技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物病原菌抗药性检测领域，更具体地，涉及用于检测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂的抗药性的引物组合及其试剂盒。
背景技术
[0002] 由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是果蔬上一种非常普遍的病害，且危害十分严重，给果蔬生产造成了巨大的损失。目前防治该病害仍然主要依赖于杀菌剂。
琥珀酸脱氢酶
抑制剂(SDHI)类杀菌剂是生产上现在使用较多的一类杀菌剂。但由于其大量使用，灰葡萄孢已对其产生了抗药性，而该药的防治效果也随之大幅度下降。对抗性菌株进行研究发现，抗性菌株的琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)基因的第272位密码子发生了点突变，使原先的组
氨酸被精氨酸替代(H272R)。经验证，该点突变是大部分菌株产生抗性的原因。
[0003] 若在喷药前就能明确田间是否已产生了抗性菌株，就可以准确制定杀菌剂喷施计划，以提高防治效果。目前比较常用的检测方法包括两种：即以菌丝生长抑制为
基础的传统的菌落直径法和基于目标基因的PCR技术。其中，传统的菌落直径法需要采集田间菌株，进行单孢分离，然后在添加一系列浓度的杀菌剂培养基上进行培养，检测杀菌剂对菌丝生长的抑制效应。另外，抗性菌株的SdhB基因的H272R点突变是田间大多数病原菌对SDHI类杀菌剂产生抗药性的原因。在此基础上设计相应引物，通过扩增
片段长度或者测序结果可以对灰葡萄孢的抗药性进行定性检测。
[0004] 传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，难以在早期就发现抗药性菌株的存在。基于PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者地方市县等农业部
门推广。
发明内容
[0005] 为了克服
现有技术检测周期长，工作量大，需要无菌条件，及PCR技术对仪器和人员技术要求高的
缺陷，本发明的第一个目的，提供了一种用于检测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂产生抗药性的引物组合，所述引物组合包括外引物和内引物，所述外引物由SdhB-F3和SdhB-B3组成，所述内引物由SdhB-FIP和SdhB-BIP组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
[0006] 本发明提供的引物可以使得灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂的抗药性检测更加方便和灵敏。
[0007] 本发明第二个目的，还提供了含有上述引物组合的试剂盒。
[0008] 其中，试剂盒中还包括10×Thermopol Buffer、Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4溶液和甜菜
碱溶液。
[0009] 其中，在该试剂盒中还包括10×TE裂解液和/或10000×SYBR Green I染料。
[0010] 本发明第三个目的，还提供了上述引物组合或含有上述引物组合的试剂盒在检测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂的抗药性中的应用。
[0011] 在本发明一个优选实施方式中，该应用包括如下步骤：
[0012] 1)提取待测灰葡萄孢的基因组DNA；
[0013] 2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增；
[0014] 3)分析扩增产物。
[0015] 其中，步骤1)中优选使用10×TE裂解液提取待测灰葡萄孢的基因组DNA。具体可以为：挑取米粒大小的待测灰葡萄孢的菌丝于50μL10×TE裂解液中，沸
水煮后得到待测灰葡萄孢的基因组DNA。沸水煮优选2分钟。
[0016] 使用本发明的特异性引物来检测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂的抗药性时，只需使用简单的裂解液和步骤来提取DNA。该方法简单易学、省时省
力，而且所提取得到的DNA完全满足LAMP检测需求。
[0017] 其中，步骤2)中环介导等温扩增的反应总体积为25μL，反应体系为：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4，1mM dNTPs，1.2mM SdhB-FIP，1.2mM SdhB-BIP，0.4mM SdhB-F3，0.4mM SdhB-B3，0.8M甜菜碱和1μL所述基因组DNA模板。
[0018] 其中，步骤2)中环介导等温扩增的条件为：63℃60min，85℃10min。具体地，是先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min。
[0019] 其中，步骤3)可以为：在所得扩增产物中加入10000×SYBR Green I染料，观察
颜色反应，得出结果。10000×SYBR Green I染料的加入量优选为0.2μL。若产生肉眼清晰可分辨的
荧光绿色，则表示该待测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂产生了抗药性，该待测灰葡萄孢为抗性菌株；若不变色为棕褐色，则表示该待测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂未产生抗药性，该待测灰葡萄孢为敏感菌株。
[0020] 在另一个优选实施方式中，步骤3)也可以为：对扩增产物进行琼脂糖凝胶
电泳，观察有无扩增产物。若通过琼脂糖凝胶电泳检测到梯状条带的扩增产物，则表示该待测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂产生了抗药性，该待测灰葡萄孢为抗性菌株；若通过琼脂糖凝胶电泳未检测到梯状条带的扩增产物，则表示该待测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂未产生抗药性，该待测灰葡萄孢为敏感菌株。
[0021] 本发明提供的用于检测对SDHI类杀菌剂产生抗药性的灰葡萄孢的引物组合以及相应的试剂盒和现有其他技术相比，具有如下优点和积极效果：
[0022] 1、本发明在已知灰葡萄孢抗SDHI类杀菌剂分子机理的研究基础上，根据H272R点突变，应用环介导恒温扩增(LAMP)技术，使检测灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂的抗药性不需要昂贵的PCR仪器，在田间条件下就能快速、准确检测大量样本，使在喷施杀菌剂前快速检测田间病原菌是否已经产生抗药性成为可能。
[0023] 2、本发明提供可以特异性针对灰葡萄孢对SDHI杀菌剂抗性产生的H272R点突变的引物组合，及其高效准确便捷的检测试剂盒及扩增条件。应用该试剂盒可在两小时内从菌丝中快速、简便、准确、灵敏的检测出抗SDHI类杀菌剂的灰葡萄孢，检测速度比传统的检测方法和普通分子检测方法更简单、高效。
[0024] 3、步骤简单易操作，不需要PCR仪等实验室高级仪器，这对于
基层植保站和田间操作的工作有重要意义。使用特异性引物和环介导恒温扩增反应，可以达到很高的准确率和灵敏度，可以在两小时内完成对田间样本的检测。
附图说明
[0025] 图1为本发明
实施例1中7个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行SYBR Green I
染色后的对照图；
[0026] 图2为本发明实施例2中7个灰葡萄孢菌株DNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后的电泳图谱。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
[0029] 实施例1
[0030] (1)挑取少量菌丝于50μL 10×TE裂解液中，沸水煮2分钟，得到DNA模板；
[0031] (2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25ul)：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4，1mM dNTPs，1.2mM SdhB-FIP，1.2mM SdhB-BIP，0.4mM SdhB-F3，0.4mM SdhB-B3，0.8M甜菜碱，1μL步骤(1)中DNA模板；反应条件：先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min；
[0032] (3)在步骤(2)所得扩增产物中加入0.2μL 10000×SYBR Green I染料，观察颜色反应，得出结果。
[0033] 使用上述方法对7个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-7，其中编号8为蒸馏水对照。结果如图1所示，编号为1-2中加入SYBR Green I染料出现了肉眼清晰可分辨的荧光绿色，3-7中加入SYBR Green I染料后未变色，该结果表示编号1-2中的灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂具有抗药性，是抗性菌株；其它不变色的3-7中灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂不具有抗药性，为敏感菌株。该检测方法具有很高的准确性，准确性可高达100％，可有效地实现灰葡萄孢是否对SDHI类杀菌剂具有抗药性的检测。
[0034] 实施例2
[0035] (1)挑取少量菌丝于50μL 10×TE裂解液中，沸水煮2分钟，得到DNA模板；
[0036] (2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25ul)：4U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Buffer，4mM MgSO4，1mM dNTPs，1.2mM SdhB-FIP，1.2mM SdhB-BIP，0.4mM SdhB-F3，0.4mM SdhB-B3，0.8M甜菜碱，1μL步骤(1)中DNA模板；反应条件：先在63℃下恒温60min后再在85℃下恒温10min；
[0037] (3)对步骤(2)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无扩增产物。
[0038] 使用上述方法分别对7个待测灰葡萄孢进行检测分析，编号依次为1-7，其中编号8为蒸馏水对照，M代表Marker。结果如图2所示，编号为1-2中能检测到梯状条带的扩增产物，编号3-7中检测不到梯状条带的扩增产物。该结果表示编号1-2中的灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂产生了抗药性，该灰葡萄孢为抗性菌株，编号3-7中的灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂未产生抗药性，该灰葡萄孢为敏感菌株。该检测方法具有很高的准确性，准确性可高达100％，可有效地实现灰葡萄孢是否对SDHI类杀菌剂具有抗药性的检测。
[0039] 最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
