵母ERG12基因的编码序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第II阶段标记物循环构建体可以通过同源重组整合到已经整合的第II阶段破坏序列中，从而使选择标记物natA被替换为URA3。
[0107] 第III阶段标记物循环构建体(图6；SEQ ID NO：146)包含编码选择标记物(URA3，提供在缺乏尿嘧啶的培养基上生长的能力)的核苷酸序列；A.annua的酶(FS编码序列，编码金合欢烯合酶)，置于酿酒酵母GAL7基因启动子的调控下；侧接有酿酒酵母ERG9位点的上游核苷酸序列和酿酒酵母ERG19基因的编码序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，第II阶段标记物循环构建体可以通过同源重组整合到已经整合的第III阶段破坏序列中，从而使选择标记物kanA被替换为URA3。
[0108] 表达质粒pAM404(SEQ ID NO：153)编码β-金合欢烯合酶。插入核苷酸序列是通过合成产生，以青蒿的β-金合欢烯合酶基因(GenBank登录号AY835398)的编码序列为模板，并优化了密码子以适合在酿酒酵母中的表达。
[0109] 在含有100ug/mL羧苄青霉素和50ug/mL卡那霉素的5mLYPD培养基中，重悬浮活性PE-2干酵母(1994年分离，受赠于Santelisa Vale， Brazil)，产生起始宿主菌株Y1198。培养物在30℃，200rpm的旋转振荡器中培养过夜。每10uL培养物在YPD平板上铺板，放置干燥。细胞连续划线以产生单菌落，在30℃培养2天。挑选12个单菌落，在新的YPD平板上铺板，在30℃生长过夜。根据制造商的说明书，使用Bio-Rad CHEF Genomic DNA Plug试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)在Bio-Rad CHEF DR II系统(Bio-Rad，Hercules，CA)上分析它们的染色体尺寸，以确定菌落的菌种。挑取一个菌落，作为菌种Y1198保存。
[0110] 通过使菌株Y1198成为单倍体以允许遗传工程操作，从而生成菌株Y1661、Y1662、Y1663和Y1664。将菌种Y1198置于滚筒中的玻璃管中，在30℃，5mLYPD培养基中生长过夜。测量OD600，用含有2％醋酸钾的5mL YP培养基将细胞稀释至OD600为0.2。培养物置于滚筒中的玻璃管中，在30℃生长过夜。再次测量OD600，5,000x g离心2分钟，收集4OD600*mL的细胞。细胞沉淀用无菌水清洗一次，然后重悬于3mL含有0.02％棉子糖的2％醋酸钾中。
细胞放置于滚筒中的玻璃管中，在30℃生长3天。通过显微镜证实孢子的形成。将33μL培养物转移至1.5mL离心管中，14,000rpm离心2分钟。细胞沉淀重悬于含有2μL 10mg/mL Zymolyase 100T(MP Biomedicals，Solon，OH)的50μL无菌水中，细胞在30℃水浴中培养
10分钟。离心管转移至冰上，并加入150μL冰水。将10μL的该混合物加入到12mL YPD平板上，在Singer MSM 300解剖显微镜(Singer，Somerset，UK)下分割四分体。YPD平板在30℃培养3天，之后将孢子接种到新鲜的YPD平板上，30℃生长过夜。通过菌落PCR，分析
8个四孢子的四分体中每个孢子的交配型。挑取具有2个MATa和2个MATα孢子的单个4孢子四分体，并保存为菌种Y1661(MATa)、Y1662(MATa)、Y1663(MATα)和Y1664(MATα)。
细胞放置于滚筒中的玻璃管中，在30℃生长3天。通过显微镜证实孢子的形成。将33μL培养物转移至1.5mL离心管中，14,000rpm离心2分钟。细胞沉淀重悬于含有2μL 10mg/mL Zymolyase 100T(MP Biomedicals，Solon，OH)的50μL无菌水中，细胞在30℃水浴中培养
10分钟。离心管转移至冰上，并加入150μL冰水。将10μL的该混合物加入到12mL YPD平板上，在Singer MSM 300解剖显微镜(Singer，Somerset，UK)下分割四分体。YPD平板在30℃培养3天，之后将孢子接种到新鲜的YPD平板上，30℃生长过夜。通过菌落PCR，分析
8个四孢子的四分体中每个孢子的交配型。挑取具有2个MATa和2个MATα孢子的单个4孢子四分体，并保存为菌种Y1661(MATa)、Y1662(MATa)、Y1663(MATα)和Y1664(MATα)。
[0111] 为转化酵母细胞，将起始宿主菌株的单菌落接种到25ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基中。培养物在30℃，200rpm旋转振荡器中过夜生长。检测培养物的OD600，之后将培养物接种于50ml YPD培养基中，至OD600为0.15。新接种的培养物在30℃，200rpm旋转振荡器中生长，直到OD600为0.7到0.9，此时用1μg DNA转化细胞。将细胞在YPD培养基中恢复4个小时，然后将其铺板到含有选择剂的琼脂糖上，以鉴定宿主细胞转化株。
[0112] 将质粒TOPO-第I阶段破坏构建体用PmeI限制性内切酶消化完全，转化菌株Y1664，生成宿主菌株Y1515。在含有300ug/mL潮霉素B的YPD培养基上，选择宿主细胞转化株。通过PCR扩增，鉴定包含整合在GAL80位点的第I阶段破坏序列的阳性转化株。
[0113] 将质粒TOPO-第II阶段破坏构建体用PmeI限制性内切酶消化完全，转化菌株Y1515，生成宿主菌株Y1762。在含有100ug/mL诺尔斯菌素的YPD培养基上，选择宿主细胞转化株。通过PCR扩增，鉴定包含整合在LEU2位点的第II阶段破坏序列的阳性转化株。
[0114] 将表达质粒pAM404和质粒TOPO-第III阶段破坏构建体用PmeI限制性内切酶消化完全，通过两个步骤转化菌株Y1762，生成宿主菌株Y1770。在不含甲硫氨酸和亮氨酸的完全合成培养基(CSM)中，选择带有pAM404的宿主细胞转化株。在不含甲硫氨酸和亮氨酸以及含有200ug/mL G418(Geneticin )的CSM上，选择带有pAM404和第III阶段破坏构建体的宿主细胞转化株，通过PCR扩增，鉴定包含整合在ERG9位点的第III阶段破坏序列的阳性转化株。
[0115] 通过用URA3敲除构建体(SEQ ID NO：154)转化菌株Y1770，生成宿主菌株Y1793。URA3敲除构建体包含URA3位点的上游和下游序列(由酿酒酵母菌株CEN.PK2基因组DNA生成)。在含有5-FOA的YPD培养基上挑选宿主细胞转化株。
[0116] 通过用第一阶段标记物循环构建体转化菌株Y1793，生成宿主菌株YAAA。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上挑选宿主细胞转化株。在YPD培养基中，200rpm旋转振荡器上，在30℃过夜培养细胞，然后把细胞接种在含有5-FOA的琼脂上，从而切除URA3标记物。用菌落PCR验证标记物的切除。
[0117] 通过用第II阶段标记物循环构建体转化菌株YAAA，生成宿主菌株YBBB。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑选宿主细胞转化株。在YPD培养基中，200rpm旋转振荡器上，在30℃过夜培养细胞，然后把细胞接种在含有5-FOA的琼脂上，从而切除URA3标记物。用菌落PCR验证标记物的切除。
[0118] 通过用第III阶段标记物循环构建体转化菌株YBBB，生成宿主菌株Y1912。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑选宿主细胞转化株。在YPD培养基中，200rpm旋转振荡器上，在30℃过夜培养细胞，然后把细胞接种在含有5-FOA的琼脂上，从而切除URA3标记物。用菌落PCR验证标记物的切除。
[0119] 6.2实施例2：经遗传修饰的具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的单倍体细胞的产生
[0120] 本实施例描述了一种在经遗传修饰的单倍体酿酒酵母细胞中，破坏孢子形成基因和信息素应答基因，以产生具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的经遗传修饰的单倍体酿酒酵母细胞的示例方法。
[0121] STE5破坏构建体(图7；SEQ ID NO：147)包含作为破坏序列的编码选择标记物(URA3，提供在不含尿嘧啶的培养基上生长的能力)的核苷酸序列，酿酒酵母MEV通路的酶(截短的HMG1编码序列，编码截短的HMG-CoA还原酶)，置于酿酒酵母TDH3基因启动子的调控下；侧接有由酿酒酵母STE5位点的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，可以通过同源重组将STE5破坏构建体整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的STE5位点，将STE5的编码序列替换为破坏序列，从而功能性破坏STE5位点。
[0122] IME1破坏构建体(图8；SEQ ID NO：148)包含作为破坏序列的编码选择标记物(LEU2，提供在不含亮氨酸的培养基上生长的能力)的核苷酸序列，A.annua的酶(FS编码序列，其编码金合欢烯合酶)，置于酿酒酵母TDH3基因启动子的调控下；侧接有由酿酒酵母IME5位点的上游和下游核苷酸序列组成的同源序列。当转入到酿酒酵母宿主细胞时，可以通过同源重组将IME1破坏构建体整合到酿酒酵母宿主细胞基因组的IME1位点，将IME1的编码序列替换为破坏序列，从而功能性破坏IME1位点。
[0123] 通过用STE5破坏构建体(见实施例1)转化菌株Y1912，生成宿主菌株Y1913。在不含甲硫氨酸和尿嘧啶的CSM上，挑选宿主细胞转化株。通过PCR扩增，鉴定阳性转化株。
[0124] 通过将菌株Y1913从pAM404中恢复(curing)，并用IME1破坏构建体转化所获得的宿主，生成菌株Y1915。在200rpm旋转振荡器中，在30℃下，将菌株Y1913在非选择性YPD培养基中增殖3天。将大约100个细胞铺板到YPD固体培养基上，在30℃生长3天，然后将其复制接种到不含甲硫氨酸和亮氨酸的CSM平板上，继续在30℃生长3天。在含有亮氨酸的基本培养基上具有生长能力，且在不含亮氨酸的培养基上无法生长的细胞被鉴定为恢复的细胞。挑选这样的单一菌落，然后用IME1破坏构建体转化。在不含甲硫氨酸和亮氨酸的CSM上，挑选宿主细胞转化株。
[0125] 6.3实施例3：经遗传修饰的具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的二倍体细胞的产生
[0126] 本实施例描述了一种示例方法，用于使具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的经遗传修饰单倍体酿酒酵母细胞成为二倍体。
[0127] 二倍体宿主菌株Y1979是由菌株Y1915自交配产生的。为了产生相反交配型的细胞，并使菌株Y1915具有短暂的交配能力，用编码HO蛋白质和诺尔斯菌素抗性标记物的质粒pAM1124(SEQ ID NO：149)和编码STE5和G418抗性标记物的质粒pAM1758(SEQ ID NO：150)共转化菌株。在含有G418和诺尔斯菌素的CSM上挑选宿主细胞转化株。在非选择性培养基上重新铺板阳性转化株，使成单菌落，通过菌落PCR筛选，鉴定对G418和诺尔斯菌素敏感的二倍体。
[0128] 6.4实施例4：对孢子形成障碍和内源性交配障碍的证实
[0129] 本实施例描述了一种示例的方法，用来证实经遗传修饰的酿酒酵母细胞具有孢子形成障碍和内源性交配障碍。
[0130] 为了证实菌株Y1915没有交配能力，将单倍体Y1915细胞(MATαKansURA3^ste5)s或者单倍体Y1912细胞(MATαKanURA3STE5)在YEPD固体培养基上与单倍体Y1792细胞R
(MATa Kan ura3STE5)结合。交配培养物在30℃培养16小时。将相同量的每种交配培养物铺板到不含尿嘧啶且含有G418的CSM固体培养基上，培养物在30℃培养一周。如图9所示，只有在含有等量的Y1792x Y1912交配培养物的平板上可以观察到菌落生长，而在含有等量的Y1792x Y1915培养物的平板上观察不到。
(MATa Kan ura3STE5)结合。交配培养物在30℃培养16小时。将相同量的每种交配培养物铺板到不含尿嘧啶且含有G418的CSM固体培养基上，培养物在30℃培养一周。如图9所示，只有在含有等量的Y1792x Y1912交配培养物的平板上可以观察到菌落生长，而在含有等量的Y1792x Y1915培养物的平板上观察不到。
[0131] 为了确认菌株Y1979没有孢子形成的能力，菌株Y1979细胞和菌株Y1198细胞在孢子形成诱导培养基(培养基中不含非发酵碳源，如醋酸钾，其可以诱导天然的酿酒酵母细胞停止细胞有丝分裂周期而进入减数分裂和孢子形成)中培养7天。随后将培养物分成几份，并用水或乙醚处理15分钟。通过倒置使悬液均匀，在无菌水中重悬，稀释，铺板到YEPD固体培养基上，生长3天。如图10所示，95％的菌株Y1198的细胞形成了四分体孢子，而同样的条件下的菌株Y1979的细胞则没有。
[0132] 6.5实施例5：对具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的细胞在自然界中没有传播能力的证实
[0133] 本实施例描述了一种示例方法，用以证实具有内源性交配障碍的经遗传修饰的酿酒酵母细胞没有孢子形成能力，在自然界中不能传播。
[0134] 评估了Y1979以及其非转基因的等基因系Y1198(PE-2)在土壤中的存活。为此，在45L烧瓶中加入大约25％的蛭石和75％的甘蔗园土壤(共40L)，并种植了1Saccharum属，RB 86-7515甘蔗植物品种(大约6个月大)。每盆用5-25-30的氮/磷/钾混合物施肥，植物在隔离温室中生长14天。每盆加入600mL菌株Y1979或菌株Y1198的细胞悬液。7
使用的酵母细胞的量相当于在土壤第一表面的5cm能达到10 个细胞/g的浓度。按照下面的时间点收集五个1.5x 5cm的土壤核心的样品：t＝0(暴露前)、0(暴露后)、3、7、14、
28、40、60和90天(土壤样品总体积为44mL，土壤样品总重量大约50g)。从复合样品中分离10克，并重悬于100mL蒸馏水中。为了对存活的酵母进行定量，直接在YEPD培养基上铺板100μL水提取物(25mL/板)，培养基用6N硫酸调节至pH 5.5，加入了0.05g/L孟加拉玫瑰红(Sigma#R3877)并含有0.2g/L氨苄青霉素(SigmaA0166)。将样品重复铺板，按
7
照从1-10 的一系列稀释度，或者根据之前每一次处理中取样测得的存活数量来决定接种的稀释倍数。铺板液体后，立即用Drigalski铲把液体涂开。平板开口放置30分钟，使液体完全蒸发，然后盖上，倒置，在30℃培养48小时。在可以计数的稀释度中，用菌落计数器(CP600Plus，Phoenix)计数每板的菌落数量，结果表示为CFU/板。只有总菌落数在30-300个菌落时，计数才有效。如图11所示(每个数据都是五次重复的平均数)，Y1979细胞在土壤中生存力明显低于未经遗传修饰的且能高效形成孢子和交配的菌株Y1198的母细胞。
使用的酵母细胞的量相当于在土壤第一表面的5cm能达到10 个细胞/g的浓度。按照下面的时间点收集五个1.5x 5cm的土壤核心的样品：t＝0(暴露前)、0(暴露后)、3、7、14、
28、40、60和90天(土壤样品总体积为44mL，土壤样品总重量大约50g)。从复合样品中分离10克，并重悬于100mL蒸馏水中。为了对存活的酵母进行定量，直接在YEPD培养基上铺板100μL水提取物(25mL/板)，培养基用6N硫酸调节至pH 5.5，加入了0.05g/L孟加拉玫瑰红(Sigma#R3877)并含有0.2g/L氨苄青霉素(SigmaA0166)。将样品重复铺板，按
7
照从1-10 的一系列稀释度，或者根据之前每一次处理中取样测得的存活数量来决定接种的稀释倍数。铺板液体后，立即用Drigalski铲把液体涂开。平板开口放置30分钟，使液体完全蒸发，然后盖上，倒置，在30℃培养48小时。在可以计数的稀释度中，用菌落计数器(CP600Plus，Phoenix)计数每板的菌落数量，结果表示为CFU/板。只有总菌落数在30-300个菌落时，计数才有效。如图11所示(每个数据都是五次重复的平均数)，Y1979细胞在土壤中生存力明显低于未经遗传修饰的且能高效形成孢子和交配的菌株Y1198的母细胞。
[0135] 本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均在此参考并入，如同其中的每一篇出版物或专利申请都被明确地、单独地指明参考并入一样。虽然为了理解清楚，通过例证和实施例详尽地描述了上述发明，但是本领域普通技术人员很容易知道，在不脱离本发明宗旨或权利要求保护范围的前提下，根据本发明的教导可以对本发明进行某些改变或修饰。
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