用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物
阅读：520发布：2021-09-29
专利汇可以提供用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且制造包含提供附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的 水 凝胶微粒的方法。该方法包括将水凝胶形成剂溶解于水性介质中以形成溶液；将一种或多种活细胞悬浮于溶液中以形成细胞悬浮液；将该细胞悬浮液分散于有机油中，以形成微乳液；以及使该微乳液经历允许水凝胶形成剂形成包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。还提供了包含可降解的水凝胶和具有一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物以及制造组织工程 支架 的方法。，下面是用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物专利的具体信息内容。
1.制造水凝胶微粒的方法，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞，所述方法包含：
a)将水凝胶形成剂溶解于水性介质中以形成溶液；
b)将一种或多种活细胞悬浮于所述溶液中以形成细胞悬浮液；
c)将所述细胞悬浮液分散于有机油中以形成微乳液；以及
d)使所述微乳液经历允许所述水凝胶形成剂形成水凝胶微粒的条件，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水凝胶形成剂包含可物理交联聚合物、可化学交联聚合物或它们的混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述可物理交联聚合物选自由明胶、藻酸盐、果胶、红藻胶、鹿角菜胶、壳聚糖、它们的衍生物、它们的共聚物以及它们的混合物组成的组中。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶形成剂包含明胶或主要由明胶组成。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述可化学交联聚合物选自由淀粉、结冷胶、葡聚糖、透明质酸、聚(环氧乙烯)、聚膦腈、它们的衍生物、它们的共聚物以及它们的混合物组成的组中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述溶液中的水凝胶形成剂的量为约1％(w/v)至约10％(w/v)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述溶液中的水凝胶形成剂的量为约5％(w/v)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述活细胞为真核细胞或原核细胞或古生菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述真核细胞为非贴壁依赖性细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述非贴壁依赖性细胞选自由软骨细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述活细胞包含软骨细胞或主要由软骨细胞组成。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述真核细胞为贴壁依赖性细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述贴壁依赖性细胞选自由成骨细胞、成纤维细胞、表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、肝细胞、肌细胞、来自关节韧带的细胞以及来自髓核的细胞组成的组中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述有机油选自由豆油、玉米油、葵花籽油、油菜籽油、棉籽油、花生油、橄榄油、芝麻籽油、大米胚芽油、鱼油、鲸油、棕榈油、椰子油、大麻籽油、菜籽油、麦胚油、红花油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和它们的混合物组成的组中。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述有机油包含豆油或主要由豆油组成。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，将所述水凝胶形成剂溶解于所述水性介质中是在约20℃至约45℃范围内的温度下进行的。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，将所述水凝胶形成剂溶解于所述水性介质中是在约37℃的温度下进行的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，将所述细胞悬浮液分散于所述有机油中是在持续搅拌下进行的。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，使所述微乳液经历允许所述水凝胶形成剂形成水凝胶微粒的条件包含在约0℃至约10℃范围内的温度下冷却所述微乳液。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，进一步包含在所述水凝胶微粒形成之后提取所述有机油。
21.根据权利要求20所述的方法，进一步包含在提取所述有机油之后的至少一个离心步骤和至少一个清洗步骤。
22.一种组合物，所述组合物包含可降解的水凝胶和至少一种如权利要求1至21中任一项所限定的水凝胶微粒的混合物，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞。
23.一种组合物，所述组合物包含可降解的水凝胶和至少一种水凝胶微粒的混合物，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞，其中，所述可降解的水凝胶和所述水凝胶微粒中的至少一种包含影响所述水凝胶微粒降解的致孔剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述致孔剂包含酶或主要由酶组成。
25.根据权利要求23或24所述的组合物，其中，所述致孔剂选自由胶原酶、蛋白酶、糖苷酶、链霉蛋白酶、酪蛋白酶、软骨素酶、皮肤素酶、弹性蛋白酶、明胶酶、肝素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、脂肪酶、金属蛋白酶、葡激酶、链激酶、糜蛋白酶、肽链内切酶V8、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和它们的组合组成的组中。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中，所述致孔剂包含胶原酶或主要由胶原酶组成。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶包含一种或多种活细胞。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中，所述活细胞为真核细胞或原核细胞或古生菌。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述真核细胞为非贴壁依赖性细胞。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述非贴壁依赖性细胞选自由软骨细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的组合物，其中，所述活细胞包含软骨细胞或主要由软骨细胞组成。
32.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述真核细胞为贴壁依赖性细胞。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中，所述贴壁依赖性细胞选自由成骨细胞、成纤维细胞、表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、肝细胞、肌细胞、来自关节韧带的细胞以及来自髓核的细胞组成的组中。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶选自由由天然聚合物制成的水凝胶、合成水凝胶以及它们的组合组成的组中。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中，所述天然聚合物选自由多糖、粘多糖和蛋白质组成的组中。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中，所述多糖选自由藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、淀粉和结冷胶组成的组中。
37.根据权利要求22至36中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶包含藻酸盐。
38.根据权利要求34所述的组合物，其中，所述合成水凝胶选自由亲水性单体制成的水凝胶、由亲水性聚合物制成的水凝胶、由亲水性共聚物制成的水凝胶和它们的组合组成的组中。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中，所述亲水性单体选自由2-羟乙基甲基丙烯酸酯、2-羟乙基丙烯酸酯、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、2-羟乙基丙烯酰胺、N-2-羟乙基乙烯基氨基甲酸酯、2-羟乙基乙烯基碳酸脂、2-羟丙基甲基丙烯酸酯、羟己基甲基丙烯酸酯、羟辛基甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、富马酸、巴豆酸、马来酸、单甲基马来酸酯、单乙基马来酸酯、单甲基富马酸酯、单乙基富马酸酯、(甲基)丙烯酰胺、巴豆酰胺、肉桂酰胺、马来酰二胺、富马酰二胺、甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、丁硫醇、叔丁硫醇、戊硫醇、对苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、p-α-甲基苯乙烯磺酸、异戊二烯亚砜及其盐组成的组中。
40.根据权利要求38所述的组合物、其中、所述亲水性聚合物选自由乙交酯、丙交酯的聚合物和低聚物；聚乳酸；α-醇酸的聚酯，其中所述醇酸包括乳酸和乙醇酸，例如聚(α-羟基)酸，包括聚乙醇酸、聚-DL-乳酸、聚-L-乳酸；以及DL-丙交酯和乙交酯的三元共聚物；ε-己内酯和与聚酯共聚的ε-己内酯；聚内酯和聚己内酯，包括聚(ε-己内酯)、聚(ε-戊内酯)和聚(γ-丁内酯)；聚酐；聚原酸酯；其他醇酸；聚二氧环己酮；胶原蛋白-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)；聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)以及无毒或在体内作为代谢物存在的其他可生物降解的聚合物组成的组中。
41.根据权利要求22至40中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含在体温下降解的可降解材料。
42.根据权利要求22至41中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含表面交联的明胶。
43.根据权利要求22至42中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含用交联剂交联的明胶。
44.根据权利要43所述的组合物，其中，所述交联剂选自由京尼平、甲醛、戊二醛、l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸化物(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和它们的混合物组成的组中。
45.根据权利要求22至44中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒包含在
0.25wt％的京尼平溶液中交联的明胶。
46.根据权利要求22至45中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒的最大尺寸在约50μm至约200μm之间。
47.根据权利要求22至46中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为可注射组合物。
48.根据权利要求22至47中任一项所述的组合物，其中，所述水凝胶微粒具有提供额外反应性基团的表面，所述额外反应性基团允许结合其它分子。
49.根据权利要求22至48中任一项所述的组合物，其中，所述可降解的水凝胶和/或所述水凝胶微粒进一步包含至少一种类型的生物活性分子。
50.根据权利要求22至49中任一项所述的组合物，其中，所述生物活性分子选自由生长因子、细胞因子、抗生素、抗炎剂、止痛剂和细胞粘附分子组成的组中。
51.制造组织工程支架的方法，所述方法包括：
a)提供包含可降解的水凝胶和至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，所述水凝胶微粒包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞；
b)在允许所述一种或多种活细胞增殖和所述至少一种水凝胶微粒在所述可降解的水凝胶中降解的条件下培养所述组合物，以允许所述一种或多种活细胞增殖和所述至少一种水凝胶微粒降解；以及
c)降解经培养的所述混合物的所述可降解的水凝胶以获得支架。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述至少一种水凝胶微粒和所述可降解的水凝胶包含影响所述水凝胶微粒的降解的致孔剂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述致孔剂包含酶或主要由酶组成。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中，致孔剂选自由胶原酶、蛋白酶、糖苷酶、链霉蛋白酶、酪蛋白酶、软骨素酶、皮肤素酶、弹性蛋白酶、明胶酶、肝素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、脂肪酶、金属蛋白酶、葡激酶、链激酶、糜蛋白酶、肽链内切酶V8、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和它们的组合组成的组中。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中，所述致孔剂包含胶原酶或主要由胶原酶组成。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中，所述可降解的水凝胶包含一种或多种活细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述可降解的水凝胶和/或所述水凝胶微粒中包含的所述一种或多种活细胞为非贴壁依赖性细胞，选自由软骨细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、内胚层谱系细胞和用于再生医学的癌细胞组成的组中。
用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织
工程支架的组合物
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求于2012年8月8日提交的美国临时申请61/680,854的权益，出于所有目的将其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
[0003] 本申请涉及水凝胶微粒以及水凝胶微粒在形成可用于代替组织(例如器官、骨或其部分)的组织工程支架的应用的领域。
背景技术
[0004] 由于微球提供了移植的微创方式，其已被用作药物和细胞的递送载体。尤其是，由于以下优点已经开发了用于再生医学目的细胞递送的许多材料和制造方法：在受控尺寸的微球中大规模培养细胞的简便性、为细胞提供可调节的三维(3-D)环境、结合生化信号和生物力学部分的能力以及将负载细胞的微球直接注射到缺陷部位而不存在胰蛋白酶化的简便性。
[0005] 通常通过两步法来进行研究，首先制造微球，例如通过单乳法或复乳法、电喷雾和热诱导的相分离以及随后将细胞接种于所述微球上。尽管上述方法能够支持细胞，但微球制造技术通常需要专用设备或大量的时间，因为在化学处理之后彻底的清洗步骤是必需的。
[0006] 而且，这些技术在很大程度上满足了贴壁依赖性细胞(例如成纤维细胞)的需要。一些其他的研究小组报道了利用合成的聚乙二醇二丙烯酸酯或天然生物聚合物直接将细胞封装到微球中的技术，其中利用合成的聚乙二醇二丙烯酸酯需要表面修饰并添加酶降解位点，天然生物聚合物(例如藻酸盐)的每个批次不同且具有不受控的降解速率。
[0007] 组织工程学技术通常需要使用临时支架作为初始细胞附着以及随后组织形成的三维模板。支架能够被身体代谢，这使得其逐渐被新的细胞替代而形成功能性组织。如此，支架设计是组织工程学中最重要的方面之一。
[0008] 水凝胶由于其类似于组织的含水量、良好的生物相容性以及用于原位移植的可注射进入性(injectable accessibility)而显出作为组织工程支架的巨大潜力。然而，在将水凝胶用作支架和细胞递送材料中还存在实质性挑战。例如，水凝胶具有低细胞亲和性。因此，当其被用于封装再生医学中常用的细胞(例如，成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞)时，这些贴壁依赖性细胞(ADC)不能在水凝胶框架中分散而是被束缚在球体形状中，从而导致较差的固定并且经常会发生细胞死亡。另外，细胞在水凝胶本体中的球形约束防止了细胞迁移和细胞间相互作用，而这对于介导细胞分化和组织再生是至关重要的，同时球形约束也防止了对细胞聚集的抑制，而这种抑制对于组织(例如软骨和肝)的再造是尤其必需的。
[0009] 肝是人体内最大的内部器官，负责大量的基本功能，例如解毒和蛋白质合成。酗酒和例如肝炎的疾病引起最为急性或慢性的肝衰竭。目前，世界上有数以百万计的人患有这种疾病，但由于肝供体的严重短缺，只有少部分人接受了肝移植。另外，接受了成功肝移植的患者并不一定能完全康复。他们具有免疫排斥的风险并且终生依赖于免疫抑制药物。肝病的患病率增加已促使研究人员寻找替代疗法，例如作为可能的解决方案的肝细胞移植；这些在过去十年中已被广泛开发。
[0010] 肝细胞移植依赖于将成熟肝细胞或肝脏干细胞引入到宿主中以修复、保持或改善有缺陷的肝功能。成熟的肝细胞在体外的增殖能力不理想并且其在二维单层培养物中会迅速失去其表型。尽管肝细胞移植可具有直接疗效，但其临床应用受到细胞可用性和质量的限制。研究已报道了当肝细胞团块或球体形成时在三维培养物中对肝特异性的功能性的保持。从这个意义上讲，产生具有可控尺寸和形状的肝细胞球状体提出了肝组织工程研究和开发中的关键挑战之一。
[0011] 已经开发了多种不同的方法来辅助形成这些球体。常用的方法包括利用生物反应器、光刻法或微图形化以产生合适尺寸的模型。但是，这些方法需要专用设备，以产生可控尺寸的球体并且在扩大规模方面面临相当大的困难。
[0012] 从上文中可看出，仍然存在对形成水凝胶微粒的方法的需求，该方法可在用于制造组织工程支架的组合物中使用，并且解决上述问题中的一种或多种。发明内容
[0013] 在第一个方面。本发明涉及制造包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的方法。该方法包括
[0014] a)将水凝胶形成剂溶解于水性介质中以形成溶液；
[0015] b)将一种或多种活细胞悬浮于该溶液中以形成细胞悬浮液；
[0016] c)将该细胞悬浮液分散于有机油中以形成微乳液；以及
[0017] d)使该微乳液经历使水凝胶形成剂能够形成包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。
[0018] 在第二个方面，本发明涉及包含可降解的水凝胶和根据本发明第一个方面的包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物。
[0019] 在第三个方面，本发明涉及可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，其中至少一种可降解的水凝胶和水凝胶微粒包含影响该水凝胶微粒降解的致孔剂。
[0020] 在第四个方面，本发明涉及制造组织工程支架的方法。该方法包括
[0021] a)提供包含可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物；
[0022] b)在使该一种或多种活细胞能够增殖并且至少一种水凝胶微粒在可降解的水凝胶中降解以使得一种或多种活细胞增殖以及使得至少一种水凝胶微粒降解的条件下培养该组合物；以及
[0024] 当结合非限制性实例和附图时，参照详细描述将能够更好地理解本发明，其中：
[0025] 图1(A)至图1(C)为tDGMC和构建体的制造方法的示意图。在图1(A)中描绘了tDGMC的制造方法。将悬浮在37℃的明胶A型溶液中的软骨细胞加入到37℃豆油的烧杯中，并在冰水浴中搅拌。将tDGMC-油乳液离心，然后用1x PBS清洗两次。随后除去PBS上清液。在(B)中，描述了PTCC-tDGMC和LhCG-tDGMC的制造过程。将软骨细胞在藻酸盐中的-1悬浮液加入到tDGMC中(0.30g ml 藻酸盐)。然后将充分混合的悬浮液转移至硅胶模具，并通过加入氯化钙溶液完成藻酸盐凝胶化以形成PTCC-tDGMC。在37℃下孵育后，明胶完全溶解，并且在2天后形成腔室。悬浮于腔中的细胞增殖为细胞岛(cell islet)，同时来自藻酸盐凝胶本体的细胞渗入腔中。由软骨细胞和其分泌的ECM构成的新组织填满孔并融合在一起。在培养中，在21天后通过经由柠檬酸钠(SC)处理PTCC-tDGMC构建体以除去藻酸盐来获得LhCG-tDGMC。在(C)中，描述了根据现有技术方法的PTCC-blkMC和LhCG-blkMC制造方法。将软骨细胞和空白明胶微球在藻酸盐中的悬浮液转移到硅胶模具中；如上所述进行凝胶化。来自藻酸盐本体的细胞渗入被明胶微球留下的腔中，并发育了新组织。在培养
35天后，通过SC处理除去藻酸盐，以产生无支架3-D LhCG-blkMC。
35天后，通过SC处理除去藻酸盐，以产生无支架3-D LhCG-blkMC。
[0027] 图3示出了封装在blkGEL-tDGMC中的细胞的活性测试。在(A)中，示出了在不同时间点的4x放大的tDGMC构建体的活/死染色和对应的亮视野显微镜图像。比例尺代表500μm并且适用于所有图像。(B)示出了根据构建体干重归一化的细胞密度的图示，其基
4
于利用Hoechst 33258测试的DNA定量分析。Y-轴：细胞密度(x 10/mg干重)；x-轴：时间(天)。
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于利用Hoechst 33258测试的DNA定量分析。Y-轴：细胞密度(x 10/mg干重)；x-轴：时间(天)。
[0028] 图4为示出了通过WST-1测试的细胞活性评价的图示。*表示p<0.05；观察到构建体之间的统计学显著性差异。
[0029] 图5示出了各种软骨细胞标记物表达的分析图示(A)2型胶原蛋白；(B)1型胶原蛋白；(C)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)；(D)Sox9；(E)COMP；(F)RhoA；(G)(i)PTCC-blkMC的整合素β1；(ii)PTCC-tDGMC的整合素β1；和(iii)LhCG-tDGMC的整合素βl。Y-轴：倍数；x-轴：时间(天)。基于在第0天PTCC-blkMC构建体中特定基因的表达值来计算每种基因的倍数值。*表示p<0.05；观察到构建体之间的统计学显著性差异。
[0030] 图6为示出了GAG和胶原蛋白含量相对与时间(天)作图的生物化学分析的图示，其中(A)和(B)：每个细胞的GAG和胶原蛋白；(C)和(D)：根据干重归一化的GAG和胶原蛋白。*表明p<0.05；观察到构建体之间的统计学显著性差异。
[0031] 图7示出了以10x放大比较PTCC-blkMC和LhCG-tDGMC构建体的各种组织化学和免疫组织化学染色：(A)H&E染色；(B)马松三色染色；(C)番红O染色；(D)2型胶原蛋白的免疫组织化学染色；和(E)1型胶原蛋白的免疫组织化学染色。在所有的免疫组织化学图像中，细胞核被染成蓝色(DAPI)。比例尺代表200μm并且适用于全部图像。
[0032] 图8(A)示出了负载细胞的微球水凝胶复合构建体(对照、MM和MG)的制造步骤的示意图；插图为10倍放大；(B)经过或未经过MMP-9处理的对照、MM和MG构建体的相衬像。比例尺代表100μm的长度。
[0033] 图9示出了在不同浓度的京尼平(0.1wt％、0.25wt％和0.5wt％)中交联之后的明胶微球的总图。第一柱：在PBS溶液中溶胀之后的京尼平交联的微球。交联度的近似值由所形成的蓝色颜料的强度表示。第二柱：在37℃下在PBS中孵育30分钟的京尼平交联-1的微球。第三柱：在37℃下在含有100μg ml 的MMP-9的培养基中孵育京尼平微球4小时。比例尺代表100μm的长度。
[0034] 图10是示出了利用WST-1测试进行的在对照、MM和MG构建体中细胞增殖情况的图示。*代表p<0.05，当与该天的对照样品相比较时。Y-轴：吸光度；x-轴：时间(天)。
[0035] 图11示出了在第4、7和17天，对照、MM和MG构建体中的细胞的活/死染色和相衬像。比例尺表示100μm的长度。
[0036] 图12示出了在不同时间点的对照、MM和MG构建体的白蛋白和细胞色素P4501A1(CYP1A1)的基因表达。*代表当与该天对照样品相比较时p<0.05。Y-轴：基因表-ΔC达(2 T)；x-轴：时间(天)。
[0037] 图13为示出了在不同的时间点的对照、MM和MG构建体的白蛋白分泌的图示。*代表当与该天对照样品相比较时p<0.05。Y-轴：归一化的白蛋白；x-轴：时间(天)。
[0038] 图14示出了在裸鼠中进行皮下移植14天后，对照、MM和MG构建体的组织化学染色。红色虚线表示腔，而白色箭头代表构建体中的HepG2细胞团块。比例尺表示100μm的长度。
[0039] 图15示出了在第21天用柠檬酸钠溶液处理后的构建体的照片。左侧：LhCG-blkMC和右侧：LhCG-tDGMC。保留了完整的LhCG-tDGMC构建体，但对于部分崩塌的LhCG-blkMC构建体而言则不太明显。红色箭头代表碎片。
具体实施方式
[0040] 在第一个方面，本发明涉及制造包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的方法。
[0041] 有利地，该制造水凝胶微粒的方法允许在水凝胶微粒中负载具有高细胞活性的细胞。该具有附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒可由可降解的水凝胶形成，并且可被分散于可降解的水凝胶基质中，因此，通过利用例如加热或致孔剂的方法相对于水凝胶基质优先降解该水凝胶微粒，使得包含在水凝胶微粒中的细胞可被释放并悬浮在腔的内部。因此，该水凝胶微粒可起到作为细胞递送载体和作为用于在水凝胶基质中产生腔的致孔剂的双重作用。这为活细胞提供了改善的可渗透环境和细胞增殖的空间，其转化为高细胞活性，例如本文中所证明的。
[0042] 如在本申请中使用的，术语”水凝胶”是指一大类聚合材料，其可以是天然的或合成的，其对于水性介质具有亲和性，并且可吸附大量的水性介质但通常不溶解于水性介质中。
[0043] 通常，可通过利用至少一种或者一种或多种类型的水凝胶形成剂，并在水性介质中固定或固化该一种或多种类型的水凝胶形成剂以形成三维网络来形成水凝胶，其中该三维网络的形成会导致该一种或多种类型的水凝胶形成剂凝胶化，从而形成水凝胶。术语”水凝胶形成剂”，在本文中也被称为”水凝胶前体”，是指可用于制造水凝胶的任何化学化合物。水凝胶形成剂可包含可物理交联聚合物、可化学交联聚合物或它们的混合物。
[0044] 物理交联可通过例如，络合、氢键、解溶剂化、范德华相互作用或离子键而发生。在各种实施方式中，水凝胶可通过一种或多种类型的水凝胶形成剂在水性介质中的自组装来形成。术语”自组装”是指高阶结构的组分依赖于组分间彼此的吸引力自发组织的过程，且在组分之间无化学键形成。例如，聚合物链可通过在聚合物链上引发的疏水力、氢键、范德华力、静电力或聚合链纠缠中的任一种彼此发生相互作用，以使得该聚合物链在水性介质中聚集或凝结以形成三维网络，从而捕获水分子以形成水凝胶。可以使用的可物理交联聚合物的实例包括，但不限于，明胶、藻酸盐、果胶、红藻胶、鹿角菜胶、壳聚糖、它们的衍生物、它们的共聚物和它们的混合物。
[0045] 化学交联可通过，例如，链反应(加成)聚合和逐步反应(缩合)聚合来进行。如本文中使用的，术语”化学交联”是指聚合物链之间经由化学键互连，例如，但不限于共价键、离子键或亲和作用(例如，配体/受体相互作用、抗体/抗原相互作用等)。可以使用的可化学交联聚合物的实例包括，但不限于，淀粉、结冷胶、葡聚糖、透明质酸、聚(环氧乙烯)、聚膦腈、它们的衍生物、它们的共聚物，及它们的混合物。例如，在制造过程中在乳液液滴的形成过程中这样的聚合物可被甲基丙烯酸酯基团官能化，并且可以经由这些基团的聚合原位交联。
[0046] 化学交联可以在化学交联剂的存在发生。术语”化学交联剂”是指诱导化学交联的试剂。化学交联剂可以是能够诱导相连聚合物链之间的化学键的任何试剂。例如，化学交联剂可以是化学化合物。可作为交联剂的化学化合物的实例包括，但不限于，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸化物(EDC)、乙烯基胺、2-氨基乙基甲基丙烯酸酯、3-氨基丙基甲基丙烯酰胺、亚乙基二胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、Ν,Ν'-亚甲基-双丙烯酰胺、N,N'-亚甲基-双-甲基丙烯酰胺、二烯丙基酒石二酰胺、烯丙基(甲基)丙烯酸酯、低级亚烷基二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚低级亚烷基二醇二(甲基)丙烯酸酯、低级亚烷基二(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基醚、二乙烯基砜、二乙烯基苯或三乙烯基苯、三羟甲基丙烷、三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、双酚A二(甲基)丙烯酸酯、亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、三烯丙基邻苯二甲酸酯、二烯丙基邻苯二甲酸酯、谷氨酰胺转胺酶、它们的衍生物或它们的混合物。
[0047] 在一些实施方式中，水凝胶形成剂本身能够化学或物理交联而无需使用交联剂。
[0049] 因此，交联剂的选择取决于存在的聚合物链和存在的官能团的类型，而且本领域技术人员能够据此选择适合类型的交联剂。
[0050] 在各种实施方式中，水凝胶形成剂主要由可物理交联聚合物组成。在一些实施方式中，水凝胶形成剂包含明胶。在具体的实施方式中，水凝胶形成剂主要由明胶组成或由明胶组成。如本文中使用的，术语”明胶”是指衍生自胶原蛋白的蛋白物质。在本发明的上下文中，”明胶”还指等价物质，例如明胶的合成类似物。通常，可将明胶分类为碱性明胶、酸性明胶或酶明胶。碱性明胶可通过利用碱(例如氢氧化钠或氢氧化钙)处理胶原蛋白而获得。酸性明胶可通过利用酸(例如盐酸)处理胶原蛋白获得。酶明胶可通过利用酶(例如水解酶)处理胶原蛋白获得。由于明胶可以是水凝胶的形式，因此本文中提到的影响水凝胶的降解行为的因素也可适用于明胶。
[0051] 第一个方面的方法包括将水凝胶形成剂溶解于水性介质以形成溶液。如本文中使用的，术语”水性介质”和”水溶液”可互换使用，并且是指水或主要基于水的溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含有溶于其中的盐的水溶液。水性介质也可以包含细胞培养基或由细胞培养基组成。术语”细胞培养基”是指使细胞能够增殖的任何液体培养基。生长培养基是本领域已知的并且能够根据想要生长的细胞来选择。例如，用于使哺乳动物细胞生长的生长培养基是达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)，其能够补充热灭活的胎牛血清。
[0052] 水凝胶形成剂可以至少基本或完全溶解于水性介质中以形成溶液。可以进行搅动，例如，通过搅拌或超声处理，以增强水凝胶形成剂溶于水性介质中的速率。在一些情况下，可选地向水性介质施加热能以增加水凝胶形成剂在水性介质中的溶解速率。例如，可以在约20℃至约45℃的温度范围内将水凝胶形成剂溶解于水性介质，例如约20℃至约40℃，约20℃至约35℃，约20℃至约30℃，约25℃至约45℃，约30℃至约45℃，约35℃至约45℃，约30℃至约40℃，约35℃至约40℃，约30℃，32℃，34℃，36℃，38℃或40℃。在一些实施方式中，将水凝胶形成剂溶解于水性介质在约37℃的温度下进行。
[0054] 溶液中的水凝胶形成剂的浓度会影响所形成的水凝胶微粒的尺寸。通常，大量的水凝胶形成剂导致形成较大尺寸的水凝胶微粒。在各种实施方式中，溶液中的水凝胶形成剂的量的范围可以为约1％(w/v)至约10％(w/v)，例如约1％(w/v)至约8％(w/v)，约1％(w/v)至约6％(w/v)，约1％(w/v)至约5％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2％(w/v)至约6％(w/v)，约2％(w/v)至约5％(w/v)，约3％(w/v)至约8％(w/v)，约3％(w/v)至约6％(w/v)，约3％(w/v)至约5％(w/v)，约8％(w/v)至约10％(w/v)，约6％(w/v)至约10％(w/v)，约4％(w/v)至约10％(w/v)，约4％(w/v)至约8％(w/v)，约4％(w/v)至约6％(w/v)，约4％(w/v)，约5％(w/v)或约6％(w/v)。例如，溶液中的水凝胶形成剂的量可以为约5％(w/v)。
[0055] 第二个方面的方法进一步包括将一种或多种活细胞悬浮于溶液中以形成细胞悬浮液。在细胞悬浮液中包含一种或多种活细胞，例如一种、两种、三种、四种或五种活细胞。术语”活细胞”是指任何能够细胞分化或含有细胞核的细胞。”活细胞”也指具有活性代谢机制(例如线粒体)的细胞。活细胞可以是真核细胞、原核细胞或古生菌。如本文中使用的，术语”真核细胞”是指任何具有确定的细胞核的动物或植物细胞。动物的真核细胞包括脊椎动物(例如哺乳动物)的细胞以及非脊椎动物(例如昆虫)的细胞。植物的真核细胞的实例包括酵母细胞和藻类细胞。真核细胞也可以包含产生抗体的细胞，例如杂交瘤。术语”原核细胞”是指缺少确定细胞核的原核生物的细胞。原核细胞的实例可以包括，但不限于，埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属或乳球菌属。来自这些属的原核细胞种的一些实例为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。术语”古生菌”是指一组单细胞微生物，其细胞内没有细胞核或任何其他的细胞器。
[0056] 真核细胞可以是贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞是指任何当附着于固体支撑材料时生长和增殖，且当存在于悬浮液中无法生长的细胞。在一些实施方式中，贴壁依赖性细胞可以是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞是来源于哺乳动物的任何细胞。哺乳动物细胞可以包括哺乳动物细胞系。在一种实施方式中，哺乳动物细胞系可以是人细胞。人细胞的实例包括，但不限于，骨原细胞、成纤维细胞、表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、肝细胞、肌细胞、来自关节韧带的细胞、来自髓核的细胞、HEK 293细胞和细胞。对于这样的细胞，细胞附着于特定基质的条件很大程度上影响其随后的功能。
[0057] 骨原细胞是指成骨细胞或成骨细胞祖细胞，其形成骨组织。成纤维细胞是纺锤形细胞，其可迅速复制并合成由各种包括I型胶原蛋白的胞外基质分子构成的纤维性基质，并且可以在皮肤中发现。上皮细胞是指表皮的细胞，其中表皮是皮肤的外层，并由四种类型的细胞组成，即，角化细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞。术语"脂肪细胞″是指末期分化的存在于或来源于脂肪组织的细胞。其也被称为贮脂细胞或脂细胞，并且专门用于将能量储存为脂肪。在其分化状态中，脂肪细胞呈圆形形态，其与细胞支架变化和流动性损失有关。神经细胞是指神经系统(尤其是脑)的细胞。神经细胞的实例包括，但不限于，神经元、星形胶质细胞和少突细胞。内皮细胞是指薄的扁平细胞，其是衬在体腔、血管和淋巴管内侧表面的一层细胞，并构成内皮。术语"上皮细胞"是指立方形的有核细胞，其通常位于组织的表面上。一层上皮细胞通常起到提供保护性内衬和/或表面的作用，该内衬和/或表面也可能涉及运输过程。术语"角化细胞"是指能够产生角质的皮肤细胞，包括例如，已知为基底细胞、棘细胞、棘层细胞和颗粒细胞的细胞。肝细胞是构成肝的主要功能性细胞，并且可构成肝组织质量的60％至80％。肝细胞进行关键的代谢、内分泌和分泌功能，举例而言包括碳水化合物、胆固醇和胆汁盐的合成。肌细胞是指分化的、有丝分裂后期的肌肉细胞，在大多数情况下其还未经历融合并且代表过渡细胞类型。来自关节韧带的细胞可以包含来自关节韧带、腹膜韧带或胚胎残余配体(fetal remnant ligant)的软骨细胞或成纤维细胞，由于韧带将骨头彼此连接以形成运动所必需的关节，因此该种细胞是非常重要的。来自髓核的细胞具有类似软骨细胞的特征。在成人中，髓核的细胞经由通过邻近于椎间盘的脊椎终板中的血管扩散以获得营养物质并排除废物。HEK 293细胞为人胚肾细胞系，而细胞为人视网膜细胞系。
[0058] 在可替代的实施方式中，真核细胞可以是非贴壁依赖性细胞。非贴壁依赖性细胞可被进一步分类为A型和B型。A型非贴壁依赖性细胞是指在不存在固体支撑材料时能够生长和繁殖的细胞。例如，A型非贴壁依赖性细胞能够在悬浮液中增殖。A型非贴壁依赖性细胞的实例包括用于再生医学的癌细胞。用于再生医学的癌细胞可以包括，但不限于肝癌细胞或胰腺癌细胞。B型非贴壁依赖性细胞是指当附着于固体支撑材料时能够生长和繁殖，并且在不存在固体支撑材料时也能够生长和繁殖的细胞。B型非贴壁依赖性细胞的实例包括，但不限于软骨细胞、胚胎干细胞、成体干细胞和内胚层谱系细胞。例如，软骨细胞能够在水凝胶中增殖，而水溶胶不被认为是固体支撑材料。在水凝胶中不存在粘着部分的情况下，软骨细胞可以呈有利的球形表型并且进行正常增殖。
[0059] 术语”软骨细胞”是指能够表达软骨细胞的特征生化标记物(例如但不限于II型胶原蛋白、硫酸软骨素和硫酸角质素)，并且能够在体外产生具有软骨的血液动力学性质的组织或基质的细胞。干细胞是指具有自我复制能力并且还具有分化为至少两种细胞的能力的细胞，其可被分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和专能干细胞(multipotent stem cell)。
[0060] 在各种实施方式中，一种或多种活细胞包含软骨细胞。例如，一种或多种活细胞可以主要由软骨细胞组成或由软骨细胞组成。一种或多种活细胞可以是至少基本上均匀地分散于细胞悬浮液中。
[0061] 一种或多种活细胞的浓度可以根据存在的水凝胶形成剂的量而变化。在各种实3 -1 10 -1
施方式中，细胞悬浮液中活细胞的量可在约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 的水凝
3 -1 7 -1 5 -1
胶形成剂的范围内，例如约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 、约1×10细胞ml 至约
7 -1 5 -1 10 -1 7 -1 10
1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 、约1×10细胞ml 至约1×10
-1 5 -1 6 -1 7 -1 8 -1
细胞ml 、约1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 或约1×10 细胞ml 。
7 -1
在一些实施方式中，细胞悬浮液中的活细胞的量为约1×10细胞ml 的水凝胶形成剂。
施方式中，细胞悬浮液中活细胞的量可在约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 的水凝
3 -1 7 -1 5 -1
胶形成剂的范围内，例如约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 、约1×10细胞ml 至约
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1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 至约1×10 细胞ml 、约1×10细胞ml 至约1×10
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细胞ml 、约1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 、约1×10细胞ml 或约1×10 细胞ml 。
7 -1
在一些实施方式中，细胞悬浮液中的活细胞的量为约1×10细胞ml 的水凝胶形成剂。
[0062] 然后将包含一种或多种活细胞和水凝胶形成剂的细胞悬浮液分散于有机油中以形成微乳剂。通过将细胞悬浮液分散于有机油中，细胞悬浮液被乳化以形成具有水相和油相的微乳液，其中水相包含一种或多种活细胞和水凝胶形成剂，油相包含有机油。
[0063] 有机油可以是矿物油或者植物或动物来源的油。如本文中使用的，术语”矿物油”是指是指来自含碳来源(例如石油、页岩和煤或其等价物)的烃油。在优选的实施方式中，有机油为植物或动物来源的油。可以使用的有机油的实例包括，但不限于，豆油、玉米油、葵花籽油、油菜籽油、棉籽油、花生油、橄榄油、芝麻籽油、大米胚芽油、鱼油、鲸油、棕榈油、椰子油、大麻籽油、菜籽油、麦胚油、红花油、亚麻籽油、桐油、蓖麻油和它们的混合物。在各种实施方式中，有机油包含豆油。在一些实施方式中，有机油主要由豆油组成或由豆油组成。
[0064] 本文中使用的术语”微乳液”和”乳液”可互换使用，并且是指两种或更多种不混溶液体的分散体系。因此，将一种液体乳化到另一种液体中会导致形成两个不同的相，其中一种液体的小液滴可以被分散(例如分离并分布在整个空间内)在另一种液体中。该液体的小液滴被称为分散相，而小液滴分散于其中的另一种液体被称为连续相。
[0065] 大多数微乳液由作为不混溶相的水和油或脂肪组成。根据相的组成和比率，存在两种分布方式。在水相的情况下，例如水”W”为连续相而油”O”为分散相，结果是”O/W乳液”或水包油乳液，其基本特性由水相决定。如果油”O”为连续相而水”W”为分散相，则结果为”W/O乳液”或油包水乳液，其中基本特性由油决定。
[0066] 如上文中所述，在根据第一个方面的方法中，细胞悬浮液(其为水系的)被分散于有机油(其为油系的)中，以形成油包水(W/O)乳液。在一些实施方式中，有机油可以含有表面活性剂以使分散于其中的细胞悬浮液稳定，以形成油包水乳液。例如，表面活性剂可以包含疏水性表面活性剂或主要由疏水性表面活性剂组成。这样的表面活性剂的实例包括，但不限于，脱水山梨醇酯、脱水山梨醇单酯、脱水山梨醇三油酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇酐倍半油酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、PEO/PPO共聚物、它们的衍生物和它们的混合物。
[0067] 在各种实施方式中，将细胞悬浮液分散到有机油中是在持续搅拌或者能够乳化两个不混溶相的任何形式的分散方法的条件下进行的。有利的是，利用持续搅拌允许通过改变搅拌速度而简单地控制所形成的微粒尺寸。通常，较低的搅拌速度导致较大的乳化液滴尺寸，并且会转化为增加所形成的微粒尺寸。另一方面，较高的搅拌速度会导致较小的微粒。因此，搅拌速度可被用来影响所形成微粒的尺寸。
[0068] 本文中所使用的搅拌速度可以在约150rpm至约2000rpm的范围内，例如约150rpm至约1500rpm，约150rpm至约1000rpm，约300rpm至约2000rpm，约300rpm至约1500rpm，约300rpm至约1000rpm，约300rpm至约700rpm、约300rpm、约400rpm、约500rpm、约600rpm或约700rpm。在各种实施方式中，以约500rpm的速度进行持续搅拌。根据用于形成细胞悬浮液的材料的类型，例如，过低的搅拌速度会导致用于形成微乳液液滴的剪切力不足。
[0069] 持续搅拌可以进行形成微乳液所必需的任意适合的时间。例如，持续搅拌可以进行几分钟，例如约1分钟至约60分钟，约1分钟至约30分钟，约1分钟至约15分钟，约1分钟至约10分钟，约1分钟至约5分钟，约2分钟至约30分钟，约2分钟至约15分钟，约2分钟至约10分钟，约2分钟至约5分钟，约5分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟，约5分钟至约10分钟或约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟或约1分钟范围内的时间段。在各种实施方式中，将细胞悬浮液分散到有机油中是在持续搅拌约2分钟的条件下进行的。
[0070] 第一个方面的方法包括使微乳液经历使水凝胶形成剂形成为包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件。有利地，这允许一种或多种活细胞在单一步骤过程中与水凝胶微粒结合，其转化为处理简便性和效率。一种或多种活细胞可被负载且位于微粒中，并且另外地或可替代地，可在微粒的表面处存在。在各种实施方式中，一种或多种活细胞至少基本均匀地分散于水凝胶微粒中。在各种实施方式中，包含在微乳液中的水凝胶形成剂被固化以形成水凝胶微粒。
[0071] 在各种实施方式中，使微乳液经历允许水凝胶形成剂形成包含附着于其上和/或封装于其中的一种或多种活细胞的水凝胶微粒的条件包含将微乳液以及包含于其中的水凝胶形成剂，在约0℃至约10℃范围内的温度下冷却，例如约0℃至约8℃，0℃至约6℃，0℃至约4℃，0℃至约2℃，2℃至约10℃，2℃至约8℃，2℃至约6℃，5℃至约10℃，7℃至约
10℃或约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃或约5℃。在各种实施方式中，通过冷却该微乳液，包含在微乳液中的水凝胶形成剂被凝胶化或固化，从而封装一种或多种活细胞。
10℃或约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃或约5℃。在各种实施方式中，通过冷却该微乳液，包含在微乳液中的水凝胶形成剂被凝胶化或固化，从而封装一种或多种活细胞。
[0072] 在形成水凝胶微粒时或水凝胶微粒形成后，可从乳液提取有机油。例如，有机油和水凝胶微粒可经历分离过程(例如离心)以将有机油与水凝胶微粒分离，并且其可以存在为两个相，以使得易于从微乳液提取有机油。第一方面的方法可以在有机油的提取之后进一步包括至少一个离心步骤和至少一个清洗步骤。该至少一个离心步骤和至少一个清洗步骤可作为纯化步骤对所形成的用于储存和/或应用的微粒进行清洁。
[0073] 如本文中使用的，术语”微粒”是指具有测量为微米(μm)级别尺寸的微观的颗粒。微粒的尺寸可由其最大尺寸来表征。如在本文中适用的，术语"最大尺寸(maximal dimension)"是指穿过微粒中心并在边缘处终止的直线部分的最大长度。在微球的情况下，微球的最大尺寸对应于其直径。术语”平均最大尺寸”是指微粒的均值或平均最大尺寸，并且可通过用每个微粒的最大尺寸的和除以微粒的总数来计算。因此，最大尺寸的平均值可用于任意形状微粒的计算，例如具有常规形状的微粒，例如球形、半球形、立方形、棱柱形或菱形或不规则形状的微粒。
[0074] 所形成的水凝胶微粒的最大尺寸可以在约50μm至约200μm的范围内，例如约50μm至约150μm，约50μm至约100μm或约50μm至约75μm。在各种实施方式中，所形成的水凝胶微粒基本上是单分散性的。
[0075] 在第二个方面，本发明涉及包含根据第一个方面的可降解的水凝胶与包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物。在另一个方面，本发明还涉及包含可降解的水凝胶与包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物，其中可降解的水凝胶和水凝胶微粒中的至少一种包含影响水凝胶微粒降解的致孔剂。
[0077] 热降解是指利用热施加于材料，以使其分解为较小的分子。磨擦降解或物理降解是指在材料上施加力或压力以将材料破坏为较小的部分。化学降解是指使用通过溶液的pH或离子强度的影响或者通过与材料的化学反应将材料降解为较小的分子的化学试剂(例如水凝胶)。例如，化学降解的形式可以是水解降解，其中明胶在水的存在下经历水解降解，并且能够产生被称为的胶原蛋白水解物(CH)的产物，其可含有平均分子量为3至6kDa的肽。
[0078] 电降解是指使用电流和/或电压通过材料以使得材料被分解。在辐照降解中，使用例如γ波和紫外波的电磁波以降解材料。可降解的水凝胶也可以被生物降解，即，其是可生物降解的。术语”可生物降解的”是指当暴露于自然中通常存在的环境条件时能够被微生物分解或在相对短的时间内(在2至15个月内)自发分解的物质。例如，明胶能够被体内存在的酶降解。
[0079] 在一些实施方式中，可降解的水凝胶的降解可在几秒至几天或几个月的时间段内发生。水凝胶降解所需的时间段可取决于几个参数，例如，水凝胶的构成，例如所使用的水凝胶前体或水凝胶形成剂的类型以及水凝胶的水含量、交联度、温度、pH、存在的水性介质的量以及凝胶化过程中的压力。在生理条件下，这意味着在动物体内，通常在约2个月后发生。如上文所述，可通过使水凝胶经历交联而延长该时间段。
[0080] 可降解的水凝胶可形成或作为至少一种水凝胶微粒的基质或框架。在各种实施方式中，可降解的水凝胶中存在多个水凝胶微粒，并且该水凝胶微粒可以至少基本均匀地分散于该可降解的水凝胶基质中。
[0081] 可降解的水凝胶可由与水凝胶微粒相同或不同的材料形成。在各种实施方式中，可降解的水凝胶由与水凝胶微粒中包含的材料不同的材料形成。该可降解的水凝胶可选自由天然聚合物制成的水凝胶、由合成聚合物制成的水凝胶以及它们的组合组成的组中。例如，形成可降解的水凝胶的聚合物的(一种或多种)类型的具体选择可取决于预期应用。
[0082] “天然聚合物”是指可在自然中发现的聚合物材料。在各种实施方式中，水凝胶由选自由多糖、粘多糖、蛋白质和它们的混合物组成的组中的天然聚合物形成。这些水凝胶也可被称为"天然水凝胶"。
[0083] 多糖是可被水解为两个或更个单糖分子的碳水化合物。它们可以含有重复的碳水化合物(即糖)单元的骨架。多糖的实例包括，但不限于，藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、淀粉和结冷胶。粘多糖为含有氨基糖作为组分的多糖。粘多糖的实例包括，但不限于，透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、肝素、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺和葡糖胺。
[0084] 形成多肽以及蛋白质的构建块的肽通常是指通过肽键连接的氨基酸短链。通常，肽包含约2至100个，更典型地为约4至50个，且最通常为约6至20个氨基酸的氨基酸链。多肽通常是指单个直链或支链的氨基酸序列，其通常比肽要长。其通常包含长度为至少约20至1000个氨基酸，更典型地至少约100至600个氨基酸，并且经常为至少约200至约500个氨基酸。包括一种特定氨基酸的共聚物，例如，聚赖氨酸。蛋白质包括单个多肽以及多条多肽链的复合物，其可以相同或不同。
[0085] 蛋白质可具有生物学功能并且可被分为五种主要类型，即，结构性蛋白质例如胶原蛋白、催化性蛋白质例如酶、转运性蛋白质例如血红蛋白、调节性蛋白质例如激素以及保护性蛋白质例如抗体和凝血酶。蛋白质的其他实例包括，但不限于，纤连蛋白、明胶,、纤维蛋白、果胶、白蛋白、卵清蛋白和聚氨基酸。例如，多糖可以选自由藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、淀粉、结冷胶和它们的混合物组成的组中。
[0086] 本领域公知的天然水凝胶的实例包括藻酸盐和琼脂糖。在一些实施方式中，可降解的水凝胶包含藻酸盐。术语”藻酸盐”是指褐藻胶的任何常规盐，其为海洋藻类的多糖并2+
且由于其生物相容性、低毒性、相对低成本并且易于被二价阳离子(例如钙离子(Ca )和镁
2+
离子(Mg ))凝胶化，其可聚合以形成用于药物递送和组织工程的基质。藻酸盐的实例包括藻酸钠，其是水溶性的以及藻酸钙，其不溶于水。在一些实施方式中，可以使用琼脂糖作为水凝胶。琼脂糖是指从海藻(例如红藻)的agarocytes提取的多糖复合物的中性凝胶部分。然而，与藻酸盐不同的是，其形成热可逆的凝胶。
且由于其生物相容性、低毒性、相对低成本并且易于被二价阳离子(例如钙离子(Ca )和镁
2+
离子(Mg ))凝胶化，其可聚合以形成用于药物递送和组织工程的基质。藻酸盐的实例包括藻酸钠，其是水溶性的以及藻酸钙，其不溶于水。在一些实施方式中，可以使用琼脂糖作为水凝胶。琼脂糖是指从海藻(例如红藻)的agarocytes提取的多糖复合物的中性凝胶部分。然而，与藻酸盐不同的是，其形成热可逆的凝胶。
[0087] 在各种实施方式中，合成水凝胶选自由亲水性单体制成的水凝胶、由亲水性聚合物制成的水凝胶、由亲水性共聚物制成的水凝胶和它们的组合组成的组中。
[0088] 可以使用的亲水性单体的实例包括，但不限于，2-羟乙基甲基丙烯酸酯、2-羟乙基丙烯酸酯、2-羟乙基甲基丙烯酰胺、2-羟乙基丙烯酰胺、N-2-羟乙基乙烯基氨基甲酸酯、2-羟乙基乙烯基碳酸脂、2-羟丙基甲基丙烯酸酯、羟己基甲基丙烯酸酯、羟辛基甲基丙烯酸酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、富马酸、巴豆酸、马来酸、单甲基马来酸酯、单乙基马来酸酯、单甲基富马酸酯、单乙基富马酸酯、(甲基)丙烯酰胺、巴豆酰胺、肉桂酰胺、马来酰二胺、富马酰二胺、甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、丁硫醇、叔丁硫醇、戊硫醇、对苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、p-α-甲基苯乙烯磺酸、异戊二烯亚砜及其盐。
[0089] 可以使用的亲水性聚合物的实例包括，但不限于，乙交酯、丙交酯的聚合物和低聚物；聚乳酸；α-醇酸的聚酯，其中所述醇酸包括乳酸和乙醇酸，例如聚(α-羟基)酸，包括聚乙醇酸、聚-DL-乳酸、聚-L-乳酸；以及DL-丙交酯和乙交酯的三元共聚物；ε-己内酯和与聚酯共聚的ε-己内酯；聚内酯和聚己内酯，包括聚(ε-己内酯)、聚(ε-戊内酯)和聚(γ-丁内酯)；聚酐；聚原酸酯；其他醇酸；聚二氧环己酮；胶原蛋白-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)；聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)(PHEMA)以及无毒或在体内作为代谢物存在的其他可生物降解的聚合物。上文列出的亲水性聚合物的实例也可以是可生物降解的。
[0090] 如上文中所述，可降解的水凝胶可以形成或作为包含至少一种水凝胶微粒的基质或框架。在各种实施方式中，在可降解的水凝胶中存在多个水凝胶微粒，并且该水凝胶微粒可以至少基本均匀分布在可降解的水凝胶基质中。
[0091] 组合物中的可降解的水凝胶和至少一种水凝胶微粒的重量比可以是任意比率，例如约0.01至1或约0.25至1或约0.5至1或约0.75至1或约1至1。
[0092] 在各种实施方式中，水凝胶微粒包含在体温下降解的可降解材料。如本文中使用的，术语”体温”是指对活的哺乳动物所期望的体温范围，其为约34℃至约40℃，并且对于人通常接受的为约37℃。
[0093] 在各种实施方式中，水凝胶微粒包含表面交联的明胶。可用于交联明胶的适合的交联剂包括京尼平、甲醛、戊二醛、l-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸化物(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和它们的混合物。例如，明胶可与诸如京尼平的交联剂交联。在具体的实施方式中，水凝胶微粒包含在0.25wt％京尼平溶液中交联的明胶。
[0094] 表面交联度会受到，例如，可降解的颗粒暴露于交联剂的时间变化、交联剂与水凝胶微粒的比率以及水凝胶微粒暴露于交联剂期间的温度和/或时间变化的影响。交联的温度可在约20℃至约40℃的范围内，例如约25℃至约40℃、约30℃至约40℃、约35℃至约40℃或约35℃、约36℃、约37℃、约38℃或约39℃。所采用的温度取决于用于制造水凝胶微粒的交联剂和聚合物的类型。
[0095] 可降解的水凝胶和水凝胶微粒中的至少一种包含影响水凝胶微粒降解的致孔剂。当存在于水凝胶微粒中时，可通过将致孔剂加入用于培养至少一种类型的活细胞的细胞培养基中，并随后使活细胞分散在水凝胶微粒中，从而将致孔剂引入到水凝胶微粒中。组合物中存在致孔剂使得相比于水凝胶基质，水凝胶微粒的降解速率更快。由于水凝胶微粒比周围可降解的水凝胶基质降解得更快，一种或多种活细胞可被释放到由降解水凝胶微粒而形成的腔中，在其中该一种或多种活细胞继续增殖。有利的是，在可降解的水凝胶基质中形成的腔为细胞生长提供了空间，同时允许其获得改善的营养物和废物扩散。
[0096] 在各种实施方式中，致孔剂包含酶或主要由酶组成。致孔剂的选择可以取决于水凝胶微粒中包含的水凝胶的类型。例如，致孔剂可以选自由胶原酶、蛋白酶、糖苷酶、链霉蛋白酶、酪蛋白酶、软骨素酶、皮肤素酶(dermatanase)、弹性蛋白酶、明胶酶、肝素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、脂肪酶、金属蛋白酶、葡激酶、链激酶、糜蛋白酶、肽链内切酶V8、胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和它们的组合组成的组中。在一些实施方式中，致孔剂包含胶原酶。在具体的实施方式中，致孔剂主要由胶原酶组成或由胶原酶组成。
[0097] 除了致孔剂的浓度和类型之外，水凝胶颗粒降解所需的时间段也可以取决于不同的参数，例如，水凝胶颗粒的组成，例如所使用的可降解的颗粒前体的类型和水凝胶颗粒的水含量，交联度、温度、pH、存在的水性介质的量、水凝胶颗粒上所受到的可降解的水凝胶基质的压力量以及凝胶化期间的压力。在各种实施方式中，该水凝胶颗粒可以被热处理以降解水凝胶颗粒。
[0098] 除了组合物中的至少一种水凝胶微粒中包含的一种或多种活细胞之外，该组合物的可降解的水凝胶也可以包含一种或多种活细胞。根据预期应用，可降解的水凝胶中含有的活细胞可以与至少一种水凝胶微粒中含有的一种或多种活细胞相同或不同。可以使用的活细胞可以已经在上文中描述。在各种实施方式中，可降解的水凝胶中含有的活细胞包含软骨细胞。在具体的实施方式中，可降解的水凝胶中含有的活细胞主要由软骨细胞组成或由软骨细胞组成。
[0099] 根据本发明各个方面的组合物可以是可注射组合物。在生物学应用中，例如，组合物的可注射性使得能够容易地将其递送至期望应用的位点。在注射组合物之后，其后的步骤可以发生：(a)水凝胶基质形成，(b)水凝胶颗粒降解以形成水凝胶基质中的腔，(c)细胞增殖和在水凝胶基质中迁移，其中细胞可由水凝胶颗粒或水凝胶基质和水凝胶颗粒引入到腔中；(d)水凝胶基质降解和组织岛扩增。组织岛扩增是指自身形成胞外基质代替水凝胶基质的细胞。
[0100] 在各种实施方式中，水凝胶具有提供额外反应性基团或官能团的表面，所述反应性基团或官能团允许结合其它分子。如本文中使用的，术语"反应性基团"或"官能团"是指表现出成键能力的化学基团。官能团的实例包括，但不限于，羟基(-OH)、羧基(-COOH)、酰胺(-CONH-)、巯基(-SH)或磺酰基(-SO3H)基团可进一步包括其他部分，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、地高辛(digoxigenin)和抗地高辛(anti-digoxigenin)。术语”结合”可意指物理键合或化学键合。其他分子的实例包括，但不限于，举例而言：细胞、生物活性分子、颗粒、分子。在一些实施方式中，水凝胶微粒可以具有允许细胞结合于其表面上的反应性基团。因此，在这样的实施方式中，被结合的细胞可以存在于水凝胶微粒的周围，因而其可以在通过降解微粒而形成的腔处增殖和生长，其可以缩短组织形成的时间，因为细胞不必通过水凝胶本体迁移到腔。
[0101] 在一些实施方式中，可将该组合物倒入或注入到具有所需解剖形状的模具中，然后使其变硬以形成其中具有分散于其中的细胞的基质，可将该基质移植到患者体内。水凝胶可以降解，只留下所获得的组织。在一些实施方式中，该组合物适合于被递送至动物或人体中的位点，例如缺陷位点。可将该组合物直接注射到患者的位点(例如缺陷位点)中，在该处水凝胶会变硬成为其中分散有细胞的基质。凝胶也可以是与悬浮于水凝胶中的细胞生物相容，例如无毒。也可以使水凝胶形成并且随后将该组合物造型以匹配待移植的缺陷位点处的尺寸和形状。
[0102] 根据本发明的组合物也可以作为细胞生长培养基或细胞构建体。可在适合用于细胞生长的条件下培养细胞构建体。也就是说，可将该细胞构建体置于孵育器中或患者体内，从而将细胞保持在适当的环境条件下以允许细胞存活、增殖、分化和/或表达某些产物。”细胞生长”意指细胞存活并且优选，但不是排他性地分化和增殖。该组合物可被用于诱导组织产生。在一些实施方式中，该组合物可以包含细胞生长培养基，其通常为细胞生长提供必要的营养物质和环境条件。可通过将组合物引入到患者中并使天然细胞(例如干细胞)迁移至该组合物中而在适于细胞生长的条件下引入和培养细胞。可通过将该组合物注入到需要细胞生长或重建的区域(例如损伤的组织或缺陷位点的区域)中来施用该组合物。
[0103] 在一些实施方式中，根据本发明的组合物可进一步包含生物活性分子。如本文中使用的，”生物活性分子”被定义为那些在生物系统中起作用的有机分子，不论这样的系统是在体内、体外或原位。生物活性分子可以包括，但不限于生长因子、细胞因子、防腐剂、抗生素、抗炎剂、止痛剂、麻醉剂、化疗剂、凝血剂、代谢物、趋化因子、激素、类固醇和其他药物或细胞粘附分子。
[0104] 术语”生长因子”是指影响细胞(例如成骨细胞、成纤维细胞、神经细胞、内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、软骨细胞、肌细胞、来自关节韧带的细胞和来自髓核的细胞)功能的因子。血小板衍化生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)胰岛素样生长因子(IGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)和骨形态发生蛋白(BMPs)是根据本发明的组合物所涵盖的生长因子的实例。术语”细胞因子”是指由免疫细胞产生以调节细胞功能的肽蛋白调节因子。细胞因子的实例包括，但不限于，白细胞介素-Iβ(IL-Ιβ)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)。
[0105] 术语”防腐剂”是指抑制携带疾病的微生物生长的化学试剂。防腐剂的实例包括过氧化物、C6至C14烷基羧酸和烷基酯羧酸、抗菌天然油、抗菌金属和金属盐，例如银、铜、锌及其盐。术语"抗生素"包括基本上可溶于水的抗细菌、抗真菌和抗感染药物，例如，庆大霉素、万古霉素、青霉素和头孢菌素。可以加入抗生素，例如，以选择细胞或防止组合物中细菌生长。术语"抗炎剂"是指具有减轻或消除脑水肿(积液)或脑缺血的能力的任何试剂，并且能够包括以下实例，例如自由基清除剂和抗氧化剂、非甾体抗炎药、甾体抗炎剂、应激蛋白或NMDA拮抗剂。术语"止痛剂"是指在不丧失意识的情况下减轻或消除疼痛的药物。止痛剂通常被分为例如，麻醉性止痛剂(例如吗啡)、非麻醉性止痛剂(例如阿司匹林)和麻醉拮抗性止痛剂，其通过类似于麻醉性止痛剂的机制发挥止痛剂的作用。术语"麻醉剂"是指使受试者身体的某一区域产生可逆的感觉丧失的试剂。麻醉剂的实例包括丁哌卡因、左旋布比卡因、利多卡因、丙胺卡因和可卡因。
[0106] 术语”化疗剂”是指有效对抗一种或多种形式癌症的任何天然或合成分子，并且可以包括为细胞毒素的分子(抗癌剂)、刺激免疫系统的分子(免疫刺激剂)或调节或抑制血管生成的分子。化疗剂的实例包括烷化剂、抗代谢物、紫杉烷(taxanesm)、细胞毒素和细胞保护佐剂。术语"凝血剂"是指促进凝血的任何分子或化合物。凝血剂的实例包括凝血酶剂、肝素、华法令和香豆素衍生物，凝血酶剂通常被血管外科医生用作局部治疗以在体内发生的大的表面切口之后终止表面出血。术语"代谢物"是指由向受试者施用的物质的酶转化而产生的中间体或产物，该转化作为受试者的代谢过程的一部分发生。代谢物的实例包括葡萄糖、碳水化合物、氨基酸和脂质。术语”趋化因子”是指引起细胞积聚的物质，例如趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1和半乳凝素-3。术语"激素"是指由不同的内分泌腺产生的痕量物质，其起到被血液带到不同靶器官的化学信使的作用，其调节脊椎动物中的各种生理和代谢活动。激素的实例包括甾体雌激素、孕酮、雄激素和孕激素黄体酮。类固醇也可以被分类为脂质。以非常低浓度存在的天然存在的类固醇为动物发育和代谢的重要调节剂。类固醇的实例包括胆固醇、可的松以及雌激素和黄体酮的衍生物。如本文中使用的，术语"细胞粘附分子"包括，但不限于，纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、I型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白、凝血酶敏感蛋白和纤维蛋白原。这些分子对于贴壁依赖性细胞的附着是很重要的。
[0107] 在第四个方面，本发明涉及制造组织工程支架的方法。
[0108] 如本文中使用的，术语”支架”是指彼此联通的孔的高孔隙率、人造的三维网络，其在体内被用作支架，额外的细胞可附着于其上并且现有的和额外的细胞可以生长以使得由于损伤或疾病而丧失的组织再生。术语"活支架"是指可由活细胞或通过活细胞形成的支架。可通过本文中所述的物理键合或化学键合将一种或多种活细胞附着于支架。可允许活细胞在一段时间内增殖，其中这些细胞可以生长以形成群落，之后该群落可以融合以形成细胞的网络，并随后形成活支架。
[0109] 通常，增殖的时间可在几小时或几天至几周的范围内，例如约1天至约4周或约1天至约2周或约1天至约1周。增殖的时间也可以取决于细胞的培养条件。培养条件的参数可以包括，例如，温度、pH、水量、压力、存在的营养物质以及细胞的类型。例如，公知真核哺乳动物细胞的生长通常比例如原核细菌细胞要慢得多。细胞的培养条件是本领域已知的并且因此本领域技术人员可根据期望的细胞类型和应用来采用。
[0110] 该方法包括，提供包含可降解的水凝胶和包含附着在其上和/或封装在其中的一种或多种活细胞的至少一种水凝胶微粒的混合物的组合物。上文中已经描述了可以使用的可降解的水凝胶、水凝胶微粒和活细胞的实例。
[0111] 在各种实施方式中，可降解的水凝胶包含一种或多种活细胞。在允许一种或多种活细胞在可降解的水凝胶中增殖并且至少一种水凝胶微粒在可降解的水凝胶中降解的条件下培养该组合物，以允许存在于水凝胶微粒或水凝胶微粒和可降解的水凝胶中的一种或多种活细胞增殖，并允许至少一种水凝胶微粒降解。该方法还包括降解所培养混合物的可降解的水凝胶以获得支架。
[0112] 包含水凝胶微粒和可降解的水凝胶的组合物可以自然降解。术语”自然降解”是指将组合物置于预期应用的环境中以使得水凝胶降解。该组合物也可以利用本文中所述的降解方式之一被人工降解。可以调节水凝胶微粒和可降解的水凝胶的降解速率以匹配细胞增殖的速率。例如，水凝胶微粒可以相比于可降解的水凝胶的降解速率更快的速率降解，二者可以均比细胞增殖速率要快，以使得细胞可具有足够的生长空间。随后，可降解的水凝胶中的腔可以物理引导和适应新组织在腔内的生长。该新组织可最终填充腔并且最终在可降解的水凝胶中融合在一起。
[0113] 在各种实施方式中，水凝胶微粒和可降解的水凝胶中的至少一种包含影响水凝胶微粒降解的致孔剂。上文中已经描述了适合的致孔剂的实例。
[0114] 水凝胶的特征在于高渗透性，以用于交换细胞增殖必需的营养物质，且水凝胶的物理性质类似于天然组织。如上文中所述，根据用于移植的组织或器官的类型，可以向水凝胶微粒和/或可降解的水凝胶中加入不同种类的活细胞。术语”组织”是指由连接在一起的相关细胞形成的结构，其中细胞共同作用以完成特定的功能。器官是指由各种细胞或组织构成并且适应于特定功能的有机体的分化结构。因此，可向组合物中加入一种或多种活细胞或者组合物中可包含一种或多种活细胞以形成特定的器官。例如，心脏是一种器官，其含有用于泵送血液的肌肉组织、构成心脏瓣膜的纤维组织和维持心率和心跳节律的特殊细胞(special cells)。
[0115] 根据第四个方面的支架可被广泛用于多种应用，例如组织工程。例如，其可被用于自体细胞的三维扩增，如骨髓间充质干细胞，其由于供区并发症而受到限制。用于这样的应用的宿主可以是任何适合的动物。在进一步的实施方式中，所述宿主为哺乳动物或人类患者。
[0116] 根据第四个方面的支架也可以作为基质用于移植，例如，解离的细胞(例如软骨细胞或肝细胞)，以产生三维组织或器官。可将任意类型的细胞加入到支架中用于进行培养和可能的移植，包括肌肉和骨骼系统的细胞，例如软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞和骨细胞、实质细胞例如肝细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肠源性细胞和其他细胞例如神经细胞和皮肤细胞，不论是由供体获得的、由构建的细胞培养物系或甚至在基因工程之前或之后获得的。也可以使用组织的切片，其可以在同一结构中提供一些不同的细胞类型。支架也可以被用作用于贴壁依赖性细胞的三维体外培养系统，例如更近似地模仿生理学微环境的三维微环境中的肝细胞。
[0117] 下文中，将参照附图更全面地描述本发明，其中示出了本发明的示例性实施方式。然而，本发明可以许多不同的形式实施，而不应被解释为限于本文中所述的示例性实施方式。而提供这些实施方式是为了使本公开全面和完整，并向本领域技术人员全面解释本发明的范围。在附图中，出于清楚的目的，可能扩大了层和区域的长度和尺寸。
[0118] 如本文中使用的，术语”和/或”包括一个或多个相关所列事项中的任一种或全部组合。应该理解，尽管术语第一、第二、第三等等在本文中可被用于描述各种元素、组分、区域、层和/或部分，但这些元素、组分、区域、层和/或部分不应限于这些术语。使用这些术语仅仅是为了将一种元素、组分、区域、层或部分与其他的区域、层或部分相区分。因此，以下所讨论的第一元素、组分、区域、层或部分能够被称为第二元素、组分、区域、层或部分，而不背离本发明的教导。
[0119] 本文中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施方式的目的，而不是意在限制本发明。除非上下文中明确指出，如本文中使用的，单数形式”一个(a)”、”一种(an)”和”该(the)”旨在也包括复数形式。还应该理解，当本发明说明书中使用术语”包含(comprises)”和/或”包含(comprising)”时，表明所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组分的存在，而不是排除存在或加入一种或多种其他的特征、整数、步骤、操作、元素、组分和/或它们的组。
[0120] 除非另外定义，本文中使用的所有的术语(包括技术和科学术语)与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的涵义。应该进一步理解，这些术语(例如在那些常用字典中的定义)应该被解释为具有与其在相关领域的情境中的涵义相一致的涵义，而不应被解释为理想化的或过度的字面涵义，除非本文中明确如此定义。
[0121] 本文中示例性描述的本发明可以适合于不存在本文中未具体披露的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应被广义理解而不是进行限制。另外，本文中采用的术语和表达被用作说明的术语，而非限制，并且并不旨在使用这样的术语和表达来排除其所示出或描述或其部分的特征的等同方式，但应该认识到，各种修改方式均可包括在本发明所要求保护的范围内。因此，应该理解，尽管已经通过优选的实施方式和可选特征具体描述了本发明，但本领域技术人员可采用实现本文的实施方式中披露的本发明的变化和改变，并且这样的变化和改变被认为是包括在本发明的范围内。
[0122] 本文中已经广泛并从总体上描述了本发明。落入总体披露内容中的每一较窄种类和下位组也构成本发明的一部分。这包括了从种属中排除了任何主题的附条件的或消极限制的对本发明的总体描述，而与本文中是否具体提到了所测试的材料无关。
[0124] 实验部分
[0125] 一方面，已经开发和研究了封装负载细胞的微球的水凝胶形式的治疗性细胞递送方法。在示例性实施方式中，作为软骨组织工程的模型细胞，在低温且无任何化学处理的条件下，在经由油包水单一乳化过程形成微球的过程中，成功地将具有高细胞活性的软骨细胞封装在明胶类微球(大多数直径为50μm至100μm，中值为75μm至100μm)中。然后将这些负载细胞的微球封装在藻酸盐类水凝胶构建体中。通过升温至37℃使负载细胞的微球在2天内完全溶解，得到水凝胶本体中的相同数量的相同尺寸球形腔，同时被封装的细胞从微球中释放并悬浮于该腔内，以待培养，从而用于进一步发育。在这种细胞递送系统中，微球起到作为可去除的细胞载体和用于产生水凝胶内腔的双重作用，其中被递送的细胞具有自由生活空间和更好的可渗透环境。通过WST-1、定量聚合酶链反应、生物化学测试和各种免疫组织化学和组织学染色来测试和评价这种与负载细胞的水凝胶支架相关的由温度固化的可溶性明胶微球类细胞载体(tDGMC)。结果表明，tDGMC技术能够促进作为非贴壁治疗性细胞的软骨细胞的递送，具有显著更好的效率。
[0126] 在另一方面，根据各种实施方式开发了将可降解的微球用作细胞载体且使用致孔剂在藻酸盐水凝胶构建体本体中产生腔用于可控尺寸的肝细胞球体发育的平台。
[0127] 在示例性实施方式中，首先将细胞接种于京尼平交联的微球上并将这些负载细胞的微球封装在藻酸盐水凝胶中。在凝胶化之后，通过引入胶原酶(MMP9)使微球崩解以在凝胶本体中制造腔；所负载的细胞悬浮并被捕获于这些腔中，为球体形成提供空间，同时藻酸盐本体起到约束的作用以将所产生的球体尺寸限定在一定范围内。
[0128] 根据各种实施方式的方法是有利的，因为整个组织机构简单且不需要任何专用设备。此外，其是经济的且便于扩大规模。尤其是在其中使用藻酸盐作为水凝胶本体的实施方式中，能够通过柠檬酸钠处理从藻酸盐凝胶本体中回收细胞球体。在多糖水凝胶中，藻酸盐是具有用于细胞回收的这种独特性质的唯一凝胶系统。因此，能够获得无支架的细胞团块以用于进一步分析或随后的研究。
[0129] 实施例1.1：tDGMC的制造和尺寸表征
[0130] 通过将0.50g明胶(来自猪皮的A型明胶；Sigma)溶解于10ml由5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)和5ml软骨细胞培养基(CC培养基)组成的溶液中来制备明胶溶液(5％w/v)。CC培养基的组成如下：含有20％v/v FBS Gold(Gibco)、0.4mM脯氨酸、0.01M的4-(2-羟-1 -1
乙基)-哌嗪-l-乙磺酸、0.1mM非必需氨基酸、0.05mg ml 维生素C、100mg ml 链霉素和-1
100单位ml 青霉素的DMEM Glutamax(Gibco)。
乙基)-哌嗪-l-乙磺酸、0.1mM非必需氨基酸、0.05mg ml 维生素C、100mg ml 链霉素和-1
100单位ml 青霉素的DMEM Glutamax(Gibco)。
[0131] 以1×107细胞ml-1明胶的浓度将第1代猪软骨细胞悬浮于37℃明胶溶液中。将悬浮液加入到含有15ml豆油(过滤并预热至37℃)的50ml烧杯中，并在室温下以500rpm搅拌2分钟。然后将烧杯转移至冰水浴中并以300rpm搅拌10分钟。将乳液以700rpm离心3分钟。在除去上清液后，将其中封装有软骨细胞(tDGMC)的明胶微球沉淀(即tDGMC)再悬浮于15ml的4℃ 1x PBS中以用于清洗。将悬浮液以700rpm离心3分钟并再次清洗。
[0132] 图1A中示出了在无菌条件下进行的程序的简单示意图。表1中给出了在样品命名中使用简称列表。
[0133] 表1：所使用的简称列表
[0134]简称 扩大解释
tDGMC 温度固化的可溶明胶微球类细胞载体
PTCC 相转移细胞培养物
LhCG 活的透明软骨接枝物
blkMC 空白明胶微球
blkGEL 空白藻酸盐凝胶
tDGMC 温度固化的可溶明胶微球类细胞载体
PTCC 相转移细胞培养物
LhCG 活的透明软骨接枝物
blkMC 空白明胶微球
blkGEL 空白藻酸盐凝胶
[0135] 为了定量分析尺寸分布，在100mm培养皿中将适当量的tDGMC悬浮于1xPBS中。在光学显微镜(Carl-Zeiss)下随机取20个图像以用于确定尺寸分布。
[0136] 实施例1.2：三维(3-D)构建体(PTCC-tDGMC构建体)的制造
[0137] 如图1B所述制造PTCC-tDGMC构建体。首先，将1×107的第1代猪软骨细胞和0.30g的tDGMC混合于1ml藻酸盐溶液(1.5％w/v褐藻酸溶解于0.15M氯化钠(NaCl)中)中。然后，将80μl的悬浮液注入到每个圆柱形硅胶模具腔中，将模具置于预涂有含氯化钙(CaCl2)的明胶基板(在蒸馏水中的15％w/v明胶和102mMCaCl2)的100mm培养皿上。每个模具腔的直径为7mm，深2mm。为了发生藻酸盐的凝胶化，将培养皿置于4℃中4分钟，之后向每个构建体的上表面缓缓加入15μl的102mM CaCl2并再次将其置于4℃中4分钟。
[0138] 在37℃培养后，在2天内明胶完全溶解，剩下软骨细胞悬浮于腔中，同时软骨细胞被封装在藻酸盐凝胶本体中。悬浮的软骨细胞在孔中增殖为细胞岛，同时藻酸盐凝胶本体中的细胞也渗透孔，形成由软骨细胞和其分泌的胞外基质(ECM)组成的新组织。一段时间后，该新组织继续发育并与其他组织融合。
[0139] 实施例1.3：3-D构建体(PTCC-blkMC构建体)的制造
[0140] 通过油包水包油双重乳化方法制备空白(无细胞)明胶微球(blkMC)。简言之，将30ml 10％w/v明胶溶液(预热至70℃)加入到含有10ml乙酸乙酯的100ml烧杯中并以
700rpm搅拌1分钟。将明胶/乙酸乙酯乳液转移至另一个含有60ml豆油的100ml烧杯中并以350rpm搅拌1.5分钟。利用二氧杂环己烷和丙酮来清洗悬浮液三次以除去豆油。最后，在70℃烘箱中干燥明胶微球并过筛以进行尺寸定量分析。
700rpm搅拌1分钟。将明胶/乙酸乙酯乳液转移至另一个含有60ml豆油的100ml烧杯中并以350rpm搅拌1.5分钟。利用二氧杂环己烷和丙酮来清洗悬浮液三次以除去豆油。最后，在70℃烘箱中干燥明胶微球并过筛以进行尺寸定量分析。
[0141] 然后利用空白的明胶微球来制造PTCC-blkMC构建体。简言之，将直径小于200μm的润湿的空白微球与1×107的1代猪软骨细胞以0.3g ml-1的浓度在1ml藻酸盐溶液中共悬浮，并如上所述凝胶化(图1C)。在37℃培养后，明胶溶解并在构建体内形成孔。藻酸盐凝胶本体内的软骨细胞朝向腔的方向自然增殖并以新组织将孔填满。
[0142] 实施例1.4：3-D构建体(blkGEL-tDGMC构建体)的制造
[0143] 以0.30g ml-1藻酸盐的浓度将tDGMC悬浮于藻酸盐溶液(不与细胞混合)中，将其注入到模具中并如上所述凝胶化。空白的藻酸盐凝胶(blkGEL)-tDGMC构建体仅被用于观察已经经历过tDGMC技术的细胞的增殖和活性。
[0144] 实施例1.5：3-D构建体的制造(无支架的LhCG构建体的获得)
[0145] 在室温下，将PTCC-blkMC或PTCC-tDGMC的每个构建体置于含有5ml柠檬酸钠(SC)溶液(55mM，在0.15M NaCl中)的15ml管中10分钟以通过溶解和洗除来除去藻酸盐相。可在每周固定时间点进行：第14天、第21天、第28天和第35天。在SC处理后，如果仍保持物理完整性而未崩塌，则将PTCC-blkMC和PTCC-tDGMC构建体分别重命名为LhCG-blkMC和LhCG-tDGMC。
[0146] 在定轨摇床上以50rpm的温和振摇(每12小时轮换)下，在37℃下、5％CO2和湿度下在CC培养基中培养所有的构建体。
[0147] 实施例1.6：细胞活性测试
[0148] 通过WST-1测试(Roche,瑞士)对PTCC-blkMC和PTCC-tDGMC构建体的细胞活性进行定量分析。
[0149] 简言之，在黑暗中在37℃，5％CO2条件下将每个样品在10％v/v WST-1试剂中在CC培养基中培养1.5小时。将培养基转移至96-孔板(Iwaki)并利用微板酶标仪( 谱,Thermo)相对于690nm对照吸光度在450nm测量吸光度。还使用活/死染色(Invitrogen)。
[0150] 实施例1.7：生化分析
[0151] 在-20℃下冷冻所收集的样品并冻干24小时，之后在由溶于0.2mM二硫苏糖醇和-10.1mM乙二胺四乙酸二钠的0.3mg ml 木瓜蛋白酶组成的1ml消化溶液中消化过夜。使用Hoechst 33258测试测量DNA含量，其与软骨细胞(7.7pg DNA/细胞)数目相关。用二甲基亚甲基蓝测试来确定粘多糖(GAG)含量，同时利用脯氨酸/羟基脯氨酸测试来测量胶原蛋白含量。
[0152] 实施例1.8：利用定量实时聚合酶链反应进行基因表达分析
[0153] 在适当的情况下，对所有构建体进行SC处理以除去藻酸盐，然后在1mlTM(Invitrogen)中均质化。提取RNA并经由逆转录使其转化为cDNA。用iQ Green TM
Supermix(Bio-Rad)和iQ qPCR系统(Bio-Rad)来进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。
表2列出了在该实验中使用的qRT-PCR引物序列(AIT Biotech,新加坡)。
Supermix(Bio-Rad)和iQ qPCR系统(Bio-Rad)来进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。
表2列出了在该实验中使用的qRT-PCR引物序列(AIT Biotech,新加坡)。
[0154] 表2：用于猪基因标记物的qRT-PCR引物序列：正向(F)和反向(R)。
[0155]
[0156] Ref.[30]:Wynn RF et al,2004,Blood,104:2643.
[0157] Ref.[31]:Jefferies D et al,2002,Vet Res,33:383-96.
[0158] 为了进行分析，利用ΔCj方法来计算相对于管家基因TATΑ结合蛋白(TBP)的基因表达值，并随后以第0天的各PTCC-blkMC基因将其归一化，以获得基因表达倍数值。除非另外说明，所有的逆转录和PCR试剂购自Promega(Madison,MI)。
[0159] 实施例1.9：组织学和免疫组织化学染色
[0160] 利用显微镜用薄片切片机将从每一时间点获得石蜡包埋的PTCC-blkMC和LhCG-tDGMC样品切成10μm厚的切片并随后将其放置于载玻片上。用苏木精和曙红(H&E)、马松三色或番红O对切片进行染色。对1型和2型胶原蛋白进行抗IgG免疫组织化学染-1色。在4℃下将切片与2型胶原蛋白的一抗(在1x PBS中2μg ml ,MAB8887,Chemicon)-1
一起培养过夜，接着在室温下在黑暗中用抗-IgG(在1xPBS中5μgml ,AlexaFluor
488,Invitrogen)培养1小时。在1型胶原蛋白免疫组织化学染色中，使用1型胶原蛋白的-1
一抗(在1x PBS中2μg ml ，山羊多克隆IgG,Santa Cruz Biotechnology)，接着使用抗-1
IgG(在1x PBS中5μgml ,AlexaFluor 543,Invitrogen)。使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行复染。
一起培养过夜，接着在室温下在黑暗中用抗-IgG(在1xPBS中5μgml ,AlexaFluor
488,Invitrogen)培养1小时。在1型胶原蛋白免疫组织化学染色中，使用1型胶原蛋白的-1
一抗(在1x PBS中2μg ml ，山羊多克隆IgG,Santa Cruz Biotechnology)，接着使用抗-1
IgG(在1x PBS中5μgml ,AlexaFluor 543,Invitrogen)。使用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行复染。
[0161] 实施例1.10：统计分析
[0162] 所有的结果表示为平均值±SD。在特定时间点处相对于PTCC-blkMC构建体比较细胞活性、生化数据和qRT-PCR数据。利用ANOVA来测量每组(每组3个样品)间的统计学显著性差异(p<0.05)。
[0163] 实施例1.11：结果与讨论-tDGMC的构建
[0164] 在本研究中，利用图1A中所示的单一油包水乳液方法制造tDGMC(其为负载软骨细胞的明胶类微球)。当封装在水凝胶支架中时，tDGMC起到两个作用：作为细胞递送载体和作为致孔剂，因为在37℃培养时明胶会在2天内完全溶解并分散到支架外。
[0165] 图2中示出了tDGMC的尺寸分布，这是基于在20个随机亮视野显微镜图像中对tDGMC人工计数得到的。大多数tDGMC的直径在50μm至125μm的范围内，中值为75μm至100μm。相比于较小尺寸，较大的tDGMC倾向于具有封装在其中的细胞(较大比例的黑色柱)。一方面，tDGMC中存在细胞会导致制得更大比例的大尺寸微球；另一方面，更大的tDMGC也更有可能含有细胞。仅出于在3-D环境中容易观察单独的tDGMC的目的，制造了blkGEL-tDGMC构建体。之前的工作已经研究了在藻酸盐凝胶相中的细胞生长和发育；因此在本研究中，在没有任何背景的情况下研究了新的tDGMC的细胞生长和组织发育，即，无细胞的藻酸盐凝胶相。通过图3A中的活/死测试，观察到该制造过程对于细胞是无毒的。在第0天，即使在构建体周围散落有一些死细胞，但大部分的细胞存活。然而，到第21天之前观察到细胞快速增殖变成细胞岛而没有坏死核心(necrotic core)。致密的细胞岛的尺寸迅速增加，尤其是在第35天，岛的最小直径约500μm，或比第0天时的平均tDGMC大了约五至六倍。岛已经生长出腔的边界并进入藻酸盐水凝胶，最终与其他类似的致密细胞岛融合。
[0166] 图3B示出了在35天的时间内blkGEL-tDGMC构建体中细胞密度的总体一致性增加(根据干重归一化)。在第35天，细胞密度为原始封装的细胞密度的超过3.5倍，尽管在第0天至第7天有稍微下降。这可能是由于在第0天将少量死细胞计算在内，以及剩余活细胞定植到新的支架系统中需要一定的时间。不管怎样，定性(活/死测试)和定量(DNA和利用Hoechst 33258测试进行的细胞定量分析)数据一致地显示，封装在tDGMC中的细胞仍然是活的并且能够增殖称为致密的活细胞岛。
[0167] 基于此，可以看出，简单、快速且不需化学处理的制造过程对于软骨细胞是无毒的。
[0168] 实施例1.12：结果与讨论–在PTCC体系中的应用
[0169] 利用用于透明软骨再生的PTCC方法(图1B)进一步采用tDGMC技术，其中软骨细胞和tDGMC共同封装在藻酸盐水凝胶中并被称为PTCC-tDGMC。之前建立的PTCC方法使用空白明胶微球代替tDGMC(因而被称为PTCC-blkMC)；培养35天后，从构建体除去藻酸盐以产生LhCG-blkMC，由软骨细胞及其分泌的ECM组成的无支架构建体。
[0170] 在PTCC-blkMC构建体中，空白明胶微球起到致孔剂的作用，然后其在藻酸盐支架中产生凝胶-培养基边界，以利用软骨细胞(一种非贴壁细胞)在对细胞无粘附性的凝胶处快速增殖并形成新组织的自然现象(图1C)。用tDGMC代替空白明胶微球不仅产生了类似于在PTCC方法中那些的凝胶边界，而且还提供了悬浮于将被溶解的明胶留下的腔内的额外的软骨细胞以进行进一步培养。然后预期细胞以两种方式生长：从藻酸盐凝胶本体长出到腔中(像PTCC方法中一样)，和在腔中形成细胞岛(由tDGMC贡献)。如在图4的WST-1测试结果中可见的，PTCC-tDGMC构建体能够增殖并保持存活，在实验的后半段具有显著高于PTCC-blkMC对照的值。这可以归因于由于tDGMC使得PTCC-tDGMC构建体中细胞数目增加。第35天相比于第28天，吸光度值存在总体下降；这能够通过构建体内缺少用于进一步细胞增殖的空间来解释。这还解释了为何在之前的研究中在第35天从PTCC-blkMC构建体除去藻酸盐。由于PTCC-tDGMC构建体的吸光度值从第21天开始下降，假定PTCC-tDGMC构建体已达到类似于PTCC-blkMC在第35天时所达到的细胞致密度和富ECM的状态。从第14天开始每周通过SC处理从PTCC-tDGMC和PTCC-blkMC构建体除去藻酸盐，并且在第21天证明了PTCC-tDGMC能够保留其结构完整性而无可见碎片并且因而对其进行重命名。
[0171] LhCG-tDGMC，即PTCC-blkMC部分崩塌为若干片(图15)。如之前所确定的，PTCC-blkMC仅仅能够承受在第35天的SC处理。相对于PTCC-tDGMC构建体，LhCG-tDGMC构建体的WST-1吸光度值得以保持。基于这些结果，在第14天，对基于软骨细胞及其分泌的ECM的无支架构建体的制造加快了40％。
[0172] 通过qRT-PCR来进行基因表达研究，以调查软骨细胞标记物(图5)。对于每种基因，根据第0天的对照PTCC-blkMC将所有样品归一化，PTCCblkMC第0天被定义为倍数值1。通常，随着时间，PTCC-blkMC和PTCC-tDGMC构建体的细胞均表达越来越多的2型胶原蛋白。
在第21天和第28天，PTCC-tDGMC构建体比PTCC-blkMC具有显著更高的2型胶原蛋白倍数表达；前者为比对照高了约6至8倍，而后者的测量值为4至5倍。在PTCC-tDGMC系统中更快地产生了适合的环境，因而细胞受到刺激产生透明软骨特异性ECM，即，2型胶原蛋白。
从第21天至第35天PTCC-tDGMC系统中的连续两倍下降可通过空间限制和细胞检测到了充分的ECM来解释。在LhCG-tDGMC构建体中测量的10至12倍高的值使其得到了进一步的证明：细胞检测到了去除藻酸盐后剩余的空间，因此受到刺激以产生ECM。然而，1型胶原蛋白基因表达始终比对照低得多并且在第35天已经降低至对照的<20％。这是很好的结果，因为1型胶原蛋白作为纤维化的主要组成部分在透明软骨ECM中极少；因此PTCC-tDGMC系统倾向于朝向透明软骨组织发育。
在第21天和第28天，PTCC-tDGMC构建体比PTCC-blkMC具有显著更高的2型胶原蛋白倍数表达；前者为比对照高了约6至8倍，而后者的测量值为4至5倍。在PTCC-tDGMC系统中更快地产生了适合的环境，因而细胞受到刺激产生透明软骨特异性ECM，即，2型胶原蛋白。
从第21天至第35天PTCC-tDGMC系统中的连续两倍下降可通过空间限制和细胞检测到了充分的ECM来解释。在LhCG-tDGMC构建体中测量的10至12倍高的值使其得到了进一步的证明：细胞检测到了去除藻酸盐后剩余的空间，因此受到刺激以产生ECM。然而，1型胶原蛋白基因表达始终比对照低得多并且在第35天已经降低至对照的<20％。这是很好的结果，因为1型胶原蛋白作为纤维化的主要组成部分在透明软骨ECM中极少；因此PTCC-tDGMC系统倾向于朝向透明软骨组织发育。
[0173] 通常，ECM组分随时间被高度表达，即PTCC-tDGMC比PTCC-blkMC构建体具有更高的值，尤其是在研究周期的后半段中。总之，PTCC-tDGMC系统具有类似于PTCC-blkMC的表达方式，但其更趋于形成透明软骨组织。
[0174] 通过生物化学测试来评价在两种系统中产生的两种软骨ECM组分(GAG和胶原蛋白)(图6)。当与PTCC-blkMC相比较时，在整个研究期间在PTCC-tDGMC构建体中一贯测得显著更高的GAG和胶原蛋白的量。由细胞产生的ECM组分在除去藻酸盐之后保持构建体的结构完整性方面是很关键的。如在总GAG和胶原蛋白含量中所见(图6(C)和图6(D))，PTCC-tDGMC第21天达到了与PTCC-blkMC构建体在第35天的类似水平的相对于每单位构建体干重的ECM组分；因此，在该特定时间能够从PTCC-tDGMC构建体成功除去藻酸盐而不会使其结构崩塌。在除去藻酸盐之后GAG含量显著更高(即对于LhCG-tDGMC构建体而言)，然而胶原蛋白含量并不是如此清晰。然而，整体结果是有前途的，因为ECM含量整体增加，因此允许在培养了21天内得到完全无支架的负载细胞的3-D构建体。
[0175] 最后，通过各种组织学和免疫组织化学染色来进行构建体向透明软骨表型发育的定性分析(图7)。在相似的时间点处，与PTCC-blkMC构建体相比较，LhCG-tDGMC构建体在细胞数目和ECM含量方面通常明显更致密；在LhCG-tDGMC中ECM分布更均匀(图7A)。此外，更经常且独特地在LhCG-tDGMC构建体中观察到腔隙，这在透明软骨组织中也经常观察到。这些观察结果分别得到了马松三色(图7B)和番红O(图7C)的进一步证实，其中胶原蛋白被染成蓝色而蛋白聚糖被染成橙红色。图7B中LhCG-tDGMC的腔隙周围的深蓝色染色和图7C中均匀且更深的橙红色番红O染色的图像暗示了分泌且塑造出了更致密的ECM结构。特别是，在图7C的第21天，在PTCC-blkMC构建体中观察到空穴，这可被归因于软骨细胞向被明胶微球留下的腔中缓慢渗透。
[0176] 然而，在相同的时间点在LhCG-tDGMC中则没有观察到这种现象，这可通过tDGMC将存活细胞递送到腔中来解释。2型胶原蛋白在PTCC-blkMC和LhCG-tDGMC构建体中都是丰富的，但在后者中明显更紧密(compact)(图7D)，而1型胶原蛋白在二者中均可忽略(图7E)，这支持了基因表达研究和生物化学分析的结果，表明tDGMC加速形成致密的无支架透明软骨组织。
[0177] tDGMC当与前述的PTCC方法组合时，显示出在很大程度上辅助透明软骨再生。软骨特异性基因标记物(例如2型胶原蛋白)被高度表达并且导致产生更高的ECM，以使得在培养的第21天就获得了无支架构建体(通过除去藻酸盐)。这归因于细胞更高的活性和增殖速率，在培养的最初21天内这也一致性地产生了每个细胞显著更高量的ECM。有利的是，如在基因表达和免疫组织化学中所观察到的，由于存在1型胶原蛋白而造成的纤维化一直不明显。因此，tDGMC不仅为构建体提供了额外的存活细胞，而且该额外的细胞还保留了其表型并有助于透明软骨再生。可预期，就像LhCG-blkMC在之前的研究中所产生的那样，体内实验也将产生透明样软骨表型，而LhCG-tDGMC会在短得多的时间内(短40％)制造而成。
[0178] 因此，tDGMC被证明是一种递送活细胞的选择，其单一油包水乳液的制造过程简单、快速且无化学处理。通过被封装在水凝胶中，tDGMC的明胶组分溶解并分散出来，剩下悬浮于孔中的细胞。因此，tDGMC起到了双重功能：首先是作为直接的细胞递送手段；第二是作为致孔剂以允许在藻酸盐水凝胶支架中更好地分散营养物质和废物。通过活/死染色测试显示细胞是活的，其增殖为细胞岛以充满孔。基于用于软骨发育的这种平台的成功，能够预见该tDGMC技术可被扩展用于封装其他非贴壁细胞类型，例如肝细胞、间充质干细胞和多能干细胞，因为其具有形成细胞岛的趋势。尤其是在干细胞的情况下，分化的潜力也能够被用于发育非贴壁谱系的组织。
[0179] 该项工作说明了一种新的利用猪软骨细胞制造封装细胞的明胶微球(tDGMC)的技术。在制成之后，软骨细胞最大程度上保留存活性并且形成细胞岛。当该平台与负载细胞的凝胶本体组合时，显示支架的稳定性增加，同时细胞增殖和透明软骨特异性ECM的产生也增高，因此仅仅基于软骨细胞及其分泌的ECM，使之前所述的形成致密的无支架构建体LhCG的PTCC方法加速40％，或从35天缩短至21天。因此，揭示了tDGMC技术能够以显著更高的效率促进软骨细胞向凝胶本体中的递送，以用于透明软骨再生。预期这种具有前景的平台可用于递送于具有形成细胞岛趋势的类似非贴壁细胞类型。
[0180] 开发了如示例性实施方式中的利用细胞-明胶悬浮液和豆油的简单无毒油包水单乳化技术以用于制造具有非贴壁依赖性细胞的明胶微球：在软骨细胞的情况下。如上所示，然后在37℃的孵育中在给定的2天时间窗内将明胶微球完全溶解；因此微球被称为温度固化的可溶性明胶微球类细胞载体(tDGMC)。tDGMC被设计为用于递送非贴壁依赖性细胞，例如肝细胞、胰腺β细胞、软骨细胞和多能干细胞的平台，所有这些细胞都是天然形成的细胞凝块。由于在本实验中使用软骨细胞，tDGMC与之前所述的相转移细胞培养物(PTCC)技术组合使用，以最终构建3-D无支架活的透明软骨移植物(LhCG)。简言之，将空白明胶微球和软骨细胞共同封装在藻酸盐凝胶相中，其中该明胶微球起到致孔剂的作用。由于PTCC现象，软骨细胞倾向于增殖到被明胶剩下的腔中并填满腔以在其中形成新组织。
随着时间流逝，该新组织岛进一步发育到藻酸盐凝胶本体中，并与临近的岛融合以形成其结构完整性不再依赖于藻酸盐的肉眼可见的软骨构建体。可通过螯合作用除去藻酸盐(浸于柠檬酸钠(SC)溶液中)以获得LhCG，其仅由软骨细胞及其分泌的胞外基质(ECM)组成。
通过在PTCC系统中实施tDGMC技术，可以预见LhCG形成过程被加速，以使用于关节炎和损坏的关节软骨的替代品的临床研究更为方便，其中tDGMC起到两个作用：产生腔以获得更好的营养物质和废物扩散以及细胞生长的空间，如在所建立的PTCC系统中那样，同时还起到将额外的细胞递送到凝胶中以加速发育的作用。
随着时间流逝，该新组织岛进一步发育到藻酸盐凝胶本体中，并与临近的岛融合以形成其结构完整性不再依赖于藻酸盐的肉眼可见的软骨构建体。可通过螯合作用除去藻酸盐(浸于柠檬酸钠(SC)溶液中)以获得LhCG，其仅由软骨细胞及其分泌的胞外基质(ECM)组成。
通过在PTCC系统中实施tDGMC技术，可以预见LhCG形成过程被加速，以使用于关节炎和损坏的关节软骨的替代品的临床研究更为方便，其中tDGMC起到两个作用：产生腔以获得更好的营养物质和废物扩散以及细胞生长的空间，如在所建立的PTCC系统中那样，同时还起到将额外的细胞递送到凝胶中以加速发育的作用。
[0181] 实施例2.1：京尼平交联的明胶微球的制备
[0182] 除非另外说明，所有的化学品和试剂均购自Sigma Aldrich,Singapore。明胶微球由如前述工作所述的油包水包油(o/w/o)复乳法来制造。简言之，以3:1的比例将10wt％明胶溶液加入乙酸乙酯中，并以700rpm搅拌混合物1分钟，形成第一水包油乳液。
[0183] 通过以2:3的比例将混合物加入食用油中来制备第二乳液(o/w/o)。以350rpm搅拌最终混合物1.5分钟，然后将其转移到冷水浴中并在相同的搅拌速率下再保持15分钟。在冰冷的乙醇浴中冷却整体混合物(约20分钟)以用于最终微球固化。
[0184] 然后用二氧杂环己烷和丙酮溶液交替清洗微球以除去食用油。在70℃下干燥收集的微球并过筛分成不同的尺寸。
[0185] 为了使微球与京尼平交联，将1克的明胶微球(74μm至165μm)分散在5ml含有不同浓度(0.1wt％、0.25wt％和0.5wt％)京尼平(Wako,Japan)的90％乙醇水溶液中。将微球保持在37℃培养箱中16小时以使其交联。然后用纯的乙醇清洗京尼平交联的微球三次，之后在100℃烘箱中干燥3小时。用10X青霉素/链霉素(P/S)对所有的微球进行灭菌，之后在4℃在达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)细胞培养基中水合以用于长期储存。
[0186] 实施例2.2：交联微球的表征
[0187] 以100g ml-1的浓度将0.05g具有不同交联度的京尼平交联的微球浸于5ml的4℃的磷酸盐缓冲溶液(PBS)或含有PBS的基质金属蛋白酶9(MMP-9)中，并在37℃分别孵育30分钟和4小时，以确定其稳定性。在光学显微镜(Olympus 1X71)下检查微球的完整性。
[0188] 实施例2.3：负载细胞的微球的制备
[0189] 除非另外说明，所有细胞相关的试剂均购自PAA Laboratories。HepG2细胞购自American Type Culture Collections(ATCC),Manassas,VA,USA并且在37℃保持在含有1.5m M L-谷氨酰胺、10％(v/v)胎牛血清(FBS,'Gold')和100单位mg m1P/S的标准DMEM中。
[0190] 当HepG2细胞在培养烧瓶中达到70％至80％汇合时，用胰蛋白酶使其解离并以6 -1
5x 10细胞ml 的浓度再悬浮在培养基中。对于负载细胞的微球的制备，仅使用那些在
0.25wt％京尼平溶液中交联的微球。对于每毫升的细胞悬浮液，加入0.13g的微球。然后将
300μl的整体混合物加入到预先涂覆有琼脂糖凝胶的24-孔培养板的每个孔中并在37℃培养箱中保持24小时，以允许发生细胞附着。然后将负载细胞的微球转移到筛孔尺寸为
40μm的滤网上(BD Falcon TM)以促进培养基变化。
5x 10细胞ml 的浓度再悬浮在培养基中。对于负载细胞的微球的制备，仅使用那些在
0.25wt％京尼平溶液中交联的微球。对于每毫升的细胞悬浮液，加入0.13g的微球。然后将
300μl的整体混合物加入到预先涂覆有琼脂糖凝胶的24-孔培养板的每个孔中并在37℃培养箱中保持24小时，以允许发生细胞附着。然后将负载细胞的微球转移到筛孔尺寸为
40μm的滤网上(BD Falcon TM)以促进培养基变化。
[0191] 实施例2.4：具有或不具有MMP-9的负载细胞的微球水凝胶复合物的制造[0192] 在负载细胞的微球在滤网上培养3天之后，将其封装于藻酸盐水凝胶中，以形成微载体-凝胶复合物。如在图8A的示意图中所示出的，构建了三个不同的组，即，对照组、培养基中的MMP-9组(MM)和凝胶中的MMP-9组(MG)。
[0193] 对于对照组和MM组，将每毫升的藻酸盐溶液(1.5wt.％在0.15M NaCl中)缓缓与0.1g负载细胞的微球混合。将85μl的混合物注入到圆形模具( )中并且加入102mM的氯化钙水溶液以促进凝胶化。在标准DMEM中培养对照构建体，而在含有-1
100μg ml 基质MMP-9的标准DMEM中培养MM组构建体。基于我们之前的研究选择这种浓度的MMP-9，其中没有在HepG2细胞中观察到的明显毒性。对于MG组，不同于常规的藻酸盐凝胶前体溶液，在构建体制造过程中，将负载细胞的微球悬浮于相同浓度的含有100μg -1
ml MMP-9的藻酸盐前体溶液。与对照一样，在标准DMEM中培养MG构建体。制造构建体的天数记为第0天。在第1天，如图8B中所示，改变所有组中的培养基并替换为没有任何MMP-9的标准DMEM。
100μg ml 基质MMP-9的标准DMEM中培养MM组构建体。基于我们之前的研究选择这种浓度的MMP-9，其中没有在HepG2细胞中观察到的明显毒性。对于MG组，不同于常规的藻酸盐凝胶前体溶液，在构建体制造过程中，将负载细胞的微球悬浮于相同浓度的含有100μg -1
ml MMP-9的藻酸盐前体溶液。与对照一样，在标准DMEM中培养MG构建体。制造构建体的天数记为第0天。在第1天，如图8B中所示，改变所有组中的培养基并替换为没有任何MMP-9的标准DMEM。
[0194] 实施例2.5：体内皮下移植到裸鼠中
[0195] 在本实验中使用总共六只雄性Balb/c裸鼠(4周龄，成熟BALB/C，i-DNA -1 -1Biotechnology Singapore)。利用开他敏(40mgkg )和安定(5mg kg )的组合对其进行镇定。每只小鼠具有三个切口以造成用于移植的皮下袋并且每一个袋一天容纳每组(对照、MM和MG)中的一个构建体。将构建体在小鼠中保持13天，之后将其取回用于组织学检查。所有的裸鼠实验都符合新加坡南洋理工大学(NTU)的实验动物照顾与使用守则(Institutional Animal Care and Use Committees，IACUC)的规定。
[0196] 实施例2.6：细胞活性和HepG2球体形态学
[0197] 在培养的14天内在各不同的时间点对所有样品测试活性和增殖。使用活/死荧光染色(Invitrogen)，其中在钙黄绿素AM和溴乙非啶同型二聚体-1中孵育30分钟后观察到细胞。在每个时间点从每个样品组收集总共三个样品以用于WST-1(Roche,新加坡)比色测试。将样品在37℃下孵育1.5小时并利用全自动定量绘图酶标仪以620nm作为对照在450nm处测量吸光度。
[0198] 实施例2.7：白蛋白和细胞色素P450基因表达
[0199] 对每个样品组，将三个构建体合并在一起并利用 (Invitrogen)提取RNA。从每组取500ng的RNA，以利用逆转录试剂盒(Promega)并严格遵照供方所提供的实验方案将其转化为cDNA。随后，利用实时聚合酶链反应(RT-PCR)对它们进行定量分析。使-δC用SYBR绿iQ缓冲液(Bio-Rad)来进行RT-PCR并使用2 T根据管家基因(β-肌动蛋白)将相对基因表达归一化。
[0201] 表3：用于实时PCT的引物序列。A.T.表示退火温度，而P.S.表示产物尺寸。
[0202]
[0203] Ref.[26]:Nakazawa K et al,2006,J.Biomater.Sci.Polym.Ed.17859-873[0204] Ref.[27]:Tostoes R M et al,2011,Biotechnol.Bioeng.108,41-49[0205] Ref.[19]:Turner WS et al,J.Biomed.Mater.Res.B,82,156-168
[0206] 实施例2.8：白蛋白定量分析
[0207] 在培养14天期间的不同时间点收集并替换来自每种构建体的培养基(n＝3)。在测试前在-20℃下储存所收集的培养基。用商购白蛋白测试试剂盒(Bio-Quant)比色确定培养基上清液中的白蛋白浓度。对所获得的值取平均并根据在第1天的对照值归一化。
[0208] 实施例2.9：组织学染色
[0209] 将所有的样品在4％仲甲醛水溶液中固定化过夜，之后在高浓度乙醇中脱水。将样品包埋在石蜡中并将其切成厚度为8μm的切片。随后，将其浸于二甲苯中以除去石蜡并分别用H&E和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，之后在荧光显微镜(Olympus IΧ71)下进行观察。
[0210] 实施例2.10：统计分析
[0211] 在适当时间，进行ANOVA以分析结果并且P<0.05被认为是表示统计学显著差异。数据以平均值±SD来表示。
[0212] 实施例2.11：京尼平交联的明胶微球的表征
[0213] 为了确定微球的合适交联度，使用三种不同浓度的京尼平溶液(0.1wt％、0.25wt％和0.5wt％)来交联明胶微球。
[0214] 如图9中所示，在较更浓度的京尼平中交联的球体导致形成更高强度的蓝色颜料，这表明更高的交联度。在37℃孵育30分钟后，在0.1wt％京尼平溶液中交联的微球溶解，而那些在0.25wt％和0.5wt％京尼平中交联的微球仍保持完整。在MMP-9的存在下，在0.1wt％和0.25wt％京尼平中交联的微球在4小时后降解，而在0.5wt％京尼平中交联的微球无法完全降解。
[0215] 在本研究中所期望的微球的性质存在于在0.25wt％中交联的微球中，其在正常培养条件下保持其完整性并且在引入MMP-9之后容易降解。出于举例说明的目的，在随后的实验中仅使用在0.25wt％京尼平中交联的微球。
[0216] 实施例2.12：构建体中的细胞活性和HepG2球体形态学
[0217] 在0.25wt％京尼平微球上培养HepG2细胞3天，之后将其封装在藻酸盐水凝胶中。如所述的，制造3个不同的体系，即，没有接受任何MMP-9处理的对照组、向培养基中加入MMP-9的MM组，以及最后，经由藻酸盐水凝胶引入MMP-9的MG组(图8A)。
[0218] 如图8B中所示，MMP-9处理6小时后，MM和MG构建体中的微球降解，产生对应尺寸的腔。原来附着于该微球上的细胞现在存在于所产生的腔的边缘处。
[0219] 细胞活性是该平台与细胞的相容性的重要指标。如图10所示，从第1天至第4天，不同构建体组的WST-1测试显示出吸光度的显著增加，但在随后几天内逐渐下降。这可能是由于水凝胶中的空间约束使细胞增殖减少。
[0220] 当细胞球体完全占据腔内的空间时，增殖速率下降，因为没有更多的空间用于进一步细胞扩增。在除了第1天之外的所有时间点，MG组中的细胞具有比对照组和MM组高得多的吸光度。
[0221] 对于定性分析，如图11所示，在第4天、第7天和第14天进行活/死染色。由于交联后微球所具有的荧光性质，能够容易地鉴定微球为红色并且能够在对照组中清楚地观察到。对照组中的大多数细胞被染成绿色，但在所测试的时间点没有观察到HepG2细胞球体。另一方面，在第4天在MM组和MG组中均观察到活的HepG2细胞团块，并且这些团块在第14天发展成球体。该球体的尺寸为大约100±20μm，类似于所使用的微球的尺寸。
[0222] 实施例2.13：负载细胞的微球水凝胶复合物的肝特异性功能
[0223] 为了研究球体产生的效率(主要关注该新型生物材料类细胞递送平台)，方便地采用人肝细胞癌细胞系(HepG2)作为模型细胞，因为其满足许多肝细胞特性，如白蛋白分泌和细胞色素P450(CYP1A1)活性，并且在本研究中对其进行测量以作为代表性肝功能的参数。尿素合成是肝细胞的另一个重要特征，其被认为不存在于该细胞系中，尽管从大量的研究中已检测到痕量的尿素产生和变化；在本研究中没有对其进行测试。
[0224] 白蛋白和CYPlAl是肝特异性功能的两种重要标记物，并且在基因表达和蛋白质水平方面对其进行评价。在图12中，在所有的时间点处MM和MG中的白蛋白表达水平高于对照组，并且所有组在第14天具有最高的白蛋白表达。在MM和MG组中CYPlAl在第14天的基因表达水平分别为0.15和0.13，并且相比于同一天的对照组要高了约5倍。尽管CYPlAl水平在随后的几天中显示出下降的趋势，但通常在大多数时间点MM和MG组中的表达水平高于对照组。
[0225] 在蛋白水平上，评价了白蛋白分泌。在图13中将获自每一构建体的值根据第1天的对照样品归一化。从第1天至第7天白蛋白分泌有增加的趋势，接着从第7天至第14天稍微下降。类似于在基因表达中所观察到的，在所有的时间点，MM和MG样品的白蛋白分泌高于对照。
[0226] 实施例2.14：体内裸鼠皮下移植
[0227] 为了研究在体内环境中的球体形成能力，在第1天将构建体皮下移植到裸鼠中。13天后，取回样品以用于通过利用H&E和DAPI染色进行组织学评价。图14中的H&E染色示出了构建体内的腔并且在腔的附近有细胞。
[0228] 此外，DAPI染色示出了在MM和MG构建体中的明显的细胞团块(以箭头突出显示)，但在对照组中不存在这些团块。另外，在对照组中的京尼平交联的微球未降解，如在图14中的正红色荧光所示出的。
[0229] 实施例2.15：讨论
[0230] 肝细胞球体的产生保持了其表型特性，这是近年来肝组织工程中主要关注点之一。已经开发了许多方法，但其经常需要复杂和高精确度的设备来促进很好限定其尺寸的球体。这不可避免地增加了制造成本并且带来扩大规模方面的挑战。从这个角度来看，我们已经开发了简单的组织，辅以京尼平交联的明胶微载体和MMP-9，其能够在藻酸盐水凝胶块中启动HepG2模型细胞球体产生。
[0231] 在本研究中，京尼平交联的微球具有双重功能，其作为临时细胞载体并且还作为用于产生腔的模板。由于典型的明胶微球在37℃的生理学温度下容易溶解，因此选择天然交联剂来交联微球以确保在细胞递送过程中保持微球的结构完整性。
[0232] 已经确定，在16小时孵育后浓度为0.25wt％的京尼平溶液将获得期望的交联度。在该交联度下，微球在37℃达到稳定性并且在相同的时间其能够经由引入MMP-9而被完全降解。
[0233] 在平面水凝胶细胞封装模型中，在大多数情况下通过水凝胶强加的严格约束限制了团块形成或导致不能够一致性复制的不规则团块结构的发展。此处表示的结果突出了在产生HepG2球体中腔的重要性。
[0234] 对照组是其中微球在整个培养期间保持完整的设定。尽管细胞保持是活的，但在任意观察时间点时都没有观察到球体。细胞能够在该系统中增殖，但球体以空间约束的形式出现并因此组织球体形成。另一方面，在MM和MG样品中细胞载体被MMP-9降解。在MM组中向培养基中加入MMP-9，而在MG组中经由藻酸盐块引入MMP-9，以保持系统中的可注射优点。所产生的腔不仅为细胞增殖和球体产生创造了空间，而且其还标记了球体扩展的边界。
[0235] 随着细胞增殖发生，所产生的球体在腔内尺寸膨胀，其在周围的凝胶块中具有向外膨胀的力。当该向外的力最终通过来自凝胶的机械力得以平衡时，达到平衡状态比国内切球体尺寸不再膨胀。由于腔的尺寸由微球尺寸确定并且所选的球体尺寸不超过200μm，因此所产生出球体的尺寸在扩散限(diffusion limits)内，并因此在它们中没有观察到坏死中心。基于转录和蛋白质水平来评价所产生的细胞球体的肝-特异性功能。相比于对照，在MM和MG中的较高白蛋白和CYP1A1基因表达以及较高的白蛋白分泌水平表明在所形成的球体这能够具有更好的肝-特异性功能特性。
[0236] 为了研究在体内环境中在该系统中形成球体的可行性，将来自所有组的第1天构建体皮下移植到裸鼠中。在第14天取回所有样品以用于分析，并且如图14所示确认球体成功形成。
[0237] DAPI染色突出显示了仅在MM和MG组中观察到了细胞球体，而在对照组中观察到可能的成纤维细胞的均匀单个细胞分布。如在结果中提到的，明胶微球在与京尼平交联后具有红色荧光特性；在移植后的13天在对照样品中仍可检测到这些微球。
[0238] 因此，明胶微球中的最佳交联度实现了细胞载体的理想性质，其中其能够将细胞递送至靶位点并且其能够容易地降解，从而不回干扰进一步细胞扩增。在该研究中突出了腔的重要性，izhong他对于为球体形成创造空间并且规定球体尺寸是至关重要的。在这些MM和MG构建体中发现了阳性肝细胞特征暗示了在该平台中产生的球体能够增强并保留肝细胞表型。基于在M和MG组之间获得的类似结果，还证明了通过将其与藻酸盐前体溶液引入MMP-9不会影响细胞活性以及随后的细胞功能。因此，这种系统是可注射的并且具有最小的侵袭性。
[0239] 另外，许多研究已经证明了通过将肝细胞球体与内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和肝星形细胞共同培养能够获得更好的功能。在该研究中建立的平台是可定制的，因为其也能够通过向藻酸盐前体溶液简单添加第二类型的细胞而容易地改变以设置共培养系统。肝细胞球体将定植于腔内，而该第二细胞类型将位于构建体的凝胶相中。
[0240] 因此，已经建立了不需要复杂设备就能够产生具有受控尺寸和形状肝细胞球体的平台。已经证明了利用可降解的京尼平交联的明胶微球作为细胞载体在水凝胶支架中形成模型肝细胞团块。在本研究中使用的京尼平交联的明胶微球具有双重功能，其既作为细胞载体又作为用于在藻酸盐块中形成腔的致孔剂。使用HepG作为模型细胞来证明在该系统中肝细胞球体形成和保持肝特异性功能的可行性。在该研究成功后，该技术能够适用于肝细胞或前体细胞。通过这种转化，认为其可最终有益于临床应用。
[0241] 对于肝再生中的细胞治疗而言，原代肝实质细胞有可能是优选的细胞。然而，其增殖能力不理想并且在2D培养过程中表型迅速丧失损害了移植的肝细胞的质量和数量，导致该治疗的成功率发生变化。许多研究已经表明，形成肝细胞球体有助于在肝细胞中保持肝特异性功能。
[0242] 然而，所采用的许多方法需要复杂的设定或专用设备，这使得对于大规模临床应用是不经济的。在本研究中，以经开发了起到用于递送模型细胞并且还用于产生腔的细胞载体和致孔剂的作用的双功能京尼平交联的明胶微球。首先将细胞接种到用于附着的京尼平交联的明胶微球上，接着将其封装在藻酸盐水凝胶中。在培养基中引入胶原酶(MMP-9)或将胶原酶(MMP-9)与藻酸盐前体溶液混合，以使得微球降解以用于在凝胶块中产生腔。因此，细胞在腔中增殖，形成肝细胞团块，而藻酸盐水凝胶起到约束的作用，将团块的尺寸和形状限制为腔的尺寸。另外，能够通过经柠檬酸盐处理除去藻酸盐水凝胶从系统收获最终的肝细胞团块。因此，这种通用的平台不仅具有可注射和简便性的优点，而且所产生的细胞团块还具有受控的尺寸和形状并且能够从系统中提取。
[0243] 尽管已经参照其示例性实施方式具体示出和描述了本发明，但本领域普通技术人员应该理解，可以在形式和细节方面作出各种变化，而不背离本发明的精神和范围，本发明的范围由所附权利要求限定。
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