专利汇可以提供禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA 疫苗 的制备方法,涉及疫苗的制备方法;根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物,PCR扩增出禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因;采用限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ酶切禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因和pcDNA3.1(+)质粒,然后构建禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒;然后依次加入 硫酸 钠、无 水 醋酸 钠、月桂基硫酸钠、氯化 钙 等物质,混合均匀后即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗。本 发明 方法制备的疫苗不含有活的病原菌,给动物应用后不会由于疫苗本身的原因而引发禽多杀性巴氏杆菌病,免疫保护率为达到85%,而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒,因此易于保存和运输。,下面是禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法专利的具体信息内容。
1.禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法,其特征在于:具体制备方法为:
步骤一、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的获得
(1)、根据禽多杀性巴氏杆菌的基因组序列设计用于扩增ptfa基因的两条引物PL和PU,其基因序列如序列表序列1和序列2:
PU:5′-TGCggattcATGAAAAAAGCCATTTTC-3′
PL:5′-TGACCTCGAGtTATGCGCAAAATCCT-3′;
(2)、向PCR反应管中依次加入PU和PL引物各1微升、浓度为100-200pmol/ml的禽多杀性巴氏杆菌基因组水溶液1微升、ddNTPs 2.5微升、Taq DNA聚合酶1微升、PCR反应缓冲液2微升和水11.5微升,混合均匀后进行PCR反应,PCR反应结束后,产物中禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的基因序列如序列表序列3;
(3)、向上述装有禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因的PCR反应管中依次加入限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各3微升、限制性核酸内切酶缓冲液4微升和水3微升,混合均匀后将PCR反应管放置于37℃的水浴锅中反应6小时,取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟以结束反应,产物为酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因,将其保存于-20℃条件下,备用;
步骤二、pcDNA3.1(+)质粒的处理
向0.5毫升的离心管中依次加入pcDNA3.1(+)质粒5微升、限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各2.5微升、限制性核酸内切酶缓冲液2微升和水8微升,混合均匀后将离心管放置于37℃的水浴锅中反应5小时,取出后再放入65℃的水浴锅中5分钟,得到处理后的pcDNA3.1(+)质粒,备用;
步骤三、禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的制备
(1)、依次向0.5毫升的离心管中加入处理后的pcDNA3.1(+)质粒1微升、酶切后禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因7微升、T4 DNA连接酶1微升和T4 DNA连接酶缓冲液1微升,混合均匀后将离心管放置于16℃的水浴锅中反应8小时,取出备用;
(2)、将上述备用的0.5毫升离心管中的液体移入1.5毫升的离心管中,再加入100微升大肠杆菌JM83,混合均匀后依次放置于0℃条件下30分钟、42℃条件下1分钟和0℃条件下2分钟,然后向离心管中加入0.8毫升的大肠杆菌液体培养基,混合均匀后放置于37℃的恒温摇床中以180转/分钟的转速振荡培养1小时,培养结束后将离心管以2000转/分钟的转速离心1分钟,倒掉上清液,再向其中加入0.1毫升无菌水,将悬浮起来的沉淀吸出,并涂布于含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的固体培养平板上,倒置于37℃的恒温培养箱内培养12小时;
(3)、挑取上述培养后的固体培养平板上的1个菌落,将菌落放入5毫升含浓度为60微克/毫升氨苄青霉素的大肠杆菌液体培养基中,置于转速为180 转/分钟,温度为37℃的恒温摇床内振荡培养12小时,备用;
(4)、取上述培养后的菌液0.6毫升,向其中加入0.3毫升苯酚和0.3毫升氯仿,混合均匀后以10000转/分钟的转速离心5分钟,离心结束后吸取上层液体加入到一个2毫升的离心管中,再向其中加入1.2毫升的无水乙醇,混合均匀后以13000转/分钟的转速离心10分钟,倒掉上清液后将含有沉淀物的2毫升的离心管室温放置30分钟,向其中加入30微升无菌水溶解沉淀后备用;
(5)、取上述2毫升的离心管中的液体2微升加入到0.5毫升的离心管中,再依次加入限制性核酸内切酶BamHⅠ和XholⅠ各1微升、限制性核酸内切酶缓冲液1微升和水5微升,混合均匀后放置于37℃的水浴锅中反应2小时,反应结束后琼脂糖凝胶电泳检测确定产物中的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒,测得其浓度,并以无菌水将其调整到0.1毫克/毫升,备用;
步骤四、禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备
(1)、取浓度为0.1毫克/毫升的禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒0.5毫升加入1.5毫升的离心管中,向其中加入0.71毫克硫酸钠,待硫酸钠溶解后放置于55℃的水浴锅中保温20分钟,备用;
(2)、称取无水醋酸钠4.1毫克溶解于含10毫升无菌水中的试管中,以氢氧化钠调节pH值为5.6,再向试管中加入壳聚糖0.2克,待壳聚糖溶解后将该试管置于55℃的水浴锅中保温20分钟,随后吸取试管中的0.5毫升液体加入到上述步骤(1)保温后的1.5毫升离心管中,将离心管在漩涡振荡器上振荡1分钟,然后在室温下放置1小时,备用;
(3)、再依次向上述步骤(2)备用的离心管中加入3毫克月桂基硫酸钠和5毫克氯化钙,待月桂基硫酸钠和氯化钙溶解后再向其中加入0.1毫升的玉米胚芽油,混合均匀后在室温下放置20分钟,此时离心管中的液体即为禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗。
2.如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法,其特征在于:所述PCR反应程序为:首先95℃预变性3分钟,然后进入循环程序,循环程序为94℃变性1分钟,53℃复性30秒,72℃延伸30秒,将上述循环程序重复25次后再以72℃终延伸5分钟结束PCR反应。
3.如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法,其特征在于:采用分光光度计测定禽多杀性巴氏杆菌ptfa重组质粒的浓度。
4.如权利要求1所述的禽多杀性巴氏杆菌ptfa基因壳聚糖纳米DNA疫苗的制备方法,其特征在于:所述的大肠杆菌液体培养基的组成成分:按重量百分比配置,其中蛋白胨1%,酵母浸膏0.5%,氯化钠1%,余量为水;所述的固体培养平板的组成成分:按重量百分比配置,其中蛋白胨1%,酵母浸膏0.5%,氯化钠1%,琼脂粉1.8%,余量为水。
法
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