一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法
阅读：699发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的目的在于提供一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法，其全过程使用一系列有助于 灰葡萄孢 的孢子积累及保存的技术手段，保证灰葡萄孢孢子的大量繁殖，最终的干粉能够保持原有的活性，将干粉活化喷洒到葡萄上时能成功地感染生成贵腐葡萄。本发明葡萄贵腐菌干粉的制备方法的步骤为：(1)灰葡萄孢的活化培养；(2)灰葡萄孢的液体培养，(3)灰葡萄孢的扩大培养；(4)灰葡萄孢的麸皮培养；(5) 真空 冷冻干燥 。本发明葡萄贵腐菌干粉的使用方法的步骤为：(1)制备乳化剂溶液；(2)制备贵腐菌干粉溶液；(3)分离贵腐菌干粉清液；(4)喷洒接种贵腐菌；(5)监测贵腐葡萄成熟度。，下面是一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法专利的具体信息内容。
1.一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法，其特征在于：所述的制备方法的步骤为：1)灰葡萄孢的活化培养，2)灰葡萄孢的液体培养，3)灰葡萄孢的扩大培养，4)灰葡萄孢的麸皮培养，
5)真空冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法，其特征在于：
1)灰葡萄孢的活化培养：取优选的灰葡萄孢菌株接种于斜面培养基上，在25～28℃恒温培养箱中培养5天；
2)灰葡萄孢的液体培养：挑取1/6步骤1)活化培养后的灰葡萄孢连同PDA培养基接种到深层液体培养基中，在180r/min，25～28℃的摇床培养条件下培养5天；
3)灰葡萄孢的扩大培养：按1％的接种量吸取步骤2)液体培养后的菌液，并接种到培养基上，在180r/min，25～28℃条件下摇床培养5天；
4)灰葡萄孢的麸皮培养：将经过步骤3)扩大培养的灰葡萄孢菌悬液按2％的接种量接种到麸皮培养基中，并充分搅拌，使接种均匀，在25～28℃的恒温培养箱中培养8～10天，麸皮培养基的厚度为1cm左右；
5)真空冷冻干燥：将步骤4)麸皮培养后的灰葡萄孢与麸皮培养基一同取出，真空冷冻干燥24h，制成葡萄贵腐菌干粉，装入锡箔袋中真空包装。
3.根据权利要求1所述的一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法，其特征在于：
所述的步骤1)中的斜面培养基为20％土豆、2％葡萄糖、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、2％琼脂；
所述的步骤2)中的深层液体培养基为3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾；
所述的步骤3)中的培养基为3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、
0.1％磷酸二氢钾；
所述的步骤4)中麸皮培养基为1％葡萄糖溶液：麸皮＝1:1.1的比例配制。
4.如权利要求1所述的一种葡萄贵腐菌干粉的使用方法，其特征在于：所述的方法步骤为：1)制备乳化剂溶液，2)制备贵腐菌干粉溶液，3)分离贵腐菌干粉清液，4)喷洒接种贵腐菌，5)监测贵腐葡萄成熟度。
5.根据权利要求4所述的一种葡萄贵腐菌干粉的使用方法，其特征在于：
步骤1)制备乳化剂溶液：所述的乳化剂溶液为大豆分离蛋白水溶液，先量取大豆分离蛋白，用23～25℃温清水充分溶解，使其浓度为2％；
步骤2)制备贵腐菌干粉溶液：取灰葡萄孢干粉，按1g/L的添加量，添加到步骤1)得到的大豆分离蛋白水溶液中，常温下充分搅拌、超声波或者离心方法使孢子充分脱离麸皮固体表面，得贵腐菌干粉溶液；
步骤3)分离贵腐菌干粉清液：将步骤2)得到的悬浊液，进行固液分离，取清液备用；
步骤4)喷洒接种贵腐菌：按10L/亩的用量，选择连续3～5天下午无雨的日子，在傍晚或清晨连续喷洒孢子溶液3～7日，具体喷洒次数视果穗感染情况而定。
步骤5)监测贵腐葡萄成熟度：果穗感染灰霉菌后，每隔五日测定一次糖、酸含量，合理确定采收期。
一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法
一、技术领域：
[0001] 本发明涉及一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法。二、背景技术：
[0002] 贵腐葡萄酒是源自欧洲的一款很珍贵的甜葡萄酒，因其葡萄原料经过一种 灰霉菌的感染作用而生成。贵腐葡萄生成的自然条件比较苛刻，它需要一种独 特的葡萄园微型气候才能产生——早上阴冷富水气，下午光照炎热、干燥。因 此酒的产量少、价格贵，故名“贵腐酒”。葡萄在接近成熟期感染灰葡萄孢以后 可以发生贵腐作用，以贵腐葡萄为原料可以酿制贵腐葡萄酒。葡萄贵腐化的过 程包括复杂的酶转换和葡萄浆果的脱水，生成更高浓度的糖、酸、甘油、矿物 质和香气成分。特殊的香气包括柑橘类水果、橘皮或葡萄柚、蜂蜜、焦糖、结 晶果、核桃、香料和咖喱等。而且，这些香气成分典型，风味复杂纯正。葡萄 的天然贵腐作用对气候条件的要求十分苛刻，从而天然贵腐葡萄酒的产量很少， 生产贵腐葡萄酒的风险也很大。全世界拥有这种独特地理环境，造就如此苛刻 气候条件的葡萄园产区就那么几个，像波尔多苏玳产区、匈牙利托卡伊产区和 德国莱茵高产区。我国葡萄酒产区的自然条件不满足自然贵腐葡萄的形成。因 此，贵腐葡萄酒的原料不易生产，从而造成贵腐葡萄酒的产品和产量受限。三、发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明的提供一种葡萄贵腐菌干粉的制备方法及其使用方法， 其结合灰葡萄孢的培养及霉菌干粉的制作方法，全过程使用一系列有助于灰葡 萄孢的孢子积累及保存的技术手段，保证灰葡萄孢孢子的大量繁殖，最终的干 粉能够保持原有的活性，将干粉活化喷洒到葡萄上时能成功地感染生成贵腐葡 萄。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种葡萄贵腐菌干粉的制备 方法，其特征在于：所述的制备方法的步骤为：1)灰葡萄孢的活化培养，2) 灰葡萄孢的液体培养，3)灰葡萄孢的扩大培养，4)灰葡萄孢的麸皮培养，5) 真空冷冻干燥。
[0005] 1)灰葡萄孢的活化培养：取优选的灰葡萄孢菌株接种于斜面培养基上，在 25～28℃恒温培养箱中培养5天；
[0006] 2)灰葡萄孢的液体培养：挑取1/6步骤1)活化培养后的灰葡萄孢连同PDA 培养基接种到深层液体培养基中，在180r/min，25～28℃的摇床培养条件下培养 5天；
[0007] 3)灰葡萄孢的扩大培养：按1％的接种量吸取步骤2)液体培养后的菌液， 并接种到培养基上，在180r/min，25～28℃条件下摇床培养5天；
[0008] 4)灰葡萄孢的麸皮培养：将经过步骤3)扩大培养的灰葡萄孢菌悬液按2％ 的接种量接种到麸皮培养基中，并充分搅拌，使接种均匀，在25～28℃的恒温培 养箱中培养8～10天，麸皮培养基的厚度为1cm左右；
[0012] 所述的步骤3)中的培养基为3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％ 硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾；
[0013] 所述的步骤4)中麸皮培养基为1％葡萄糖溶液：麸皮＝1:1.1的比例配制。
[0014] 一种葡萄贵腐菌干粉的使用方法，其特征在于：所述的方法步骤为：1)制 备乳化剂溶液，2)制备贵腐菌干粉溶液，3)分离贵腐菌干粉清液，4)喷洒接 种贵腐菌，5)监测贵腐葡萄成熟度。
[0016] 步骤2)制备贵腐菌干粉溶液：取灰葡萄孢干粉，按1g/L的添加量，添加 到步骤1)得到的大豆分离蛋白水溶液中，常温下充分搅拌、超声波或者离心方 法使孢子充分脱离麸皮固体表面，得贵腐菌干粉溶液；
[0017] 步骤3)分离贵腐菌干粉清液：将步骤2)得到的悬浊液，进行固液分离， 取清液备用；
[0018] 步骤4)喷洒接种贵腐菌：按10L/亩的用量，选择连续3～5天下午无雨的 日子，在傍晚或清晨连续喷洒孢子溶液3～7日，具体喷洒次数视果穗感染情况 而定。
[0019] 步骤5)监测贵腐葡萄成熟度：果穗感染灰霉菌后，每隔五日测定一次糖、 酸含量，合理确定采收期。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
[0021] 1、本发明简化了人工贵腐葡萄培育过程中繁琐的操作，简化灰葡萄孢菌种 优选、接种和扩培等步骤，研发优选灰葡萄孢菌株的干粉制剂，通过人工喷洒 接种贵腐菌到葡萄上，控制葡萄的侵染状况，生产出了人工贵腐葡萄及酿造贵 腐葡萄酒。
[0022] 2、本发明结合灰葡萄孢的培养及霉菌干粉的制作方法，全过程使用一系列 有助于灰葡萄孢的孢子积累及保存的技术手段，包括液体培养、麸皮培养、真 空冷冻干燥、真空包装等，保证灰葡萄孢孢子的大量繁殖，最终的干粉能够保 持原有的活性，以及将干粉活化喷洒到葡萄上时能成功地感染生成贵腐葡萄。
[0024] 图1为本发明操作流程图；
[0025] 图2为灰葡萄孢的培养：a.PDA平板培养；b.深层液体培养；c.麸皮培养[0026] 图3不同浓度淀粉保护剂的菌种干粉在模拟葡萄汁培养下β-葡萄糖苷酶活 性测定的吸光值；
[0027] 图4为人工贵腐酒与晚采原料甜酒的香气感官分析结果的雷达图。五、具体实施方式
[0028] 下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定：
[0029] 本发明针对我国贵腐葡萄酒原料难以自然形成的问题，在前人研究基础上 提出了一种人工贵腐葡萄的生产方法，首先筛选灰葡萄孢菌株，然后对优化菌 株进行扩大培养，再将菌悬液喷洒到正常生长的葡萄果实上，引起葡萄浆果在 表皮上发生贵腐作用。
[0030] 本发明前提是人工筛选的优良灰葡萄孢菌株Botrytis-C，中国典型培养物保 藏中心保藏编号：M2013661，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址： 中国武汉，保藏日期：2013年12月13日，分类命名：灰葡萄孢Botrytis-C(Botvytis cinerea Botrytis-C)。该菌株具有较高的糖苷酶活性，且生长活力较强，是人工贵 腐葡萄生产的潜力菌株。
[0031] 本发明葡萄贵腐菌干粉的制备方法的步骤为：(1)灰葡萄孢的活化培养；(2) 灰葡萄孢的液体培养，(3)灰葡萄孢的扩大培养；(4)灰葡萄孢的麸皮培养；(5) 真空冷冻干燥。
[0032] 本发明葡萄贵腐菌干粉的使用方法的步骤为：(1)制备乳化剂溶液；(2) 制备贵腐菌干粉溶液；(3)分离贵腐菌干粉清液；(4)喷洒接种贵腐菌；(5) 监测贵腐葡萄成熟度。
[0033] 实施例：
[0034] 1.贵腐菌干粉的制备方法(参见图1)：
[0035] (1)灰葡萄孢的活化培养：取优选的灰葡萄孢菌株接种于PDA斜面培养 基(20％土豆、2％葡萄糖、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、2％琼脂)上，在 25～28℃恒温培养箱中培养5天；
[0036] (2)灰葡萄孢的液体培养：挑取1/6步骤(1)活化培养后的灰葡萄孢连同 PDA培养基接种到深层液体培养基(3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％ 硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾)中，在180r/min，25～28℃的摇床培养条件下培养5 天；
[0037] (3)灰葡萄孢的扩大培养：按1％的接种量吸取步骤2)液体培养后的菌液， 并接种到培养基(3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、0.1％磷 酸二氢钾)上，在180r/min，25～28℃条件下摇床培养5天。
[0038] (4)灰葡萄孢的麸皮培养：将经过扩大培养的灰葡萄孢菌悬液按2％的接 种量接种到麸皮培养基(1％葡萄糖溶液：麸皮＝1:1.1的比例配制)中，并充分 搅拌，使接种均匀，在25～28℃的恒温培养箱中培养8～10天。培养基的厚度为 1cm左右。
[0039] (5)真空冷冻干燥：将麸皮培养后的灰葡萄孢与麸皮培养基一同取出，真 空冷冻干燥，制成干粉，装入锡箔袋中真空包装。
[0040] 以上的培养基均为重量百分比。
[0041] 2.干粉的使用方法：
[0042] 干粉应用于贵腐葡萄的生产，具体步骤如下：
[0043] (1)制备乳化剂溶液：制备大豆分离蛋白水溶液，浓度约2％(即20g/L)， 先量取大豆分离蛋白，用少量温水充分溶解，然后充分溶解至常温(23～25℃) 清水中；
[0044] (2)制备贵腐菌干粉溶液：取灰葡萄孢干粉按1g/L的添加量，添加到上述 大豆分离蛋白水溶液中，常温下充分搅拌使孢子充分脱离麸皮固体表面(也可 使用超声波或离心等方法)；
[0045] (3)分离贵腐菌干粉清液：将第(2)步得到的悬浊液，进行固液分离， 取清液备用。
[0046] (4)喷洒接种贵腐菌：按10L/亩的用量，选择连续3～5天下午无雨的日子， 在傍晚或清晨连续喷洒孢子溶液3～7日。具体喷洒次数视果穗感染情况而定。
[0047] (5)监测贵腐葡萄成熟度：果穗感染灰霉菌后，每隔五日测定一次糖、酸 含量，合理确定采收期。
[0048] 本发明在生产人工贵腐葡萄的过程中将灰葡萄孢干粉活化后喷洒到正常葡 萄上，从而得到贵腐葡萄，减少了从菌种筛选、活化、以及扩大培养的系列过 程，从而简化操作，节省时间，提高工作效率。实验研究表明，经过麸皮培养 基8～10天培养后得到大量的灰霉菌孢子，而后将灰葡萄孢与麸皮培养基一同进 行真空冷冻干燥，在不添加任何保护剂的条件下，干燥后的灰葡萄孢的孢子有 较高的存活率和糖苷酶活性。
[0049] 在应用灰葡萄孢干粉获得人工贵腐葡萄的过程中，首先要进行贵腐菌干粉 的活化。由于葡萄果实表面有蜡质物质，因此，需要添加乳化剂(大豆分离蛋 白)，以保证喷洒活化后的灰葡萄孢溶液时，孢子能附着在葡萄果皮上，保证贵 腐菌的有效侵染，产生贵腐作用。选择连续3～5天下午无雨的日子，在旁晚至 清晨的时间段喷洒孢子溶液，为的是避免灰葡萄孢浸染雨后的裂果，造成浸染 过度，引起病害。连续喷洒3～7日，保证浸染成功，每隔五日测定一次糖、酸 含量，合理确定采收期。应用干粉酿造的贵腐葡萄酒具有柑橘、焦糖、蜂蜜、 奶香、香料等特殊的香气。
[0050] 实验例：
[0051] 本发明以前期优选的一株灰葡萄孢菌株Botrytis C为材料，使用一系列有助 于灰葡萄孢的培养及保存方法，研究比较了液体培养后离心冻干与麸皮培养后 冷冻干燥两种方法，结果表明，麸皮培养后，在不添加保护剂的条件下，进行 真空冷冻干燥，得到的灰葡萄孢干粉存活率较高，达到83％，且β-葡萄糖苷酶 活性高达1.11U/mL。
[0052] 1目的
[0053] 针对贵腐葡萄酒原料的难以自然形成的问题，对优选灰葡萄孢进行干粉制剂 的研发，从而减少人工贵腐酒生产中的菌种筛选、优化、扩大培养等步骤，通 过人为地控制葡萄的侵染情况，便于人工贵腐葡萄的生成。
[0054] 2实验内容
[0056] (2)应用深层液体培养、麸皮培养等方法培养灰葡萄孢，得到大量的孢子。
[0057] (3)确定灰葡萄孢的干燥方法和保护剂配方，保持霉菌制成干粉后的活力 和β-葡萄糖苷酶活性在一个较高的水平，保证后续实验的成功。
[0058] 3材料与仪器
[0059] 3.1菌种材料
[0060] 灰葡萄孢菌株：实验室前期筛选的优良灰葡萄孢菌株Botrytis-C，该菌株具 有较高的糖苷酶活性，且生长活力较强。
[0062] MP-250B恒温培养箱(上海试验室设备有限公司)；NRY-2102C型摇床上海 试验室设备有限公司)；AIRTECH型无菌操作台(苏州安泰空气技术有限公司)； LABCONCO77530-11型真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)； TOMYSS-325型全自动高压灭菌锅(日本托马斯公司)RC-5CPLUS高速冷冻离 心机(美国科峻仪器(香港)有限公司)；Cary60型紫外可见分光光度计(安捷 伦科技有限公司)；GCMS-PQ2020仪器(岛津公司)。
[0063] 葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂、酵母浸粉、苹果酸、果糖、单宁酸、 酒石酸、氯化铵、柠檬酸、磷酸氢二钾、可溶性淀粉、蔗糖、甘油(西陇化工 股份有限公司)、海藻糖(生物试剂，MPBiomedicals)、乳糖(生物试剂，北京 奥博星生物技术有限责任公司)、脱脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公 司)、4-硝基-β-D葡萄糖苷(美国Sigma公司)。
[0064] 3.3培养基
[0065] PDA培养基配方：20％土豆、2％葡萄糖、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸二氢钾、 2％琼脂。
[0066] 深层液体培养基配方：3％葡萄糖、4％土豆汁、0.1％硝酸钾、0.05％硫酸镁、 0.1％磷酸二氢钾。
[0067] 麸皮培养基配方：1％葡萄糖溶液：麸皮＝1:1.1
[0068] 模拟葡萄汁配方：11％葡萄糖、11％果糖、0.3％酒石酸、0.03％苹果酸、0.05％ 氯化铵、0.06％酵母浸粉、0.2％单宁酸、0.2％磷酸二氢钾、0.02％硫酸镁。
[0069] 4试验方法
[0070] 4.1灰葡萄孢的活化培养
[0071] 取保存在-20℃的优选灰葡萄孢菌株接种于斜面PDA培养基上，在25℃恒温 培养箱中培养5天。
[0072] 4.2灰葡萄孢的液体培养
[0073] 挑取1/6活化培养后的灰葡萄孢连同PDA培养基接种到深层液体培养基中， 在180r/min，25℃的摇床培养条件下培养5天。
[0074] 4.3灰葡萄孢的扩大培养
[0075] 按1％的接种量吸取液体培养后的菌液，并接种到深层液体培养基上，在 180r/min，25℃条件下摇床培养5天。
[0076] 4.4灰葡萄孢的麸皮培养
[0077] 将经过扩大培养的灰葡萄孢菌悬液按2％的接种量接种到麸皮培养基中，并 充分搅拌，使接种均匀。在25℃的恒温培养箱中培养8～10天。培养基的厚度为 1cm左右。
[0078] 4.5真空冷冻干燥
[0079] 将经过扩大培养后的菌液在转速为8000r/min，离心时间为20min的条件下 冷冻高速离心。离心后的沉淀物添加海藻糖、乳糖、蔗糖、脱脂奶粉、甘油做 为保护剂进行真空冷冻干燥，程序参数如表1。每种保护剂有三个不同的浓度 (5％、10％、15％)，按1:2的比例添加保护剂，即1mL保护剂，2g菌体的比例 进行单因素实验。冻干后用锡箔袋真空包装。观察并记录。
[0080] 表1真空冷冻干燥程序
[0081]
[0082] 将麸皮培养后的灰葡萄孢与麸皮培养基一同取出，分别添加浓度为(0、10％、 20％)的淀粉保护剂，并平铺到干燥盘中放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干 燥24h，制成干粉，干燥程序参数如表1。为保证干燥完全，平铺的培养基及灰 葡萄孢的厚度在5mm左右。冻干后用锡箔袋真空包装。
[0083] 4.6存活率和糖苷酶活性测定
[0084] 在冻干前将菌种接种到PDA平板培养基上培养3天后，记录菌落数。冻干 后用同样的方法培养并记录。计算冻干后的存活率。
[0085] 将冻干后的灰葡萄孢接种到模拟葡萄汁中，测定培养1d，2d，3d，4d，5d， 6d的β-葡萄糖苷酶活性。
[0086] β-葡萄糖苷酶活性测定的底物是4-硝基苯-β-D-葡萄糖苷，反应体系包括 100μL培养液，750μL柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液，250μL(1mM)底物，37℃ 反应30min后用1M的碳酸钠溶液终止反应。在400nm处测定吸光值。由于在 一定范围内吸光值与糖苷酶活性成正比，因此可以用吸光值来表示糖苷酶活性 大小。
[0087] 4.7干粉的使用方法
[0088] 在香格里拉酒庄威代尔葡萄上进行灰葡萄孢干粉的使用实验，将干粉按一定 的方法活化后，选择合适的时间喷洒到威代尔葡萄果实上，具体喷洒次数视果 穗感染情况而定，并测定糖、酸含量，合理确定采收期。
[0089] 4.7.1贵腐酒的酿造：
[0090] 贵腐葡萄酒和晚采原料甜葡萄酒的酿造工艺参照甜葡萄酒的工艺进行，主要 工艺步骤如下：
[0093] (3)自然澄清24h，使葡萄汁的浊度达到500～600NTU(散光浊度单位)；
[0094] (4)在发酵液中加入100～150mg/L的硫酸铵和VB1促进发酵，并接入2％ 活化24h的酵母液，并将发酵温度控制在20～24℃；
[0095] (5)当残糖的潜在酒度与酒度达到平衡时，进行封闭式分离，并用 200～350mg/L的二氧化硫处理，用抑菌剂终止发酵；
[0096] (6)数天后分析游离二氧化硫的含量，并进行分离，将游离二氧化硫含量 调整至60mg/L左右；
[0097] (7)储藏至次年5月进行常规理化指标测定、感官特性分析。
[0098] 4.7.2葡萄酒常规理化指标的测定
[0099] 分别测定使用灰葡萄孢干粉酿造的人工贵腐葡萄酒(NW)与香格里拉晚采 威代尔葡萄原料酿造的自然浓甜葡萄酒(SW)的常规理化指标。测定方法如下：
[0100] 残糖测定：斐林试剂测定法；
[0102] 总酸和挥发酸：酸碱滴定法。
[0103] 4.7.3感官分析
[0104] 酒样的感官分析采用感官量化品尝法参考Peng等(2013)，由15名主修葡 萄酒专业的研究生和本科生组成品尝小组对NW和SW两款酒样进行感官品评。 静止闻香5～8s，晃动酒杯闻香5～10s，两样闻香操作间隔1～2min，然后饮用葡 萄酒，酒液盖住舌面，轻吸一口气，搅动舌尖，感觉5～6s，吐出酒液，鼻腔反 馈感觉3～4s，对感知的感官特征用5点标度法进行量化：1-很弱，2-弱，3-中， 4-强，5-很强。某一香气特征的最终量化强度值(MF％)综合品尝组对这一香 气特征词汇的使用频率(F％)和强度平均值(I％)的信息，量化采用以下公式 计算：
[0105]
[0106] 5结果与分析
[0107] 5.1灰葡萄孢的培养与孢子的收集
[0108] 取保存在-20℃的人工筛选的优良灰葡萄孢菌株Botrytis-C，接种于PDA培 养基上，在25℃恒温培养箱中培养5天。灰葡萄孢的繁殖先长出白色的菌丝， 然后菌丝范围逐渐扩大。培养三天后开始产孢，菌落的颜色开始转变为灰色。 在显微镜下观察，孢子梗末端膨大，有分支，有小突起，从末端产生很多分身 孢子，呈葡萄穗状，分身孢子为单胞，呈球状或椭球形。
[0109] 取活化培养后的灰葡萄孢进行深层液体培养培养3天后能观察到白色小米 粒状的菌丝团，此时培养液的颜色为浅黄色。由于孢子的产生，5天后培养液变 成灰绿色，随着培养时间增长，菌团变大。扩大培养时观察到的现象与液体培 养相似。
[0110] 麸皮培养3天时有白色菌丝生成，5天时有少量孢子生成，孢子主要集中在 麸皮培养基表面以及培养基与锥形瓶的接触面。
[0111] 灰葡萄孢的培养如图1。
[0112] 5.2真空冷冻干燥方法与保护剂的确定
[0113] 液体培养-离心冻干
[0114] 将扩大培养后的菌液在转速为8000r/min，的条件下离心20min。将离心后 的沉淀物(菌体)用海藻糖(5％、10％、15％)、乳糖(5％、10％、15％)、蔗 糖(5％、10％、15％)、脱脂奶粉(5％、10％、15％)、甘油(5％、10％、15％) 做为保护剂进行冻干。按1:2的比例添加，即1mL保护剂，2g菌体的比例进行 单因素实验。
[0115] 保护剂为海藻糖、乳糖、蔗糖、脱脂奶粉的冷冻干燥后湿度大，形状如面团， 颜色为灰白色，保护剂为甘油和蒸馏水的菌冷冻干燥后，十分粘稠，没有固定 形状，颜色呈灰绿色。不是理想的干粉状态。
[0116] 将冻干后的菌接种到深层液体培养基中培养。添加不同保护剂的菌种在培养 时会产生不同物质，导致培养液的颜色以及香气不同。保护剂添加量越大培养 液的颜色越深，保护剂为蔗糖和脱脂奶粉的培养后分别有指甲油和水果的特殊 香味。
[0117] 麸皮培养-冷冻干燥
[0118] 将麸皮培养后的灰葡萄孢与麸皮培养基一同取出，分别添加浓度为(0、10％、20％)的淀粉保护剂，并平铺到干燥盘中放入真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干 燥，制成干粉。
[0119] 真空冷冻干燥后的存活率
[0120] 由表2可知，不添加任何保护剂时有较高的存活率为83.34％±2.54％，添加 淀粉保护剂后灰葡萄孢的存活率反而降低，添加10％的淀粉时存活率为 80.81％±0.00％，添加20％的淀粉时存活率为53.04％±2.53％。不添加淀粉保护剂 的存活率最高，添加的淀粉含量越少存活率降低的幅度越小。测定麸皮培养-冷 冻干燥后添加不同含量淀粉保护剂冻干后的存活率如表2所示。
[0121] 表2麸皮培养-冷冻干燥后灰葡萄孢的存活率
[0122]
[0123] 注：小写字母表示每行的差异性，α＝0.05
[0124] 不同添加量的淀粉下β-葡萄糖苷酶活性
[0125] 将干粉活化后接种到模拟葡萄汁中，测定培养1d，2d，3d，4d，5d，6d的 β-葡萄糖苷酶活性，测定情况如表3，每天的吸光值如图3。
[0126] 由表3可知，模拟葡萄汁培养前三天，三种情况的糖苷酶活性变化一致，培 养第一天后糖苷酶活性最小，第二天有所增高，第三天略降低后增加高。没有 添加淀粉保护剂的在培养第天时糖苷酶活性急剧增高，糖苷酶活性达到最大值。 10％淀粉添加量的在第六天时糖苷酶活性达到1U/mL。10％淀粉添加量的处理在 第4～6天的变化与无淀粉添加量的处理在3～5天的变化趋势相同，而20％的变 化延后。
[0127] 由图2分析可得，在培养5天后无淀粉添加的吸光值升高并且此时的吸光值 最大。10％淀粉添加量的菌种在培养6天时升高，此时的吸光值最大。从第4 天开始没有添加淀粉保护剂的吸光值上升最快，其次为淀粉添加量为10％的菌 种，淀粉添加量最大的吸光值上升最慢。而且没有添加淀粉保护剂的吸光值最 先达到最大值。由此分析可知淀粉对灰葡萄孢的生长有抑制作用，而且抑制的 强度与淀粉的含量有关。
[0128] 表3添加不同浓度淀粉保护剂的菌种干粉在模拟葡萄汁培养下 β-葡萄糖苷酶活性的测定结果
[0129]
[0130] 注：小写字母表示每行的差异性，α＝0.05
[0131] 贵腐葡萄酒的质量分析
[0132] 表4所示是应用本发明制作的贵腐菌干粉所得葡萄原料酿造的人工贵腐葡 萄酒(NW)与该葡萄晚采原料酿造的浓甜葡萄酒(SW)的常规理化指标分析 结果。两款甜葡萄酒相比总体差异不大，各个指标都正常，具体数值略有不同。 NW酒样的酒度为8.79(％vol)高于SW酒样0.9(％vol)左右；挥发酸都略 高于1.1g/L，低于1.2g/L；总酸NW酒样少SW酒样4g/L；残糖含量NW比SW 多19g/L。
[0133] 表4人工贵腐酒与晚采原料甜酒的常规理化指标分析结果
[0134]
[0135] 注：小写字母表示每行的差异性，α＝0.05
[0136] 图4所示是人工贵腐酒与晚采原料甜酒的香气感官分析结果的雷达图，涉 及香气种类有10种，对于贵腐酒的特征香气如焦糖、蜂蜜、咖啡、橘皮、香料 等，这两款酒均有呈现。NW酒样的酸果类、甜果类、花香类、小浆果和柑橘类 的MF值大于50％，而SW酒样只有酸果类、甜果类、花香类、小浆果四种大 于50％。两款酒呈现的香气强弱趋势大致一样，但NW与SW相比更协调，没 有特别突出的香气。
[0137] 6结论
[0138] 实验以前期优选的一株灰葡萄孢菌株Botrytis C为材料，使用一系列有助于 灰葡萄孢的培养及保存方法，研究比较了液体培养后离心冻干与麸皮培养后冷 冻干燥两种方法制备贵腐菌干粉。
[0139] 液体培养-离心冻干后，结果不是理想的菌体干粉状态，而且与麸皮培养冷 冻干燥的方法相比，增加了离心这一步骤，因此多了对离心设备的需求。相比 较而言，麸皮培养-冷冻干燥这个方法操作简单，减少了设备需求，且麸皮价格 低廉，容易获得。因此使用麸皮培养-冷冻干燥不仅操作简单，而且成本低。
[0140] 使用麸皮培养-冷冻干燥这一方法，在不添加保护剂的情况下，真空冷冻干 燥对孢子的伤害小，孢子的存活率高。添加了淀粉保护剂的干粉，在用模拟葡 萄汁培养时β-葡萄糖苷酶活性低于没有添加淀粉保护剂的干粉。在培养时对菌 液观察发现，淀粉对灰葡萄孢的β-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，添加的淀粉保 护剂浓度越高，糖苷酶活性越低。因此用麸皮培养-冷冻干燥的方法制备灰葡萄 孢干粉时不需要添加保护剂。比较液体培养后离心冻干与麸皮培养后冷冻干燥 两种方法，结果表明，麸皮培养后，在不添加任何保护剂的条件下，将麸皮与 菌种混合进行真空冷冻干燥，得到存活率高(83.34％)、β-葡萄糖苷酶活性大 (1.11U/mL)的贵腐菌干粉。
[0141] 贵腐菌干粉的应用结果表明，所得贵腐葡萄原料能够成功酿造出贵腐葡萄 酒。常规理化指标分析结果和香气感官分析结果显示，人工贵腐葡萄酒的各项 常规指标在甜葡萄酒的理想范围内，香气特征更为协调，具有贵腐葡萄酒的典 型性。
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