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木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法

阅读:260发布:2021-11-17

专利汇可以提供木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的酶,其例如催化内部β-1,4-木糖苷键或内β-1,4-葡聚糖键的 水 解 ;和/或将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。因此,本发明提供分解作为 植物 细胞壁主要成分的半 纤维 素的方法和过程,包括水解任何植物或木材或木制品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的半 纤维素 的方法和过程。另外,还提供设计新木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法和其应用方法。所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在增加的pH和 温度 下具有增加的活性和 稳定性 。,下面是木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法专利的具体信息内容。

1.分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸),其包含
(a)编码至少一种多肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含与下列核酸序列具有
至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、
64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、
79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或完全(100%)序列同一性的序列:
(i)SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列,其具有表1中所述的一个或更多个核苷酸
残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、
6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部:编码基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为
CGC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC;编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为
GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG;编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG;编码氨基酸残基63的密码子由ATC变
为GTC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC
变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;编码氨基酸残基108的密码子由
TTC变为AAG;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC;编码氨基酸残基1 50的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG和/或编码氨基酸残基
189的密码子由TCC变为CAG;或
(ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23的核酸(多核苷酸)序列;
其中(i)或(ii)的所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至
少一种多肽,或编码能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽)的多肽或肽,
(b)(a)的核酸(多核苷酸),其中所述序列同一性如下测定:(A)通过用序列比对算法
分析或通过视觉观察,或(B)在至少约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、
450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个残基的区域上,或在cDNA、转录物(mRNA)或基因的全长上;
(c)(a)或(b)的核酸(多核苷酸),其中所述序列比对算法是2.2.2版BLAST算法,其
中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F并且所有其它选项被设置为默认值;
(d)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含在严格条件下与这
样的核酸杂交的序列:所述核酸包含SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列以及具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC;编码氨基
酸残基9的密码子由CCC变为GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG;编码氨
基酸残基38的密码子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG;编码
氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC;编
码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;
编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为
TAC;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸残基188的密码子由AGC
变为GAG;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG,
其中所述多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性或能够产生木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽),
以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤,其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤
约15分钟;
(e)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含在严格条件下与包
含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:
23序列的核酸杂交的序列,
以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤,其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤
约15分钟;
(f)(a)至(d)中任意的核酸(多核苷酸),其长度为至少约20、25、30、50、75、100、125、
150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、
1050、1100、1150或更多个核苷酸残基,或基因或转录物的全长;
(g)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多
核苷酸),其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列或其酶促活性片段,以及具有表1中所述的至少一个氨基酸残基改变(或其等价物),或具有下列氨基酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为N(或asn或天冬
酰胺);氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为R(或arg或精氨酸);氨基酸残基4从
T(或thr或苏氨酸)变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基9从P(或pro或脯氨酸)变
为D(或asp或天冬氨酸));氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或val或
缬氨酸);氨基酸残基21从F(或phe或苯丙氨酸))变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残
基33从L(或leu或亮氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基38从R(或arg或
精氨酸)变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基44从S(或ser或丝氨酸)变为T(或thr
或苏氨酸);氨基酸残基63从I(或ile或异亮氨酸))变为V(或val或缬氨酸);氨基酸
残基73从G(或gly或甘氨酸)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或
甘氨酸)变为V(或val或缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为E(或glu
或谷氨酸);氨基酸残基108从F(或phe或苯丙氨酸)变为K(或lys或赖氨酸);氨基酸
残基125从Q(或gln或谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基150从V(或
val或缬氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基188从S(或ser或丝氨酸)变为
E(或glu或谷氨酸);和/或氨基酸残基189从S(或ser或丝氨酸)变为Q(或gln或谷
氨酰胺);
(h)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多
核苷酸),其中所述多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24的序列或其酶促活性片段;
(i)(A)(a)至(h)中任意的核酸(多核苷酸)并且编码这样的多肽,所述多肽具有至
少一个保守氨基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;或(B)(i)(A)的核酸,其中至少一个保守氨基酸替代包括用相似特性的另一种氨基酸替代氨基酸;
或保守替代包括:用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸;用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然;用另一种酸性残基置换酸性残基;用带有酰胺基团的另一种残基置换带有酰胺基团的残基;用另一种性残基交换碱性残基;或用另一种芳香族残基置换芳香族残基;
(j)(a)至(i)的任意核酸(多核苷酸),其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚
糖酶活性的多肽,但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模(CBM);
(k)(j)的核酸(多核苷酸),其中所述糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤维
结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成;
(l)(a)至(k)的任意核酸(多核苷酸),其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚
糖酶活性的多肽,进一步包含异源序列;
(m)(l)的核酸(多核苷酸),其中所述异源序列包含编码下列的序列或由其组成:(A)
异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合;(B)(l)的序列,其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)源自异源酶;或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶;
(n)(l)的核酸(多核苷酸),其中所述异源糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤
维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成;
(o)(l)的核酸(多核苷酸),其中所述异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、
叶绿体或淀粉颗粒;或
(p)与(a)至(o)的任意序列充分(完全)互补的核酸序列(多核苷酸)。
2.分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸),其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述核酸包含为SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列或由其组成,所述序列具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC;编码氨基酸残基4的密码
子由ACC变为CAC;编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密
码子由CTG变为GCG;编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的
密码子由AGC变为ACG;编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC;编码氨基酸残基73
的密码子由GGC变为TAC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG;编码氨基酸残基
125的密码子由CAG变为TAC;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸
残基188的密码子由AGC变为GAG;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG。
3.权利要求1或2所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中
(a)所述木聚糖酶活性包括催化内部β-1,4-木糖苷键解;包括内-1,4-β-木聚糖
酶活性;包括水解木聚糖或阿拉伯木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体;包括水解含1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖的多糖;包括水解纤维素或半纤维素;包括水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的纤维素或半纤维素;包括催化饲料或食品中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解;或包括催化生物细胞或植物细胞中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解。
(b)所述葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性,例如内-1,4-和/或1,3-β-D-葡聚糖
4-葡聚糖水解酶活性;催化1,4-β-D-糖苷键的水解;内-1,4-和/或1,3-β-内切葡聚糖酶活性或内-β-1,4-葡聚糖酶活性;内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性;催化纤维素、纤维素衍生物、羧甲基纤维素和/或羟乙基纤维素、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键、在混合的β-1,3葡聚糖、谷类β-D-葡聚糖和/或含纤维素部分的其它植物材料中的β-1,4键的水解;水解葡聚糖、β-葡聚糖或多糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体;或,(c)所述甘露聚糖酶活性包括内-1,4-β-D-甘露聚糖酶活性,或催化β-1,4-甘露聚
糖或未取代的线性β-1,4-甘露聚糖的水解。
4.权利要求3所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中所述木聚糖或阿拉伯木聚糖
包含水溶性阿拉伯木聚糖,以及任选地,所述水溶性木聚糖或阿拉伯木聚糖包括面团或面包产品。
5.权利要求3所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中所述饲料或食品包括基于谷
物的动物饲料、麦芽汁啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜。
6.权利要求1-5中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中(a)所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是热稳定的;或(b)所述多肽在包含约0℃至约20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约
80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃之间或更高的温度范围的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
7.权利要求1至5中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中(a)所述木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是耐热的;或(b)所述多肽在暴露于约0℃至约
20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约
80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高范围的温度后保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
8.权利要求1至7中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸)pH的酸性条件下保持活性,或在暴露于包括约pH 6.5、pH
6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸)pH的酸性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
9.权利要求1至7中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下保持活性,或在暴露于包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
10.权利要求1至9中任意一项所述的分离的、合成的或重组的核酸,其中所述木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在至少约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、
87℃、88℃、89℃或90℃的温度和至少约pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH
10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性pH下保持活性。
11.核酸探针,其用于鉴定编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽
的核酸,其中所述探针包含下列核酸中的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、
70、75、100、125、150、175、200、225或更多个连续碱基:
(a)包含SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列的核酸,所述核酸序列具有表1中所
述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、
17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC;编码氨基酸
残基9的密码子由CCC变为GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨基
酸残基21的密码子由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG;编码氨
基酸残基38的密码子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG;编码
氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC;编
码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;
编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为
TAC;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸残基188的密码子由AGC
变为GAG;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG;
(b)(a)所述的探针,其包含这样的核酸,所述核酸包含权利要求1至10中任一项所述
的序列;或
(c)(a)或(b)所述的探针,其中所述探针包含寡核苷酸,所述寡核苷酸包含至少约10
至50、约20至60、约30至70、约40至80、约60至100、或约50至150或更多个连续碱基。
12.扩增引物对,其用于扩增编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多
肽的核酸,其中(a)所述引物对能够扩增包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸;
或(b)(a)所述的引物对,其中所述扩增引物对的成员包含这样的寡核苷酸,所述寡核苷酸包含所述序列的至少约10至50个连续碱基,或所述序列的约10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个连续碱基。
13.扩增引物对,其中所述引物对包含第一成员和第二成员,所述第一成员具有权利要求1至10中任一项所述序列的约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个残基所述的序列,以及所述第二成员具有所述第一成员互补链的约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个残基所述的序列。
14.编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸,其通过应用权利要求12或权利要求13所述
的扩增引物对由多核苷酸的扩增而产生,其中任选地所述扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行。
15.权利要求14所述的编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸,其中所述核酸通过基因
文库的扩增产生,其中任选地所述基因文库是环境文库。
16.分离的、合成的或重组的木聚糖酶,其由权利要求15中所述的编码木聚糖酶和/或
葡聚糖酶的核酸编码。
17.扩增编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸的方法,包
括用扩增引物序列对扩增模板核酸,所述扩增引物序列对能够扩增权利要求1至10中任一项所述的序列。
18.表达盒、载体或克隆运载体,其包括这样的核酸,所述核酸包含权利要求1至10中
任一项所述的序列,其中任选地所述克隆运载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体。
19.权利要求18所述的克隆运载体,其中所述病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒
载体或腺伴随病毒载体,或所述人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
20.转化细胞,其包含具有权利要求1至10中任一项所述序列的核酸,或包含权利要
求18至权利要求19所述的表达盒、载体或克隆运载体,其中任选地所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
21.转基因非人动物,其包含具有权利要求1至10中任一项所述序列的核酸,或包含权
利要求18至权利要求19所述的表达盒、载体或克隆运载体,或权利要求20所述的转化细胞,其中任选地所述动物是小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、鸡、山羊、鱼或
22.转基因植物、植物部分或植物种子,其包含具有权利要求1至10中任一项所述序列
的核酸,其中任选地所述植物是玉米植株、高粱植株、铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、稻植株、大麦植株、草类、花植株、棉籽植株、棕榈、芝麻植株、花生植株、向日葵植株或烟草植株。
23.反义寡核苷酸,其包含与权利要求1至10中任一项所述序列互补的核酸序列,或能
够与权利要求1至10中任一项所述序列在严格条件下杂交的核酸序列,其中任选地所述反义寡核苷酸长度为约10至50、约20至60、约30至70、约40至80或约60至100个碱基,
以及任选地所述严格条件包括这样的洗涤步骤,其包括在约65℃温度下于0.2×SSC
中洗涤约15分钟。
24.双链抑制RNA(RNAi)分子,其包含权利要求1至10中任一项所述序列的子序列,其
中任选地所述RNAi长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29或30或更多个双链核苷酸。
25.抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶信息在细胞中翻译或抑制木聚糖酶在
细胞中表达的方法,包括给予所述细胞或在所述细胞中表达权利要求23所述的反义寡核苷酸或权利要求24所述的双链抑制RNA(RNAi)分子。
26.分离的、合成的或重组的多肽或肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
活性,
(a)包含与下列氨基酸序列具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、
57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、
72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、
87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或具有
100%(完全)序列同一性的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其酶促活性片段,其具有表1中所述的至少一个氨基
酸残基改变(或其等价物),或具有下列氨基酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、
6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为N(或asn或天冬酰胺);氨基酸残基4
从T(或thr或苏氨酸)变为R(或arg,或精氨酸);氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)
变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基9从P(或pro或脯氨酸)变为D(或asp或天冬氨
酸));氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或val或缬氨酸);氨基酸残基
21从F(或phe或苯丙氨酸))变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基33从L(或leu或亮
氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基38从R(或arg或精氨酸)变为H(或his
或组氨酸);氨基酸残基44从S(或ser或丝氨酸)变为T(或thr或苏氨酸);氨基酸残基
63从I(或ile或异亮氨酸))变为V(或val或缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘
氨酸)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为V(或val或
缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为E(或glu或谷氨酸);氨基酸残基
108从F(或phe或苯丙氨酸)变为K(或lys或赖氨酸);氨基酸残基125从Q(或gln或
谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基150从V(或val或缬氨酸)变为A(或
ala或丙氨酸));氨基酸残基188从S(或ser或丝氨酸)变为E(或glu或谷氨酸);和/
或氨基酸残基189从S(或ser或丝氨酸)变为Q(或gln或谷氨酰胺);或
(ii)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列;
其中(i)或(ii)所述的多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,或
所述多肽或肽能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽),
(b)(a)的多肽或肽,其中所述序列同一性如下测定:(A)通过用序列比对算法分析或
通过视觉观察,或(B)在至少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基区域上,或在所述多肽或肽或酶和/或其酶促活性子序列(片段)的全长上;
(c)(b)的(a)的多肽或肽,其中所述序列同一性通过用序列比对算法分析或通过视觉
观察来测定,以及任选地所述序列比对算法是2.2.2版BLAST算法,其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F并且所有其它选项被设置为默认值;
(d)权利要求1所述的核酸编码的氨基酸序列,其中所述多肽具有(i)木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,或(ii)具有免疫原活性,因为其能够产生特异性结合具有(a)序列和/或其酶促活性子序列(片段)的多肽的抗体;
(e)(a)至(d)所述的任意氨基酸序列,并且包含至少一个氨基酸残基保守替代,以及
所述多肽或肽仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;
(e)(e)的氨基酸序列,其中所述保守替代包括用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基
酸;用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然;用另一种酸性残基置换酸性残基;用带有酰胺基团的另一种残基置换带有酰胺基团的残基;用另一种碱性残基交换碱性残基;或用另一种芳香族残基置换芳香族残基,或其组合,
(f)(e)的氨基酸序列,其中所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物;所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物;所述包含酰胺基团的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物;所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物;或所述芳香族残基包括苯丙氨酸、酪氨酸或其合成的等价物;
(g)(a)至(f)的任意多肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,但缺少
信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM),
(h)(g)的多肽,其中所述糖结合模块(CBM)包括木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块,或由其组成;
(i)(a)至(h)的任意多肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,进一步
包含异源序列;
(i)(i)的多肽,其中所述异源序列包括:(A)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合,或由其组成;(B)(A)的序列,其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)衍生自异源木质纤维素酶;和/或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶;
(k)(i)或(j)的多肽,其中所述异源序列或所述异源糖结合模块(CBM)包括木聚糖结
合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块,或由其组成;
(l)(i)的多肽,其中所述异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒;或
(m)包含权利要求1-10中任一项所述核酸序列编码的氨基酸序列。
27.分离的、合成的或重组的多肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽具有包含SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列的序列或其酶促活性片段,并且具有表1中所述的至少一个氨基酸残基改变(或其等价物),或具有下列氨基酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、
16个、17个或18个或一些或全部改变:氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为N(或
asn或天冬酰胺);氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为R(或arg,或精氨酸);氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基9从P(或pro或脯
氨酸)变为D(或asp或天冬氨酸);氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或
val或缬氨酸);氨基酸残基21从F(或phe或苯丙氨酸))变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基
酸残基33从L(或leu或亮氨酸)变为A(或ala或丙氨酸);氨基酸残基38从R(或arg
或精氨酸)变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基44从S(或ser或丝氨酸)变为T(或
thr或苏氨酸);氨基酸残基63从I(或ile或异亮氨酸)变为V(或val或缬氨酸);氨基
酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基73从G(或gly
或甘氨酸)变为V(或val或缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为E(或
glu或谷氨酸);氨基酸残基108从F(或phe或苯丙氨酸)变为K(或1ys或赖氨酸);氨基
酸残基125从Q(或gln或谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基150从V(或
val或缬氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基188从S(或ser或丝氨酸)变为
E(或glu或谷氨酸);和/或氨基酸残基189从S(或ser或丝氨酸)变为Q(或gln或谷
氨酰胺)。
28.权利要求26至权利要求27所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中
(a)所述木聚糖酶活性包括催化内部β-1,4-木糖苷键水解;包括内-1,4-β-木聚糖
酶活性;包括水解木聚糖或阿拉伯木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体;包括水解含1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖的多糖;包括水解纤维素或半纤维素;包括水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的纤维素或半纤维素;包括催化饲料或食品中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解;或包括催化微生物细胞或植物细胞中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解;
(b)所述葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性,例如内-1,4-和/或1,3-β-D-葡聚糖
4-葡聚糖水解酶活性;其催化1,4-β-D-糖苷键的水解;内-1,4-和/或1,3-β-内切葡聚糖酶活性或内-β-1,4-葡聚糖酶活性;内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性;催化纤维素、纤维素衍生物、羧甲基纤维素和/或羟乙基纤维素、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键、在混合的β-1,3葡聚糖、谷类β-D-葡聚糖和/或含纤维素部分的其它植物材料中的β-1,4键的水解;水解葡聚糖、β-葡聚糖或多糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体;或,(c)所述甘露聚糖酶活性包括内-1,4-β-D-甘露聚糖酶活性,或催化β-1,4-甘露聚
糖或未取代的线性β-1,4-甘露聚糖的水解。
29.权利要求28所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚糖或阿拉伯木聚
糖包括水溶性阿拉伯木聚糖,以及任选地所述水溶性木聚糖或阿拉伯木聚糖包括面团或面包产品。
30.权利要求28所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述饲料或食品包括基于
谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜。
31.权利要求26-30中任一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是热稳定的,以及任选地所述多肽在包括约0℃至约
20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约
80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高的温度范围的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
32.权利要求26至30中任意一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是耐热的,以及任选地所述多肽在暴露于约0℃至约
20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约
80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高范围的温度后保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中任选地所述耐热性包括在被加热到高温之后保持37℃下的木聚糖酶、甘露聚糖酶
和/或葡聚糖酶的比活性的至少一半,或任选地所述耐热性包括在被加热到高温之后保持每毫克蛋白约500到约1200单位范围内的37℃下的比活性,以及任选地所述高温是至少约
0℃至约20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约
75℃至约80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高。
33.权利要求26至30中任意一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH
4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸)pH的酸性条件下保持活性,或在暴露于包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸)pH的酸性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
34.权利要求26至30中任一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下保持活性,或在暴露于包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
35.权利要求26至30中任一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在至少约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、
87℃、88℃、89℃或90℃的温度和至少约pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH
10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性pH下保持活性。
36.分离的、合成的或重组的多肽,其包括权利要求26至35中任一项的多肽,以及缺少信号序列或前原序列。
37.分离的、合成的或重组的多肽,其包括权利要求26至35中任一项的多肽,并且具有异源信号序列或异源前原序列。
38.权利要求26至37中任一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性包括在每毫克蛋白约100至约1000单位、每毫克蛋白约500至约750单位、每毫克蛋白约500至约1200单位或每毫克蛋白约750至约1000单
位范围内的约37℃下的比活性。
39.权利要求26至38中任一项所述的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述多肽包
含至少一个糖基化位点或进一步包含多糖,其中任选地所述糖基化是N-连接的糖基化,以及任选地所述多肽在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)中被表达后被糖基化。
40.蛋白质制剂,其包含权利要求26至39中任一项所述的多肽,其中所述蛋白质制剂
包括液体、固体或凝胶。
41.异二聚体,其包含权利要求26至39中任一项所述的多肽和第二结构域,其中任选
地所述第二结构域是多肽以及所述异二聚体是融合蛋白,或任选地所述第二结构域是表位或标记。
42.同型二聚体,其包含权利要求26至39中任一项所述的多肽,以及任选地所述同型
二聚体是融合蛋白。
43.固定化多肽,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的多肽,其中任选
地所述多肽被固定化在木屑、纸、细胞、金属、树脂聚合物、陶瓷、玻璃、微电极石墨颗粒、珠子、凝胶、板、阵列或毛细管上。
44.分离的、合成的或重组的抗体,其与权利要求26至39中任一项所述的多肽特异性
结合,其中任选地所述抗体是单克隆或多克隆抗体,或是单链抗体。
45.杂交瘤,其包含权利要求44中所述的抗体。
46.阵列,其包含:固定化多肽,其中所述多肽包括权利要求26至39中任一项所述的
多肽;固定化核酸,其中所述核酸包括权利要求1至10任一项所述的核酸;权利要求44所述的抗体;或其组合。
47.分离或鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶酶活性的多肽的方法,其包
括下列步骤:
(a)提供权利要求44所述的抗体;
(b)提供包含多肽的样品;和
(c)将步骤(b)的所述样品与步骤(a)的所述抗体在所述抗体能与所述多肽特异性结
合的条件下接触,从而分离或鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽。
48.制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体的方法,其包括以足以产生体液免疫应答
的量给予非人动物权利要求1至10中任一项所述的核酸,从而制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体。
49.制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体的方法,其包括以足以产生体液免疫应答
的量给予非人动物权利要求26-39中任一项所述的多肽,从而制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体。
50.产生重组多肽的方法,其包括下列步骤:(a)提供与启动子可操作地连接的核酸,
其中所述核酸包含权利要求1-10中任一项所述的序列;和(b)在允许所述多肽表达的条件下表达步骤(a)的所述核酸,从而产生重组多肽,以及任选地所述方法进一步包括用步骤(a)的所述核酸转化宿主细胞,随后表达步骤(a)的所述核酸,从而在转化细胞中产生重组多肽。
51.用于鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的方法,其包括:
(a)提供权利要求26-39中任一项所述的多肽;
(b)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物;和
(c)将所述多肽与步骤(b)的所述底物接触,并且检测底物量的降低或反应产物量的
增加,其中底物量的降低或反应产物量的增加检测出具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽。
52.用于鉴定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物的方法,其包括:
(a)提供权利要求26-39中任一项所述的多肽;
(b)提供测试底物;和
(c)将步骤(a)的所述多肽与步骤(b)的所述测试底物接触,并且检测底物量的降低或
反应产物量的增加,其中底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物的测试底物。
53.确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法,其包括:
(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包含所述核酸的载体,其中所述核酸
具有权利要求1-10中任一项所述的序列;
(b)提供测试化合物;
(c)将所述多肽与所述测试化合物接触;和
(d)确定步骤(b)的所述测试化合物是否与所述多肽特异性结合。
54.确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法,其包括:
(a)提供权利要求26-39中任一项所述的多肽;
(b)提供测试化合物;
(c)将所述多肽与所述测试化合物接触;和
(d)确定步骤(b)的所述测试化合物是否与所述多肽特异性结合。
55.用于鉴定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的调节剂的方法,其包括:
(a)提供权利要求26-39中任一项所述的多肽;
(b)提供测试化合物;和
(c)将步骤(a)的所述多肽与步骤(b)的所述测试化合物接触,并测定木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中在存在测试化合物的情况下测定的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性与不存在测试化合物的情况下的活性相比的变化确定了所述测试化合物调节木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
56.权利要求55所述的方法,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,通
过提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物,并检测底物量的降低或反应产物量的增加,或底物量的增加或反应产物量的降低来测量,其中任选地与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比,有测试化合物时底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的激活剂的所述测试化合物。
57.权利要求56所述的方法,其中与没有测试化合物时底物或反应产物量相比,有测
试化合物时底物量的增加或反应产物量的降低鉴定出作为木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的抑制剂的所述测试化合物。
58.计算机系统,其包括处理器和数据存储设备,或已经存储了多肽序列或核酸序列的计算机可读介质,其中所述数据存储设备或计算机可读介质上已经存储了多肽序列或核酸序列,其中所述多肽序列包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列、权利要求1至
10中任一项所述的核酸序列编码的多肽,
其中任选地所述系统进一步包括序列比对算法和数据存储设备,所述数据存储设备上
已经存储了至少一个参考序列,或任选地进一步包括在所述序列中鉴定一个或多个特征的鉴定器,
以及任选地所述序列比对算法包含表明多态性的计算机程序
59.用于鉴定序列中的特征的方法,其包括如下步骤:(a)使用鉴定序列中的一个或多
个特征的计算机程序读取所述序列,其中所述序列包括多肽序列或核酸序列,其中所述多肽序列包括权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列、权利要求1至10中任一项所述的核酸序列编码的多肽;和(b)用所述计算机程序鉴定所述序列中的一个或多个特征。
60.将第一序列与第二序列进行比较的方法,其包括如下步骤:(a)通过使用比较序列
的计算机程序读取所述第一序列和所述第二序列,其中所述第一序列包括多肽序列或核酸序列,其中所述多肽序列包括权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列、权利要求1至
10中任一项所述的核酸序列编码的多肽;和(b)用所述计算机程序确定所述第一序列和所述第二序列之间的差异,
其中任选地确定所述第一序列和所述第二序列之间差异的步骤进一步包括鉴定多态
性的步骤,
以及任选地所述方法进一步包括鉴定序列中的一个或多个特征的鉴定器,以及任选地
所述方法进一步包括使用计算机程序读取所述第一序列,并鉴定所述序列中的一个或多个特征。
61.从环境样品中分离或回收核酸的方法,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,所述方法包括如下步骤:
(a)提供权利要求11所述的多核苷酸探针;
(b)从环境样品中分离核酸或处理所述环境样品,以便样品中的核酸可达到与步骤
(a)的多核苷酸探针杂交;
(c)将步骤(b)分离的核酸或处理的环境样品与步骤(a)的所述多核苷酸探针结合;

(d)分离与步骤(a)的所述多核苷酸探针特异性杂交的核酸,从而从环境样品中分离
或回收编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸,
其中任选地所述环境样品包含水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品;
以及任选地所述生物样品源自细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
62.从环境样品中分离或回收核酸的方法,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,所述方法包括如下步骤:
(a)提供权利要求12或权利要求13所述的扩增引物序列对;
(b)从环境样品中分离核酸或处理环境样品,以便样品中的核酸可达到与扩增引物对
杂交;和
(c)将步骤(b)所述的核酸与步骤(a)所述的扩增引物对结合,并从环境样品中扩增核
酸,从而从环境样品中分离或回收编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸。
63.产生编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的核酸的变体的方法,包
括以下步骤:
(a)提供包含权利要求1至10中任一项所述序列的模板核酸;和
(b)在模板序列中修饰、缺失或者添加一个或者多个核苷酸,或其组合,以产生所述模板核酸的变体,
其中任选地所述方法进一步包括表达所述变异核酸,以产生变体木聚糖酶、甘露聚糖
酶和/或葡聚糖酶多肽,
以及任选地所述修饰、添加或者缺失由包括易错PCR、重排、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、回归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)和其组合的方法来引入,或所述修饰、添加或者缺失通过包括下述的方法引入:重组、回归序列重组、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复-缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和其组合。
64.权利要求63所述的方法,其中所述方法被反复重复,直到产生与模板核酸编码的
多肽相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,
其中任选地所述变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽是耐热的,并且在暴
露于高温度之后保留一些活性,或任选地所述变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽与模板核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶相比,具有增加的糖基化,或任选地所述变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽在高温下具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中由所述模板核酸编码的所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在高温下没有活性。
65.权利要求63所述的方法,其中所述方法被反复重复,直到产生具有与所述模板核
酸的密码子使用有所改变的密码子使用的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶编码序列,
其中任选地所述方法被反复重复,直到产生具有比所述模板核酸的信息表达或稳定性
更高或更低水平的信息表达或稳定性的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶基因。
66.在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码
子以增加其在宿主细胞中表达的方法,所述方法包括:
(a)提供编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸,所述核酸
包含权利要求1至10中任一项所述的序列;和
(b)鉴定步骤(a)的所述核酸中非优选或较不优选的密码子,并用优选的或中度使用
的密码子来代替之,所述优选或中度使用的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸,其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子,以及非优选或较不优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子,从而修饰所述核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
67.在编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的核酸中修饰密码子的方法,所
述方法包括:
(a)提供编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸,所述核酸
包含权利要求1至10中任一项所述的序列;和
(b)鉴定步骤(a)的核酸中的密码子,并用不同的密码子来代替它,所述不同的密码子
编码与被代替的密码子相同的氨基酸,从而修饰在编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸中的密码子。
68.在编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的核酸中修饰密码子以增加其
在宿主细胞中表达的方法,所述该方法包括:
(a)提供编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的核酸,所述核酸包含权利要
求1至10中任一项所述的序列;和
(b)鉴定步骤(a)的核酸中的非优选或较不优选密码子,并用优选的或中度使用的密
码子来代替它,所述优选或中度使用的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸,其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子,以及非优选或较不优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子,从而修饰所述核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
69.在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码
子以降低其在宿主细胞中的表达的方法,所述方法包括:
(a)提供编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的核酸,所述核酸包含权利要
求1至10中任一项所述的序列;和
(b)鉴定步骤(a)的核酸中的至少一个优选密码子,并用非优选的或较不优选的密码
子来代替它,所述非优选或较不优选的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸,其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子,以及非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子,从而修饰所述核酸以降低其在宿主细胞中的表达,
其中任选地所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
70.产生核酸文库的方法,所述核酸文库编码一系列被修饰的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或底物结合位点,其中所述被修饰的活性位点或底物结合位点来源于第一核酸,所述第一核酸包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列,所述方法包括:
(a)提供第一核酸,其编码第一活性位点或第一底物结合位点,其中所述第一核酸序列包含在严格条件下与权利要求1至10中任一项所述的序列或其子序列杂交的序列,以及所述核酸编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物结合位点;
(b)提供一组诱变寡核苷酸,其在第一核酸的多个目标密码子处编码天然发生的氨基
酸变体;和
(c)使用所述组的诱变寡核苷酸,产生一组编码活性位点或编码底物结合位点的变体
核酸,其在被诱变的每一氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变异,从而产生编码多个被修饰的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或底物结合位点的核酸文库。
71.权利要求70所述的方法,包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核
酸或变体:优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、易错PCR、重排、寡核苷酸定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、回归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、重组、回归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成或其组合。
72.制备小分子的方法,包括:
(a)提供多个能合成或修饰小分子的生物合成酶,其中所述酶中的一种酶包含这样的
核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,所述核酸包含权利要求1至10中任一项所述的序列;
(b)为步骤(a)的至少一种酶提供底物;和
(c)将步骤(b)的底物与所述酶在促进多个生物催化反应的条件下通过一系列生物催
化反应进行反应,以产生小分子。
73.修饰小分子的方法,包括:
(a)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中所述酶包含权利要求26至39中
任一项所述的多肽或由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码的多肽;
(b)提供小分子;和
(c)将步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子在促进木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
催化的酶促反应的条件下进行反应,从而通过木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶酶促反应修饰小分子,
其中任选地所述方法包括为步骤(a)的所述酶提供多个小分子底物,从而产生通过由
木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶催化的至少一种酶促反应产生的被修饰小分子的文库。
74.权利要求73所述的方法,进一步包括多种其它的酶,在有助于所述酶的多个生物
催化反应的条件下使用,以形成由多个酶促反应产生的被修饰小分子的文库,其中任选地所述方法进一步包括测试所述文库以确定所述文库中是否存在表现出期望活性的特定被修饰小分子的步骤,以及任选地测试所述文库的步骤进一步包括系统地去除所有但保留一个用于产生文库中多个被修饰小分子中的一部分的生物催化反应,其是通过测试被修饰小分子的所述部分中存在或不存在具有期望活性的特定被修饰小分子,并鉴定出产生具有期望活性的特定修饰小分子的至少一个特定生物催化反应。
75.确定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的功能片段的方法,包括如下步骤:
(a)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中所述酶包括权利要求26至39中
任一项所述的多肽或由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码的多肽;和
(b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基,并测试具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或
葡聚糖酶活性的剩余子序列,从而确定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的功能片段,其中任选地所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性通过提供木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加来测量。
76.通过使用实时代谢流分析进行新的或修饰的表型的全细胞工程改造的方法,所述
方法包括:
(a)通过修饰细胞的遗传组成产生修饰的细胞,其中所述遗传组成通过将包含权利要
求1至10中任一项所述序列的核酸加入到细胞来修饰;
(b)培养所述修饰的细胞以产生多个修饰的细胞;
(c)通过实时监控步骤(b)的细胞培养物来测量所述细胞的至少一个代谢参数;和
(d)分析步骤(c)的数据,以确定被测量的参数是否与在类似条件下未修饰细胞中的
参照测量值不同,从而使用实时代谢流量分析鉴定细胞中的工程改造的表型,
其中任选地所述细胞的遗传组成通过包括在所述细胞中序列的删除或序列的修饰,或
敲除基因的表达的方法来修饰,
以及任选地所述方法进一步包括选择含有新工程改造的表型的细胞,以及任选地进一
步包括培养被选择的细胞,从而产生包含新工程改造的表型的新细胞株。
77.嵌合多肽,其包含至少第一结构域和至少第二结构域,所述第一结构域包含信号肽(SP),所述第二结构域包含含有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列或其子序列的异源多肽或肽,其中所述异源多肽或肽与信号肽(SP)之间没有天然的联系,其中任选地所述信号肽(SP)的来源不是木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,以及任选地所述异源多肽或者肽在所述信号肽(SP)或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶催化结构域(CD)的氨基末端、羧基末端或者羧基和氨基末端。
78.分离的、合成的或者重组的核酸,其编码嵌合多肽,其中所述嵌合多肽包括至少第一结构域和至少第二结构域,所述第一结构域含有信号肽(SP),所述第二结构域包含异源多肽或者肽,其中所述信号肽(SP)包含权利要求83中所述的信号序列。
79.增加木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性的方法,所述
方法包括糖基化木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中所述多肽包含权利要求26至
39中任一项所述多肽或由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码的多肽的至少30个连续氨基酸,从而增加木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的耐热性或热稳定性。
80.在细胞中过量表达重组木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法,包括表达载
体,所述载体包含权利要求1至10中任一项所述的核酸序列,或编码权利要求26至39中任一项所述多肽的至少30个连续氨基酸的核酸,其中过量表达通过使用高活性启动子、双顺反子载体或通过所述载体的基因扩增来实现。
81.产生转基因植物的方法,包括:
(a)将异源核酸序列引入细胞中,其中所述异源核酸序列包含权利要求1至10中任一
项所述的序列,或编码权利要求26至39中任一项所述多肽的至少30个连续氨基酸的核
酸,从而产生转化的植物细胞;
(b)从所述转化的细胞产生转基因植物,
其中任选地步骤(a)进一步包括通过植物细胞原生质体的电穿孔或微注射而引入所
述异源核酸序列,
以及任选地步骤(a)包括通过DNA颗粒轰击或通过应用根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)宿主直接将所述异源核酸序列引入到植物组织。
82.在植物细胞中表达异源核酸序列的方法,包括:
(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序列转化所述植物细胞,其中所述异源核酸
序列包括权利要求1至10中任一项所述的序列,或编码权利要求26至39中任一项所述多肽的至少30个连续氨基酸的核酸;
(b)在所述异源核酸序列在所述植物细胞中表达的条件下使所述植物生长。
83.水解、液化、分解或破坏含木聚糖、纤维素或半纤维素的组合物的方法,包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽包含权
利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供含木聚糖、纤维素或半纤维素的组合物;和
(c)在其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶水解、液化、分解或破坏含木聚
糖、纤维素或半纤维素的组合物的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触,其中任选地所述组合物包括植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
84.面团或面包制品,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,
其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
85.面团调理的方法,其包括在足以调理所述面团的条件下,使面团或面包制品与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽接触,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
86.饮料,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多
肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码。
87.饮料生产的方法,包括在足以降低饮料粘性的条件下将具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽施用到饮料或饮料前体,其中所述多肽包含权利要求
26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
其中,任选地所述饮料或饮料前体是麦芽汁或啤酒。
88.食物、饲料或营养补充物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性
的多肽,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码。
89.将木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶用作动物膳食中的营养补充物的方法,所
述方法包括:
制备含有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的营养补充物,所述酶包含具有木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的至少30个连续氨基酸,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述序列的核酸编码,或其酶促活性片段;和
给予动物所述营养补充物用以增加包含在被动物摄取的饲料或食品中的木聚糖的利
用,
其中任选地所述动物是人或非人,以及任选地所述动物是反刍动物单胃动物
90.权利要求96所述的方法,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶通过
在选自细菌、酵母、植物、昆虫、真菌和动物的生物体中表达编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的多核苷酸来进行制备,其中任选地所述生物体选自粟酒裂殖酵母、酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌(E.coli)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、链霉菌属某种(Streptomyces sp.)、杆菌属某种(Bacillus sp.)和乳酸杆菌属某种
(Lactobacillus sp.)。
91.可食用的酶输送基质,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多
肽,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
其中任选地所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶是热稳定的。
92.向动物输送木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶补充物的方法,所述方法包括:
制备丸剂形式的可食用的酶输送基质,其包含粒状可食用载体以及热稳定的重组的木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中所述丸剂容易将包含在其中的所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶分散入含水介质中,以及
给予所述动物所述可食用酶输送基质;
其中所述重组木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包含权利要求26至39中任一项
所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,其中任选地所述颗粒状可食用载体包含选自如下的载体:谷物胚芽,无油谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵花籽粕和次粉,
以及任选地所述可食用载体包含无油谷物胚芽,或任选地所述木聚糖酶、甘露聚糖酶
和/或葡聚糖酶被糖基化,以在压丸条件下提供热稳定性,以及任选地所述输送基质通过对含有谷物胚芽和木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的混合物进行压丸而形成,以及任选地所述压丸条件包括应用蒸汽,及任选地所述压丸条件包括应用超过约80℃的温度约
5分钟,而所述酶保持每毫克酶至少大约350到大约900单位的比活性。
93.清洁剂组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其
中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
94.药物组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中
所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求
1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
95.消除包含木聚糖的微生物或保护动物免受包含木聚糖的微生物损害的方法,包含
给予具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽包含权利要求
26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
其中任选地所述微生物是细菌或沙氏菌。
96.在纸或纸制品、木材、木浆或木制品、或木材或纸再生组合物中减少木质素量(去
木质素化)或溶解木质素的方法,包括使所述纸或纸制品、木材、木浆或木制品、或木材或纸再生组合物与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
97.水解生物质、木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中纤维素、半纤维素或木聚糖的方法,包括使所述木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
98.纸、大麻或亚麻浆酶促脱色的方法,包括使所述纸、大麻或亚麻浆与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶和漂白剂接触,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
其中任选地所述脱色剂包括过化氧或过氧化氢。
99.脱色木质纤维素浆的方法,包括使所述木质纤维素浆与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶接触,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
100.纸、废纸、纸再生产品的酶促脱墨的方法、从非接触性印刷废纸或非接触性和接触性印刷废纸的混合物中脱去墨粉的方法,包括使所述纸、废纸、纸再生产品、非接触性印刷废纸或接触性印刷废纸与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶接触,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
101.脱色织物、纱、布料或纺织品的方法,包括使所述织物、纱、布料或纺织品与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在适于使纺织品变白的条件下接触,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编
码,或其酶促活性片段,
其中任选地所述织物、纱、布料或纺织品包含非棉纤维素线织物、纱、布料或纺织品。
102.报纸脱色或脱墨的方法,包括接触所述报纸,其中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
103.生物质、木材、木浆、木制品、纸浆、纸制品、报纸或废纸,其包含具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的多肽,或包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码的多肽,或其酶促活性片段。
104.织物、纱、布料或纺织品,其包含具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序
列的多肽,或包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码的多肽,或其酶促活性片段,
其中任选地所述织物、纱、布料或纺织品包含非棉纤维素织物、纱、布料或纺织品。
105.减少木材或木制品中木质素的方法,包括使所述木材或木制品与具有木聚糖酶、
甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
106.在高温和碱性pH条件下减少生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中木质素的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包含至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供含木质素的生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包含至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,其中所述多肽减少木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的所述木质素。
107.在高温和碱性pH条件下处理生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸制品、纸或纸浆的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包含至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包含至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,
其中所述多肽催化所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,
以及其中任选地所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆包括软木材和硬木材,或所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸或纸浆源自软木材和硬木材;
以及其中任选地,在所述处理后,所述浆料具有至少约10%或至少约32%的稠度。
108.在高温和碱性pH条件下对生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆脱色的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包含至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,
其中所述多肽催化所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而对所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆漂白。
109.在高温和碱性pH条件下减少生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆漂白过程中漂白化学品的使用的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,
其中所述多肽催化所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而对所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆生物漂白并且减少漂白过程中漂白化学品的使用;
其中任选地所述漂白化学品包括氯、二氧化氯、苛性碱、过氧化物或其任意组合。
110.在高温和碱性pH条件下纸或浆料脱墨的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供含墨的木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,
其中所述多肽催化所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸或纸浆中的化合物的水解,从而促进所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的脱墨。
111.在高温和碱性pH条件下从木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中释放木质素的方法,所述方法包括:
(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多
肽在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,
其中所述多肽包括具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;
(b)提供含木质素的木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及
(c)使步骤(b)的所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的所述多肽接触,
其中所述多肽催化木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而促进木质素从所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的释放;
其中任选地在所述处理后,所述浆料具有约10%的稠度。
112.包含生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
其中任选地所述生物质、木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆包括软木材和硬木材,或所述木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆源自软木材和硬木材。
113.制造醇的方法,包括使含木聚糖、纤维素或半纤维素的组合物与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段,
以及任选地所述方法进一步包括发酵
以及任选地所述醇是乙醇或包含乙醇。
114.包含醇和具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的组合物,其中
所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求
1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;或所述组合物包含权利要求
124或权利要求128的酶混合物或鸡尾酒,
以及任选地所述醇是乙醇或包含乙醇。
115.隐形眼镜清洗液,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;或权利要求124或权利要求128的酶混合物或鸡尾酒。
116.废物处理溶液,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段;或权利要求124或权利要求128的酶混合物或鸡尾酒。
117.肥皂或液体肥皂,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
118.口香糖、含片或糖果,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列,或所述多肽由包含权利要求1至10中任一项所述的序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
119.嵌合糖苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其包含(a)权利要求26至39中任一项所
述的氨基酸序列和至少一个异源糖结合模块(CBM);或(b)(a)的嵌合糖苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中任选地所述CBM包括CBM3a、CBM3b、CBM4、CBM6,、CBM22或X14。
120.嵌合糖苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其包含至少一个异源糖结合模块(CBM),
其中所述CBM包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的糖结合子序列,或含X14模块的糖结合子序列。
121.设计具有新的糖结合特异性或糖结合特异性提高的嵌合糖苷酶、木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法,其包括将异源或另外的内源糖结合模块(CBM)插入糖苷酶中,其中所述CBM包含权利要求26至39中任一项所述的氨基酸序列的糖结合子序列,或含X14模块的糖结合子序列。
122.酶混合物或“鸡尾酒”,其包含(a)权利要求26至39中任一项的任意至少一种酶
和一种或更多种其它酶;(b)(a)的酶混合物或鸡尾酒,其中所述一种或更多种其它酶是另一种木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶或内糖苷酶、内-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内-β-1,3(4)-葡聚糖酶、质酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯树胶酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、鼠李糖半乳糖酸聚糖乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶
123.水解任意有机化合物、植物或木材或木制品或木材副产品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的木聚糖、纤维素或半纤维素的方法,包括应用权利要求124或权利要求128的酶混合物或鸡尾酒和/或权利要求26至39中任一项的任意多肽。
124.液体组合物,其包含(a)醇和权利要求26至39中任一项的任意多肽,或权利要
求124所述的酶混合物或鸡尾酒;(b)(a)的液体组合物,其中所述醇是或包括乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇;(c)(a)或(b)的液体组合物,其包含燃料生物燃料、合成液体或气体或合成气,或含在燃料、生物燃料、合成液体或气体或合成气中。
125.权利要求124所述的酶混合物或鸡尾酒,其包含内切葡聚糖酶、寡聚酶I(β-葡糖
苷酶)、CBH1(GH家族7)、CBH2(GH家族6)、木聚糖酶(GH家族11)、阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酶(GH家族10)和寡聚酶II(β-木糖苷酶),其中这些酶中的1、2、3、4、5、6、7种和/或所有8种是权利要求26至39中任一项的任意多肽。

说明书全文

木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法

[0001] 关于在联邦资助的研究下做出的发明权的声明
[0002] 本发明一部分是依据能源部提供的第DOE1435-04-03-CA-70224号合同,在政府的支持下进行的。政府可以在本发明中享有一定的权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2007年10月3日提交的美国临时申请序列号60/977,348的权益。该文件的内容通过引用而并入本文。
[0005] 参考通过EFS-WEB提交的序列表
[0006] 本申请通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交,如在MPEP§1730II.B.2.(a)(A)所批准并阐明的,并且该电子提交包括电子提交的序列(SEQ ID)表;该序列表的全部内容通
过引用并入本文用于所有目的。序列表根据如下电子提交的.txt文件确定:
[0007]发明领域
[0008] 本发明一般涉及酶、编码酶的多核苷酸、这些多核苷酸和多肽的应用,以及更具体而言,涉及这样的酶:所述酶具有木聚糖酶活性,例如内切木聚糖酶活性,和/或催化内部β-1,4-木糖苷键或内-β-1,4-葡聚糖键的解;和/或将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖;或葡聚糖酶活性,例如内切葡聚糖酶活性,例如催化内部内-β-1,4-和/或1,
3-葡聚糖键的水解、木聚糖酶活性和/或甘露聚糖酶活性。因此,本发明提供分解植物细胞壁主要组分半纤维素的方法和过程,包括水解任意有机化合物、植物或木材或木制品或木
材副产品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的半纤维素的方法和过程。本发明进一步提供应用本发明的“混合物/鸡尾酒(cocktails)”将含纤维素和/或半纤维素的植物
物质分解成单糖的方法和过程。
[0009] 背景
[0010] 木聚糖酶(例如,内切-β-1,4-木聚糖酶,EC 3.2.1.8)水解木聚糖中的内部β-1,4-木糖苷键,以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体。木聚糖是由1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃型木糖形成的多糖。木聚糖酶具有可观的商业价值,被用在食品工业中如烘焙
及水果和蔬菜加工、农业废物的分解,用在动物饲料的生产中和用在纸浆和纸的生产中。通过真菌和细菌,形成木聚糖酶。
[0011] 阿拉伯木聚糖是谷物主要的非淀粉多糖,取决于品种和生长条件,占2.5-7.1%w/w。该多糖的物理化学性质是在化条件下产生粘性溶液或者甚至是凝胶。此外,阿拉伯木聚糖具有高的水结合能并且可以在蛋白泡沫稳定性中具有作用。所有这些特征给几个
行业带来了问题,这些行业包括酿造、烘焙、动物营养和造纸。在酿造应用中,木聚糖的存在导致麦芽汁过滤性和形成浑浊的问题。在烘焙应用中(尤其对于曲奇和脆饼),这些阿拉伯
木聚糖产生发粘面团,其难以进行机械加工和减小饼干尺寸。此外,这种水化合物参与烘焙产品的快速再水化,导致松脆性损失和缩短的货架期。对于谷物食物的单胃动物饲料应
用,阿拉伯木聚糖是消化道内容物的粘性的主要促成因素,并且从而负面影响饲料的可消
化性和动物生长速率。对于反刍动物,这些多糖代表纤维摄入的基本成分,而阿拉伯木聚糖的更完全的消化将促进更高的饲料转化效率。
[0012] 在本领域中对木聚糖酶一直存在需求,所述木聚糖酶用于纸和纸浆工业中,例如其中该酶在65℃至75℃的温度范围内和在约10的pH下是有活性。此外,用于纸和纸浆工
业中的酶将减少对漂白化学品如二氧化氯的需求。
[0013] 此外,对提供用于通过生物质转化生产生物醇、多种生物燃料和/或一种生物燃料(例如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇和/或生物甲醇)的有效、低成本的方法和组合物
一直存在需求。酶或酶“鸡尾酒”可以提供将生物质转化成糖的途径,所述糖然后被发酵生物燃料
[0014] 发明概述
[0015] 本发明提供这样的酶,所述酶具有:木聚糖酶活性,例如内切木聚糖酶活性,和/或催化内部β-1,4-木糖苷键或内β-1,4-葡聚糖键的水解;和/或具有葡聚糖酶活性,例如内切葡聚糖酶活性,例如催化内部内β-1,4-和/或1,3-葡聚糖键的水解、木聚糖酶活性和/或甘露聚糖酶活性;以及编码它们的核酸、包含它们的载体和细胞、扩增和鉴定这些编码木聚糖酶的核酸的探针及制备和应用这些多肽和肽的方法。
[0016] 例如,本发明提供具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶活性)的酶以及包含它们的组合物和方法,用于水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的内部β-1,4-木糖苷键或内-β-1,4-葡聚糖键或半纤维素。在一个方面,木聚糖酶活性包括催化木聚糖的水解,例如将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。因此,本发明提供分解包含木聚糖的组合物和
/或半纤维素的方法和过程,所述半纤维素是植物细胞壁的主要组分。
[0017] 在一个方面,本发明多肽或肽(其包括本发明核酸编码的蛋白质或肽)的葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性,例如内-1,4-和/或1,3-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活
性。在一个方面,内切葡聚糖酶活性包括催化1,4-β-D-糖苷键水解。在一个方面,葡聚
糖酶,例如内切葡聚糖酶活性包括内-1,4-和/或1,3-β-内切葡聚糖酶活性或内-β-1,
4-葡聚糖酶活性。在一个方面,葡聚糖酶活性(例如内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解
酶活性)包括纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)地衣多糖中的
1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖和含纤维素部分的其它植物
材料中的β-1,4键的水解。在一个方面,葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性包括水解葡聚糖或其它多糖,以产生较小分子量的多糖或寡聚体。在一个方面,葡聚糖包括β-葡聚糖,如水溶性β-葡聚糖。
[0018] 本发明提供水解任意有机物质包括细胞、植物和/或木材或木制品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的半纤维素的酶、组合物、方法和过程。本发明进一步提供使用本发明的”鸡尾酒”将含纤维素和/或半纤维素的植物物质分解成简单糖的方法和过
程。
[0019] 在另一个方面中,本发明提供这样的多肽:所述多肽具有木质纤维素分解(木质纤维素)活性,例如木质素分解和纤维素分解活性,包括,例如具有水解酶活性,例如糖基水解酶活性,包括纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性,以及编码它们的核酸及制备和应用它们的方法。本发明提供将任意生物质例如木质纤维素残留物生物转
化成可发酵糖或多糖的酶;并且这些糖或多糖可以用作生产醇类如乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇、生产燃料例如生物燃料如合成液体或气体如合成气以及生产其它发酵产品例如琥珀
酸、乳酸或乙酸的化学原料。本发明的酶可以连续、以分批或间歇(喂料-分批)的方法添
加到生物转化和其它工业过程。在另一个方面中,本发明的酶在生物转化和其它工业过程
中可以被再循环,从而降低酶需求。
[0020] 在一个方面,本发明的酶具有增加的催化速率,以改进底物(例如木质纤维素残留物、纤维素、蔗渣)水解的过程。这种催化速率的效率增加导致生产糖或多糖的效率增
加,所述糖或多糖可以用于工业、农业或医学应用中,例如以制备生物燃料或醇类如乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇。在一个方面,应用本发明酶通过水解生产的糖可以通过微生物用于醇类(例如乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇)的生产和/或燃料(例如生物燃料)的生产。另
外,应用本发明酶通过水解生产的糖可以通过微生物用于其它发酵产品例如琥珀酸、乳酸
或乙酸的生产。
[0021] 本发明提供工业、农业或医学应用:例如生物质转化为生物燃料例如乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇,其使用本发明的具有降低的酶成本的酶,例如在生物质转化为生物燃料的过程中降低的成本。因此,本发明提供了由任何生物质生产生物醇、生物燃料和/或包含生物燃料(例如生物乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇-)的组合物的有效过程,包括包含生物醇
的合成的、液体或气体燃料。
[0022] 一方面,本发明的酶,包括本发明的酶“鸡尾酒”(“鸡尾酒”意思是包括本发明的至少一种酶的酶混合物),用于水解木质纤维素生物质的主要组分,或任何包括纤维素和/或半纤维素(木质纤维素生物质也包括木质素)的组合物,例如种子、谷物、茎、植
物废料(例如干草或稻草例如水稻杆或小麦杆或任何谷类植物的任何干秸秆)或食品加
工或工业加工的副产品(例如秸秆)、玉米(包括穗、秸、等等)、草(例如印度草如蓝刚
草(Sorghastrum nutans);或柳枝稷(switch grass)例如黍(Panicum)的种,如柳枝稷
(Panicum virgatum))、木材(其包括木屑、加工废料例如木材废料)、纸、纸浆、再生纸(例如新闻纸);还包括单子叶植物或双子叶植物或单子叶玉米、甘蔗或其部分(例如蔗梢)、水稻、小麦、大麦、柳枝稷或芒(Miscanthus);或双子叶含油种子作物、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花、棕榈油糖用甜菜、花生、树木、杨树或羽扇豆;或木材或木材加工的副产品,如废木料,例如在木材加工、纸浆和/或纸工业中的、在纺织品制造和在家用和工业清洗剂中的和/或在废生物质加工中的。
[0023] 一方面,本发明的酶用于水解纤维素,包括β-1,4-连接的葡萄糖部分的线性链,和/或半纤维素,其作为复杂的结构在各植物之间有所变化。一方面,本发明的酶用于水解半纤维素,其含有具有阿拉伯糖、半乳糖、葡糖酸和/或甘露糖的不连续分支的β-1,4连接的木糖分子的骨架。一方面,本发明的酶用于水解半纤维素,其含有非碳水化合物成分例如木糖上的乙酰基以及阿拉伯糖上的阿魏酸酯。一方面,本发明的酶用于水解半纤维素,其被共价地连接至木质素和/或通过二阿魏酸酯(diferulate)交联被偶联至其它半纤维素链。
[0024] 一方面,本发明的组合物和方法用于生物质的酶促消化并可包括使用多种不同的酶,其包括纤维素酶和半纤维素酶。用于实践本发明的木质纤维素酶能够消化纤维素为包
括葡萄糖在内的单聚体糖。一方面,用于实践本发明的组合物可包括酶的混合物,例如糖基水解酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)、纤维二糖水解酶和/或
阿拉伯呋喃糖苷酶或其它可消化半纤维素为单体糖的酶。本发明的混合物可包括本发明的
酶或仅由本发明的酶组成,或可包括至少一种本发明的酶和其它酶,所述其它酶也可以是
木质纤维素酶和/或任何其它酶。
[0025] 一方面,本发明的酶具有葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶活性,例如催化内部内-β-1,4-和/或β-1,3-葡聚糖酶键的水解。一方面,内切葡聚糖酶活性(例如内-1,
4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维
素和羟乙基纤维素)、地衣聚糖(lichenin)的中1,4-和/或β-1,3-β-D-糖苷键,混合的
β-1,3葡聚糖,例如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖和其它含有纤维素部分的植物材料中
的β-1,4键。
[0026] 在可选的实施方式中,本发明提供多肽(以及编码它们的核酸),所述多肽具有至少一种保守基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;或其中至
少一种保守氨基酸替代包括用相似特性的另一种氨基酸替代氨基酸;或保守替代包括:用
另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸;用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然;用另一种酸性
残基置换酸性残基;用带有酰胺基团的另一种残基置换带有酰胺基团的残基;用另一种
性残基交换碱性残基;或用另一种芳香族残基置换芳香族残基;
[0027] 在可选的实施方式中,本发明提供多肽(以及编码它们的核酸),所述多肽具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,但缺少信号序列、前原结构域(prepro domain)、锚定(dockerin)结构域和/或糖(碳水化合物)结合模块(CBM);以
及在一个方面,糖结合模块(CBM)包括或组成为木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块。
[0028] 在可选的实施方式中,本发明提供多肽(以及编码它们的核酸),所述多肽具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,进一步包含异源序列;以
及在一个方面,异源序列包括或组成为编码下列的序列:(i)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合;(ii),(i)的序列,其中异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)源自异源酶;或(iii)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶;以及在一个方面,异源糖结合模块(CBM)包含或组成为木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块;以及在一个方面,异源信号序列将编码的蛋白
靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒。
[0029] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其包含:
[0030] (a)编码至少一种多肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含与下列核酸序列具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、
63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或完全(100%)序列同一性的序列:
[0031] (i)SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列,其具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、
5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子由
ACC变为CGC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC;编码氨基酸残基9的密码子由
CCC变为GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨基酸残基21的密码子
由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG;编码氨基酸残基38的密码
子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG;编码氨基酸残基63的密
码子由ATC变为GTC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC;编码氨基酸残基73的
密码子由GGC变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;编码氨基酸残基108
的密码子由TTC变为AAG;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC;编码氨基酸残基
150的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG和/或编码氨
基酸残基189的密码子由TCC变为CAG;或
[0032] (ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21或SEQ ID NO:23的核酸(多核苷酸)序列;
[0033] 其中(i)或(ii)的核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,或编码能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或
免疫原作用的多肽或肽)的多肽或肽,
[0034] (b)(a)的核酸(多核苷酸),其中序列同一性如下测定:(A)通过用序列比对算法分析或通过视觉观察,或(B)在至少约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、
450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个残基区域上,或在cDNA、转录物(mRNA)或基因的全长上;
[0035] (c)(a)或(b)的核酸(多核苷酸),其中序列比对算法是2.2.2版BLAST算法,其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F,并且所有其它选项被设置
为默认值;
[0036] (d)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含在严格条件下与这样的核酸杂交的序列:所述核酸包含SEQ ID NO:1的核酸(多核苷酸)序列,其具有表
1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物),或具有下列核苷酸残基改变中的
至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、
16个、17个或18个或一些或全部改变:编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC;编码氨
基酸残基4的密码子由ACC变为CGC;编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC;编码氨
基酸残基9的密码子由CCC变为GAC;编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC;编码氨
基酸残基21的密码子由TTC变为TAC;编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG;编码
氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC;编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG;编
码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC;
编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG;编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC;
编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG;编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为
TAC;编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC;编码氨基酸残基188的密码子由AGC
变为GAG;和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG,
[0037] 其中多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性或能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽),
[0038] 以及严格条件包括这样的洗涤步骤,其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤约15分钟;
[0039] (e)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸),其中所述核酸包含在严格条件下与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:
11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:23序列的核酸杂交的序列,
[0040] 以及严格条件包括这样的洗涤步骤,其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤约15分钟;
[0041] (f)(a)至(d)中任意的核酸(多核苷酸),其长度为至少约20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、
1000、1050、1100、1150或更多个核苷酸残基或基因或转录物的全长;
[0042] (g)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸),其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列或其酶促活性片段,具有下列氨基酸
残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、
14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部:
[0043] (h)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸),其中所述多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:
20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24的序列或其酶促活性片段;
[0044] (i)(A)(a)至(h)中任意的核酸(多核苷酸)并且编码这样的多肽,所述多肽具有至少一个保守氨基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;或(B),
(i)(A)的核酸,其中至少一种保守氨基酸替代包括用相似特性的另一种氨基酸替代一种氨
基酸;或保守替代包括:用另一种脂肪族氨基酸置换一种脂肪族氨基酸;用苏氨酸置换丝
氨酸或反之亦然;用另一种酸性残基置换一种酸性残基;用带有酰胺基团的另一种残基置
换带有酰胺基团的一种残基;用另一种碱性残基交换一种碱性残基;或用另一种芳香族残
基置换一种芳香族残基;
[0045] (j)(a)至(i)的任意核酸(多核苷酸),其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM);
[0046] (k)(j)的核酸(多核苷酸),其中糖结合模块(CBM)包括木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成;
[0047] (l)(a)至(k)的任意核酸(多核苷酸),其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,进一步包含异源序列;
[0048] (m)(l)的核酸(多核苷酸),其中异源序列包括编码下列的序列或由其组成:(A)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合;(B)(l)的序列,其中异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)源自异源酶;或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶;
[0049] (n)(l)的核酸(多核苷酸),其中异源糖结合模块(CBM)包括木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块,或由其组成;
[0050] (o)(l)的核酸(多核苷酸),其中异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒;或
[0051] (p)与(a)至(o)的任意序列充分(完全)互补的核酸序列(多核苷酸)。
[0052] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其包含编码具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸,其中该多肽具有
SEQID NO:2中所述的序列或其酶促活性片段,所述序列具有本文中和表1中所述的一个或
更多个改变,包括本文中和表1中以及序列表(所有这些序列是“本发明的示例性酶/多
肽”)所述的序列,和其酶促活性子序列(片段)和/或其免疫活性子序列(如表位或免疫
原)(均为“本发明的肽”)和其变体(包含本发明的多肽或肽序列的所有这些序列)(或下
文称为本发明的示例性多肽序列)。
[0053] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其包含与本发明的所有这些核酸序列完全互补的序列(互补(非编码)和编码序列在下文中也被统称为本发明的核酸序列)。
[0054] 在一个方面,序列同一性是至少约51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、
74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(完全)序列同一性(同源性)。在一个方面,序列同一性在至少约150、175、200、225、250、275、300、350、400、
450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个残基的区域内或基因或转录物的全长区域内。例如,本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其包含SEQID NO:1的核酸序列,具有本文描述的,例如表1(本发明的示例性多核苷酸序列)
中所述的一个或更多个突变。本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其编码多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:2的序列,具有本文描述的,例如表1(本发明的示例性多肽序列)中
所述的一个或更多个氨基酸改变,以及其酶促活性片段。
[0055] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其编码具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述核酸具有本发明示例性序列或本
发明的任意序列中的至少一个序列修饰。
[0056] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其编码具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述核酸具有本发明示例性核酸中的
至少一个序列修饰,其中在一个方面修饰(改变)阐述在表1中。
[0057] 在一个方面,本发明还提供编码酶的核酸,其共同的新颖性在于它们编码木聚糖酶的新亚型或分化体,包含“X14模块”(J Bacteriol.2002 August;184(15):4124-4133)。
在一个方面,本发明还提供编码酶的核酸,其共同的新颖性在于它们编码木聚糖酶的新亚
型或分化体,包含“X14模块”。因此,在一个方面,本发明提供木聚糖酶的新种类,其包含SEQ ID NO:2的木聚糖酶成员,具有本文中,例如表1中所述的一个或更多个突变。
[0058] 在一个方面(任选地),本发明分离的、合成的或重组的核酸具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,例如其中木聚糖酶活性包括催化内部
β-1,4-木糖苷键水解;包括内-1,4-β-木聚糖酶活性;包括水解木聚糖或阿拉伯木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体;包括水解含1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖的
多糖;包括水解纤维素或半纤维素;包括水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的纤维素或半纤维素;包括催化饲料或食品中木聚糖或阿拉伯木聚糖的水解;或包括催化微生物
细胞或植物细胞中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解。在一个方面,木聚糖酶活性包括水解含1,
4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖的多糖或水解半纤维素,例如水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的半纤维素。在一个方面,阿拉伯木聚糖是谷物阿拉伯木聚糖,如小麦阿拉伯木聚糖。
[0059] 在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性包括催化饲料或食品如基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜中的多糖例如甘露聚糖或木聚糖的水解。在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性包括催化微生物细胞或植物细胞中的多糖例如甘露聚糖或木聚糖的水解。
[0060] 在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是热稳定的,例如其中所述多肽在包括下列温度范围的条件下仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性:约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃
至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃
至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约
90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约
120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、
107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高。在一些实施方式中,本发明所述的热稳定多肽在下列pH下于上述范围内的温度下仍保持活性,例如木聚糖酶、
甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性:约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更大。
[0061] 在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是耐热的,例如其中所述多肽在暴露于下列温度范围后仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性:
约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃
至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃
至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约
90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约
120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、
107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高。本发明所述的耐热多肽在暴露于下列温度范围后可以仍保持活性,例如木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶活性:约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约
45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、
约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至
约120℃或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、
107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。在一些实施方式中,本发明所述的耐热多肽在下列pH下在暴露于上述温度范围之后仍保持活性,例如木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性:约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH
9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高。
[0062] 在一个方面,本发明核酸编码的多肽的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸的)pH的酸性条件下仍保持活性,或在暴露于包括约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH4.5、pH
4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸的)pH的酸性条件后仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或
葡聚糖酶活性;或在包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下仍保持活性,或在暴露于包括约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH
12.5或更大(更碱)的碱性条件之后仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。
在一个方面,本发明核酸编码的多肽的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在至少
约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、
95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、
108℃、109℃或110℃或更高的温度下和在至少约pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性pH下仍保持活性。
[0063] 本发明提供表达盒(expression cassette)、克隆运载体或载体(例如表达载体),其包含含有本发明序列的核酸。克隆运载体可以包括病毒载体、质粒、噬菌体
(phage)、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体(bacteriophage)或人工染色体。病毒载体可以包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体。克隆运载体可以包括人工染色体,所述人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)
哺乳动物人工染色体(MAC)。
[0064] 本发明提供用于鉴定核酸的核酸探针,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中探针包含这样的核酸的至少约10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300个或更多个连续碱基,该核酸包含本发明的示例性序列或本发明的任意序列(如本文所限定),其中在一个方面(任
选地)探针包含寡核苷酸,所述寡核苷酸包含至少约10至300、约25至250、约10至50、约
20至60、约30至70、约40至80、约60至100或约50至150个或更多个连续碱基。
[0065] 本发明提供扩增引物对,其用于核酸扩增核酸,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中引物对能够扩增包含本发明示例性序列或本发明任意序列(如本文所限定)或其子序列的核酸,其中任选地扩增引物序列对的成员包含寡
核苷酸,所述寡核苷酸包含序列的至少约10至50个连续碱基,或序列的约10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个更多个连续碱基。本发明提供扩增引物对,其中所述引物对包含第一成员和第二成员,第一成员具有
本发明示例性序列或本发明任意序列(如本文所限定)的约前(5’)10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个残基所示的序列,以及第二成员含有第一成员互补链的约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个残基所示的序列。
[0066] 本发明提供编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸,其应用本发明的扩增引物对通过多核苷酸的扩增而产生,其中任选地扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行。在一个方面,所述核酸通过基因文库的扩增而产生,其中在一个方面(任选地)基因文库是环境文库。本
发明提供分离的、合成的或重组的木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其由编码木聚糖酶和/或葡聚
糖酶的核酸所编码,所述核酸应用本发明的扩增引物对通过多核苷酸的扩增而产生。本发
明提供扩增编码多肽的核酸的方法,所述多肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
活性,所述方法包括用扩增引物序列对扩增模板核酸的步骤,所述扩增引物序列对能够扩
增发明的示例性序列或本发明的任意序列(如本文所限定)或其子序列。
[0067] 本发明提供表达盒、载体或克隆运载体,其含有包含本发明序列的核酸,其中任选地克隆运载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体。病毒载体可以包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体,或人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染
色体(MAC)。
[0068] 本发明提供转化的细胞,其包含本发明的核酸或载体,或本发明的表达盒或克隆运载体。转化的细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。
[0069] 本发明提供包含本发明序列的转基因非人动物。转基因非人动物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、猪、鸡、山羊、鱼、狗或。本发明提供包含本发明序列的转基因植物,例如其中植物是玉米植株、高粱植株、铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、稻植株、大麦植株、草类或烟草植株。本发明提供包含本发明序列的转基因种子,例如其中种子是玉米种子、小麦粒、油菜、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、稻、大麦、花生或烟草植物种子。
[0070] 本发明提供反义寡核苷酸,其包含与本发明的序列(包括例如本发明的示例性序列)或其子序列互补的核酸序列,或能够与本发明的序列(包括例如本发明的示例性序列)
或其子序列在严格条件下杂交的核酸序列,其中任选地反义寡核苷酸长度为约10至50、约
20至60、约30至70、约40至80或约60至100个碱基,以及在一方面(任选地)严格条件
包括这样的洗涤步骤,其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤约15分钟。
[0071] 本发明提供抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶信息在细胞中翻译的方法,其包括给予细胞反义寡核苷酸或在细胞中表达反义寡核苷酸,所述反义寡核苷酸包含
与本发明的序列(包括例如本发明的示例性序列)互补的核酸序列或能与本发明的序列
(包括例如本发明的示例性序列)在严格条件下杂交的核酸序列。
[0072] 本发明提供含有本发明序列(包括例如本发明示例性序列)的子序列的双链抑制RNA(RNAi)分子。双链抑制RNA(RNAi)分子长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多个双链核苷酸。本发明提供抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在细胞中表达的方法,该方法包括给予细胞或在细胞中表达双链抑
制RNA(iRNA),其中所述RNA含有本发明序列(包括例如本发明示例性序列)的子序列。
[0073] 本发明提供分离的、合成的或重组的具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽或能够产生对木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异
的免疫反应的多肽(例如表位);以及在可选的方面,本发明的肽和多肽包含下列序列:
[0074] (a)所述序列包含与下列氨基酸序列具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、
70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或具有100%(完全)序列同一性的氨基酸序列:
[0075] (i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其酶促活性片段,并且具有表1中所述的至少一个氨基酸残基改变(或其等价物),或具有下列氨基酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4
个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部:氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为N(或asn或天冬酰胺);氨基酸残
基4从T(或thr或苏氨酸)变为R(或arg,或精氨酸);氨基酸残基4从T(或thr或苏氨
酸)变为H(或his或组氨酸);氨基酸残基9从P(或pro或脯氨酸)变为D(或asp或天
冬氨酸));氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或val或缬氨酸);氨基酸
残基21从F(或phe或苯丙氨酸))变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基33从L(或leu
或亮氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基38从R(或arg或精氨酸)变为H(或
his或组氨酸);氨基酸残基44从S(或ser或丝氨酸)变为T(或thr或苏氨酸);氨基酸
残基63从I(或ile或异亮氨酸))变为V(或val或缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly
或甘氨酸)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为V(或
val或缬氨酸);氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为E(或glu或谷氨酸);氨基酸
残基108从F(或phe或苯丙氨酸(phenylalaine))变为K(或lys或赖氨酸);氨基酸残基
125从Q(或gln或谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸);氨基酸残基150从V(或val或
缬氨酸)变为A(或ala或丙氨酸));氨基酸残基188从S(或ser或丝氨酸)变为E(或
glu或谷氨酸);和/或氨基酸残基189从S(或ser或丝氨酸)变为Q(或gln或谷氨酰
胺),或
[0076] (ii)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列;
[0077] 其中(i)或(ii)的多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,或所述多肽或肽能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫
原作用的多肽或肽),
[0078] (b)(a)的多肽或肽和/或其酶促活性子序列(片段),其中序列同一性如下测定:(A)通过用序列比对算法分析或通过视觉观察,或(B)在至少约20、25、30、35、40、45、50、
55、60、75、100、150、200、250、300个或更多个氨基酸残基区域上,或在多肽或肽或酶的全长上,
[0079] (c)(b)中(a)的多肽或肽,其中序列同一性通过用序列比对算法分析或通过视觉观察进行测定,以及任选地序列比对算法是2.2.2版BLAST算法,其中过滤设置被设置为
blastall-p blastp-d″nr pataa″-F F和所有其它选项被设置为默认值;
[0080] (d)权利要求1的核酸编码的氨基酸序列,其中所述多肽具有(i)木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,或(ii)具有免疫原活性,因为其能够产生特异性结合具有(a)
序列的多肽的抗体和/或其酶促活性子序列(片段);
[0081] (e)(a)至(d)的任意氨基酸序列,并且包含至少一种氨基酸残基保守替代,以及所述多肽或肽仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;
[0082] (e)(e)的氨基酸序列,其中保守替代包括用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸;用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然;用另一种酸性残基置换酸性残基;用带有酰胺基团
的另一种残基置换带有酰胺基团的残基;用另一种碱性残基交换碱性残基;或用另一种芳
香族残基置换芳香族残基,或其组合,
[0083] (f)(e)的氨基酸序列,其中脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物;酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物;包含酰胺基团的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物;碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物;或芳香族残基包括苯丙氨酸、酪氨酸或其合成的等价物;
[0084] (g)(a)至(f)的任意多肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM),
[0085] (h)(g)的多肽,其中糖结合模块(CBM)包含或组成为木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块;
[0086] (i)(a)至(h)的任意多肽,其具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,进一步包含异源序列;
[0087] (j)(i)的多肽,其中异源序列包含或组成为:(A)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合;(B),(A)的序列,其中异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)衍生自异源木质纤维素酶;和/或(C)标记、表位、靶向肽、
可切割序列、可检测部分或酶;
[0088] (k)(i)或(j)的多肽,其中异源序列或异源糖结合模块(CBM)包含或组成为木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块;
[0089] (l)(i)的多肽,其中异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒;或
[0090] (m)包含本发明任意核酸序列编码的氨基酸序列。
[0091] 在一个方面,本发明的分离的、合成的或重组的肽具有木聚糖酶活性,例如其中木聚糖酶活性包括催化内部β-1,4-木糖苷键水解;包括内-1,4-β-木聚糖酶活性;包
括水解木聚糖或阿拉伯木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体;包括水解含有1,
4-β-糖苷连接的D-吡喃木糖的多糖;包括水解纤维素或半纤维素;包括水解木材、木制
品、纸浆、纸制品或废纸中的纤维素或半纤维素;包括催化饲料或食品中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解;或包括催化微生物细胞或植物细胞中木聚糖或阿拉伯木聚糖水解。木聚糖可以
包括阿拉伯木聚糖,例如水溶性阿拉伯木聚糖,例如在面团或面包产品中的水溶性阿拉伯
木聚糖。
[0092] 在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性包括水解例如包含1,4-β-糖苷连接的D-吡喃木糖的多糖,或水解半纤维素,例如水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中的半纤维素。
[0093] 在一个方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性包括催化饲料或食品如基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、乳或乳制品、水果或蔬菜中的多糖例如木聚糖的水
解。在一个方面,木聚糖酶活性包括催化微生物细胞或植物细胞中木聚糖的水解。
[0094] 本发明提供分离的、合成的或重组的多肽,其包含本发明的多肽并且缺少信号序列或前原序列。本发明提供分离的、合成的或重组的多肽,其包含本发明的多肽并且具有异源信号序列或异源前原序列。
[0095] 在一个方面,本发明的多肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其包括在下列范围内约37℃下的比活性:每毫克蛋白约100至约1000单位、每毫克蛋白约500至约750单位、每毫克蛋白约500至约1200单位或每毫克蛋白约750至约1000单位。在
一个方面,单位被限定为0.1至20单位/g的纸浆,其中单位等于如下面详细描述的Nelson
Somogyi试验中所述应用阿拉伯木聚糖作为底物每mg酶每分钟释放的木糖的umol。在可
选的方面,本发明的多肽具有下列范围内的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性:每克纸浆约0.05至20单位,或每克纸浆0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、
0.90、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19或20或更多单位(其中单位等于如Nelson Somogyi试验中所述应用阿拉伯
木聚糖作为底物每mg酶每分钟释放的木糖的umol)。
[0096] 在一个方面,耐热性包括,在被加热到高温,如在约0℃至约20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约80℃、约80℃至
约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更
高的温度之后,仍保持37℃下的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的比活性的至少一
半。耐热性可以包括,在被加热到高温,如在约0℃至约20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约80℃、约80℃至约85℃、约85℃
至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高的温度之后,仍保持每毫克蛋白约500到约1200单位范围内的37℃下的比活性。
[0097] 在一个方面,本发明的多肽包含至少一个糖基化位点或进一步包含多糖。糖基化可以是N-连接的糖基化,例如其中多肽在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母
(S.pombe)中被表达后被糖基化。
[0098] 在一个方面,本发明多肽的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在包括大约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0或更小(更酸)的酸性条件下仍保持活性,或在暴露于包括大约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0或更小(更酸)的酸性
条件后仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性;或在包括大约pH 7、pH 7.5、pH
8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件下仍保持活性,或在暴露于包括大约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱)的碱性条件后仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。在一个方面,本发明多肽的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性在至少约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、
88℃、89℃或90℃的温度和至少约pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或大(更碱)的碱性pH下仍保持活性。
[0099] 本发明提供包含本发明多肽的蛋白质制剂,其中蛋白质制剂包括液体、浆液、固体或凝胶。本发明提供包含本发明多肽和第二结构域的异二聚体。第二结构域可以是多肽以及异二聚体是融合蛋白。第二结构域可以是表位或标标记。本发明提供包含本发明多肽的
同型二聚体或异二聚体。本发明提供固定化多肽,其中所述多肽包含本发明的序列、或其子序列、或本发明核酸编码的多肽、或包含本发明多肽和第二结构域的多肽,例如其中多肽被固定化在细胞、小泡、脂质体、薄膜、膜、金属、树脂聚合物、陶瓷、玻璃、微电极石墨颗粒、珠子、凝胶、板、阵列、毛细管、晶体、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝块(agglomerate)、表面、多孔结构或材料如木屑、粗浆(brownstock)、浆、纸和衍生自其的材料之上或之内。
[0100] 本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶可以单独或作为木聚糖酶和/或葡聚糖酶和其它水解酶如纤维素酶、甘露聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶或氧化还原酶如漆酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、氧化酶或还原酶的混合物(“鸡尾酒”)来使用或配制。它们可以配制成固体形式如粉末、冻干制剂、颗粒、片剂、条、晶体、胶囊、丸、丸粒,或液体形式如水溶液、气溶胶、凝胶、糊、浆、水/油乳状液、乳剂、胶囊、或小泡或胶束悬浮液。本发明的制剂可以包括任何下述组分或它们的组合:多元醇如聚乙二醇、聚乙烯醇、丙三醇,糖类如蔗糖、山梨醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖;胶凝剂如瓜尔树胶、鹿菜胶、藻酸盐、葡聚糖、纤维素衍生物、果胶;盐如氯化钠硫酸钠、硫酸铵、氯化、氯化镁、氯化锌、硫酸锌、脂肪酸及其衍生物的盐;金属螯合剂如EDTA、EGTA、柠檬酸钠;抗微生物剂如脂肪酸或其衍生物、对羟基苯甲酸酯、山梨酸酯、苯甲酸盐;抑制酶如蛋白酶作用的其它调节化合物、大体积蛋白质(bulkprotein),诸如BSA、小麦水解产物、酸盐化合物、氨基酸或肽、适合的pH或温度调节化合物;乳化剂如非离子型和/或离子型洗涤剂;氧化还原剂如胱氨酸/半胱氨酸、谷胱
甘肽、氧化谷胱甘肽;还原的或抗氧化的化合物如抗坏血酸;或分散剂。交联和蛋白质修饰如聚乙二醇化、脂肪酸修饰、糖基化也可以用于提高酶的稳定性。
[0101] 本发明提供包含本发明固定的多肽(或多种)和/或核酸的阵列以及包含本发明固定的寡核苷酸的阵列。本发明的酶、其片段和编码酶的核酸、或探针和其片段可以附
于固体支持物上;并且这些实施方式对于工业、医学、研究、药学、食品和饲料以及食品和饲料补充剂加工和其它应用及过程中本发明酶和核酸的使用可以是经济的且有效的。例如,
酶(或其活性片段)的聚生体或混合物——其用于特定的化学反应——可以附于固体支持
物,并且浸于处理容器中。酶反应可以进行。随后,可以将固体支持物从容器中取出,同时取出的是固定在支持物上的酶,用于重复使用。在本发明的一个实施方式中,将分离的核酸附着于固体支持物。在本发明的另一个实施方式中,固体支持物选自凝胶、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极以及它们的任意组合。
[0102] 例如,用于本发明的固体支持物包括凝胶。凝胶的一些例子包括琼脂糖(Sepharose)、明胶、戊二醛、壳聚糖-处理的戊二醛、清蛋白-戊二醛、壳聚糖-黄原胶、
toyopearl胶(聚合胶)、藻酸盐、藻酸盐-聚赖氨酸、角叉菜胶、琼脂糖、乙二醛琼脂糖
(glyoxyl agarose)、磁性琼脂糖、葡聚糖-琼脂糖、聚(氨基甲酰磺酸盐)水凝胶、BSA-PEG水凝胶、磷酸化的聚乙烯醇(PVA)、单氨基乙基-N-氨基乙基(MANA)、氨基,或者它们的
任何组合。用于本发明的另一固体支持物是树脂或者聚合物。树脂或者聚合物的一些
TM
例子包括纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造纤维、聚酯、阴离子交换树脂、AMBERLITE XAD-7、TM TM TM
AMBERLITE XAD-8、AMBERLITE IRA-94、AMBERLITE IRC-50、聚乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯或者它们的任何组合。用于本发明的另一类固体支持物是陶瓷。一些例子包括无孔陶
瓷、多孔陶瓷、SiO2、Al2O3。用于本发明的另一类固体支持物是玻璃。一些例子包括无孔玻璃、多孔玻璃、氨丙基玻璃或者它们的任何组合。可以应用的另一类型固体支持物是微电
极。例子是聚乙烯亚胺涂覆的磁。石墨颗粒可以用作固体支持物。固体支持物的另一个
实例是细胞,如红细胞。
[0103] 有许多本领域技术人员已知的用于将酶或者其片段,或者核酸固定在固体支持物上的方法。这样的方法的一些例子包括:产生静电液滴的方法、电化学方法,通过吸收、通过共价结合、通过交联、通过化学反应或者化学方法、通过封装、通过捕集、通过藻酸钙,或者通过聚(2-甲基丙烯酸羟基乙酯)进行固定化的方法。类似的方法在下述文献中描
述:Methods in Enzymology,Immobilized Enzymes and Cells,Part C.1987.Academic Press.S.P.Colowick和N.O.Kaplan编辑,Volume 136;和Immobilization ofEnzymes
and Cells.1997.Humana Press.Edited,G.F.Bickerstaff 编 辑 .Series:Methods
inBiotechnology,由J.M.Walker编辑。
[0104] 本发明提供分离的、合成的或重组的抗体,其与本发明的多肽特异性结合。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体、或是单链抗体。本发明提供包含抗体的杂交瘤,所述抗体与本发明的多肽特异性结合。
[0105] 本发明提供分离或鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的方法,该方法包括如下步骤:(a)提供本发明的抗体;(b)提供包括多肽的样品;和(c)将步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体在所述抗体能与所述多肽特异性结合的条件下接触,从而
分离或鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽。本发明提供制备抗木
聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体的方法,该方法包括以足以产生体液免疫应答的量给予非人
动物本发明的核酸或其子序列,从而制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体。本发明提供
产生抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体的方法,该方法包括以足以产生体液免疫应答的量
给予非人动物本发明的多肽或其子序列,从而制备抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶抗体。
[0106] 本发明提供产生重组多肽的方法,包括如下步骤:(a)提供与启动子可操作地连接的核酸,其中所述核酸包含本发明的序列;和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)
的核酸,从而产生重组多肽。该方法可进一步包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞,随后表达步骤(a)的核酸,从而在转化细胞中产生重组多肽。
[0107] 本发明提供用于鉴定具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的方法,该方法包括:(a)提供本发明的多肽;(b)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物;和(c)将所述多肽与步骤(b)的底物接触,并且检测底物量的降低或反应产物量的增
加,其中底物量的降低或反应产物量的增加检测出具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚
糖酶活性的多肽。
[0108] 本发明提供用于鉴定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物的方法,包括:(a)提供本发明的多肽;(b)提供测试底物;和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试底
物接触,并且检测底物量的降低或反应产物量的增加,其中底物量的降低或反应产物量的
增加鉴定出作为木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物的测试底物。
[0109] 本发明提供确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法,包括:(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包括核酸的载体,其中所述核酸具有本发明的序列;(b)提供测试化合物;(c)将多肽与测试化合物接触;和(d)确定步骤(b)的测试化合物是否与
多肽特异性结合。
[0110] 本发明提供确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法,包括:(a)提供本发明的多肽;(b)提供测试化合物;(c)将多肽与测试化合物接触;和(d)确定步骤(b)的测
试化合物是否与多肽特异性结合。
[0111] 本发明提供用于鉴定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的调节剂的方法,包括:(a)提供本发明的多肽;(b)提供测试化合物;和(c)将步骤(a)的多肽与步骤
(b)的测试化合物接触,并测定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的活性,其中在存在
测试化合物的情况下测定的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性——与不存在测试
化合物的情况下的活性相比的变化,确定了该测试化合物调节木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶活性。木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,可以通过提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物,并检测底物量的降低或反应产物量的增加,或底物量的增
加或反应产物量的降低来测量。在一方面,与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比,有测试化合物时底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶活性的激活剂的测试化合物。在一个方面,与没有测试化合物时底物或反应产
物量相比,有测试化合物时底物量的增加或反应产物量的降低鉴定出作为木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的抑制剂的测试化合物。
[0112] 本发明提供计算机系统,该系统包括处理器和数据存储设备,其中所述数据存储设备上已经存储了多肽序列或核酸序列,其中多肽序列包含本发明的序列、本发明的核酸
编码的多肽。计算机系统可以进一步包括序列比对算法和数据存储设备,所述数据存储设
备上已经存储了至少一个参考序列。另一方面,序列比对算法包括指出多态现象(多态性)
计算机程序。一方面,计算机系统可以进一步包括在所述序列中鉴定一个或多个特征的
鉴定器(标识符,identifier)。本发明提供了计算机可读介质,其上已经存储了本发明的
多肽序列或核酸序列。本发明提供了用于鉴定序列中的特征的方法,包括如下步骤:(a)使用鉴定序列中的一个或多个特征的计算机程序读取序列,其中所述序列包括本发明的多肽
序列或核酸序列;和(b)用所述计算机程序鉴定序列中的一个或多个特征。本发明提供了
将第一序列与第二序列进行比较的方法,包括如下步骤:(a)通过使用比较序列的计算机
程序读取第一序列和第二序列,其中第一序列包括本发明的多肽序列或核酸序列;和(b)
用所述计算机程序确定第一序列和第二序列之间的差异。确定第一序列和第二序列之间差
异的步骤可以进一步包括鉴定多态性的步骤。一方面,该方法可以进一步包括可鉴定序列
中的一个或多个特征的鉴定器。另一方面,该方法可以包括使用计算机程序读取第一序列,并鉴定该序列中的一个或多个特征。
[0113] 本发明提供从环境样品中分离或回收核酸的方法,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,该方法包括如下步骤:(a)提供用于扩增编码具有
木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列对,其中所述引
物对能够扩增本发明的核酸;(b)从环境样品中分离核酸或处理环境样品,以便样品中的
核酸可达到与扩增引物对杂交;和(c)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对结合,并
从环境样品中扩增核酸,从而从环境样品中分离或回收编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸。扩增引物序列对中一个或每一成员可以包含寡核苷酸,该
寡核苷酸包含本发明序列的至少约10至50个连续碱基。在一个方面,所述扩增引物序列
对是本发明的扩增对。
[0114] 本发明提供从环境样品中分离或回收核酸的方法,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,该方法包括如下步骤:(a)提供包含本发明核酸或
其子序列的多核苷酸探针;(b)从环境样品中分离核酸或处理环境样品,以便样品中的核
酸可达到与步骤(a)的多核苷酸探针杂交;(c)将步骤(b)分离的核酸或处理的环境样品
与步骤(a)的多核苷酸探针结合;和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异性杂交的核
酸,从而从环境样品中分离或回收编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的
多肽的核酸。环境样品可以包含水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品。在一个方面,生物样品可以源自细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
[0115] 本发明提供产生编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸的变体的方法,包括以下步骤:(a)提供包含本发明核酸的模板核酸;和(b)在模板序列
中修饰、缺失或者添加一个或者多个核苷酸,或其组合,以产生模板核酸的变体。在一个
方面,该方法进一步包括表达变体核酸,以产生变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶多肽。修饰、添加或者缺失由包括易错PCR(error-prone PCR)、重排(shuffling)、寡
核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)、装配PCR(assemblyPCR)、
有性PCR诱变(sexual PCR mutagenesis)、体内诱变(in vivo mutagenesis)、盒式诱
变(cassette mutagenesis)、回归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)、指
数整体诱变(exponential ensemble mutagenesis)、位点特异性诱变(site-specific
mutagenesis)、基因重装配(gene reassembly,例如GeneReassembly,参见例如美国专
利号6,537,776)、基因位点饱和诱变(Gene Site Saturation Mutagenesis,GSSM)、合
成连接重装配(syntheticligation reassembly,SLR)或其组合的方法来引入。在另一
个方面,修饰、添加或者缺失通过包括下述的方法引入:重组、回归序列重组(recursive sequence recombination)、硫代磷酸酯-修饰的DNA诱变(phosphothioate-modified
DNA mutagenesis)、含尿嘧啶的模板诱变(uracil-containing template mutagenesis)、
缺口二重诱变(gapped duplexmutagenesis)、点错配修复诱变(point mismatch repair
mutagenesis)、修复-缺陷型宿主株诱变(repair-deficient host strain mutagenesis)、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制-选择诱变(restriction-selection mutagenesis)、限制-纯化诱变(restriction-purificationmutagenesis)、人工基因合成(artificial
gene synthesis)、整体诱变(ensemble mutagenesis)、嵌合核酸多聚体生成(chimeric
nucleic acid multimer creation)和其组合。
[0116] 在一方面,该方法可以被反复重复,直到产生与模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶。
在一方面,变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽是耐热的,在暴露于高温度之后仍保留一些活性。在另一个方面,与模板核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶相比,变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽具有增加的糖基化。可选地,所述变体木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽,在高温下具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或
葡聚糖酶活性,其中由模板核酸编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在高温下没有
活性。在一个方面,该方法可以被反复重复,直到产生具有与模板核酸的密码子使用有所改变的密码子使用的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶编码序列。在另一个方面,该方
法可以被反复重复,直到产生具有比模板核酸的信息表达或稳定性更高或更低水平的信息
表达或稳定性的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶基因。在另一个方面,最终的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶产品的制剂能够增加或调节木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡
聚糖酶在产品中的性能。
[0117] 本发明提供了在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中表达的方法,该方法包括:(a)提供编码具有木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的本发明的核酸;和(b)鉴定步骤(a)的核
酸中非优选或较不优选的密码子,用优选的或中度使用(neutrally used)的密码子来代
替之,所述优选或中度使用的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸,其中优选密码
子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子,非优选或较不优选密码子是在宿
主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子,从而修饰核酸以增加其在宿主细胞中的表
达。
[0118] 本发明提供了在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子的方法,该方法包括:(a)提供本发明的核酸;和(b)鉴定步骤(a)的核酸
中的密码子,并用不同的密码子来代替,所述不同的密码子编码与被代替的密码子相同的
氨基酸,从而修饰在编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸中的密码子。
[0119] 本发明提供了在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中的表达的方法,该方法包括:(a)提供编码木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的本发明核酸;和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的非优选
或较不优选密码子,并用优选的或中度使用的密码子来代替之,所述优选或中度使用的密
码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸,其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序
列中过度表现的密码子,非优选或较不优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现
不足的密码子,从而修饰核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
[0120] 本发明提供了在编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以降低其在宿主细胞中的表达的方法,该方法包括:(a)提供本发明的核
酸;和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的至少一个优选密码子,并用非优选的或较不优选的密码
子来代替,所述非优选或较不优选的密码子与被代替的密码子编码相同的氨基酸,其中优
选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子,非优选或较不优选的密码
子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子,从而修饰核酸以降低其在宿主细
胞中的表达。一方面,宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
[0121] 本发明提供了用于产生核酸文库的方法,所述核酸文库编码一系列被修饰的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或底物结合位点,其中被修饰的活性位点或底
物结合位点来源于第一核酸,所述第一核酸包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的
序列,该方法包括:(a)提供第一核酸,其编码第一活性位点或第一底物结合位点,其中所述第一核酸序列包含在严格条件下与本发明的序列或其子序列杂交的序列,以及所述核酸
编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶底物结合位点;(b)提供一组诱变寡核苷酸,其在第一核酸的多个目标密码子处编码天
然发生的氨基酸变体;和(c)使用该组诱变寡核苷酸,产生一组编码活性位点或编码底物
结合位点的变体核酸,其在被诱变的每一氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变异,从
而产生编码多个被修饰的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性位点或底物结合位点
的核酸文库。一方面,该方法包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核酸:优
化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)或合成连接重装配(SLR)。一方面,该方法
包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核酸或变体:易错PCR、重排、寡核苷酸
定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、回归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配(GeneReassembly,美国专利号6,537,776)、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)及其组合。一方面,该方法包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核酸或变体:重组、回归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧
啶的模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成及其组合。
[0122] 本发明提供了产生小分子的方法,包括如下步骤:(a)提供多个能合成或修饰小分子的生物合成酶,其中这些酶中的一种酶包含由本发明的核酸编码的木聚糖酶、甘露聚
糖酶和/或葡聚糖酶;(b)为步骤(a)的至少一种酶提供底物;和(c)将步骤(b)的底物与
这些酶在能促进多个生物催化反应的条件下通过一系列生物催化反应进行反应,以产生小
分子。本发明提供了修饰小分子的方法,包括:(a)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚
糖酶,其中该酶包含本发明的多肽,或由本发明的核酸或其子序列编码的多肽;(b)提供小分子;和(c)将步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子在能促进木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡
聚糖酶催化的酶促反应的条件下进行反应,从而通过木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶酶促反应修饰小分子。一方面,该方法可以包含步骤(a)的酶的多个小分子底物,从而产生通过由木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶催化的至少一种酶促反应产生的被修饰小
分子的文库。一方面,该方法可以包含多种其它的酶,在有助于这些酶的多个生物催化反应的条件下使用,以形成由多个酶促反应产生的被修饰小分子的文库。另一方面,该方法可以进一步包括测试该文库以确定该文库中是否存在表现出期望活性的特定被修饰小分子的
步骤。测试该文库的步骤可以进一步包括系统地去除所有但保留一个用于产生文库中多个
被修饰小分子中的一部分的生物催化反应,方法是通过测试被修饰小分子的所述部分中存
在或不存在具有期望活性的特定被修饰小分子,并鉴定出产生具有期望活性的特定修饰小
分子的至少一个特定生物催化反应。
[0123] 本发明提供了确定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的功能片段的方法,包括如下步骤:(a)提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中该酶包含本发明的多肽
或由本发明核酸或其子序列编码的多肽;和(b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基,并
测试剩余子序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,从而确定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的功能片段。一方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性通过
提供木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加
来测量。
[0124] 本发明提供了通过使用实时代谢流(real-time metabolic flux)分析进行新的或修饰的表型的全细胞工程改造的方法,该方法包括:(a)通过修饰细胞的遗传组成产生
修饰的细胞,其中所述遗传组成通过将本发明的核酸加入到细胞来修饰;(b)培养修饰的
细胞以产生多个修饰的细胞;(c)通过实时监控步骤(b)的细胞培养物来测量该细胞的至
少一个代谢参数;和(d)分析步骤(c)的数据,以确定被测量的参数是否与在类似条件下
未修饰细胞中的参照测量值不同,从而使用实时代谢流量分析鉴定细胞中的工程改造的表
型。一方面,细胞的遗传组成可以通过包括在细胞中序列的删除或序列的修饰,或敲除基因的表达的方法来修饰。一方面,该方法可以进一步包括选择含有新工程改造的表型的细胞。
另一方面,该方法可以包括培养被选择的细胞,从而产生包含新工程改造的表型的新细胞
株。
[0125] 本发明提供了分离的、合成的或重组的信号序列,其组成为或包含在本发明多肽的残基1至12、1至13、1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、
1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至29、1至30、1至31、1至32、
1至33、1至34、1至35、1至36、1至37、1至38、1至40、1至41、1至42、1至43或1至44
中所述的序列,包括本发明的示例性多肽序列。
[0126] 本发明提供包含至少第一结构域和至少第二结构域的嵌合多肽,第一结构域包含信号肽(SP),第二结构域包含含有本发明序列或其子序列的异源多肽或肽,其中异源多肽
或肽与信号肽(SP)之间没有天然的联系。一方面,信号肽(SP)的来源不是木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶。异源多肽或者肽可以在信号肽(SP)或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶催化结构域(CD)的氨基末端、羧基末端或者羧基和氨基末端。本发明提供编码
嵌合多肽的分离的、合成的或者重组的核酸,其中嵌合多肽包括至少第一结构域和至少第
二结构域,第一结构域含有信号肽(SP),第二结构域包含含有本发明序列或其子序列的异
源多肽或者肽,其中异源多肽或肽与信号肽(SP)之间没有天然的联系。
[0127] 本发明提供了增加木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性的方法,该方法包括糖基化木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽,其中该多肽包含本发明多肽或由本发明核酸序列编码的多肽的至少30个连续氨基酸,从而增加木聚糖酶、
甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性。一方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和
/或葡聚糖酶比活性可以在大于下列温度的温度范围内是热稳定的或耐热的:约0℃至约
20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约
80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃
至约110℃或更高温度。
[0128] 本发明提供了在细胞中过量表达重组木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽的方法,该方法包括表达含有核酸的载体,该核酸包含本发明的核酸或本发明的核酸序列,其中序列同一性通过使用序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定,其中过量表达通过
使用高活性启动子、双顺反子(dicistronic)载体或通过该载体的基因扩增来实现。
[0129] 本发明提供了产生转基因植物和种子的方法,该方法包括:(a)将异源核酸序列引入细胞中,其中异源核酸序列包括本发明的核酸序列,从而产生转化的植物或种子细胞;
和(b)从转化的细胞或种子产生转基因植物。在一个方面,步骤(a)可以进一步包括通过
植物细胞原生质体的电穿孔或微注射而引入异源核酸序列。在另一个方面中,步骤(a)可
进一步包括通过DNA颗粒轰击而直接将异源核酸序列引入到植物组织。可选地,步骤(a)
可进一步包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主将异源核酸序列引入植
物细胞DNA中。在一个方面,植物细胞可以是马铃薯、玉米、水稻、小麦、烟草或大麦细胞。
[0130] 本发明提供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法,该方法包括:(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序列转化植物细胞,其中异源核酸序列包括本发明的核酸;
(b)在异源核酸序列可在植物细胞中表达的条件下培养所述植物。本发明提供了在植物细
胞中表达异源核酸序列的方法,该方法包括:(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序
列转化植物细胞,其中异源核酸序列包括本发明的序列;(b)在异源核酸序列可在植物细
胞中表达的条件下培养所述植物。
[0131] 本发明提供水解、分解或破坏含木聚糖的组合物的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明的多肽,或本发明的核酸编码的多肽;(b)提供含木聚糖的组合物;和(c)在木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶水解、分解或破坏含木聚糖的组合物的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。一方面,
所述组合物包括植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。因此,所述组合物可包括任何植物或植物部分、任何含木聚糖的食品或饲料,废产品等。
[0132] 本发明提供液化或去除含木聚糖的组合物的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶活性的本发明多肽,或由本发明核酸编码的多肽;(b)提供含有木聚糖的组合物;和(c)在木聚糖酶去除、软化或液化含木聚糖的组合物的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤
(b)的组合物接触。
[0133] 本发明提供了包含本发明多肽或本发明核酸编码的多肽的洗涤剂组合物,其中多肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性。木聚糖酶可以是非表面活性的木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶或表面活性的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶。木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶可被配制成不含水的液体组合物、铸型固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片剂、凝胶形式、糊剂或浆液的形式。本发明提供了洗涤物体的方法,该方法包括:(a)提供包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽或由本发
明核酸编码的多肽的组合物;(b)提供物体;和(c)在组合物可洗涤物体的条件下,将步骤
(a)的多肽与步骤(b)的物体接触。
[0134] 本发明提供了纺织品或织物,包括例如线,其包含本发明多肽或本发明核酸编码的多肽。一方面,所述纺织品或织物包括含有木聚糖的纤维。本发明提供了处理纺织品或
织物的方法(例如从组合物上去除污物),该方法包括:(a)提供组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸编码的多肽;(b)提供包
含木聚糖的纺织品或织物;和(c)在木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶可以处理纺织
品或织物(例如去除污物)的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。本发
明提供了改进织物饰面(finish)的方法,该方法包括:(a)提供组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸编码的多肽;(b)提供织
物;和(c)在多肽可以处理织物从而改进织物饰面的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤(b)
的织物接触。一方面,所述织物是毛料或丝绸。另一方面,织物是纤维素纤维或天然纤维和合成纤维的掺合物。
[0135] 本发明提供饲料或食物,其包含本发明多肽或本发明核酸编码的多肽。本发明提供了在动物食用之前,在饲料或食物中水解木聚糖的方法,该方法包括:(a)获得饲料原料,其包含本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或本发明核酸编码的木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;和(b)添加步骤(a)的多肽至饲料或食物原料,加入的量
足以在足够长的时间内水解木聚糖并且形成处理的食物或饲料,从而在动物食用之前,在
食物或饲料中水解木聚糖。一方面,本发明提供在动物食用之后,在饲料或食物中水解木聚糖的方法,该方法包括:(a)获得饲料原料,其包含本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或本发明核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;(b)添加步骤(a)的
多肽至饲料或食物原料;和(c)将饲料或食物原料给予动物,其中在食用后,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶引起在动物消化道内的饲料或食物中木聚糖的水解。食物或饲料
可以是例如谷类、谷物、玉米等等。
[0136] 本发明提供面团或面包制品,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽包含本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段。本发明提供面团调理的方法,其包括在足以调理面团的条件下,使面团或面包制品与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽接触,其中
所述多肽包含本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片
段。
[0137] 本发明提供饮料,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽包含本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码。本发明提供饮料生产的方法,包括在足以降低饮料粘性的条件下将具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或
葡聚糖酶活性的至少一种多肽——其中所述多肽包含本发明的序列,或所述多肽由包含本
发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段——施用到饮料或饮料前体,其中一方面(任选
地),饮料或饮料前体是麦芽汁或啤酒。
[0138] 本发明提供用于动物的食物或营养补充物,其包含本发明的多肽,例如本发明核酸编码的多肽。在一个方面,食物或营养补充物中的多肽可以被糖基化。本发明提供了可
食用的酶输送基质,其含有本发明的多肽,例如,由本发明的核酸编码的多肽。一方面,该输送基质包括丸剂。一方面,多肽可被糖基化。一方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是耐热的。另一方面,木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性是热稳定的。
[0139] 本发明提供了含有本发明多肽的食物、饲料或营养补充物。本发明提供了将木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶用作动物膳食中的营养补充物的方法,所述方法包括:制备含有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的营养补充物,所述酶包含本发明多肽的至
少30个连续氨基酸;以及给予动物所述营养补充物用以增加包含在被动物摄取的饲料或
食品中的木聚糖的利用。动物可以是人、反刍动物或单胃动物。通过在选自细菌、酵母、
植物、昆虫、真菌和动物的生物体中表达编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的多
核苷酸,可以制备木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶。生物体可以选自粟酒裂殖酵母
(S.pombe)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌属某种(Pseudomonas sp.)、大肠杆菌(E.coli.)、链霉菌属某种(Streptomyces sp.)、杆菌属某种(Bacillus sp.)和乳酸杆菌属某种(Lactobacillus sp.)。
[0140] 本发明提供了可食用的酶输送基质,其包含热稳定的重组木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,例如本发明的多肽。本发明提供了向动物输送木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶补充物的方法,所述方法包括:制备丸剂形式的可食用的酶输送基质,其包含粒状可食用载体以及热稳定的重组的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,其中所述丸剂
容易将包含在其中的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶分散入含水介质中,以及给予
所述动物该可食用酶输送基质。重组的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶可以包括本
发明的多肽。颗粒状可食用载体可包括选自如下的载体:谷物胚芽,无油谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵花籽粕和次粉(wheat midd)。可食用载体可包含无油谷物胚芽。木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶可被糖基化,以在压丸条件下提供热稳定性。
该输送基质可以通过对含有谷物胚芽和木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的混合物进
行压丸而形成。压丸条件可包括蒸汽的应用。压丸条件可包括应用超过约80℃的温度约5
分钟,而该酶保持每毫克酶至少大约350到大约900单位的比活性。
[0141] 本发明提供了改善乳制品质地和味的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;(b)提供乳制品;和(c)将步骤(a)的多肽和步骤(b)的乳制品在其
中所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶可以改善所述乳制品的质地和风味的条件下
接触。一方面,乳制品包括奶酪或酸奶酪。本发明提供了包含本发明的或由本发明核酸编
码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的乳制品。
[0142] 本发明提供了改善从富油植物原料提取油的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;(b)提供富油植物原料;和(c)将步骤(a)的多肽与富油植物原
料接触。一方面,富油植物原料包括富油种子。所述油可以是大豆油橄榄油菜籽油(油菜)或葵花油。
[0143] 本发明提供了用于制备水果汁或蔬菜汁、糖浆、浓汤或提取物的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸
编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;(b)提供包含水果或蔬菜原料的组合物或液
体;和(c)将步骤(a)的多肽与组合物接触,从而制备水果或蔬菜汁、糖浆、浓汤或提取物。
[0144] 本发明提供了包含本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或本发明的核酸编码的多肽的纸或纸制品或纸浆。本发明提供了用于处理生物质例如任意纸或纸浆或
木浆的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发
明的多肽,或本发明的核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶;(b)提供包含纸
或纸浆或木浆的组合物,例如生物质;和(c)在其中木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
能处理纸或纸浆或木浆的条件下,将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。
[0145] 本发明提供在纸或纸制品、废纸、木材、木浆或木制品或木材或纸再生组合物中减少木质素量(去木质素化)或溶解木质素的方法,包括使纸或纸制品、木材、木浆或木制品或木材或纸再生组合物与本发明的多肽或其酶促活性片段接触。
[0146] 本发明提供水解木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸中半纤维素的方法,包括使木材、木制品、纸浆、纸制品或废纸与本发明的多肽或其酶促活性片段接触。
[0147] 本发明提供纸、大麻或亚麻浆酶促脱色(例如漂白)的方法,包括使纸、大麻或亚麻浆与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶和脱色(例如漂白)剂接触,其中木聚糖酶、
甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包含本发明的多肽或其酶促活性片段。脱色(例如漂白)剂可
以包括过氧化氧或过氧化氢。
[0148] 本发明提供脱色(例如漂白)木质纤维素浆的方法,包括使木质纤维素浆与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶接触,其中木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包括本
发明的多肽或其酶促活性片段。
[0149] 本发明提供纸、废纸、纸再生的产品的酶促脱墨的方法、从非接触性印刷废纸或非接触性和接触性印刷废纸的混合物中脱去墨粉的方法,包括使纸、废纸、纸再生的产品、非接触性印刷废纸或接触性印刷废纸与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶接触,其中木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包括本发明的多肽或其酶促活性片段。
[0150] 本发明提供脱色(例如漂白)线、织物、纱、布料或纺织品的方法,包括使织物、纱、布料或纺织品与木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在适于产生纺织品变白的条件下接触,其中木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包括本发明的多肽或其酶促活性片段。线、织物、纱、布料或纺织品可以包括非棉纤维素线、织物、纱、布料或纺织品。本发明提供织物、纱、布料或纺织品,其包含具有本发明序列的多肽或由包含本发明序列的核酸编码的多肽
或其酶促活性片段,其中一方面(任选地),织物、纱、布料或纺织品包括非棉纤维素织物、纱、布料或纺织品。
[0151] 本发明提供报纸脱色(例如漂白)或脱墨的方法,包括接触报纸,其中木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶包括本发明的多肽或其酶促活性片段。
[0152] 本发明提供木材、木屑、木浆、木制品、纸浆、纸制品、报纸或废纸,其包含本发明的多肽或其酶促活性片段。本发明提供线、织物、纱、布料或纺织品,其包含本发明的多肽或其酶促活性片段。
[0153] 本发明提供减少木材或木制品中木质素的方法,包括使木材或木制品与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽具有本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段。
[0154] 本发明提供在高温和碱性pH条件下减少生物质中,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中木质素的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少约80℃、85℃、90℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下仍保持木聚糖
酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包含具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含本发明序列的核酸
编码,或其酶促活性片段;(b)提供包含木质素的生物质,例如包含木质素的木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约80℃、85℃、90℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)
的碱性pH的条件下与步骤(a)的多肽接触,其中所述多肽减少包含木质素的生物质,例如
在木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的木质素。
[0155] 本发明提供在高温和碱性pH条件下处理包含木质素的生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸制品、纸或纸浆的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少约80℃、85℃、90℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下仍保持木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包括具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含本发明序列
的核酸编码,或其酶促活性片段;(b)提供包含木质素的生物质例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约80℃、
85℃、90℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH
的条件下与步骤(a)的多肽的接触,其中所述多肽催化包含木质素的生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,以及其中在一个方面(任选地),木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆包括软木材和硬木材,或木材、木浆、牛皮纸浆、纸或纸浆源自软木材和硬木材;以及其中在一个方面(任选地),在处理后,所述浆具有至少约10%
或至少约32%的稠度。
[0156] 本发明提供在高温和碱性pH条件下对生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆脱色的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少约80℃、85℃、90℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下仍保持木聚糖酶、甘露聚
糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包括具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/
或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段;(b)提供生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、
94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、
107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 9.5、pH 10.0、pH 10.5、pH 11、pH
12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下与步骤(a)的多肽接触,其中所述多肽催化
生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而对生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆脱色(例如漂白)。
[0157] 本发明提供高温和碱性pH条件下减少生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆脱色(例如漂白)过程中脱色(例如漂白)化学品的使用的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述
多肽在包括至少约80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、
100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下仍保持木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包括具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含本发明序列
的核酸编码,或其酶促活性片段;(b)提供生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约80℃、85℃、90℃、
91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、
104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 10.5、pH 11、pH 12、pH 12.5或更大(碱)的碱性pH的条件下与步骤(a)的多肽接触,其中所述多肽催化生物
质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而对生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆进行生物漂白以及减少脱色(例如漂白)过程中脱色(例如漂白)化学品的使用;其中在一个方面(任选地),脱色(例如漂白)化学品包括氯、
二氧化氯、苛性碱(caustic)、过氧化物或其任意组合。
[0158] 本发明提供在高温和碱性pH条件下纸或浆脱墨的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少
约80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、
99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
活性,其中所述多肽包括具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段;(b)
提供含墨的生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约85℃的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的多肽接触,其中所述多肽催化生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸或纸浆中的化合物的水解,从而促进生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的脱墨。
[0159] 本发明提供在高温和碱性pH条件下从生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中释放木质素的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少约80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、
89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、
103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包括
具有本发明序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或
葡聚糖酶由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段;(b)提供含木质素的生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使步骤(b)的木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆在包括至少约80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、
94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、
107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)
的多肽接触,其中所述多肽催化木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆中的化合物的水解,从而促进木质素从生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的释放;其中一方面(任选地),在处理后,所述浆具有约10%的稠度。
[0160] 本发明提供包含生物质,例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆的组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段,其中一方面(例如任选地),生物质例如木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆包括软木材和硬木材,或木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆——源自软木材和硬木材。
[0161] 本发明提供制造乙醇的方法,包括使含淀粉的组合物与具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽接触,其中所述多肽具有本发明的序列,或所述多肽由包含
本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段。本发明提供包含乙醇和具有木聚糖酶、甘露
聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的组合物,其中所述多肽具有本发明的序列,或所述多
肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段。本发明提供在高温和碱性pH条件
下制造乙醇的方法,该方法包括:(a)提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活
性的至少一种多肽,其中所述多肽在包括至少约80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、
91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、
104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下仍保持木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,其中所述多肽包括具有本发明序列
的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶,或木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶由包含
本发明序列的核酸编码,或是其酶促活性片段;(b)提供含淀粉的组合物,其包含木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆;以及(c)使步骤(b)的组合物在包括至少约80℃、85℃、
86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、
101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11的碱性pH的条件下与步骤(a)的多肽接触,其中所述多肽催化木材、木浆、牛
皮纸浆、纸或纸浆中的化合物的水解,从而从木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆产生乙醇。
[0162] 本发明提供药物组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述多肽具有本发明的序列,或所述多肽由包含本发明序列的核酸编码,或其酶促活性片段。在一个方面,本发明提供对动物清除或防护含木聚糖的微生物的方法,包括给予本发明的多肽。微生物可以是含木聚糖的细菌,例如沙氏菌(Salmonella)。
[0163] 在一个方面,药物组合物起消化助剂(digestive aid)或抗菌剂(例如抗沙门氏菌)的作用。在一个方面,治疗预防性的。在一个方面,本发明提供口腔护理产品,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发明多肽,或本发明核酸编码的木
聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶。口腔护理产品可以包括牙膏、牙科用乳膏、凝胶或牙粉、牙产品(odontic)、漱口水、刷牙前或刷牙后的漱口制剂、口香糖、止咳糖或糖果。本发明提供隐形眼镜清洗组合物,其包含具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的本发
明多肽,或本发明核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶。
[0164] 本发明提供嵌合糖苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其包含本发明的多肽(例如木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶)序列和至少一个异源糖结合模块(CBM),其中一方
面(任选地),CBM包括CBM3a、CBM3b、CBM4、CBM6、CBM22或X14,或下面所列出和论述的
CBM。本发明还提供嵌合糖苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶,其包含至少一个异源糖结合模
块(CBM),其中所述CBM包含本发明木聚糖酶序列的糖结合子序列,或含X14的糖结合子序
列。本发明提供设计具有新的糖结合特异性或糖结合特异性提高的嵌合糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法,其包括将异源或另外的内源糖结合模块(CBM)插入糖
苷酶、木聚糖酶和/或葡聚糖酶中,其中CBM包含本发明糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列的糖结合子序列或含X14的糖结合子序列,或可选地,异源CBM或另外的内
源CBM被插入到本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列中。
[0165] 本发明提供酶混合物或“鸡尾酒”,其包含至少一种本发明的酶和一种或更多种其它酶——其可以是另一种木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶或任意其它酶;例如,
本发明的“鸡尾酒”除了至少一种本发明的酶之外还可以包含任意其它酶,诸如木聚糖
酶(非本发明的)、纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶或内糖苷酶、内-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内-β-1,3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯树胶酶(arabinanases)、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶等等,这些仅仅是少数例
子。在可选的实施方式中,这些包含至少一种本发明的酶的酶混合物或“鸡尾酒”可以用
于本发明的任意过程或方法,或本发明的组合物中,例如用于食物或饲料、食物或饲料补充剂、纺织品、纸、加工的木材等及制造它们的方法中,以及用于处理纸、浆、木材、纸、浆或废木材或副产品等的组合物和方法中及用于其最终产品中。
[0166] 本发明的一个或多个方面的细节如附图和下面的描述所示。本发明的其它特征、目标和优点将通过阅读说明书和附图以及权利要求而更加清楚。
[0167] 此处引述的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物均被特意地引入,以作为参考,用于所有目的。
[0168] 附图简述
[0169] 下面的附图是本发明的各方面的示例性说明,而不意图限制权利要求书所包括的本发明的范围。
[0170] 本专利或申请文件包含至少一个彩图。具有彩图(或多个)的本专利或专利申请的复印件将在请求且支付所需费用后由官方提供。
[0171] 图1是一个计算机系统的框图
[0172] 图2是一个流程图,该图示意性说明了用于将新核苷酸或蛋白序列与序列数据库进行比较以确定该新序列与数据库中序列之间的同源性水平的过程的一个方面。
[0173] 图3是一个流程图,该图示意性说明了在计算机中确定两个序列是否同源的过程的一个方面。
[0174] 图4是一个流程图,该图示意性说明了检测序列中特征的存在的鉴定过程300的一个方面。
[0175] 图5是示例性常规筛选方案的示意性流程图,用以确定本发明的木聚糖酶是否如下面实施例3中所详细描述的可用于预处理纸浆。
[0176] 图6说明了下面实施例5中所详细描述的本发明的生物漂白工业过程。
[0177] 在各附图中类似的参考符号表示类似的要素。
[0178] 发明详述
[0179] 本发明提供糖基水解酶,包括木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)和/或葡聚糖酶,以及编码它们的多核苷酸及制造和应用它们的方法。本发明多肽的糖基水解酶——包括木聚
糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性——包括具有水解酶活性的酶,例如,能够水解多糖中的糖苷键如存在于木聚糖中的糖苷键的酶,例如催化内部β-1,4-木糖苷键的水解。本
发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶可以用于制造和/或加工食物、饲料、营养补充物、纺织品、洗涤剂等。本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖可以用于药物组合物和食用助剂中。
[0180] 本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶特别可用于烘焙、动物饲料、饮料和木材、木浆、牛皮纸浆、纸、纸制品或纸浆加工中。在一个方面,本发明的酶是耐热的和/或耐高和/或低pH条件的。例如,在一个方面,本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在
包括至少约80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、
97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃或110℃或更高的温度和至少约pH 11或更大的碱性pH的条件下仍保持活性。
[0181] 本发明提供分离的、合成的或重组的核酸,其包括编码具有木聚糖酶(例如内切木聚糖酶)、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,或本文所述的其它活性的至少一种多肽的核
酸,其中所述核酸包含这样的序列:所述序列在约10至2500或更多个残基,或cDNA、转录
物(mRNA)或基因的全长区域上与具有如表1中所述和本文中所述的一种或更多种核苷酸
残基改变(修饰、突变)的SEQ ID NO:1具有至少约50%至99%、或更高,或完全的(100%)序列同一性(同源性)。本发明的核酸包括编码本发明多肽的那些,其包括例如具有如表1
中所述和本文中所述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQID NO:2,以及还包括
具有各种序列同一性的一类多肽,所述序列同一性基于示例性SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24。
[0182]
[0183]
[0184] 本发明提供本发明多核苷酸或多肽的变体,其包含在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处被(分别地)修饰的序列,然而它们仍然保持本发明
的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶生物学活性。变体可以通过许多种方法产生,包
括的方法诸如,例如易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、回归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配(例如GeneReassembly,参见例如美国专利号6,537,776)、GSSM以及其任意组合。
[0185] 术语“饱和诱变”或“基因位点饱和诱变”或“GSSM”包括使用简并寡核苷酸引物将点突变引入多核苷酸的方法,如在下面所详细描述的。
[0186] 术语“优化的定向进化系统”或“优化的定向进化”包括用于重新装配相关的核酸序列的片段的方法,所述的相关核酸序列例如相关的基因,下面对其进行了详细解释。
[0187] 术语“合成连接重装配”或“SLR”包括以非随机方式连接寡核苷酸片段的方法,下面进行了详细解释。
[0188] 产生和操作核酸
[0189] 本发明提供核酸(例如编码具有糖基水解酶活性,例如木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸;包括具有本发明示例性核酸序列的至少一种序列修饰(如
上所限定)的酶,其中所述序列修饰包含表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或
其等价物),或下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个,或一些或全部:编码氨基酸残基4的密码子从ACC变为AAC;编码氨基酸残基4的密码子从ACC变为CGC;编码氨基酸
残基4的密码子从ACC变为CAC;编码氨基酸残基9的密码子从CCC变为GAC;编码氨基酸
残基17的密码子从TTC变为GTC;编码氨基酸残基21的密码子从TTC变为TAC;编码氨基
酸残基33的密码子从CTG变为GCG;编码氨基酸残基38的密码子从CGT变为CAC;编码氨
基酸残基44的密码子从AGC变为ACG;编码氨基酸残基63的密码子从ATC变为GTC;编码
氨基酸残基73的密码子从GGC变为TAC;编码氨基酸残基73的密码子从GGC变为GAG;编
码氨基酸残基73的密码子从GGC变为GTC;编码氨基酸残基108的密码子从TTC变为AAG;
编码氨基酸残基125的密码子从CAG变为TAC;编码氨基酸残基150的密码子从GTA变为
GCC;编码氨基酸残基188的密码子从AGC变为GAG;和/或编码氨基酸残基189的密码子
从TCC变为CAG,包括编码本发明多肽的表达盒如表达载体。
[0190] 本发明还包括使用本发明的核酸发现新的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列的方法。本发明还包括使用本发明的核酸抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
基因、转录物和多肽表达的方法。还提供了修饰本发明的核酸的方法,通过例如合成连接重装配、优化的定向进化系统和/或饱和诱变进行。
[0191] 本发明的核酸可以通过,例如cDNA文库的克隆和表达、通过PCR进行的信息或基因组DNA扩增以及类似的技术来制备、分离和/或操作。
[0192] 在一个方面,本发明还提供编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸,其共同新颖性在于它们源自环境来源,或细菌来源,或古细菌来源。
[0193] 在实践本发明的方法中,同源基因可以如本文所述通过操作模板核酸来修饰。本发明可以结合在科技和专利文献中充分描述的、本领域已知的任意方法或方案或装置进行
实践。
[0194] 本发明的一个方面是分离的核酸,其包含下列序列之一:本发明的序列及与其基本上相同的序列、与其互补的序列、或包含本发明序列(或与其互补的序列)之一的至少
10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基的片段。该分离的核酸可以包括DNA,包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链,并且如果是
单链,可以是编码链或非编码(反义)链。可选地,该分离的核酸可包括RNA。
[0195] 因此,本发明的另一个方面是分离的核酸,其编码本发明的多肽之一,或包含本发明多肽之一的至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段。这些核酸的编码序列可以与本发明核酸之一的编码序列之一或其片段相同或者可以是不同的编码序列,其编码下列之一:本发明的多肽、与其基本上相同的序列或具有本发明多肽之一的至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段,这是遗传密码子的冗余性或简并性的结果。遗传密码子对于本领域技术人员是熟知的,并可以例如在
B.Lewin,Genes VI,OxfordUniversity Press,1997的第214页上得到。
[0196] 分离的核酸——其编码本发明多肽和与其基本上相同的序列之一——可以包括但不限于:仅本发明的核酸的编码序列和与其基本上相同的序列以及另外的编码序列,例
如前导序列或蛋白原序列(proprotein sequences),以及非编码序列,如内含子,或编码序列的5′和/或3′非编码序列。因此,如在本发明中所使用,术语“编码多肽的多核苷酸”包括多核苷酸,其包括仅多肽的编码序列以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷
酸。
[0197] 可选地,使用常规技术,例如定点诱变或本领域技术人员熟悉的其它技术,本发明的核酸序列和与其基本上相同的序列可被诱变,以将沉默改变引入本发明的多核苷酸和与其基本上相同的序列。如本文所使用,“沉默改变(silent changes)”包括,例如不改变由所述多核苷酸编码的氨基酸序列的改变。这样的改变可能是期望的,以通过引入在宿主微
生物中频繁发生的密码子或密码子对而增加由宿主产生多肽的水平,该宿主含有编码所述
多肽的载体。
[0198] 本发明还涉及具有核苷酸改变的多核苷酸,所述核苷酸改变在本发明的多肽和与其基本上相同的序列中导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。使用技术例如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III删除和其它重组DNA技术,可以导入这样的核苷酸改变。可
选地,这样的核苷酸改变可以是天然存在的等位基因变体,其通过鉴定在本文所提供的高
严格条件、中度严格条件或低严格条件下特异性杂交到这样的探针的核酸而分离出,所述
探针包含本发明的序列和与其基本上相同的序列(或与其互补的序列)之一的至少10、15、
20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基。
[0199] 一般技术
[0200] 用于实践本发明的核酸,不管是RNA、iRNA、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体,都可以从多种来源分离、进行遗传工程改造、扩增和/或表达/重组产生。从这些核酸产生的重组多肽(例如本发明的糖基水解酶)可以被单独地分离或克隆,并且可测试其期望活性。可以使用任何重组表达系统,包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
[0201] 可选地,这些核酸可以通过熟知的化学合成技术体外合成,正如例如在Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105:661;Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25:
3440-3444;Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19:373-380;Blommers(1994)
Biochemistry 33:7886-7896;Narang(1979)Meth.Enzymol.68:90;Brown(1979)Meth.
Enzymol.68:109;Beaucage(1981)Tetra.Lett.22:1859;美国专利4,458,066中所描述
的。
[0202] 用于操纵核酸的技术,例如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交以及类似的技术在科学和专利文献中有充分的描述,例如参见Sambrook编著,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(2ND ED.),1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989);CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel编著,JohnWiley&Sons,Inc.,New York(1997);LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)。
[0203] 获得和操纵用于实践本发明的方法的核酸的另一个有用方法是从基因组样品中克隆,并且如果期望的话,筛选和再克隆插入物,插入物可以分离或扩增自例如基因组克隆或cDNA克隆。用于本发明的方法中的核酸的来源包括基因组或cDNA文库,所述文库包含
在例如哺乳动物人工染色体(MACs),例如参见美国专利5,721,118;6,025,155;人类人工
染色体,例如参见Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15:333-335;酵母人工染色体(YAC);细菌人工染色体(BAC);P1人工染色体,例如参见Woon(1998)Genomics 50:306-316;P1来源的载体(PACs),例如参见Kern(1997)Biotechniques 23:120-124;粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒中。
[0204] 一方面,编码本发明的多肽的核酸与能指导翻译出的多肽或其片段的分泌的前导序列以适当的位置关系进行装配。
[0205] 本发明提供了融合蛋白和编码这些融合蛋白的核酸。本发明的多肽可以被融合到异源肽或多肽上,如N-末端鉴定肽,其给予了期望的特性,如增加的稳定性或简化的纯
化特性。本发明的肽和多肽也可以作为融合蛋白被合成和表达,其中所述融合蛋白中连接
有一个或多个额外的结构域,例如用于产生免疫原性更强的肽、以便更易于分离重组合成
的肽、以便鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞,等等。有利于检测和纯化的结构域包括,例如金属螯合肽,如多组氨酸标记和组氨酸-色氨酸模块,其允许在固定的金属上纯化,
还包括蛋白A结构域,其允许在固定的免疫球蛋白上纯化,还包括在FLAGS延伸/亲和纯
化系统中所使用的结构域(Immunex Corp,Seattle WA)。在纯化结构域和含有基序的肽
或多肽之间包含可切裂的连接子序列有助于纯化,这样的连接子序列例如Xa因子或肠激
酶(Invitrogen,San Diego CA)。例如,表达载体可以包括编码表位的核酸序列,其连接
到六组氨酸残基上,还连接有硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(例如参见Williams(1995)
Biochemistry 34:1787-1797;Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12:404-414)。组氨酸残基有助于检测和纯化,而肠激酶切割位点提供了将表位从融合蛋白的剩余部分纯化的手
段。关于编码融合蛋白的载体的技术以及融合蛋白的应用在科学和专利文献中进行了充分
的描述,例如参见Kroll(1993)DNA Cell.Biol.,12:441-53。
[0206] 于此使用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸,或者指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一种的片段,或者指基因组的或合成来源的DNA或RNA,它们可以是单链或双链,并且可以代表正义链或反义链,还指肽核酸(PNA)或者指天然或合成来源的任何DNA样或RNA样的物质。短语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸,或者寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一种的片段,或者基因组的或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、iRNA),它们可以是单链或双链,并且可以代表正义链或反义链,还包括肽核酸(PNA)或者天然或合成来源的任何DNA样或RNA样的物质,例如包
括iRNA、核糖核蛋白(例如双链iRNA,例如iRNPs)。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,例如寡核苷酸。该术语也包括具有合成骨架的核酸样结构,例如参见Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189-197;Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36:
8692-8698;Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156。“寡核苷酸”或者包括单链的多脱氧核苷酸,或者包括两个互补的多脱氧核苷酸链,它们可以是化学合成
的。这样的合成的寡核苷酸没有5’磷酸,因此如果不在存在激酶的情况下采用ATP添加磷
酸,该合成寡核苷酸便不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸可以连接到没有被
去磷酸化的片段上。
[0207] 特定多肽或蛋白的“编码序列”或编码特定多肽或蛋白的“核苷酸序列”是这样的核酸序列,其当置于合适的调节序列的调控下时被转录和翻译成多肽或蛋白质。
[0208] 术语“基因”意指在产生多肽链中所涉及的DNA片段;其包括编码区之前的区域和之后的区域(前导区(leader)和尾区(trailer)),以及在适用的情况下,可以包括各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。正如此处所用,“可操作地连接”是指两个
或更多个核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。通常地,“可操作地连接”可以指转录调
控序列与被转录序列的功能关系。例如,如果启动子刺激或调节编码序列例如本发明的核
酸在适当的宿主细胞或其它表达系统中的转录,那么该启动子便是可操作地连接到编码序
列。通常,可操作地连接到被转录序列的启动子转录调控序列与被转录序列是物理上相邻
的,即它们是顺式作用。然而,一些转录调控序列,如增强子,不需要与编码序列物理相邻或者位于与编码序列接近的位置,但这些转录调控序列仍能增强编码序列的转录。
[0209] 在此使用的术语“表达盒(expression cassette)”是指在宿主中可以影响结构基因(即,编码蛋白质,如本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的序列)表达的
核苷酸序列,所述宿主与所述序列相容。表达盒包括至少一个与编码多肽的序列可操作地
连接的启动子;并且,一方面,与其它的序列例如转录终止信号可操作地连接。也可以应用进行表达所必要的或有帮助的额外的因子,例如增强子。因此,表达盒也包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组的“裸露DNA”载体,和类似物。“载体”包括可以感染、转染、瞬间或者永久转导细胞的核酸。将被认识到,载体可以是裸露的核酸,或者与蛋白或者脂类复合的核酸。一方面,载体包括病毒或者细菌的核酸和/或蛋白,和/或膜(如,细胞膜,病毒的脂包膜,等等)。载体包括,但不限于复制子(如,RNA复制子,细菌噬菌体),DNA片段可以与其连接,并被复制。载体因此包括,但不限于是RNA,自主复制的环状或者线性的DNA或者RNA(如质粒、病毒以及类似物,参见,如美国专利第5,217,879号),并且也包括表达质粒和非表达质粒。当重组微生物或者细胞培养物被描述为容纳“表达载体”时,其包括染色体外的环状和线性DNA,和已经整合进入宿主染色体。当载体由宿主细胞维持时,该载体可以在细胞有丝分裂期间作为自主结构由细胞稳定地复制,或者整合入宿主基因组中。
[0210] 如本文所使用,术语“启动子”包括能够驱动编码序列在细胞例如植物细胞中转录的所有序列。因此,在本发明的构建物中所用的启动子包括顺式作用转录控制元件和调节序列,它们涉及调节或调控基因转录的时间选择(定时)和/或速率。例如,启动子可以是
顺式作用转录控制元件,包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区或内含子序列,它们均涉及转录的调节。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子互相作用来执行(打开/关闭、调节、调控等等)转录。“组成型”启动子是那
些在大部分环境条件和发育状态或细胞分化状态下持续地驱动表达的启动子。“诱导型”或“可调控型”启动子在环境条件或发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括无氧条件、增高的温度、干旱或光的存在。
[0211] “组织特异性”启动子是仅仅在特定细胞或组织或器官中有活性的转录控制元件,例如在植物或动物的特定细胞或组织或器官中有活性。组织特异性调节可以通过某些内在因子来实现,这些内在因子确保编码对给定组织特异的蛋白的基因被表达。这样的因子已
知存在于哺乳动物和植物中,以便允许特异性组织的发育。
[0212] 如本文所使用,术语“分离的”意指从其原始环境(例如天然环境,如果该环境是天然存在的话)中分离出的物质(例如核酸、多肽、细胞)。例如,在活的动物中存在的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的,但与该天然系统中的一些或所有的共存物质分离开
的同一多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以成为载体的一部分,和/或这样的
多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分,但它们仍然是分离的,因为这样的载体或组合物
不是其天然环境的组成部分。正如本文所用,术语“纯化的”并不要求绝对的纯度;相反,这意味着是一个相对定义。从文库获得的各个核酸可以被常规地纯化为电泳同质。从这些克
隆获得的序列不能够从所述文库或从总人DNA直接获得。本发明的纯化的核酸已经以至少
4 6
10-10 倍从该生物体的基因组DNA的剩余物中纯化出来。但是,术语“纯化的”还包括核
酸,这些核酸已经以至少一个数量级,通常以两个或三个,和更通常地四个或五个数量级的程度从基因组DNA的剩余物或从文库或其它环境中的其它序列中被纯化出来。
[0213] 如本文所用,术语“重组子”是邻接于“骨架”核酸的核酸,而在天然环境下它们并不邻接。另外,要富集的核酸代表了核酸骨架分子群体中5%或者更多数目的核酸插入物。本发明的骨架分子包括核酸,如表达载体、自主复制核酸、病毒、整合性核酸,和用于维持或者操作感兴趣的核酸插入物的其它的载体或者核酸。通常地,富集的核酸代表了重组骨架
分子群体中的15%或者更多数目的核酸插入物。更通常地,富集的核酸代表了重组骨架分
子群体中的50%或者更多数目的核酸插入物。在一个方面中,富集的核酸代表了重组骨架
分子群体中的90%或者更多数目的核酸插入物。
[0214] “质粒”命名为在大写字母和/或数字之前和/或之后加上小写字母“p”。在此使用的起始质粒(starting plasmid)可以通过商业渠道获得,通过公共渠道自由获得,或者按照公开的程序从可利用的质粒构建得到。此外,与本文描述的那些质粒等价的质粒是在
本领域是已知的,并且对普通技术人员而言是显而易见的。“质粒”可以商购得到,在不受限制的基础上可以公开获得,或可以根据已公开的方法由可获得的质粒来构建。与本文描述
的那些质粒等价的质粒在本技术领域是已知的,并且对于普通技术人员是显而易见的。
[0215] DNA的“消化”指用仅在DNA中某些序列处起作用的限制酶催化裂解DNA。本文中使用的各种限制酶可商业购得并且如普通技术人员所了解的使用它们的反应条件、辅助因
子和其它要求。对分析目的而言,通常1μg质粒或DNA片段与在约20μl缓冲溶液中的约
2单位的酶一起使用。对于分离DNA片段用于质粒构建而言,通常5至50μgDNA用在更大
体积中的20至250单位的酶进行消化。具体限制酶的适合的缓冲液和底物量由制造商进
行了说明。普遍使用的是37℃约1小时的温育时间,但可以根据供应商的说明而变化。在
消化后,可以进行凝胶电泳以分离期望的片段。
[0216] “杂交”指这样一个过程,即,通过该过程,核酸链与互补链通过碱基配对而结合。杂交反应可以是灵敏的并且是选择性的,以便感兴趣的特定序列可以被鉴定,甚至在其以
低浓度存在的样品中也可以被鉴定。适度的严格条件(stringentcondition)可以通过,例
如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度来定义,或者通过杂交温度来定义,这些严格条
件在本技术领域是已知的。特别地,严格性可以通过降低盐的浓度、增加甲酰胺的浓度或升高杂交温度来增加。在可选择的方面,本发明的核酸通过它们在各种严格条件(例如高、中等和低严格条件)下杂交的能力来定义,正如本文所示。
[0217] 例如,高严格性下的杂交在大约37℃到42℃的温度、大约50%的甲酰胺的条件下发生。杂交还可以在大约30℃到35℃、大约35%至25%甲酰胺的降低的严格性条件下
发生。特别地,杂交可以在高度严格性条件下发生,所述条件为约42℃、在50%甲酰胺、
5×SSPE、0.3%SDS中,和200μg/ml的剪切和变性鲑精DNA。杂交发生在如上所述的降低
的严格性条件下,但在降低的温度35℃在35%甲酰胺中。相应于特定的严格性水平的温度
范围可以通过计算目标核酸中的嘌呤与嘧啶比并相应调节温度而进一步缩小。上述范围和
条件的变化在本领域中是熟知的。
[0218] 转录和翻译控制序列
[0219] 本发明提供了可操作地连接到一个或多个表达(例如转录或翻译)控制序列上的本发明的核酸(例如DNA)序列,所述控制序列例如启动子或增强子,它们指导或调节RNA
合成/表达。表达控制序列可以在表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。示例性的真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启
动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子以及鼠金属硫蛋白I启动子。
当在启动子处启动转录的RNA聚合酶将编码序列转录成为mRNA时,启动子序列被“可操作
地连接于”编码序列。适合于在细菌中表达多肽的启动子包括大肠杆菌(E.coli)lac或trp
启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子和λPL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子以及酸性磷酸酶
启动子。真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热激启动子、早期和
晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs、以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用已
知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。适合于在细菌中表达多
肽或其片段的启动子包括大肠杆菌lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动
子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子和λRL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子、以及酸性磷酸酶启动子。真菌启动子包括α-因子启动子。
真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热激启动子、早期和晚期SV40
启动子、来自逆转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用已知在原核
或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。
[0220] 组织特异性植物启动子
[0221] 本发明提供了可以以组织特异性方式表达的表达盒,例如可以以组织特异性方式表达本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的表达盒。本发明也提供了以组织特
异性方式表达本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的植物或种子。组织特异性
可以是种子特异性、茎特异性、叶特异性、根特异性、果实特异性等。
[0222] 一方面,组成型启动子如CaMV 35S启动子可以被用于在植物或种子的特定部分或在整个植物中的表达。例如,为了过量表达,可以使用植物启动子片段,其将指导核酸在植物例如再生植物的一些或所有组织中表达。此处,这样的启动子被称作“组成型”启动
子,它们在大部分环境条件和发育或细胞分化状态下是有活性的。组成型启动子的实例包
括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、来自根瘤农杆菌的T-DNA的1’或2’启动子以
及来自本技术领域已知的多种植物基因的其它转录起始区。这些基因包括,例如来自拟南
芥(Arabidopsis)的ACT11(Huang(1996)Plant Mol.Biol.33:125-139);来自拟南芥的
Cat3(Genbank No.U43147,Zhong(1996)Mol.Gen.Genet.251:196-203);来自甘蓝型油菜
(Brassica napus)的编码硬酯酰基-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank No.X74782,
Solocombe(1994)Plant Physiol.104:1167-1176);来自玉米的GPc1(Genbank No.X15596;
Martinez(1989)J.Mol.Biol.208:551-565);来 自 玉 米 的 Gpc2(Genbank No.U45855,Manjunath(1997)Plant.Mol.Biol.33:97-112);在美国专利4,962,028;5,633,440中描述的植物启动子。
[0223] 本发明使用来自病毒的组织特异性或组成型启动子,它们可以包括,例如烟草花叶病毒亚基因组启动子(Kumagai(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1679-1683;稻米东
格鲁杆状病毒(RTBV),该病毒仅在受感染稻米植物中的韧皮细胞中复制,它的启动子驱动
强的韧皮特异性报道基因的表达;木薯脉带花叶病毒(CVMV)启动子,其在导管组分、叶中
轴细胞和根尖中具有最高活性(Verdaguer(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-1139)。
[0224] 可选择地,植物启动子可以指导表达木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸在特定组织、器官或细胞类型中表达(即,组织特异性启动子),或者可以另外在更加精确的环境或
发育控制下或在诱导型启动子的控制下指导表达。可能影响转录的环境条件的实例包括厌
氧条件、升高的温度、有光或喷撒化学品/激素。例如,本发明包括玉米的干旱诱导型启动子(Busk(1997)出处同上),马铃薯的寒冷、干旱、高盐诱导型启动子(Kirch(1997)Plant
Mol.Biol.33:897909)。
[0225] 组织特异性启动子可以只在该组织的发育阶段的某个时间段内促进转录。参见例如表征拟南芥LEAFY基因启动子的Blazquez(1998)Plant Cell 10:791-800。还参见描述
转录因子SPL3的Cardon(1997)Plant J12:367-77,SPL3识别拟南芥(A.thaliana)花分
生组织特征基因(floral meristem identity gene)AP1的启动子区域中的保守序列基序;
和描述分生组织启动子eIF4的Mandel(1995)PlantMolecular Biology,29卷,第995-1004
页。可以使用在特定组织的整个生命周期都具有活性的组织特异性启动子。一方面,本发明的核酸与主要仅在棉纤维细胞中有活性的启动子可操作地连接。一方面,本发明的核酸与
主要在棉纤维细胞伸长的阶段具有活性的启动子可操作地连接,例如,如Rinehart(1996)
(出处同上)所述。核酸可以与Fbl2A基因启动子可操作地连接,这样它将偏好在棉纤
维细胞(同前)中表达。也参见John(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5769-5773;
John等,美国专利5,608,148和5,602,321,描述了用于构建转基因棉花植物的棉纤维特
异性启动子和方法。也可以使用根特异性启动子来表达本发明的核酸。根特异性启动子
的例子包括来自醇脱氢酶基因的启动子(DeLisle(1990)Int.Rey.Cytol.123:39-60)。可
以用来表达本发明核酸的其它启动子包括,例如胚珠特异的、胚芽特异的、胚乳特异的、珠柄特异的、种皮特异的启动子或它们的一些组合;叶特异的启动子(参见例如Busk(1997)
Plant J.11:12851295,描述了玉米的叶特异的启动子);发根农杆菌(Agrobacterium
rhizogenes)的ORF13启动子(ORF13启动子在根部表现出高活性,见,例如Hansen(1997)
如上);玉米花粉特异性启动子(见,例如Guerrero(1990)Mol.Gen.Genet.224:161168);
番茄启动子,其在果实成熟、变老、叶子脱落的期间有活性,在花中具有低一些的活性(参见例如Blume(1997)Plant J.12:731746);马铃薯SK2基因的雌蕊特异性启动子(见,例
如Ficker(1997)Plant Mol.Biol.35:425431);豌豆的Blec4基因,Blec4基因在蔬菜的表
皮组织和转基因苜蓿的花梗顶中具有活性,这使它成为使外源基因靶向表达于活跃生长的
芽或纤维的表皮层的有用工具;胚珠特异的BEL1基因(参见例如Reiser(1995)Cell 83:
735-742,GenBank号:U39944);和/或Klee,美国专利5,589,583中的启动子,该美国专利描述了一种植物启动子区域,其可导致在分生组织和/或快速分裂细胞中的高水平转录。
[0226] 可选择地,使用暴露于植物激素例如植物生长素后可诱导的植物启动子来表达本发明的核酸。例如,本发明可以使用大豆(Glycine max L.)的植物生长素响应元件E1
启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)Plant Physiol.115:397-407);植物生长素响应的拟南
芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢产生响应)(Chen(1996)Plant J.10:955-966);
烟草的植物生长素诱导的parC启动子(Sakai(1996)37:906-913);植物生物素响应元件
(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10:933-937);和对应激激素脱落酸产生响
应的启动子(Sheen(1996)Science 274:1900-1902)。
[0227] 本发明的核酸也可以与植物启动子可操作地连接,所述植物启动子暴露于施用于植物的化学试剂例如除草剂或抗生素后可被诱导。例如,可以使用被苯磺酰胺除草剂安全
剂活化的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38:568-577);不
同的除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式,包括在根中、排水器中和芽尖分生组
织中的表达。编码序列可以处于例如四环素诱导的启动子的控制下,例如,针对含有燕麦
(Avena sativa L.)(oat)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物所描述的(Masgrau(1997)
Plant J.11:465-473);或者处于水杨酸响应元件的控制之下(Stange(1997)Plant J.11:
1315-1324)。使用化学(例如,激素或杀虫剂)诱导的启动子,即,对可施用于田间的转基
因植物的化学剂产生响应的启动子,本发明的多肽的表达可以在植物发育的特定阶段被诱
导。因此,本发明也提供转基因植物,其包括编码本发明多肽的诱导型基因,其宿主范围限于目标植物种类,如玉米、水稻、大麦、小麦、马铃薯或其它作物,在作物发育的任何阶段是可诱导的。
[0228] 本领域技术人员应认识到,组织特异性的植物启动子可能驱动可操作地连接的序列在不是靶组织的组织中表达。因此,组织特异性启动子是优选在靶组织或细胞类型中驱
动表达的启动子,但是也可以在其它组织中导致一些表达。
[0229] 本发明的核酸也可以与在暴露于化学试剂后可诱导的植物启动子可操作地连接。这些试剂包括例如,除草剂、合成的植物生长激素或抗生素,它们可以通过例如喷雾施用于转基因植物。本发明的产生木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸的诱导型表达将允许种植者对
具有最佳木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表达和/或活性的植物进行选择。植物部
分的发育也可以因此被控制。以这种方式,本发明提供了促进植物和植物部分的收获的方
法。例如,在各种实施方式中,玉米的由苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉米In2-2启动子被使用(De Veylder(1997)Plant CellPhysiol.38:568-577);应用不同的除草剂安全剂诱导出不同的基因表达模式,包括在根中、排水器中、芽尖分生组织中的表达。本发明的编码序列也可以处于四环素诱导的启动子的控制之下,例如,对含有燕麦(oat)精氨酸脱羧酶基
因的转基因烟草植物的描述(Masgrau(1997)Plant J.11:465-473);或者在水杨酸响应元
件控制下(Stange(1997)Plant J.11:1315-1324)。
[0230] 在一些方面,适当的多肽表达可能要求在该编码区域的3’端具有多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、各类其它植物(或者动物或其它)基因或者农杆菌T-DNA中的基因。
[0231] 术语“植物”(例如,转基因植物或本发明的植物种子,或用于本发明载体的植物启动子)包括全植物、植物部分(例如叶、茎、花、根等等)、植物原生质体、种子和植物细胞以及它们的后代。可以用于实践本发明(包括组合物和方法)的植物的种类很广泛,广泛至包括能用转化技术进行处理的植物在内的高等植物,包括被子植物(单子叶植物和双子叶
植物),以及裸子植物;还包括各种倍数性水平的植物,包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子状态的植物。如本文所用,术语“转基因植物”包括异源核酸序列已经被插入到其中的植物或植物细胞,所述异源核酸序列例如本发明的核酸和各种重组构建物(例如表达盒,如
载体)。本发明的转基因植物在下面也进行了论述。
[0232] 表达载体和克隆运载体
[0233] 本发明提供表达载体和克隆运载体,其包含本发明的核酸,例如编码本发明木聚糖酶和/或葡聚糖酶的序列。本发明的表达载体和克隆运载体可以包括病毒颗粒、杆状
病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒(phagemids)、粘粒、F粘粒、细菌人工染色体、病毒DNA(例如疫苗、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40的衍生物)、P1衍生的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和任何别的对感兴趣的特定宿主(例如杆菌、曲霉和酵母)有特异性
的载体。本发明的载体可以包括染色体、非染色体和合成的DNA序列。大量的合适的载体
对于本领域技术人员都是已知的,并且可以商业获得。示例性的载体包括:细菌:pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体、λ-ZAP载体(Stratagene);ptrc99a、PKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia);真核细胞载体:PXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而,也可以使用任何其它质粒或其它载体,只要它们可以在宿主中复制和存活。可以在本发明中使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
[0234] 表达载体可以包括启动子、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。哺乳动物表达载体可以包括复制起点、任何必需的
核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、5’侧翼非转录序列。在一些方面,衍生于SV40剪接子和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需要的
非转录遗传元件。
[0235] 在一个方面,表达载体含有一个或多个选择性标记基因,使得可以对含有该载体的宿主细胞进行选择。这样的选择性标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或使得真核细胞
培养物具有新霉素抗性的基因、使得大肠杆菌(E.coli)具有四环素或氨苄青霉素抗性的
基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。使用氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标
记的其它载体,启动子区域可以从任何期望的基因中选择出来。
[0236] 用于在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可以含有增强子,以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件,一般长度为大约10到大约300bp,其作用于启动子,以
增强其转录。例子包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期
启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子,和腺病毒增强子。
[0237] 核酸序列可以通过各种方法插入载体中。一般而言,将插入物和载体用合适的限制性内切酶消化后,序列可以连接到载体中的所希望的位置。可选择地,插入物和载体的平末端可以被连接。多种克隆技术在本领域已知,例如在Ausubel和Sambrook中描述的。这
样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的范围内。
[0238] 载体可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列,SV40的衍生物;细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体被例如Sambrook描述。
[0239] 可以使用的具体细菌载体包括商业上可获得的质粒,其包括以下熟知的克隆载体的遗传元件:pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,
Sweden)、GEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USA)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174 pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、DR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。具体的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而,可以使用任何其它载体,只要它可以在宿主细胞中复制和存活。
[0240] 本发明的核酸可以在表达盒、载体或病毒中表达,在植物细胞和种子中短暂地或稳定地表达。一个示例性的短暂表达系统应用了附加型(episomal)表达系统,例如,通过
含有超螺旋DNA的附加小染色体的转录而在核中产生的花椰菜花叶病毒(CaMV)病毒RNA,
见,例如,Covey(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1633-1637。作为选择,编码序列,即本发明的序列的全部或子片段,可以插入到植物宿主细胞基因组中,而成为该宿主染色体DNA的整体部分。正义和反义转录子可以以这种方式被表达。包含本发明的核酸的序列(例如,启动子或编码区域)的载体可以包含赋予植物细胞或种子选择性表型的标记基因。例如,
所述标记可以编码生物杀灭剂抗性,特别是抗生素抗性,例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或除草剂的抗性,例如对氯磺隆或Basta的抗性。
[0241] 可以在植物中表达核酸和蛋白的表达载体在本领域中是熟知的,可以包括,例如,根瘤农杆菌某种的载体、马铃薯病毒X(见,例如,Angell(1997)EMBOJ.16:3675-3684)、烟草花叶病病毒(见,例如,Casper(1996)Gene 173:69-73)、番茄丛矮病毒(见,例如,
Hillman(1989)Virology 169:42-50)、烟草蚀纹病毒(见,例如,Dolja(1997)Virology
234:243-252)、菜豆金色花叶病毒(见,例如,Morinaga(1993)Microbiol inimunol.37:
471-476)、花椰菜花叶病毒(见,例如,Cecchini(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10:
1094-1101)、玉米Ac/Ds转座元件(见,例如,Rubin(1997)Mol.Cell.Biol.17:6294-6302;
Kunze(1996)Curr.Top.Microbiol.Inimunol.204:161-194),和玉米抑制基因-突变基因
(Spm)转座元件(见,例如Schlappi(1996)Plant Mol.Biol.32:717-725);和它们的衍生
物。
[0242] 在一个方面,表达载体可以有两套复制系统,使其可以在两种生物中保持,例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达,在原核宿主中克隆和扩增。进一步,对于整合表达载体,该表达载体可以包括至少一个与宿主细胞基因组同源的序列。它可以在该表达构建物的两侧包含两个同源序列。通过选择包含入载体的合适的同源序列,可以将该整合载体定位到宿主
细胞的特定位置。整合载体的构建物在本领域是已知的。
[0243] 本发明的表达载体也可以包括选择性的标记基因,以便对已经被转化的细菌株进行选择,例如,使细菌对药物,例如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。选择性的标记也可以包括生物合成基因,例如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的基因。
[0244] 表达载体中的DNA序列被可操纵连接到合适的表达控制序列(一种或多种)(启动子),以指导RNA合成。具体命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、λPL和trp。真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动
子、来自逆转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。选择合适的载体和启动子完
全在本领域技术人员的水平之内。表达载体还可以包含用于起始翻译的核糖体结合位点和
转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。启动子区域可以从任何期望的基
因中选择出来,使用氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标记的其它载体。此外,表达载体优选含有一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择被转化的宿主细胞的表型特征,例
如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性,或例如大肠杆菌中的四环素或氨苄
青霉素抗性。
[0245] 哺乳动物表达载体还可以包括复制起点、任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。在一些方面,衍生于SV40剪接子的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以用于提供所需要的非转录遗传元件。
[0246] 用于在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可以含有增强子,以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件,一般长度为大约10到大约300bp,其作用于启动子,增
强其转录。增强子的例子包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病
毒早期启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子,和腺病毒增强子。
[0247] 此外,表达载体通常含有一个或多个选择性标记基因,使得可以对含有该载体的宿主细胞进行选择。这样的选择性标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因和使得真核细胞培
养物具有新霉素抗性的基因、使得大肠杆菌(E.coli)具有四环素或氨苄青霉素抗性的基
因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。
[0248] 在一些方面中,编码本发明的多肽和与其基本上相同的序列之一或含有其至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的核酸与能指导翻译出的多肽或其片段的分泌的前导序列以适当的位置关系进行装配。该核酸可以编码融合
多肽,其中本发明的多肽和与其基本上相同的序列之一或含有其至少大约5、10、15、20、25、
30、35、40、50、75、100或150或更多个连续氨基酸的片段被融合到异源肽或多肽,例如N-末端鉴定肽,其给予了期望的特性,如增加的稳定性或简化的纯化特性。
[0249] 合适的DNA序列可以通过各种方法插入载体中。一般而言,将插入物和载体用合适的限制性内切酶消化后,DNA序列可以连接到载体中的所希望的位置。可选择地,插入物和载体的平末端可以被连接。多种克隆技术被公开于Ausubel等Current Protocols in
Molecular Biology,John Wiley 503 Sons,Inc.1997和Sambrook等,Molecular Cloning:
A Laboratory Manual 2nd Ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的范围内。
[0250] 载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列,SV40的衍生物;细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体在Sambrook等,Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,2nd Ed.,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)中描述。
[0251] 宿主细胞转化细胞
[0252] 本发明也提供了包含本发明的核酸序列的转化细胞,所述核酸序列例如编码本发明木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的序列,或本发明的载体。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞,包括原核细胞,真核细胞,例如,细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包括大肠杆菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属和葡萄球菌属内的任何种,包括埃希氏
大肠杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状
芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、荧光假单胞
菌(Pseudomonas fluorescens)。示例性的真菌细胞包括曲霉菌属(Aspergillus)的任何
种。示例性酵母细胞包括毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)内的任何种,包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵
母(Saccharomycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。示例性
的昆虫细胞包括草地夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)内的任何种,包括果蝇
S2和草地夜蛾Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤细胞或任何鼠或人的细
胞系。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。转化各种高等植物种类的技术
是熟知的,并在技术和科学文献中有描述。参见,例如,Weising(1988)Ann.Rey.Genet.22:
421-477;美国专利5,750,870。
[0253] 载体可以使用各种技术导入宿主细胞中,包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法(lipofection)或电穿孔(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,BasicMethods in Molecular Biology,(1986))。
[0254] 一方面,本发明的核酸或载体导入细胞是为了筛选,所以,所述核酸是以适合于该核酸的后续表达的方式进入细胞。导入的方法大体上由靶细胞类型决定。示例性的方法TM
包括CaPO4沉淀法、脂质体融合、脂转染法(例如,LIPOFECTIN )、电穿孔法、病毒感染法,等等。候选的核酸可以稳定地整合到宿主细胞基因组中(例如,用反转录病毒导入)或者可
以短暂地或稳定地存在于细胞质中(即,通过使用传统的质粒,利用标准的调控序列、选择标记,等等)。因为许多药学上重要的筛选要求人或模型哺乳动物靶细胞,所以可以使用能够转染这些靶标的反转录病毒载体。
[0255] 在适当的情况下,工程改造的宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养,所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被
转化和宿主株生长到合适的细胞密度之后,用合适的方法(例如,温度变化或化学诱导)诱
导被选择的启动子,细胞再培养一段时期,使得它们产生所需的多肽或其片段。
[0256] 细胞可以通过离心收获,通过物理或化学方法破碎,保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎,包括冷冻-融解
循环、声波裂解法、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。
表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离
子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话,可以应用蛋白质重折叠步骤来完成多肽的
构象。假如需要的话,在最终的纯化步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。
[0257] 宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产方法中所用的宿主,由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以糖基化或者未糖基
化。本发明的多肽也可以包括或不包括起始甲硫氨酸残基。
[0258] 也可以采用无细胞的翻译系统来产生本发明的多肽。无细胞翻译系统可以应用由DNA构建物转录得到的mRNA,所述DNA构建物包括与编码所述多肽或其片段的核酸可操作
地连接的启动子。在一些方面,该DNA构建物在进行体外转录反应之前可以被线性化。转
录得到的mRNA然后与合适的无细胞翻译提取物例如兔网状细胞提取物温育,产生所需的
多肽或其片段。
[0259] 表达载体可以含有一个或多个选择性标记基因,为选择转化的宿主细胞提供表型特征,例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性,或者例如大肠杆菌的四环素
或氨苄青霉素抗性。
[0260] 含有感兴趣多核苷酸如本发明的核酸的宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养,所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增基因。培养条件例如温
度、pH和类似条件是先前选择宿主细胞用于表达所使用的培养条件,对于普通技术人员是
明显的。然后,被鉴定为具有指定的酶活性的克隆被测序,以鉴定编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
[0261] 本发明提供了在细胞中过度表达重组木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法,该方法包括表达含有本发明的核酸的载体,本发明的核酸例如包含在至少约100个
残基的区域上与本发明的序列具有至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、
58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、
73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的核酸序列的核酸,其中序列同一性通过用序列比对算法分析或通过视觉观察来测定,或在
严格条件下与本发明的核酸序列或其子序列杂交的核酸。过度表达可通过任何方式例如使
用高活性启动子、双顺反子(dicistronic)载体或通过该载体的基因扩增来实现。
[0262] 本发明的核酸可以在任何体外或体内表达系统中被表达或过度表达。任何细胞培养系统可被用于表达或过度表达重组蛋白,包括细菌、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物培养物。
通过启动子、增强子、载体(例如,复制子载体、双顺反子载体的使用(见,例如Gurtu(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.229:295-8))、培养基、培养系统等等的合适选择,可以实现过度表达。一方面,使用选择标记如谷氨酰胺合酶(见,例如Sanders(1987)Dev.Biol.
Stand.66:55-63)在细胞系统中进行的基因扩增被用于过度表达本发明的多肽。
[0263] 关于该方法的另外详述在公开文献中和/或对本领域普通技术人员是已知的。在具体的非限制性例示中,所述公开可获得的文献包括EP 0659215(W09403612A1)
(Nevalainen 等 );Lapidot,A.,Mechaly,A.,Shoham,Y.,“Overexpression
and single-steppurification of athermostable xylanase from Bacillus
stearothermophilus T-6,”J.Biotechnol.Nov 51:259-64(1996);Lüthi,E.,Jasmat,N.B.,Bergquist,P.L.,“Xylanasefrom the extremely thermophilic bacterium
Caldocellum saccharolyticum:overexpression of the gene in Escherichia coli
and characterization of the geneproduct,”Appl.Environ.Microbiol.Sep 56:
2677-83(1990);以及Sung,W.L.,Luk,C.K.,Zahab,D.M.,Wakarchuk,W.,“Overexpression of the Bacillus subtilis andcirculans xylanases in Escherichia coli,”Protein Expr. Purif.Jun 4:200-6(1993)——尽管这些参考文献没有教导本申请的创造性酶。
[0264] 宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞,包括原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。作为合适宿主的代表性例子,可以被提及的有:细菌细胞,例如埃希氏大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各个种;真菌细胞,例如曲霉菌属(Aspergillus);酵母细胞,例如毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或许旺酵母属中的任何种,包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或粟酒裂殖酵母;昆虫细胞,例如果蝇S2和草地夜蛾Sf9;动物细胞,例如CHO、COS或黑色素瘤细胞或腺病毒。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。
[0265] 载体可以使用各种技术中任何技术导入宿主细胞中,包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法或电穿孔(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。
[0266] 在适当的情况下,工程化宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养,所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被转化
和宿主株生长到合适的细胞密度之后,用合适的方法(例如,温度变化或化学诱导)诱导被
选择的启动子,细胞再培养一段时期,使得它们产生所需的多肽或其片段。
[0267] 细胞一般通过离心收获,通过物理或化学方法破碎,保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎,包括冷冻-融解
循环、超声波裂解法、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。
表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离
子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话,可以应用蛋白质重折叠来完成多肽的构象。
假如需要的话,在最终的纯化步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。
[0268] 各种哺乳动物细胞培养系统也可以被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系(由Gluzman,Cell,23:175,1981描述),以及能从相容载体表达蛋白的其它细胞系,如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
[0269] 宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。根据重组产生方法中所用的宿主,由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以糖基化或者未糖基
化。本发明的多肽也可以包括或不包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
[0270] 可选地,本发明氨基酸序列的多肽或包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个其连续氨基酸的片段可以通过常规肽合成仪合成产生。在其它方面,通过肽合
成,所述多肽的片段或部分可以被用于产生相应的全长多肽;因此,所述片段可用作产生全长多肽的中间体。
[0271] 也可以采用无细胞的翻译系统来产生本发明氨基酸序列的多肽之一或包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个其连续氨基酸的片段,其应用由DNA构建物转录得到的mRNA,所述DNA构建物包括与编码所述多肽或其片段的核酸可操作地连接的启
动子。在一些方面,该DNA构建物在进行体外转录反应之前可以被线性化。然后将转录得到的mRNA与合适的无细胞翻译提取物如兔网状细胞提取物温育,产生所需的多肽或其片段。
[0272] 核酸的扩增
[0273] 在本发明的实践中,本发明的核酸和编码本发明木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸,或本发明的修饰的核酸,可以通过扩增来增殖。扩增也可以被用于克隆或修饰本发明的核酸。因此,本发明提供了用于扩增本发明核酸的扩增引物序列对。本技术领域技术人员
能设计用于扩增这些序列的任何部分或全长的扩增引物序列对。
[0274] 一方面,本发明提供了通过本发明的扩增引物对扩增的核酸,所述扩增引物对例如本发明的核酸的大约前(5′)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基,或者互补链的大约前(5′)15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基所示的引物对。
[0275] 本发明提供了用于扩增核酸的扩增引物序列对,所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽,其中所述引物对能够扩增含有本发明的序列或其片
段或子序列的核酸。扩增引物序列对的一个成员或每一成员可以包含寡核苷酸,该寡核苷
酸包含所述序列的至少约10至50个连续碱基,或所述序列的约12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24或25个连续残基。本发明提供了扩增引物对,其中所述引物对包括第一成员和第二成员,第一成员具有本发明核酸的大约前(5’)12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24或25个残基所示的序列,第二成员具有第一成员的互补链的大约前(5’)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基所示的序列。本发明提供了通过扩增产生的木聚糖酶和/或葡聚糖酶,所述扩增例如聚合酶链反应(PCR),其使用本发
明的扩增引物对。本发明提供了通过扩增制备木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方
法,所述扩增例如聚合酶链反应(PCR),其使用本发明的扩增引物对。一方面,所述扩增引物对从文库例如基因文库诸如环境文库扩增核酸。
[0276] 扩增反应也可以被用于量化样品中核酸的量(如细胞样品中信息的量)、标记核酸(例如将其应用于阵列或印迹)、检测核酸,或量化样品中特异性核酸的量。在本发明的
一个方面,扩增从细胞或cDNA文库分离出的信息。
[0277] 技术人员可以选择和设计合适的寡核苷酸扩增引物。扩增方法在本技术领域也是熟知的,包括,例如聚合酶链式反应PCR(例如参见PCR PROTOCOLS,AGUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,ed.Innis,Academic Press,N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995),
ed.Innis,Academic Press,Inc.N.Y.,连接酶链式反应(LCR)(例如参见Wu(1989)
Genomics 4:560;Landegren(1988)Science 241:1077;Barringer(1990)Gene 89:117);
转录扩增(例如参见Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173);和自主维持序列复
制(例如参见Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874);Qβ复制酶扩增(例
如参见Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35:1477-1491),自动Q-β复制酶扩增测定法(例
如参见Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10:257-271)和其它的RNA聚合酶介导的技术(例
如NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario);也参见Berger(1987)Methods Enzymol.152:
307-316;Sambrook;Ausubel;美 国 专 利 4,683,195 和 4,683,202;Sooknanan(1995)Biotechnology 13:563-564。
[0278] 确定序列同一性程度
[0279] 本发明提供了核酸,所述核酸包含与本发明的示例性核酸(如上所限定),在至少大约50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多残基的区域内具有至少大约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、
61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、
76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的序列。本发明提供了多肽,该多肽包含与本发明的示例性多肽具有至少大约50%、51%、
52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、
67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、
82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的序列。序列同一性(同源性)的程
度可以使用任何计算机程序和相关参数来确定,包括本文描述的那些,如BLAST 2.2.2或
FASTA 3.0t78版本,参数为默认值。
[0280] 如本文所用,术语“计算机”、“计算机程序”和“处理器”以它们在最广的普通语境中的含义被使用,包括了所有这样的设备,例如下面所详细描述的。特定多肽或蛋白的“编码序列”或“编码特定多肽或蛋白的序列”是指当被置于适当的调控序列的控制下时可被转录和翻译成多肽或蛋白的核酸序列。
[0281] 短语“基本上相同(substantially identical)”在用于两个核酸或多肽时,是指当两个或更多个序列被比较和比对以寻找最大对应性(maximun correspondence)时,它们具有例如至少大约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、
62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、
77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、
92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的核苷酸或氨基酸残基(序列)同一性,所述同一性可以使用一种已知的序列比较算法测量,或者通过视觉观察。一般地,在至少约100个残基的区域内存在基本同一性以及最普遍地,序列在至少约150-200个残基上
是基本相同的。在一些方面,序列在编码区域的整个长度上是基本相同的。
[0282] 另外,“基本上相同的”氨基酸序列是通过一个或多个保守或非保守氨基酸的置换、缺失或插入而与参考序列有所不同的序列,特别是当这种置换发生在不是分子的活性
位点的位点,并且前提是多肽必需保持它的功能特性。保守的氨基酸置换,例如用一个氨基酸置换另一个相同类别的氨基酸(例如用一个疏水氨基酸,如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸,置换另一个疏水氨基酸,或用一个极性氨基酸置换另一个极性氨基酸,例如用精氨酸置换赖氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸,或用谷氨酰胺置换天冬酰胺)。可以例如从木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶多肽中删除一个或多个氨基酸,从而形成对多肽结构的
修饰,而又不会显著地改变其生物活性。例如,对木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的生物活性来说不需要的氨基或羧基末端氨基酸可以被去除。可以通过任何方法测定本发明
的修饰的多肽序列的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶生物活性,所述方法包括将所
述修饰的多肽序列和木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶底物接触,确定所述修饰的多
肽是否在该测定中减少特定底物的量或者增加功能性木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶多肽与底物的酶促反应的生物产物。
[0283] 本发明的核酸序列可以包含本发明的示例性序列和与其基本上相同的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续核苷酸。本发明的核酸序列可以包含同源序列以及核酸序列和与其基本上相同的序列的片段,是指与这些序
列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、
63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性(同源性)的序列。同源性可以使用本文所描述的任何计算机程序和参数来确定,包括FASTA 3.0t78版本,参数为默认
值。同源序列还包括RNA序列,其中尿嘧啶替代本发明核酸序列中的胸腺嘧啶。同源序列可以使用本文描述的任意一种方法获得,或者从对测序错误的纠正中产生。应该意识到,本发明的核酸序列和与其基本上相同的序列可以以传统的单字母形式表示(例如参见Stryer,
Lubert.Biochemistry,3rd Ed.,W.H Freeman &Co.,NewYork的内封底),或以在序列中记录核苷酸的身份的任何其它形式表示。
[0284] 在本专利说明书中别处表明的各种序列比对程序被特别考虑用于本发明的这方面。蛋白和/或核酸序列同源性可以使用本技术领域已知的任何各种序列比
较算法或程序来评价。这样的算法和程序包括,但不限于,TBLASTN、BLASTP、FASTA、
TFASTA 和 CLUSTALW(Pearson 和 Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448,
1988;Altschul 等,J.Mol.Biol.215(3):403-410,1990;Thompson 等,Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680,1994;Higgins等,Methods Enzymol.266:383-402,1996;Altschul等,J.Mol.Biol.215(3):403-410,1990;Altschul等,NatureGenetics 3:266-272,1993)。
[0285] 同源性或同一性通常使用序列分析软件来测量(例如,位于1710UniversityAvenue,Madison,WI 53705的威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组
(Genetics Computer Group)的序列分析软件包)。这样的软件通过对各种缺失、置换和其
它的修饰指定同源性程度来匹配相似的序列。在两个或者更多个核酸或者多肽序列的上下
文中,术语“同源性”和“同一性”是指这样的两个或者更多个序列或子序列,当两个或更多个序列或子序列在某一比较窗口(comparison window)或者指定区域内被比较和联配以确
定最大对应性时,这些序列是相同的,或者具有特定百分比例的相同氨基酸残基或核苷酸,其可以应用各种序列比较算法或者通过人工联配和视觉观察来确定。
[0286] 对于序列比较,通常将一个序列作为参考序列,而将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时,将测试序列和参考序列输入到计算机中,指定子序列坐标,如果必要,也指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数,或者可以指定别的参数。然后基于程序参数,序列比较算法计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0287] 如本文所用,“比较窗口”包括参考具有任意数目的连续位置的片段,所述数目选自从20到600、通常大约50到大约200,更经常大约100到大约150,其中在序
列和参考序列进行最优化联配后,序列可与具有相同数目的连续位置的参考序列作比
较。用于比较的联配方法在本技术领域是熟知的。可以通过如下方法进行用于比较的
序列的最优化联配:例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源
性算法,Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性联配算法,person和
Lipman,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的查询相似性的方法,这些算法
的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA
和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI),或者手工联配
和观察检验。除了BLAST程序(国家生物信息中心的基本局域联配搜索工具(Basic
Local Alignment Search Tool))外,用于确定同源性或者同一性的其它的算法包括,例
如,ALIGN、AMAS(多重联配序列分析(Analysis of Multiply Aligned Sequences))、
AMPS(蛋白多重序列联配(ProteinMultiple Sequence Alignment))、ASSET(联配片段
统计评估工具(Aligned SegmentStatistical Evaluation Tool))、BANDS、BESTSCOR、
BIOSCAN(生物学序列比较分析节点(Biological Sequence Comparative Analysis
Node))、BLIMPS(BLocksIMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman 算 法、DARWIN、
Las Vegas算法、FNAT(强迫核苷酸联配工具(Forced NucleotideAlignment Tool))、
Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FASP(Fristensky序列分析软件包)、GAP(全局联配程序(Global Alignment Program))、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(灵敏性序
列比较(Sensitive Sequence Comparison))、LALIGN(局部序列联配(Local Sequence
Alignment))、LCP(局部内容程序(LocalContent Program))、MACAW(多重联配构建和
分析工作台(Multiple AlignmentConstruction & Analysis Workbench))、MAP(多重
联配程序(Multiple AlignmentProgram))、MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多重序列
联配(Pattern-InducedMulti-sequence Alignment))、SAGA(通过遗传算法的序列联配
(Sequence Alignmentby Genetic Algorithm))和WHAT-IF。这样的联配程序也可以用于
筛查基因组数据库,以鉴定具有大体上相同的序列的多核苷酸序列。大量的基因组数据库
是可利用的,例如,作为人类基因组测序工程的一部分的人类基因组的实质部分可以被利
用。至少二十一个其它基因组已经被测序,包括如生殖器支原体(M.genitalium)(Fraser
等,1995)、甲烷球菌(M.jannaschii)(Bult等,1996)、流行性感冒杆菌(H.influenzae)
(Fleischmann等,1995)、大肠杆菌(E.coli)(Blattner等,1997)和酵母(酿酒酵母
(S.cerevisiae))(Mewes等,1997)和黑腹果蝇(D.melanogaster)(Adams等,2000)。在模
式生物的基因组序列的测序上已经取得了很大的进展,如小鼠,线虫(C.elegans)和拟南
芥(Arabadopsis sp.)。含有基因组信息并且注释有一些功能性信息的一些数据库由不同
组织维护,可以通过互联网访问
[0288] 可用算法的一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别被描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1997和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410,1990。用于实施BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心公开获得。这一算法涉及首
先通过鉴别待询序列(query sequence)中长度为W的短的字串来确定高分序列对(high
scoring sequence pairs,HSPs),所述高分序列对在与数据库序列中同样长度的字串联配时,匹配或者满足某些正值的阈值分数T。T是指邻近字串(neighborhood word)的分数阈
值(Altschul等,如上)。这些初始的邻近字串作为种子(seed)用来启动搜索以发现包含
有它们的更长的HSPs。只要累积的联配分数能够被增加,所述字串沿着每一个序列向两个
方向延伸。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配的残基的奖励分数;总是大于0)来计
算累积分数。对于氨基酸序列,使用记分矩阵来计算累计分数。出现下面情况时,字串在各个方向上的延伸便停止:累积的联配分数由达到的最大值下降了数量X;由于一个或者多
个记分为负的残基联配的累积,累积分数达到0或者0以下;或者延伸到了任一序列的末
端。BLAST算法的参数W、T和X决定了联配的灵敏度和速率。BLASTN程序(对于核苷酸序
列)使用的默认值的是:字串长度(W)为11,期望值(E)为10,M=5,N=-4,和对两条链
进行比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用的默认值的是:字串长度为3,期望值(E)为
10,BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,
1989)联配(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4,和对两条链进行比较。
[0289] BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见,例如,Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability,P(N)),其表示两个核苷酸或者氨基酸序
列间的匹配将偶然发生的概率。例如,在测试核酸和参考核酸的比较中,如果最小合计概率小于约0.2,更优选小于约0.01,最优选小于约0.001,就认为该核酸与参考序列相似。
[0290] 一方面,应用基本局域联配搜索工具(“BLAST”)来评价蛋白和核酸序列同源性。具体而言,五个特定的BLAST程序可以用来进行以下的任务:
[0291] (1)BLASTP和BLAST3将氨基酸待询序列与蛋白质序列数据库进行比较;
[0292] (2)BLASTN将核苷酸待询序列与核苷酸序列数据库进行比较;
[0293] (3)BLASTX将待询核苷酸序列(两条链)的六个阅读框架的概念上的翻译产物与蛋白序列数据库进行比较;
[0294] (4)TBLASTN将待询蛋白序列与核苷酸序列数据库的所有六个阅读框架(两条链)的翻译结果进行比较;和
[0295] (5)TBLASTX将核苷酸待询序列的六个框架的翻译结果与核苷酸序列数据库的六个框架的翻译结果进行比较。
[0296] BLAST程序通过确定相似片段来确定同源序列,所述相似片段在此是指在待查询的氨基酸或核酸序列与测序列之间的“高分片段对(high-scoring segmentpairs)”,该测序列优选从蛋白或者核酸序列数据库得到。高分片段对优选利用记分矩阵来鉴定(即,
联配),很多的记分矩阵在本领域是已知的。优选地,应用的记分矩阵为BLOSUM62矩阵
(Gonnet等,Science 256:1443-1445,1992);Henikoff和Henikoff,Proteins 17:49-61,
1993)。较不优选地,也可以应用PAM或者PAM250矩阵(参见如,Schwartz和Dayhoff,eds.,
1978,Matrices for Detecting DistanceRelationships:Atlas of protein Sequence
and Structure,Washingion:NationalBiomedical Research Foundation)。BLAST程序可从美国国家医学图书馆(U.S.National Library of Medicine)获得。
[0297] 根据所研究的序列长度和同源性程度,上述算法使用的参数可以被调整。在一些方面,在无用户的指示的情况下,所述参数可以是所述算法所采用的默认参数。
[0298] 计算机系统和计算机程序产品
[0299] 为了确定和鉴定序列同一性、结构同源性、基序和在计算机芯片上的类似物,本发明的核酸或多肽序列可以在可被计算机读取和访问的任何介质上存储、记录和操作。
[0300] 因此,本发明提供了计算机、计算机系统、计算机可读取的介质、计算机程序产品以及其上记录或存储了本发明的核酸和多肽序列的类似设备。如本文所用,词语“记录”和“存储”指在计算机介质上存储信息的过程。熟练的技术人员能容易地采用任何已知方法,在计算机可读取的介质上存储信息,以产生包括本发明的一个或多个核酸和/或多肽序列的产品。
[0301] 本发明的多肽包括本发明的示例性序列和与其基本上相同的序列及在前序列中任意一种的片段。基本上相同的、或同源的多肽序列是指与本发明的示例性序列,例如本
发明的多肽序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、
61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、
76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的(100%)序列同一性的多肽序列。
[0302] 同源性可以使用本文所描述的任何计算机程序和参数来确定,包括FASTA3.0t78版本,参数为默认值或使用任何改进的参数。同源序列可以使用本文描述的任意一种方
法获得,或者从对测序错误的纠正中产生。多肽片段包括本发明多肽或与其基本上相
同的序列的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、
450、500或更多个连续的氨基酸。应该意识到,本发明氨基酸序列或与其基本上相同的序
列的多肽代码可以以传统的单字母形式或三字母形式表示(参见上述Stryer,Lubert.
Biochemistry,3rd Ed.),或以在序列中描述多肽身份的任何其它形式表示。
[0303] 本发明的核酸或多肽序列可以在可被计算机读取和访问的任何介质上存储、记录和操作。如本文所用,词语“记录”和“存储”指在计算机介质上存储信息的过程。熟练的技术人员能容易地采用任何目前已知的方法,在计算机可读取的介质上存储信息,以产生
包括本发明核酸序列和与其基本上相同的序列中的一个或多个、本发明多肽序列和与其基
本上相同的序列中的一个或多个的产品。本发明的另一方面是其上记录有至少2、5、10、15或20或更多个本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的计算机可读取介质。
[0304] 本发明的另一方面是其上记录有本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的一个或多个的计算机可读取介质。本发明的另一方面是其上记录有本发明多肽序列和与其基
本上相同的序列的一个或多个的计算机可读取介质。本发明的另一方面是其上记录有至少
2、5、10、15或20或更多个如上面所述的序列的计算机可读取介质。
[0305] 计算机可读取介质包括磁性可读取介质、光学可读取介质、电子可读取介质和磁/光学介质。例如,计算机可读取的介质可以是硬盘软盘、磁带、CD-ROM、数字化多功能光盘(DVD)、随机访问存储器(RAM)或只读存储器(ROM)以及本领域的技术人员已知的其它类型的其它介质。
[0306] 本发明的方面包括系统(例如基于因特网的系统),特别是计算机系统,它们存储和操纵本文描述的序列信息。计算机系统100的一个实例以框图形式示意性地描述在图1
中。如本文所用,“计算机系统”指硬件部分、软件部分以及数据存储部分,它们用于分析本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的核苷酸序列或本发明氨基酸序列中所阐述的多
肽序列。计算机系统100通常包括用于处理、访问和操纵序列数据的处理器。处理器105可
以是任何熟知类型的中央处理单元,如来自英特尔公司的奔腾III,或来自Sun、Motorola、Compag、AMD或国际商业机器(IBM)公司的类似处理器。
[0307] 计算机系统100通常是一个通用的系统,该系统包括处理器105和用于存储数据的一个或多个内部数据存储部件110,以及用于检索数据存储部件上存储的数据的一个或
多个数据检索设备。技术人员能容易地意识到,任何一种当前可获得的计算机系统都是合
适的。
[0308] 在一个特定的方面,计算机系统100包括连接到总线上的处理器105,总线连接到主存储器115(优选以RAM来实现),和一个或多个内部数据存储设备110,例如其上已经存
储了数据的硬盘驱动器和/或其它计算机可读介质。在一些方面,计算机系统100进一步
包括一个或多个数据检索设备118,用于读取在内部数据存储设备110上存储的数据。
[0309] 数据检索设备118可以是,例如软盘驱动器、压缩磁盘驱动器、磁带驱动器或能连接到远程数据存储系统的调制解调器(例如通过因特网)等等。在一些方面中,内部数据存储设备110是可移动的计算机可读介质,例如含有控制逻辑和/或其上记录的数据的软盘、
压缩磁盘、磁带等等。计算机系统100可以有利地包括适当的软件或用适当的软件编程,用于当数据存储部件被插入到数据检索设备中时从数据存储部件读取控制逻辑和/或数据。
[0310] 计算机系统100包括显示器120,用于给计算机用户显示输出。也应用注意到,计算机系统100可以被连接到网络或广域网中的其它计算机系统125a-c,以便向计算机100
提供集中访问。
[0311] 用于访问和处理本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的核苷酸或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列的软件(例如,检索工具、比较工具和建模工具等等)在执
行过程中可驻留于主存储器115中。
[0312] 在一些方面,计算机系统100可以进一步包括序列比较算法,其用于比较存储于计算机可读介质上的本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其
基本上相同的序列与存储于计算机可读介质上的参考核苷酸或多肽序列。“序列比较算法”指在计算机系统100上执行(本地或远程)的一种或多种程序,以比较核苷酸序列和数据
存储设备中存储的其它核苷酸序列和/或化合物。例如,序列比较算法可以将计算机可读
介质上存储的本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的核苷酸序列或本发明多肽序列
和与其基本上相同的序列与计算机可读介质上存储的参考序列进行比较,以鉴定同源性或
结构基序。
[0313] 图2是示意性说明过程200的一个方面的流程图,该过程用于将新的核苷酸或蛋白序列与序列数据库进行比较,以便确定新序列和数据库中的序列之间的同源性水平。序
列数据库可以是存储于计算机系统100上的私人数据库,或可以通过因特网获得的公共数
据库如GENBANK。
[0314] 过程200在起始状态201开始,然后转到状态202,其中要被比较的新序列被存储于计算机系统100的存储器上。正如上面所讨论的,该存储器可以是任何类型的存储器,包括RAM或内部存储设备。
[0315] 然后过程200转到状态204,其中打开序列数据库以进行分析和比较。然后过程200转到状态206,其中数据库中存储的第一个序列被读取到计算机的存储器中。然后在状
态210进行比较,以确定第一个序列是否与第二个序列相同。重要的是应该注意到,该步骤不限于进行新序列和数据库中第一个序列之间的精确比较。用于比较两个核苷酸或蛋白序
列的熟知的方法对于本技术领域的普通技术人员是已知的,即使所述两个核苷酸或蛋白序
列不相同。例如,可以在一个序列中引入空位,以提高两个测试序列之间的同源性水平。控制空位或其它特征在比较过程中是否被引入到序列中的参数通常由计算机系统的用户输
入。
[0316] 一旦已经在状态210进行两个序列的比较,在决策状态210就要作出两个序列是否相同的判断。当然,术语“相同的”不限于绝对相同的序列。在过程200中,在由用户输入的同源性参数范围内的序列都将被标记为“相同的”。
[0317] 如果作出两个序列相同的判断,过程200转到状态214,其中来自数据库的序列的名称被显示给用户。该状态通知用户,具有显示的名称的序列满足所输入的同源性限制。一旦所存储序列的名称被显示给用户,过程200转到决策状态218,其中作出数据库中是否存
在更多序列的判断。如果数据库中不存在更多的序列,那么过程200在结束状态220终止。
然而,如果数据库中确实存在更多的序列,那么过程200转到状态224,其中指针被指向数
据库中的下一个序列,以便与新序列进行比较。以这种方式,将新序列与数据库中的每一序列联配并进行比较。
[0318] 应该注意到,如果已经在决策状态212已经作出了序列不同源的判断,那么过程200将立即转到决策状态218,以便确定用于比较的数据库中的任何其它序列是否可利用。
[0319] 因此,本发明的一个方面是计算机系统,该系统包括处理器、其上已经存储了本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列的数据存储设备、其上以可检索方式存储了待与本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发
明多肽序列和与其基本上相同的序列比较的参考核苷酸序列或多肽序列的数据存储设备、
以及用于进行比较的序列比较器。该序列比较器可以指出被比较的序列之间的同源性水
平,或鉴定上述的本发明核酸序列和与其基本上相同的序列的核酸密码或者本发明多肽序
列和与其基本上相同的序列中的结构基序,或者该比较器可以鉴定与这些核酸密码和多肽
密码进行比较的序列中的结构基序。在一些方面中,数据存储设备可以在其上已经存储了
至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列的序列。
[0320] 本发明的另一方面是确定本发明核酸序列及与其基本上相同的序列或本发明多肽序列及与其基本上相同的序列和参考核苷酸序列之间的同源性水平的方法。所述方法包
括通过使用确定同源性水平的计算机程序读取核酸代码或多肽代码以及参考核苷酸或多
肽序列,以及用该计算机程序确定核酸代码或多肽代码与参考核苷酸或多肽序列之间的同
源性。所述计算机程序可以是确定同源性水平的许多计算机程序的任何一种,包括本文中
具体罗列的那些程序(例如,BLAST2N,具有默认参数或任何调整的参数)。所述方法可以
使用上述的计算机系统执行。所述方法还可以如下进行:通过使用所述计算机程序读取至
少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个上述的本发明的核酸序列或本发明的多肽序列,以及确定核酸代码或多肽代码与参考核苷酸序列或多肽序列之间的同源性。
[0321] 图3是示意性说明计算机中的过程250的一个方面的流程图,该过程用于确定两个序列是否同源。过程250在起始状态252开始,然后转到状态254,其中要被比较的第一
个序列被存储到存储器上。然后要被比较的第二个序列在状态256被存储到存储器上。然
后过程250转到状态260,其中读取第一个序列中的第一个字符,然后转到状态262,其中读取第二个序列的第一个字符。应该理解到,如果序列是核苷酸序列,那么字符将通常是A、T、C、G或U。如果序列是蛋白序列,那么字符优选是单字母氨基酸代码,以便第一个序列和第二个序列可以被容易地比较。
[0322] 然后在决策状态264作出两个字符是否相同的判断。如果它们相同,那么过程250转到状态268,其中第一个和第二个序列中的下一个字符被读取。然后作出该下一个字符是否相同的判断。如果它们相同,那么过程250继续循环,直到两个字符不相同。如果作出的判断是这两个字母不相同,那么过程250转到决策状态274,以确定是否有更多的字符或者
序列可以读取。
[0323] 如果没有可读取的任何更多的字符,那么过程250转到状态276,其中第一个和第二个序列之间的同源性水平被显示给用户。同源性水平通过计算序列之间相同的字符在第
一个序列的序列总数中的比例来确定。因此,如果前100个核苷酸序列中的每一个字符都
与第二个序列中的每一个字符联配,那么同源性水平将是100%。
[0324] 可以选择地,计算机程序可以是这样的计算机程序,其将本发明所示的核酸序列的核苷酸序列与一个或多个参考核苷酸序列进行比较,以确定本发明核酸序列和与其基本
上相同的序列的核酸代码是否在一个或多个位置上与参考核酸序列不同。在一个方面,这
样的程序记录了,相对于参考多核苷酸序列或者本发明核酸序列和与其基本上相同的序
列,被插入、删除或置换的核苷酸的长度和身份。一方面,计算机程序可以是确定本发明的核酸序列和与其基本上相同的序列是否相对于参考核苷酸序列含有单核苷酸多态性(SNP)
的程序。
[0325] 本发明的另一方面是确定本发明核酸序列和与其基本上相同的序列是否在一个或多个核苷酸处与参考核苷酸序列不同的方法,所述方法包括通过使用鉴定核酸序列之间
的差异的计算机程序读取核酸代码和参考核苷酸序列,并用该计算机程序鉴定核酸代码和
参考核苷酸序列之间的差异的步骤。在一些方面,计算机程序是鉴定单核苷酸多态性的程
序。该方法可以通过上面描述的计算机系统和图3所示意性说明的方法执行。所述方法还
可以如下进行:通过使用所述计算机程序读取至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个本发明核酸序列及与其基本上相同的序列和参考核苷酸序列,以及用该计算机程序鉴定核
酸代码与参考核苷酸序列之间的差异。
[0326] 在其它方面,基于计算机的系统可以进一步包括鉴定器,其用于鉴定本发明核酸序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列中的特征。
[0327] “鉴定器”指在本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列中鉴定某些特征的一个或多个程序。一方面,鉴定器可以包括在本发
明核酸序列和与其基本上相同的序列中鉴定开放阅读框(ORF)的程序。
[0328] 图4是示意性说明鉴定器过程300的一个方面的流程图,用于检测序列中特征的存在。过程300在起始状态302开始,然后转到状态304,其中将被检查特征的第一个序
列存储在计算机系统100的存储器115上。然后过程300转到状态306,其中打开序列特
征数据库。这样的数据库包括每一特征的属性以及该特征的名称的列表。例如,特征名称
可以是“起始密码子”,属性将是“ATG”。另一个实例是特征名称“TAATAA序列盒”,特征属性是“TAATAA”。这样的数据库的实例由威斯康星大学遗传学计算机组(University of
Wisconsin Genetics Computer Group)开发。可以选择地,这些特征可以是结构多肽基序
如α螺旋、β折叠,或功能多肽基序如酶促活性位点、螺旋-转角-螺旋基序或本技术领
域技术人员已知的其它基序。
[0329] 一旦在状态306打开特征数据库,过程300就转到状态308,其中从数据库读取第一个特征。然后在状态310将第一个特征的属性与第一个序列进行比较。接着在决策状态
316作出在第一个序列中是否发现该特征的属性的判断。如果发现了属性,那么过程300转
到状态318,其中所发现的特征的名称被显示给用户。
[0330] 然后,过程300转到决策状态320,其中作出数据库中是否存在更多特征的判断。如果不存在更多特征,那么过程300在结束状态324终止。然而,如果数据库中确实存在更
多的特征,那么过程300在状态326读取下一个序列特征,循环回到状态310,其中将下一
个特征的属性与第一个序列进行比较。应当注意,如果在决策状态316在第一个序列中没
有发现特征属性,那么过程300直接转到决策状态320,以便确定数据库中是否存在更多特
征。
[0331] 因此,本发明的另一方面是鉴定本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列中的特征的方法,所述方法包括通过使用鉴定其中特
征的计算机程序读取核酸代码或多肽代码,并用该计算机程序鉴定核酸代码中的特征。一
方面,计算机程序包括鉴定开放阅读框的计算机程序。所述方法可以如下进行:通过使用所述计算机程序读取本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基
本上相同的序列中的单个序列或至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个序列,以及用该计算机程序鉴定核酸代码或多肽代码中的特征。
[0332] 本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列可以以多种形式在各种数据处理器程序中存储和操作。例如,本发明核酸序列和与
其基本上相同的序列或本发明多肽序列和与其基本上相同的序列可以以文本文件存储在
TM TM
字处理文件中,如Microsoft WORD 或WORDPERFECT ,或以ASCII文件存储在本领域技术
TM TM TM
人员熟悉的各种数据库程序中,例如DB2 、SYBASE 或ORACLE 。此外,许多计算机程序和
数据库可以被用作序列比较算法、鉴定器或与本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或
本发明多肽序列和与其基本上相同的序列进行比较的参考核苷酸序列或多肽序列的来源。
下面的罗列不意图限制本发明,而是提供对本发明核酸序列和与其基本上相同的序列或本
发明多肽序列和与其基本上相同的序列有用的程序和数据库的指导。
[0333] 可 以 使 用 的 程 序 和 数 据 库,包 括 但 不 限 于:MacPattern(EMBL)、DiscoveryBase(Molecular Applications Group)、GeneMine(Molecular ApplicationsGroup)、Look(Molecular Applications Group)、MacLook(Molecular Applications
Group)、BLAST 和 BLAST2(NCBI)、BLASTN 和 BLASTX(Altschul 等,J.Mol.Biol.215:
403,1990)、FASTA(Pearson 和 Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444,1988)、
FASTDB(Brutlag 等 .Comp.App.Biosci.6:237-245,1990)、Catalyst(Molecular
2
SimulationsInc.)、Catalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)、Cerius .
DBAccess(MolecularSimulations Inc.)、HypoGen(Molecular Simulations Inc.)、
Insight II(MolecularSimulations Inc.)、Discover(Molecular Simulations Inc.)、
CHARMm(MolecularSimulations Inc.)、Felix(Molecular Simulations Inc.)、
DelPhi(Molecular SimulationsInc.)、QuanteMM(Molecular Simulations Inc.)、
Homology(Molecular Simulations Inc.)、Modeler(Molecular Simulations Inc.)、
ISIS(Molecular Simulations Inc.)、Quanta/ProteinDesign(Molecular Simulations
Inc.)、WebLab(Molecular Simulations Inc.)、WebLabDiversity Explorer(Molecular
Simulations Inc.)、Gene Explorer(Molecular SimulationsInc.)、SeqFold(Molecular Simulations Inc.)、MDL Available Chemicals Directory数据库、MDL Drug Data Report数据库、Comprehensive Medicinal Chemistry数据库、Derwents’s World Drug Index数据库、BioByteMasterFile数据库、Genbank数据库和Genseqn数据库。基于本发明的公开
内容,许多其它程序和数据库对于本技术领域的技术人员是显而易见的。
[0334] 可以用上述程序检测的基序包括:编码亮氨酸拉链的序列、螺旋-转角-螺旋基序、糖基化位点、泛素化位点、α螺旋和β折叠、编码指导被编码的蛋白分泌的信号肽的信号序列、在转录调节中涉及的序列如同源框、酸性伸展物(acidicstretches)、酶促活性位点、底物结合位点和酶切割位点。
[0335] 核酸的杂交
[0336] 本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸,所述核酸与本发明的示例性序列在严格条件下杂交。严格条件可以是高严格条件、中等严格条件和/或低严格条件,包括本文描述的高的和降低的严格性的条件。一方面,正如下面所讨论的,洗涤条件的严格性阐述了决定核酸是否在本发明范围内的条件。
[0337] 在可以选择的方面中,本发明的核酸,正如通过它们在严格条件下杂交的能力所定义的,可以在本发明的核酸的大约五个残基到全长之间;例如它们的长度可以是至少5、
10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、
500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多残基。也包括小于全长的核酸。
这些核酸可以用作,例如杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA(单链或双链)、反义或编码抗体结合肽(表位)、基序、活性位点的序列以及类似序列。
[0338] 一方面,本发明的核酸通过它们在高度严格性下杂交的能力定义,高度严格性包括在大约37℃到42℃的温度下大约50%的甲酰胺的条件。一方面,本发明的核酸通过它们
在降低的严格性下杂交的能力定义,降低的严格性包括在大约30℃到35℃在大约35%至
25%的甲酰胺中的条件。
[0339] 可以选择地,本发明的核酸通过它们在高度严格性下杂交的能力定义,高度严格性包括的条件为:在42℃、在50%甲酰胺、5×SSPE、0.3%SDS中,和封闭核酸的重复序列,如cot-1或鲑精DNA(例如200μg/ml的剪切和变性鲑精DNA)。一方面,本发明的核酸通过
它们在降低的严格性条件下杂交的能力定义,降低的严格性条件包括在35℃的降低温度下
的35%甲酰胺中。
[0340] 在核酸杂交反应中,用于得到特定严格性水平的条件将根据杂交中的核酸的性质变化。例如,所述核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)
和核酸类型(例如RNA和DNA)可以在选择杂交条件时加以考虑。另外的考虑因素是核酸
之一是否被固定,例如固定在滤膜上。
[0341] 杂交可以在低度严格性、中度严格性或高度严格性的条件下进行。作为核酸杂交的一个实例,含有固定化的变性核酸的聚合物膜首先在45℃在由如下成分组成的溶液中预
杂交30分钟:0.9M NaCl、50mM NaH2PO4,pH 7.0、5.0mM Na2EDTA、0.5%SDS、10×Denhardt’s
7 8
和0.5mg/ml多核糖腺苷酸。然后在该溶液中加入大约2×10cpm(比活性为4-9×10cpm/
32
ug)的 P末端标记的寡核苷酸探针。在温育12-16小时后,在室温下在含有0.5%SDS的
1×SET(150mM NaCl、20mM Tris盐酸,pH 7.8、1mM Na2EDTA)中将膜洗涤30分钟,随后,在该寡核苷酸探针的Tm-10℃的温度,在新鲜的1×SET中洗涤30分钟。然后将膜暴露于放射
自显影胶片,以检测杂交信号。
[0342] 所有的前述杂交将被认为是在高严格条件下。
[0343] 杂交后,洗涤滤膜以除去任何非特异性结合的可检测探针。用于洗涤滤膜的严格性也可以根据如下方面进行变化:被杂交的核酸的性质、被杂交的核酸的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)和核酸类型(例如RNA和DNA)。逐步增高的严格性
洗涤条件的实例如下:2×SSC,0.1%SDS,室温下洗涤15分钟(低度严格性);0.1×SSC,
0.5%SDS,室温下洗涤30分钟到1小时(中度严格性);0.1×SSC,0.5%SDS,在杂交温度
至68℃之间洗涤15到30分钟(高度严格性);和0.15M NaCl,72℃洗涤15分钟(极高严
格性)。最终的低严格性洗涤可以在0.1×SSC在室温下进行。上述的实例仅仅是可用于洗
涤滤膜的一组条件的示例性说明。本领域技术人员将知道,对于不同严格性的洗涤,可以有多种方案。下面给出了一些其它实例。
[0344] 通过放射自显影或其它常规技术,来鉴定已杂交至探针的核酸。
[0345] 可以对上述方法进行修改,以鉴定与探针序列具有降低水平的同源性的核酸。例如,为了获得与可检测的探针具有降低的序列同源性的核酸,可以使用较低严格性的条件。
+
例如,杂交温度可以以5℃的增量从68℃降低到42℃,杂交缓冲液的Na 浓度为大约1M。在
杂交后,用2×SSC、0.5%SDS在杂交温度下洗涤滤膜。这些条件在高于50℃被认为是“中
度”条件,在低于50℃被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在
55℃进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在45℃进行。
[0346] 可以选择地,杂交可以在含有甲酰胺的缓冲液如6×SSC中在42℃的温度下进行。在这种情况下,杂交缓冲液中甲酰胺的浓度可以以5%的增量从50%降低到0%,以鉴定与
探针具有降低水平的同源性的克隆。在杂交后,用6×SSC、0.5%SDS在50℃洗涤滤膜。这
些条件在高于25%的甲酰胺被认为是“中度”条件,在低于25%甲酰胺被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在30%甲酰胺中进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在10%甲酰胺中进行。
[0347] 然而,杂交形式的选择不是关键性的——洗涤条件的严格性是决定核酸是否在本发明范围内的条件。用于鉴定本发明范围内的核酸的洗涤条件包括,例如:在pH 7大约
0.02M的盐浓度,至少大约50℃或大约55℃到大约60℃的温度;或者在72℃大约0.15M
NaCl的盐浓度下大约15分钟;或者在至少大约50℃或大约55℃到大约60℃的温度下大约
0.2×SSC的盐浓度下大约15到大约20分钟;或者用溶液将杂交复合物洗涤两次,所述溶
液的盐浓度为含有0.1%SDS的大约2×SSC,在室温下洗涤15分钟,然后用含有0.1%SDS
的0.1×SSC在68℃洗涤15分钟,洗涤两次;或者等同的条件。参见Sambrook,Tijssen和
Ausubel对于SSC缓冲液和等同条件的描述。
[0348] 这些方法可以被用于分离本发明的核酸。例如,前述方法可用于分离核酸,所述核酸具有与选自本发明序列及与其基本上相同的序列或其含有至少大约10、15、20、25、30、
35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基的片段以及其互补序列之一的核酸序列具有至少约97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%同源性的序列。同源性可以使用联配算法来测
量。例如,同源多核苷酸可以具有编码序列,该编码序列是本文描述的编码序列之一的天然发生的等位基因变体。当与本发明核酸或其基本上互补的序列比较时,这样的等位基因变
体可以具有一个或多个核苷酸的置换、删除或添加。
[0349] 另外,上述的方法可用于分离编码多肽的核酸,所述多肽与具有本发明氨基酸序列之一的序列的多肽或者其包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段具有至少大约99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%的同源性,正如使用序列联配算法
(例如FASTA 3.0t78版本算法,参数为默认值)所测定的。
[0350] 寡核苷酸探针及使用这些寡核苷酸探针的方法
[0351] 本发明也提供了核酸探针,例如可以用于鉴定编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽的核酸或其片段,或用于鉴定木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的基因。一方面,该探针包括本发明核酸中的至少大约10个连续碱基。可以选择地,本发明的探针可以是如本发明核酸中所示序列的至少大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150或大约10到50、大约20到60或大约30到70个连续碱基。这些探针通过结合和/或杂交来鉴
定核酸。这些探针可以在本发明的阵列中使用,参见下面的讨论,包括例如毛细管阵列。本发明的探针也可以用于分离其它核酸或多肽。
[0352] 本发明的分离的核酸及与其基本上相同的序列、与其互补的序列、或含有本发明序列及与其基本上相同的序列之一的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、
300、400或500个连续碱基的片段、或与其互补的序列,也可用作探针,以确定生物样品如土壤样品是否含有具有本发明的核酸序列的生物体或从中可得到所述核酸的生物体。在这
样的方法中,获得潜在地具有从中可分离出所述核酸的生物体的生物样品,并从样品中获
得核酸。将这些核酸在允许探针与样品中存在的任何互补序列特异性杂交的条件下与探针
接触。
[0353] 在必要的时候,允许探针与互补序列特异性杂交的条件,可以通过将探针与来自样品的互补序列以及对照序列进行接触来确定,所述样品已知含有互补序列,所述对照序
列不含有互补序列。杂交条件,如杂交缓冲液的盐浓度、杂交缓冲液的甲酰胺浓度或杂交温度,可以被改变以确定允许探针与互补核酸特异性杂交的条件。
[0354] 如果该样品含有从中可分离出核酸的生物体,那么探针的特异性杂交被检测到。杂交可以通过用可检测的试剂标记探针来检测,所述可检测的试剂如放射性同位素、荧光
染料或能催化可检测产物形成的酶。
[0355] 使用标记探针来检测样品中互补核酸的存在的许多方法对于本领域技术人员是熟知的。这些方法包括DNA印迹法、RNA印迹法、集落杂交方法和斑点印迹法。这些方法中的每一种方法的方案在Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley
503 Sons,Inc.(1997)和Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中提供。
[0356] 可以选择地,一种以上的探针(其中至少一种探针能与核酸样品中存在的任何互补序列特异性杂交)可以在扩增反应中使用,以确定样品是否包含含有本发明的核
酸序列的生物体(例如从中可分离出所述核酸的生物体)。这些探针通常包括寡核苷
酸。一方面,扩增反应可以包括PCR反应。PCR实验方案在Ausubel和Sambrook,同上
中有所描述。可选地,扩增可以包括连接酶链式反应、3SR或链置换反应(见Barany,
F.,″The Ligase Chain Reaction in a PCR World″,PCR Methods andApplications
1:5-16,1991;E.Fahy 等, ″ Self-sustained Sequence Replication(3SR):
AnIsothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR″,
PCRMethods and Applications 1:25-33,1991;以 及 Walker G.T. 等, ″ Strand
DisplacementAmplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification
Technique″,Nucleic AcidResearch 20:1691-1696,1992)。在这样的方法中,将样品中的核酸与探针接触,进行扩增反应,检测任何所得的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳并用嵌入剂如溴化乙锭对凝胶进行染色来检测。可以选择地,可以用放射性
同位素标记一种或多种探针,放射性扩增产物的存在在凝胶电泳后通过放射自显影术来检
测。
[0357] 衍生自本发明核酸及与其基本上相同的序列的末端附近的序列的探针也可以在染色体步移(chromosome walking)方法中使用,以鉴定含有临近本发明序列及与其基本上
相同的序列的基因组序列的克隆。这样的方法允许从宿主生物中分离编码额外蛋白的基
因。
[0358] 本发明的分离的核酸及与其基本上相同的序列、与其互补的序列、或含有本发明序列及与其基本上相同的序列之一的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、
250、300、400或500个连续碱基的片段、或与其互补的序列,可被用作探针,以鉴定和分离相关的核酸。在一些方面,该相关的核酸可以是来自生物体的cDNA或基因组DNA,这些生物体并不是从中分离出所述核酸的生物体。例如,其它生物体可以是相关生物体。在这样的
方法中,核酸样品在允许探针与相关序列特异性杂交的条件下与探针接触。然后用上面描
述的任意一种方法检测探针与来自相关生物体的核酸的杂交。
[0359] 通过改变用于鉴定与可检测探针杂交的核酸例如cDNA或基因组DNA的杂交条件的严格性,可以鉴定并分离与探针具有不同同源性水平的核酸。严格性通过在低于探针的
解链温度的变化温度下进行杂交来改变。解链温度Tm是50%的靶序列与完全互补的探针
杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件,使其与特定探针的Tm
相等,或比Tm低大约5℃。可以使用下述公式计算探针的解链温度:
[0360] 对于长度在14到70个核苷酸的探针,使用如下公式计算解链温度(Tm):Tm=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(600/N),其中N是探针的长度。
[0361] 如果杂交在含有甲酰胺的溶液中进行,解链温度使用如下等式计算:Tm=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(0.63%甲酰胺)-(600/N),其中N是探针的
长度。
[0362] 预杂交可以在6×SSC、5×Denhardt’s试剂、0.5%SDS、100μg变性的片段化鲑精DNA或6×SSC、5X Denhardt’s试剂、0.5%SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、50%甲
酰胺中进行。SSC和Denhardt’s溶液的配方在Sambrook等,如上列出。
[0363] 杂交通过将可检测探针加入到上面所列出的预杂交溶液中来进行。在探针包含双链DNA的情况下,在加入到杂交溶液之前对探针变性。将滤膜与杂交溶液接触充足的时间,以允许探针与含有与其互补的序列或与其同源的序列的cDNA或基因组DNA杂交。对于长
度超过200个核苷酸的探针,杂交可以在比Tm低15至25℃的温度进行。对于更短的探针,
如寡核苷酸探针,杂交在比Tm低5-10℃的温度进行。通常对于6×SSC中的杂交,杂交在大
约68℃进行。经常是,对于在包含50%甲酰胺的溶液中的杂交,杂交是在大约42℃进行的。
[0364] 抑制糖基水解酶表达
[0365] 本发明提供了与本发明的核酸例如编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸互补的核酸(例如本发明的核酸的反义序列)。反义序列能抑制编码木聚糖酶和/或葡聚糖酶的
基因的转运、剪接或转录。抑制可通过将基因组DNA或信使RNA作为靶标来实现。作为靶
标的核酸的转录或功能可以被抑制,例如通过杂交和/或切割。本发明提供的一组特别有
用的抑制剂包括寡核苷酸,这些寡核苷酸或者能结合木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖
酶的基因或信息,在任一种情况下阻止或抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶产生
或功能。结合可通过序列特异性杂交来完成。另一类有用的抑制剂包括引起木聚糖酶、甘
露聚糖酶和/或葡聚糖酶的信息失活或切割的寡核苷酸。该寡核苷酸可具有引起此类切割
的酶活性,如核酶。可以对寡核苷酸进行化学修饰,或与能切割互补核酸的酶或组分偶联。
可以对许多不同的这样的寡核苷酸的库进行筛选来寻找那些具有期望活性的寡核苷酸。因
此,本发明提供了在核酸和/或蛋白水平抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表达的
各种组合物,例如,含有本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列的反义序列、iRNA和核酶,以及本发明的抗木聚糖酶和/或抗葡聚糖酶的抗体。
[0366] 木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表达的抑制可以具有各种工业、医学、药学、研究、食物和饲料以及食物和饲料补充剂加工及其它应用和过程。例如,抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的表达可以减慢或防止腐败(spoilage)。当多糖,例如结构多
糖被酶降解时,可发生腐败。这可以导致水果和蔬菜的变质或腐烂。一方面,本发明的抑制木聚糖酶和/或葡聚糖酶的表达和/或活性的组合物的使用,例如抗体、反义寡核苷酸、核
酶和iRNA的使用,被用于减慢或防止腐败。因此,一方面,本发明提供了方法和组合物,包括将本发明的抗体、反义寡核苷酸、核酶和iRNA应用于植物或者植物产品(如,谷物、谷粒、果实、种籽、根、叶等),以阻止或者延缓腐败。这些组分也可以由植物(如,转基因植物)或者其它生物(如,用本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的基因转化的细菌或者
其它微生物)表达。
[0367] 用于抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表达的本发明的组分(例如,反义序列、iRNA、核酶、抗体)可用作药物组合物,例如,抗病原体剂,或用在其它治疗中,例如用作抗微生物剂,如用于沙门氏菌属。
[0368] 反义寡核苷酸
[0369] 本发明提供了能结合木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的信息的反义寡核苷酸,其能通过以mRNA作为靶标来抑制木聚糖水解酶活性(例如催化水解内β-1,4-木糖
苷键)。设计反义寡核苷酸的策略在科学和专利文献中有很好的描述,技术人员能使用本
发明的新试剂设计这样的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶寡核苷酸。例如,筛选有
效的反义寡核苷酸的基因步移/RNA作图方案在本技术领域是熟知的,例如参见Ho(2000)
Methods Enzymol.314:168-183,该文献描述了RNA作图分析法,该分析法是基于标准的分子技术,以提供用于有效的反义序列选择的一种简单且可靠的方法。也参见Smith(2000)
Eur.J.Pharm.Sci.11:191-198。
[0370] 自然存在的核酸被用作反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸可以是任意长度;例如,在可选择的方面,该反义寡核苷酸在大约5到100之间,大约10到80之间,大约15到60之间,大约18到40之间。最适长度可以通过常规筛选来决定。这些反义寡核苷酸可以以任意
浓度存在。最适浓度可通过常规筛选来决定。广泛种类的合成的、非天然发生的核苷酸和核酸类似物是已知的,它们可以解决这一潜在的问题。例如,可以使用含有非离子骨架的肽核酸(PNAs),如含有N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。也可以使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核
苷酸,正如在如下文献中所描述的:WO 97/03211;WO 96/39154;Mata(1997)Toxicol Appl Pharmacol144:189-197;Antisense Therapeutics,ed.Agrawal(Humana Press,Totowa,N.J.,1996)。正如上面所描述的,本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义寡核苷酸
也可以包括二硫代磷酸酯、甲基膦酸、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫代乙缩醛、亚甲基(甲基亚氨)、3’-N-氨基甲酸酯和吗啉代氨基甲酸酯核酸。
[0371] 组合化学方法学可用于产生大量能被快速筛选特异性寡核苷酸的寡核苷酸,所述特异性寡核苷酸对任何靶标具有适当的结合亲和性和特异性,例如本发明的木聚糖酶、
甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶正义和反义序列(例如参见Gold(1995)J.,Biol.Chem.270:
13581-13584)。
[0372] 抑制性核酶
[0373] 本发明提供了能结合木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的信息的核酶。这些核酶能通过例如以mRNA作为靶标来抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的活性。设
计核酶和选择用于靶向的木聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性反义序列的策略在科学和专利
文献中有很好的描述,熟练的技术人员能使用本发明的新试剂来设计这样的核酶。核酶通
过核酶的靶RNA结合部分来与靶RNA结合,从而发挥作用,核酶的靶RNA结合部分与该RNA
上切割靶RNA的酶促部分非常接近。这样,通过互补的碱基配对,核酶识别和结合靶RNA,而且一旦结合于正确的位置,便以酶促活性作用来切割靶RNA和使其失活。如果切割发生在
编码序列中,以这样的方式切割靶RNA将会破坏其引导合成编码的蛋白的能力。核酶结合
和切割其RNA靶之后,它可以从结合的RNA上释放出来并且重复切割新的靶标。
[0374] 在一些情况下,核酶的酶促性质会优于其它的技术,如反义技术(其中核酸分子仅结合于核酸靶标来阻止其转录、翻译或者与其它分子的结合),因为实现治疗效果所必要的核酶有效浓度可能低于反义寡核苷酸的浓度。这一潜在的优点反映出核酶可以以酶促方
式进行作用的能力。因此,单个核酶分子可以切割多个靶RNA的分子。另外,核酶通常是高度特异性的抑制物,其抑制作用的特异性不仅依赖于碱基配对的结合机制,也依赖于该分
子抑制与其结合的RNA的表达的机制。即,所述抑制是由切割靶RNA引起的,因此特异性定
义为靶RNA的切割率与非靶RNA的切割率的比值。除了涉及碱基配对的那些因素,这种切
割机制还依赖于另外的因素。这样,核酶作用的特异性比结合于同样的RNA位点的反义寡
核苷酸高。
[0375] 本发明的核酶,例如,具有酶活的核酶RNA分子,可以形成锤头状基序、发夹基序,如肝炎δ病毒基序、I类内含子基序和/或与RNA前导序列(guide sequence)相
联系的RNaseP样RNA。锤头状基序的例子在如Rossi(1992)Aids Research andHuman
Retroviruses 8:183中有描述;发夹基序在Hampel(1989)Biochemistry 28:4929和
Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18:299中有描述;肝炎δ病毒基序在Perrotta(1992)
Biochemistry 31:16中有描述;RNaseP基序在Guetrier-Takada(1983)Cell35:849中有
描述;I类内含子在Cech美国专利4,987,071中有描述。这些特定基序的引述并不是限制
性的。本领域技术人员将认识到本发明的核酶,如,本发明的有酶活的RNA分子,可以具有与一个或者多个靶基因的RNA区域互补的特异性底物结合位点。本发明的核酶可以在底物
结合位点内或者其周围具有赋予了该分子RNA切割活性的核苷酸序列。
[0376] RNA干扰(RNAi)
[0377] 在一个方面,本发明提供了被称为“RNAi”分子的RNA抑制性分子,其含有本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶序列。RNAi分子可以包括双链RNA(dsRNA)分子,例如siRNA、miRNA和/或短发夹RNA(shRNA)分子。RNAi分子,例如siRNA(小抑制RNA)
可以抑制木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶基因的表达,和/或miRNA(微小RNA)抑制
木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶信息的翻译。在一个方面,RNAi分子例如siRNA和
/或miRNA的长度为大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或更多个双链体核苷酸。虽然本发明不限于任何特殊的作用机制,但RNAi可进入细胞中,
引起具有相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解,包括内源性mRNA。当细胞暴露于双链
RNA(dsRNA)时,来自同源基因的mRNA被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi
的一个可能的基本机制是将与特定的基因序列匹配的双链RNA(dsRNA)打断成为称为短的
干扰RNA的短碎片,它可触发与其序列匹配的mRNA的降解。在一个方面,本发明的RNAi可
用于基因沉默疗法中,参见,例如Shuey(2002)Drug Discov.Today 7:1040-1046。在一个方面,本发明提供了使用本发明的RNAi分子例如siRNA和/或miRNA选择性降解RNA的方
法。该过程可在体外、离体或体内实施。在一个方面,本发明的RNAi分子可用来在细胞、器官或动物中产生丧失功能的突变。
[0378] 在一个方面,RNAi的细胞内导入通过与RNA结合蛋白结合的靶细胞特异性配体的内化进行,包括吸收RNAi(例如微小RNA)。该配体对独特的靶细胞表面抗原是特异性的。该配体在与细胞表面抗原结合后可以自发地内化。如果独特的细胞表面抗原在与其配体结合
后没有自然地被内化,则可以通过下列方法来促进内化:将富含精氨酸的肽或其它膜可渗
透性肽并入配体的结构或RNA结合蛋白中,或将所述肽附着到配体或RNA结合蛋白。参见,
例如美国专利申请公开号20060030003;20060025361;20060019286;20060019258。在一个方面,本发明提供基于脂质的制剂,用于将本发明的核酸作为包含RNAi分子的核酸-脂质
颗粒输送,例如导入到细胞,参见,例如美国专利申请公开号20060008910。
[0379] 制备和应用选择性降解RNA的RNAi分子,例如siRNA和/或miRNA的方法在本领域中是熟知的,见,例如美国专利6,506,559;6,511,824;6,515,109;6,489,127。
[0380] 核酸的修饰
[0381] 本发明提供了产生本发明的核酸的变体的方法,所述本发明的核酸例如那些编码木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的核酸。这些方法可以被重复或者以多种组合使用,以产生具有与模板核酸编码的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶有所改变的或不同的
活性或有所改变的或不同的稳定性的木聚糖酶和/或葡聚糖酶。这些方法也可以被重复或
以多种组合使用,从而例如在基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性方面产生变化。另一方面,细胞的遗传组成可以被改变,例如通过同源基因的离体修饰,随后再将其插入到细胞中。
[0382] 本发明的核酸可以通过任何方法来改变。例如,随机(random或stochastic)方法、或者非随机、或者“定向进化”的方法,参见如,美国专利6,361,974。基因的随机突变方法在本领域是已知的,参见如,美国专利5,830,696。例如,可以应用突变剂来对基因进行随机突变。突变剂包括,如,紫外线或者γ辐射,或者化学诱变剂,如,丝裂霉素、亚硝酸、光活化的补骨脂内酯,它们单独使用或者组合使用来诱导DNA的断裂,其可以通过重组被修复。
其它的化学诱变剂包括,如,亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或者甲酸。其它的诱变剂是核苷酸前体的类似物,如,亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或者吖啶。这些试剂可以加入到PCR反应中替换核苷酸前体,从而突变该序列。也可以应用嵌入试剂如普罗黄素、吖啶黄、奎纳克林和类似物。
[0383] 可以应用分子生物学上的任何技术,如随机PCR诱变,参见,如,Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5467-5471;或者组合式多重盒式诱变,参见如,Crameri(1995)Biotechinques 18:194-196。可选择地,核酸,如基因,可以在随机片段化后重新装配,参见,如,美国专利6,291,242;6,287,862;6,287,861;5,955,358;5,830,721;5,824,514;
5,811,238;5,605,793。在可选择的方面,修饰、增加或者删除可以通过易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定点突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体突变、位点专一性诱变、基因再装配(例如GeneReassembly,参见例如美国专利
号6,537,776)、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、重组、回归序列重组
(recursive sequencerecombination)、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶模板的
诱变、缺口双重诱变(gapped duplex mutagenesis)、点错配修复诱变(point mismatch
repairmutagenesis)、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变(restriction-selection mutagenesis)、限制纯化诱变(restriction-purificationmu
tagenesis)、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和/或者这些方法和其它方法的组合产生。
[0384] 以下的出版物描述了可以并入到本发明的方法中的各种递归重组程序和/或方 法:Stemmer(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and other
clinicalproperties”Tumor Targeting 4:1-4;Ness(1999)Nature Biotechnology
17:893-896;Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA family
shuffling”NatureBiotechnology 17:793-797;Minshull(1999)“Protein evolution
by molecular breeding”Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290;
Christians(1999)“Directed evolutionof thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”NatureBiotechnology 17:259-264;Crameri(1998)“DNA shuffling of a family of genes fromdiverse species accelerates directed
evolution”Nature 391:288-291;Crameri(1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”NatureBiotechnology 15:436-438;
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(1997)“Applications of DNA Shuffling toPharmaceuticals and Vaccines”Current
Opinion in Biotechnology 8:724-733;Crameri 等 (1996)“Construction and
evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2:
100-103;Gates 等 (1996)“Affinity selective isolation of ligandsfrom peptide
libraries through display on a lac repressor ′ headpiece dimer ′”Journal
ofMolecular Biology 255:373-386;Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly
PCR”, 于 The Encyclopedia of Molecular Biology 中 .VCH Publishers,New
York.447-457 页;Crameri 和 Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassette
mutagenesis createsall the permutations of mutant and wildtype cassettes”Bio
Techniques 18:194-195;Stemmer 等 (1995)“Single-step assembly of a gene and
entire plasmid form largenumbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene,164:
49-53;Stemmer(1995)“TheEvolution of Molecular Computation”Science 270:
1510;Stemmer(1995)“SearchingSequence Space”Bio/Technology 13:549-553;
Stemmer(1994)“Rapid evolution of aprotein in vitro by DNA shuffling”Nature 370:
389-391;和Stemmer(1994)“DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:
In vitro recombination formolecular evolution”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:
10747-10751。
[0385] 产生多样性的突变方法包括,例如,定点诱变(Ling等.(1997)“ApproachestoDNA mutagenesis:an overview”Anal Biochem.254(2) :157-178;Dale 等
(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method”Methods Mol.Biol.57:369-374;Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.
Rev.Genet.19:423-462;Botstein & Shortle(1985)“Strategies and applications
of in vitromutagenesis”Science 229:1193-1201;Carter(1986)“Site-directed
mutagenesis”Biochem.J.237:1-7; 和 Kunkel(1987)“The efficiency of
oligonucleotide directedmutagenesis” 在 Nucleic Acids & Molecular
Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J.eds.,Springer Verlag,Berlin));使用含有尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)“Rapidand efficient site-specific mutagenesis
without phenotypic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492;Kunkel 等
(1987)“Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic
selection”Methods in Enzymol.154,367-382;和Bass等(1988)“Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities”Science 242:240-245);寡核苷酸诱导的定点诱变(Methods in Enzymol.100:468-500(1983);Methods inEnzymol.154:329-350(1987);
Zoller(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13-derived vectors:
an efficient and general procedure for the production ofpoint mutations in
any DNA fragment”Nucleic Acids Res.10:6487-6500;Zoller &Smith(1983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned intoM13 vectors”Methods
in Enzymol.100:468-500;和 Zoller(1987)Oligonucleotide-directed mutagenesis:
a simple method using two oligonucleotideprimers and a single-stranded
DNA template”Methods in Enzymol.154:329-350);硫 代 磷 酸 酯 修 饰 的 DNA诱
变 (Taylor(1985)“The use of phosphorothioate-modifiedDNA in restriction
enzyme reactions to prepare nicked DNA”Nucl.Acids Res.13:8749-8764;
Taylor(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutationsat
high frequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.13:
8765-8787(1985);Nakamaye(1986)“Inhibition of restriction endonuclease
NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucl
eotide-directedmutagenesis”Nucl.Acids Res.14:9679-9698;Sayers(1988)“Y-T
Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed
mutagenesis”Nucl.Asids Res.16:791-802;和Sayers 等(1988)“Strand specific
cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction
endonucleases in thepresence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16:803-814);
使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等(1984)“The gapped duplex DNA approach
tooligonucleotide-directed mutation constction”Nucl.Acids Res.12:9441-9456;
Kramer和Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directed construction
ofmutations via gapped duplex DNA”154:350-367;Kramer(1988)“Improved
enzymaticin vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucle
otide-directedconstruction of mutations”Nucl.Acids Res.16:7207;和 Fritz(19
88)“Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA
procedurewithout enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids Res.16:6987-6999)。
[0386] 可 以 用 于 实 践 本 发 明 的 另 外 的 实 验 方 案 包 括 点 错 配 修 复(Kramer(1984)″PointMismatch Repair″Cell 38:879-887)、应用修复缺陷型宿主株的诱变(Carter et al.(1985)″Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis
using M13 vectors″Nucl.Acids Res.13:4431-4443;以及Carter(1987)″Improved o
ligonucleotide-directedmutagenesis using M13 vectors″Methods in Enzymol.154:
382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh(1986)″Use of oligonucleotides to generate
large deletions″Nucl.Acids Res.14:5115)、限制-选择以及限制-选择和限制-纯
化(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the
transition state of subtilisin″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317:415-423)、通 过
全基因合成的诱变(Nambiar等(1984)″Total synthesis and cloning of a gene
coding for the ribonuclease S protein ″ Science 223:1299-1301;Sakamar 和
Khorana(1988)″Total synthesis and expression ofa gene for the a-subunit of
bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)″Nucl.
Acids Res.14:6361-6372;Wells 等.(1985) ″ Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites ″ Gene34:
315-323;以 及 Grundstrom 等 (1985) ″ Oligonucleotide-directed mutagenesis
bymicroscale`shot-gun`gene synthesis ″ Nucl.Acids Res.13:3305-3316)、 双
链 断 裂 修 复 (Mandecki(1986);Amold(1993) ″Protein engineering for unusual
environments″Current Opinion in Biotechnology 4:450-455.″Oligonucleotide-di
rected double-strandbreak repair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis″Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181)。很多以上的方法的另外的细节可在Methods in Enzymology第154卷中发现,其中也描述了用于解决各
种诱变方法中所遇到的问题的有用策略。
[0387] 在例如下列的文件中描述了可以用于实践本发明的实验方案,如Stemmer的美国专利5,605,793(1997.2.25),“Methods for In Vitro Recombination”;Stemmer等的美国专利5,811,238(1998.9.22)“Methods for Generating Polynucleotides havingDesired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”;Stemmer等的美国专利
5,830,721(1998.11.3),“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly”;
Stemmer 等 的 美 国 专 利 5,834,252(1998.11.10),“End-ComplementaryPolymerase Reaetion”;Minshull等的美国专利5,837,458(1998.11.17)“Methods andCompositions for Cellular and Metabolic Engineering”;WO 95/22625,Stemmer 和 Crameri,
“Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”;WO 96/33207,Stemmer和
Lipschutz,“End Complementary Polymerase Chain Reaction”;WO97/20078,Stemmer和Crameri的“Methods for Generating Polynucleotides havingDesired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”;WO 97/35966,Minshull 和 Stemmer,
“Methods and Compositions for Cellular and MetabolicEngineerin”;WO 99/41402,Punnonen 等,“Targeting of Genetic Vaccine Vectors”;WO 99/41383,Punnonen 等,“Antigen Library Immunization”;WO 99/41369,Punnonen 等,“Genetic Vaccine
Vector Engineering”;WO 99/41368,Punnonen等,“Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”;EP 752008,Stemmer和Crameri,“DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”;EP 0932670,Stemmer,“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive SequenceRecombination;WO 99/23107,Stemmer等,“Modification of Virus Tropism and HostRange by Viral Genome Shuffling”;WO 99/21979,Apt
等,“Human PapillomavirusVectors”;WO 98/31837,del Cardayre 等,“Evolution of Whole Cells and Organismsby Recursive Sequence Recombination”;WO 98/27230,
Patten 和 Stemmer,“Methodsand Compositions for Polypeptide Engineering”;WO
98/27230,Stemmer 等,“Methodsfor Optimization of Gene Therapy by Recursive
Sequence Shuffling and Selection”;WO 00/00632,“Methods for Generating Highly Diverse Libraries”;WO 00/09679,“Methods for Obtaining in Vitro Recombined
Polynucleotide Sequence Banks andResulting Sequences”;WO 98/42832,Arnold等,“Recombination of PolynucleotideSequences Using Random or Defined Primers”;
WO 99/29902,Arnold 等,“Method forCreating Polynucleotide and Polypeptide
Sequences”;WO 98/41653,Vind,“An inVitro Method for Construction of a DNA
Library”;WO 98/41622,Borchert 等,“Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”;以及WO 98/42727,Pati和Zarling,“Sequence Alterations using
Homologous Recombination”。
[0388] 在例如下列的文件中描述了可以用于实践本发明的方案(提供了关于产生不同多样性的方法的细节),如美国专利申请系列号(USSN)09/407,800,Patten等的“SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES”,于1999年9月28日提交;delCardayre等的“EVOLUTION
OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BYRECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”,美国专利
6,379,964;Crameri等的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”,美国专利6,319,714;6,368,861;6,376,246;6,423,542;6,426,224和PCT/US00/01203;
Welch 等 的“USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FORSYNTHETIC
SHUFFLING”,美 国 专 利6,436,675;Selifonov等 的“METHODS FORMAKING CHARACTER STRINGS,POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDESHAVING DESIRED CHARACTERISTICS”,2000年
1月18日提交,(PCT/US00/01202)和,如Selifonov等的“METHODS FOR MAKINGCHARACTER
STRINGS,POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVINGDESIRED CHARACTERISTICS”,
2000年7月18日提交,(美国系列号09/618,579);Selifonov和Stemmer的“METHODS
OF POPULATING DATA STRUCTURES FORUSE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”,2000
年 1 月 18 日 提 交 (PCT/US00/01138),和 Affholter 的“SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDTEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENTISOLATION”,2000年
9月6日提交(美国系列号09/656,549),和美国专利6,177,263;6,153,410。
[0389] 非随机或“定向进化”方法包括,例如饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)或其组合,它们被用于修饰本发明的核酸,以产生具有新的或改变的特性(例如在高度酸性或碱性条件下的活性,在高温或低温的活性,等等)的木聚糖酶和/或葡聚糖酶。由修饰
的核酸编码的多肽可以在测试木聚糖水解或其它活性之前被筛选活性。可以使用任何测
试形式或实验方案,例如使用毛细管阵列平台。例如参见美国专利6,361,974;6,280,926;
5,939,250。
[0390] 基因位点饱和诱变或GSSM
[0391] 本发明也提供了使用基因位点饱和诱变或GSSM制备酶的方法,如在本文中以及美国专利6,171,820和6,579,258所述的。一方面,含有简并N,N,G/T序列的密码子引物
被用于将点突变引入多核苷酸中,例如本发明的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶或
抗体,以便产生一组子代多肽,其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换,置换发生的位置例如酶活性位点中的氨基酸残基,或将要被修饰的配体结合位点。这些寡
核苷酸可以包括相邻的第一同源序列,简并N,N,G/T序列,以及一方面可以包括第二同源序列。由使用这些寡核苷酸而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上
的所有可能的氨基酸变化,这是由于N,N,G/T序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。一方面,一个这样的简并寡核苷酸(例如包括一个简并N,N,G/T序列盒)被用于使亲
本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面,使用至少两
个简并序列盒,或在相同的寡核苷酸中或不同的寡核苷酸中,用于使亲本多核苷酸模板中
的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。例如,一个寡核苷酸中可以包含一个
以上N,N,G/T序列,以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N,N,G/T序列可以直接相邻,或被一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面,用于引入插入和删除的寡核苷酸可以单独使用,或者与含有N,N,G/T序列的密码子组合使用,以便引入氨基酸插入、删除和/或置换的任何组合和排列。
[0392] 一方面,两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是使用含有相邻N,N,G/T三联体的寡核苷酸进行的,即简并(N,N,G/T)n序列。另一方面,使用与N,N,G/T序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如,在一些情况下,可能期望(例如,在寡核苷酸中)使用仅包括一个N的简并三联体序列,其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在
该三联体的剩余两个位置上,可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可以选择地,在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N,N,N三联体序列。
[0393] 一方面,使用简并三联体(例如N,N,G/T三联体)允许在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且容易地产生完全范围的可能的天然氨基酸(总共20种氨基酸)(在可
以选择的方面,这些方法也包括在每一氨基酸残基或密码子、位置产生少于全部的可能置
换)。例如,对于100个氨基酸的多肽,可以产生2000个不同种类(即每个位置上的20种
可能氨基酸×100个氨基酸位置)。通过使用含有简并N,N,G/T三联体的寡核苷酸或一组
寡核苷酸,32种不同序列可编码所有20种可能的天然氨基酸。因此,在其中使用至少一种
这样的寡核苷酸对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中,产生了编码20种不同
多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反,在定点诱变中使用非简并寡核苷酸在每个反应容
器中仅仅导致一种子代多肽。一方面,非简并寡核苷酸可以与所公开的简并引物组合使用;
例如,非简并寡核苷酸可以被用于在工作多核苷酸中产生特异性点突变。这提供了产生特
异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段
的相应表达的手段。
[0394] 一方面,每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽(例如木聚糖酶和/或葡聚糖酶)分子的多核苷酸,以便所有的20种天然氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷
酸中被诱变的密码子位置的特定氨基酸位置(其它方面使用了少于20个天然的组合)。从
每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体
克隆到合适的宿主中,例如大肠杆菌宿主中),并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定,显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时,如在碱性或酸性条件下增高的木
聚糖水解活性),可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
[0395] 一方面,如本文所公开的,应用饱和诱变对亲本多肽的各个和所有的氨基酸位置进行诱变后,可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多
个新的子代分子,其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如,如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化,那么出现的排
列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性,以及两个有利变化
中的每一个的可能性)和3个位置。因此,总共有3×3×3或27种可能性,其中包括了先
前被检验的7种可能性,即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位
置上没有变化的点突变。
[0396] 另一方面,位点饱和诱变可以与改组、嵌合、重组和其它诱变方法以及筛选一起使用。本发明提供了以反复的方式使用任何诱变方法,包括饱和诱变。在一个实例中,任何诱变方法的反复使用与筛选结合使用。
[0397] 本发明还提供了使用专有密码子引物(含有简并N,N,N序列)将点突变引入多核苷酸中,以便产生一组子代多肽,其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置
换(基因位点饱和诱变(GSSM))。使用的这些寡聚体包括相邻的第一同源序列,简并N,N,
N序列,以及优选不必须包括第二同源序列。由使用这些寡聚体而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化,这是由于N,N,N序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。
[0398] 一方面,一个这样的简并寡聚体(包括一个简并N,N,N序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面,使用至少两个简
并N,N,N序列盒,或在相同的寡聚体中或不同的寡聚体中,用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。因此,一个寡聚体中可以包含一个以上
N,N,N序列,以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N,N,N序列可以直接相邻,或由一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面,用于引入插入和删除的寡聚体可以单独使用,或者与含有N,N,N序列的密码子组合使用,以便引入氨基酸插入、删除和/或置换的任何排列组合。
[0399] 在一个具体的示例中,使用含有相邻N,N,N三联体的寡聚体,即简并(N,N,N)n序列,进行两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是可能的。
[0400] 另一方面,本发明提供了使用与N,N,N序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如,在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)仅包括一个N的简并三联体序列,其
中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在三联体的剩余两个位置上,可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可以选择地,在一些情况下可能期望使用(例如在
寡聚体中)简并N,N,N三联体序列、N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列。
[0401] 但是,可以意识到的是由于若干个原因,使用如本发明公开的简并三联体(例如N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列)是有利的。一方面,本发明提供了在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且相对容易地产生完全范围的可能的氨基酸(总共20种氨基酸)的
置换的方法。因此,对于100个氨基酸的多肽,本发明提供了系统且相对容易地产生产生
2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)的方法。可以
理解,通过使用含有简并N,N,G/T或N,N,G/C三联体序列的寡聚体,32种不同序列可编码所有20种可能的氨基酸。因此,在其中使用一种这样的寡聚体对亲本多核苷酸序列进行饱
和诱变的反应容器中,产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反,在定
点诱变中使用非简并寡聚体在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽产物。
[0402] 本发明还提供了非简并寡聚体的使用,其一方面可以与所公开的简并引物组合使用。可以理解,在一些情况中,使用非简并寡聚体在工作多核苷酸中产生特异性点突变是有利的。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段的相应表达的点突变的手段。
[0403] 因此,在本发明的一方面,每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸,以便所有的20种氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码
子位置的一个特定氨基酸位置。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可
以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的大肠杆菌宿主中),并进行表达筛选。当单
个子代多肽通过筛选鉴定,显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时),可以对其测
序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
[0404] 应意识到的是,如本文所公开的,应用饱和诱变对亲本多肽的各个和所有的氨基酸位置进行诱变后,可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一
个或多个新的子代分子,其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如,如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化,那么出
现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性,以及两个有
利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此,总共有3×3×3或27种可能性,其中包
括了先前被检验的7种可能性,即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在
任何位置上没有变化的点突变。
[0405] 因此,在一个非限制性示例中,本发明提供了结合另外的诱变方法使用饱和诱变,例如其中两个或更多个相关多核苷酸被引入合适的宿主细胞的方法,以便通过重组和还原性重配产生杂合多核苷酸。
[0406] 除了沿着基因的全序列进行诱变之外,本发明提供了:诱变可用于替代多核苷酸序列中任意数量的碱基的每一个,其中待被诱变的碱基的数量优选为从15至100,000中的
每一个整数。因此,并不是沿着分子诱变每一个位置,可以对每一个或独立数目的碱基(优选为总共15至100,000的亚组)进行诱变。优选地,单独的核苷酸被用于沿着多核苷酸序
列诱变每一个位置或一组位置。待被诱变的3个位置可以是密码子。优选使用诱变引物引
入突变,该诱变引物含有异源序列盒,也称为诱变序列盒。示例性的序列盒可以具有1至
500个碱基。在这样的异源序列盒中每一个核苷酸位置可以是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E,其中E是非A、C、G或T的任何碱基(E可以被称为设计者寡聚体(designer oligo))。
[0407] 一般意义上,饱和诱变由诱变有待诱变的限定多核苷酸序列(其中待诱变的序列长度优选为约15至100,000个碱基)中的一整组诱变序列盒(其中每一个序列盒的长度
优选为约1-500个碱基)组成。因此,一组突变(范围从1至100个突变)被引入每一个
待诱变的序列盒。在应用一轮饱和诱变的过程中,一组待被引入到一个序列盒的突变可以
与第二组待被引入到第二个序列盒的突变不同或相同。这样的分组通过缺失、插入、特定密码子的分组以及特定核苷酸序列盒的分组加以例示。
[0408] 待被诱变的限定序列包括全基因、通路、cDNA、整个开放阅读框(ORF)以及整个启动子、增强子、阻抑物/反式激活蛋白、复制起点、内含子、操纵子或任何多核苷酸功能组。通常,为了此目的,“限定序列(defined sequence)”可以是15碱基多核苷酸序列的任何多核苷酸以及长度在15个碱基至15,000个碱基之间的多核苷酸序列(本发明特别指出中间
的每一个整数)。选择密码子分组时的考虑因素包括由简并诱变序列盒编码的氨基酸类型。
[0409] 一方面,可被引入到诱变序列盒中的突变分组,本发明特别提供了在每一个位置编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种氨基酸的简并密码子置换(使用简并寡聚体)以及由此编码的多肽文库。
[0410] 合成连接重装配(SLR)
[0411] 本发明提供了非随机的基因修饰系统,命名为“合成连接重装配”或简单地称作“SLR”,这是一种“定向进化方法”,产生具有新的或改变的特性的多肽,例如本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶或本发明的抗体。
[0412] SLR是将寡核苷酸片段非随机地连接在一起的一种方法。该方法与随机寡核苷酸改组不同的地方在于,核酸构件(building blocks)没有被随意地改组、连接或嵌合,而是被非随机地装配。例如参见美国专利6,773,900;6,740,506;6,713,282;6,635,449;
6,605,449;6,537,776。一方面,SLR包括:(a)提供模板多核苷酸,其中模板多核苷酸包含编码同源基因的序列;(b)提供多个构件多核苷酸,其中这些构件多核苷酸被设计成可在
预定的序列处与模板多核苷酸交换重装配(cross-over reassemble),所述构件多核苷酸
包含作为同源基因变体的序列和与变体序列两侧的模板多核苷酸同源的序列;(c)将构件
多核苷酸与模板多核苷酸组合在一起,以便构件多核苷酸与模板多核苷酸交换重装配,以
产生包含同源基因序列变异的多核苷酸。
[0413] SLR不依赖于将被重新排列的多核苷酸之间存在高度同源性。因此,该方法可以被100
用于非随机地产生包括超过10 个不同嵌合体的子代分子的文库(或集合)。SLR可以被
1000
用于产生包括超过10 个不同子代嵌合体的文库。因此,本发明的一些方面包括产生一组
最终嵌合的核酸分子的非随机方法,所述最终嵌合的核酸分子具有按设计所选择的整个装
配次序。该方法包括按设计产生多个特异性核酸构件的步骤,以及装配这些核酸构件的步
骤,这样可获得依设计而定的整个装配次序,所述的多个特异性核酸构件具有可被应用的
互相相容的可连接末端。
[0414] 将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”,如果它们能使这些构件以预定次序结合的话。因此,核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定的。如果使用多于一个的装配步骤,那么核酸构
件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。一方面,用酶例如连接酶(例
如T4 DNA连接酶)处理退火的结构片段,以实现结构片段的共价结合。
[0415] 一方面,寡核苷酸构件的设计通过分析一组祖先核酸序列模板来获得,所述祖先核酸模板作为产生最终嵌合的多核苷酸的子代集合的基础。这些亲本寡核苷酸模板因此作
为序列信息的来源,它们在将被诱变例如被嵌合或改组的核酸构件的设计中有用。在该方
法的一个方面,多个亲本核酸模板的序列被联配,以便选择一个或多个分界点。这些分界点可以位于同源区域,由一个或多个核苷酸构成。这些分界点优选地由至少两个祖先模板共
享。从而这些分界点可以被用于描绘将要产生的寡核苷酸构件的边界,以便重排列亲本多
核苷酸。在祖先分子中鉴定和选择的分界点作为最终嵌合的子代分子的装配中的潜在嵌合
点。分界点可以是由至少两个亲本多核苷酸序列分享的同源区域(包括至少一个同源性核
苷酸碱基)。可以选择地,分界点可以是由至少一半的亲本多核苷酸序列分享的同源区域,或者可以是由至少三分之二的亲本多核苷酸序列分享的同源区域。甚至更优选地,有用的
分界点是由至少四分之三的亲本多核苷酸序列分享的同源区域,或者可以是由几乎所有的
亲本多核苷酸序列分享的同源区域。一方面,分界点是由所有亲本多核苷酸序列分享的同
源区域。
[0416] 一方面,连接再装配过程被彻底地进行,以便产生含有尽量可能多的子代嵌合多核苷酸的文库。换句话说,核酸构件的所有可能的有序组合都呈现在最终嵌合的核酸分子
集合中。同时,另一方面,在每一组合中的装配次序(即各个最终嵌合核酸的5’到3序列
中每一构件的装配次序)遵循如上所述的设计(或非随机地)。由于本发明的非随机特性,
大大地降低了不需要的副产品的可能性。
[0417] 另一方面,连接再装配方法被系统地进行。例如,实施该方法,以便产生子代分子的系统区分化的文库,该文库分成能被系统地筛选的数个部分,例如可以逐个地筛选。换句话说,通过选择性的和审慎的应用特定的核酸构件,再加上选择性的和审慎的应用连续的分步骤的装配反应,本发明使得这样一种设计可以实现,即可以在各个反应容器中制备出
各自特定的一系列子代产物。这样的设计允许进行系统的检查和筛选步骤。因此,这些方
法允许很可能非常大量的子代分子以更小的组被系统地检查。由于其具有以高度变通而
又彻底和系统的方式进行嵌合化反应的能力,尤其是当祖先分子之间具有低水平的同源性
时,这些方法可以产生包含大量子代分子的文库(或集合)。由于本发明的连接再装配的
非随机特性,所产生的子代分子优选包含有最终嵌合核酸分子的文库,这些核酸分子具有
按设计而选择的总装配次序。饱和诱变和优化的定向进化方法也可以被用于产生不同的子
代分子种类。应该意识到,本发明在分界点的选择、核酸构件的大小和数量以及偶联的大小和设计方面提供了选择的自由度和可控制性。进一步,应该意识到,就本发明的可操作性而言,对分子间同源性的要求大大地放宽了。事实上,甚至可以在有很少的分子间同源性或没有分子间同源性的区域内选择分界点。例如,由于密码子的摆动,即密码子的简并性,可以将核苷酸取代引入核酸构件,同时又不会改变在相应的祖先模板中最初编码的氨基酸。可
以选择地,可以改变密码子,从而改变对原始氨基酸的编码。在本发明中,这样的取代可以被引入到核酸构件中,以便增加分子间同源分界点的发生率,从而使得在构件之间可获得
的偶联的数量增加,而这又允许产生更多数量的子代嵌合分子。
[0418] 合成基因重装配
[0419] 一方面,本发明提供了非随机的方法,命名为合成基因重装配(例如GeneReassembly,参见例如美国专利号6,537,776),其与随机改组不同之处在于,核酸构件不随机改组、连接或嵌合,而是被非随机地装配。
[0420] 合成基因重装配法不依赖于将被改组的多核苷酸之间存在高度同源性。本发明可100
以被用于非随机地产生包括超过10 个不同嵌合体的子代分子的文库(或集合)。可以想
1000
象地,合成基因重装配可以被用于产生包括超过10 个不同子代嵌合体的文库。
[0421] 因此,一方面,本发明提供了产生一组最终嵌合的核酸分子的非随机方法,所述最终嵌合的核酸分子具有按设计所选择的整个装配次序,该方法包括按设计产生多个特异性核酸构件的步骤,以及装配这些核酸构件的步骤,这样可获得依设计而定的整个装配次序,所述的多个特异性核酸构件具有可被应用的互相相容的可连接末端。
[0422] 在一个方面,合成基因重装配包括下列方法:1)制备分子(包括含有多核苷酸序列的分子,例如含有多肽编码序列的分子)的子代产生分子,其被从一个或更多个祖先或
亲代产生模板来实现至少一个点突变、增加、缺失和/或嵌合;2)例如使用高流通量方法筛选子代产生分子的至少一种感兴趣的(如酶活性提高)性质;3)一方面,获取和/或分类
关于亲代和/或子代产生分子的结构和/或功能信息;以及4)一方面,重复步骤1)至3)
中任意一个。在一个方面,在所谓的“密码子位点饱和诱变”中产生(例如从亲代多核苷酸模板)了多核苷酸的子代,每个均具有至少一组多至三个的连续点突变(即包含新密码子
的不同碱基),以便每个密码子(或每个编码相同氨基酸的简并密码子家族)表示在每个
密码子位置处。相应于多核苷酸的所述子代和由多核苷酸的所述子代所编码,还产生了一
系列子代多肽,每个均具有至少一个单氨基酸点突变。一方面,在所谓的“氨基酸位点饱和诱变”中,产生了一种这样的突变多肽,形成19种天然编码多肽的α-氨基酸置换代中的每一种均在沿着多肽的各个和所有氨基酸位置处。对于沿着亲代多肽的各个和所有氨基酸位
置,这种方法得到包括原始氨基酸在内共计20种不同的子代多肽,或可能多于21种不同的
子代多肽——如果使用的是另外的氨基酸,而不是20种天然编码氨基酸,或除20种天然编
码氨基酸之外,还使用另外的氨基酸。
[0423] 因此,另一个方面,该方法还用于产生突变体,其除20种形成天然编码多肽的α-氨基酸和/或与20种形成天然编码多肽的α-氨基酸结合外,还含有其它稀有的和/
或非自然编码的氨基酸及氨基酸衍生物。另一方面,该方法还用于产生突变体,其除适合宿主的天然或未改变的密码子识别系统和/或与适合宿主的天然或未改变的密码子识别系
统结合外,还使用改变的、诱变的和/或设计者密码子识别系统(如在具有一个或更多个改
变tRNA分子的宿主细胞中)。
[0424] 另一方面,本发明涉及重组,更具体而言涉及制备编码多肽的多核苷酸的方法,其通过含有部分同源性区域的多核苷酸序列的体内重配、装配多核苷酸以形成至少一种多核苷酸以及筛选多核苷酸以产生具有有用性质的多肽的方法进行。
[0425] 另一方面,本发明用于针对任意分子性质(例如酶促活性)或现有技术所允许的性质组合对任意突变改变(具体包括饱和诱变)所达到的效果进行分析和分类。因此,提
供综合性方法,以测定将亲代多肽中每一氨基酸改变成至少19种可能置换中每一种的效
果。这允许亲代多肽中每一氨基酸根据其对多肽可测量性质的潜在效果的光谱进行表征和
分类。
[0426] 在一个方面,内含子可以经由核酸构件而导入嵌合子代分子中。内含子通常在两个末端具有共有序列,以便使得它们可以操作。除了能够使基因剪接外,内含子还可以通过向其它核酸提供同源位点使得能够同源重组而起到另外的目的。为了该目的以及其它潜在
的目的,有时可以期望产生用于导入内含子的大核酸构件。如果大小非常大,容易通过两个单链寡聚体的直接化学合成而产生,则还可以通过两个以上单链寡聚体的直接化学合成或
通过应用基于聚合酶的扩增反应来产生这种特定的核酸构件。
[0427] 将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”,如果它们能使这些构件以预定次序结合的话。因此,在一方面,核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定的,如果使用多于一个的装配步骤,
那么核酸构件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。在本发明的一方
面,用酶例如连接酶(例如T4DNA连接酶)处理退火的结构片段,以实现结构片段的共价结
合。
[0428] 偶联可以以不使用参与突出端中每个核苷酸的方式发生。该偶联特别活跃地存活(例如在转化宿主中),如果通过用连接酶处理来强化偶联以形成所谓的“间隙连接(gap
ligation)”或“间隙的连接(gapped ligation)”的话。这种偶联可以有助于不需要的背
景产物的产生,但其也可以有利地用于增加设计连接重装配所产生的子代文库的多样性。
某些突出端能够进行自身偶联以形成回文偶联。如果通过用连接酶处理来强化偶联的话,
偶联则会大大加强。这些突出端上缺乏5’磷酸可以有利地用于防止这种回文性自身连接。
因此,本发明提供了缺乏5’磷酸基团的、可以化学制作(或定制)的核酸构件。可选择地,它们可以例如通过用磷酸酶如牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理而被除去,以防止在连接重
装配过程中回文自身连接。
[0429] 另一方面,核酸构件的设计通过分析一组祖先核酸模板序列来获得,所述祖先核酸模板作为产生最终嵌合核酸分子的子代集合的基础。这些祖先核酸模板因此作为序列信
息的来源,它们在将被诱变例如被嵌合或改组的核酸构件设计中有帮助。
[0430] 在一个示例中,本发明提供了相关基因的家族和它们编码的相关产物的家族的嵌合。在具体的示例中,编码的产物是酶。根据本文描述的方法,本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶可以被诱变。
[0431] 因此,根据本发明的一个方面,多个祖先核酸模板序列(例如本发明的多核苷酸)被联配,以便选择一个或多个分界点,这些分界点可以位于同源区域。这些分界点可以用于描绘将要产生的核酸构件的边界。因此,在祖先分子中鉴定和选择的分界点作为子代分子
的装配中的潜在嵌合点。
[0432] 有用的分界点通常是由至少两个祖先模板共享的同源区域(由至少一个同源核苷酸碱基组成),但分界点可以是由至少一半的祖先模板、至少三分之二的祖先模板、至少四分之三的祖先模板以及优选几乎所有的祖先模板共分享的同源区域。甚至更优选地,有
用的分界点是由所有祖先模板共享的同源区域。
[0433] 一方面,基因再装配过程被彻底地进行,以便产生彻底的文库。换句话说,核酸构件的所有可能的有序组合都呈现在最终嵌合的核酸分子集合中。同时,在每一组合中的装配次序(即各个最终嵌合核酸的5’到3序列中每一构件的装配次序)是设计的(或非随
机地)。由于本发明的非随机特性,大大地降低了不需要的副产品的可能性。
[0434] 另一方面,基因再装配过程被系统地进行,以便例如产生子系统区分化的文库,该文库具有能被系统地筛选的数个部分,例如可以逐个地筛选。换句话说,通过选择性的和审慎的应用特定的核酸构件,再加上选择性的和审慎的应用连续的分步骤的装配反应,本发明使得这样一种实验设计可以实现,即在其中可以在各个反应容器中制备出特定的一组子
代产物。这样的设计允许进行系统的检查和筛选步骤。因此,这些方法允许很可能非常大
量的子代分子以更小的组被系统地检查。
[0435] 由于其具有以高度灵活而又彻底和系统的方式进行嵌合的能力,尤其是当祖先分子之间具有低水平的同源性时,本发明可以产生包含大量子代分子的文库(或集合)。由于
本发明的基因再装配的非随机特性,所产生的子代分子优选包含有最终嵌合核酸分子的文
库,这些核酸分子具有按设计而选择的总装配次序。在具体方面,这样的所产生的文库包括
3 1000
大于10 至大于10 种不同的子代分子种类。
[0436] 一方面,如所述产生的一组最终嵌合的核酸分子包括编码多肽的多核苷酸。根据一方面,该多核苷酸是基因,其可以是人造基因。根据另一方面,该多核苷酸可以是基因通路,其可以是人造基因通路。本发明产生的一种或更多种人造基因在本发明中可以整合入
人造基因途径,例如在真核生物体(包括植物)中可操纵的途径。
[0437] 在另一个示例中,产生构件的步骤的合成特性允许设计和引入核苷酸(例如一个或多个核苷酸,例如可以是密码子或内含子或调控序列),这些核苷酸随后一方面在体外过程中(例如通过诱变)或者在体内过程中(例如通过利用宿主生物体的基因剪接能力)被
去除。应该意识到,在许多情况下,除了产生有用的分界点的潜在好处之外,还有许多其它原因也使得可能期望引入这些核苷酸。
[0438] 因此,根据另一方面,本发明规定,核酸构件被用于引入内含子。这样,本发明规定,功能性内含子被引入到本发明的人造基因中。本发明还规定,功能性内含子可以被引入本发明的人造基因通路中。因此,本发明提供了嵌合多核苷酸的产生,该嵌合多核苷酸是含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因。
[0439] 因此,本发明还提供了嵌合多核苷酸的产生,该嵌合多核苷酸是含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因通路。优选地,人工引入的内含子在一种或多种宿主细
胞的基因剪接中发挥作用,其发挥作用的方式与天然发生的内含子在基因剪接中发挥作用
的方式在很大程度上是相同的。本发明提供了产生含人造内含子的多核苷酸的方法,该多
核苷酸将被引入宿主生物体中,用于重组和/或剪接。
[0440] 使用本发明产生的人造基因也可作为底物发挥作用,用于与另一核酸重组。同样,使用本发明产生的人造基因途径也可作为底物发挥作用,用于与另一核酸重组。一方面,重组由人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域促进,或发生在人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域。一方面,重组伙伴也可以是本发明产
生的核酸,包括人造基因或人造基因途径。重组可以由人造基中一个(或多个)人工引入
的内含子上存在的同源区域促进,或发生在由人造基中一个(或多个)人工引入的内含子
上存在的同源区域。
[0441] 本发明的合成基因再装配方法使用多个核酸构件,其每一个优选具有两个可连接末端。在每一个核酸构件上的两个可连接末端可以是两个平端(即,每一个末端具有零个
核苷酸的突出),或者优选可以是一个平端和一个突出端,或者更优选可以依然是两个突出端。
[0442] 用于该目的的一个有用的突出端可以是3′突出端或5′突出端。因此,核酸构件可以具有一个3′突出端或可选地具有一个5′突出端或可选地具有两个3′突出端或可
选地具有两个5′突出端。核酸构件被装配来形成最终嵌合的核酸分子的整个装配次序通
过有目的试验设计确定并且是非随机的。
[0443] 一方面,通过化学合成两个单链核酸(也称为单链寡聚体)并使它们接触以便允许它们退火形成双链核酸构件来生成核酸构件。
[0444] 双链核酸构件可以具有不同的大小。这些构件的大小可以是小的或大的。构件的示例性大小在1碱基对(不包括任何突出端)至100,000碱基对(不包括任何突出端)之
间。还提供了其它示例性大小,其具有1bp至10,000bp(包括中间的每一个整数)的下限
和2bp至100,000bp(包括中间的每一个整数)的上限。
[0445] 存在许多方法,通过这些方法,可以产生可用于本发明的双链核酸构件;并且这些方法在本领域中是已知的,且普通技术人员容易进行。
[0446] 根据一个方面,通过首先产生两个单链核酸并使它们退火形成双链核酸构件,从而产生双链核酸构件。双链核酸构件的两条链可以在每个核苷酸处互补,除了形成突出端
的任何一个核苷酸;从而除了任何突出端外不含有错配。根据另一方面,双链核酸构件的两条链可以在比除了形成突出端的任何核苷酸外的每个核苷酸更少的核苷酸处互补。因此,
根据一方面,双链核酸构件可用于引入密码子简并性。使用本文描述的位点饱和诱变,使用一个或多个N,N,G/T序列盒,或者可选地,使用一个或多个N,N,N序列盒,可以引入密码子简并性。
[0447] 本发明的体内重组方法可以在未知杂合体或具体多核苷酸或序列的等位基因的库上进行盲试。然而,不必知道所述具体多核苷酸的实际DNA或RNA序列。
[0448] 采用混合基因群内的重组的方法可用于产生任何有用的蛋白质,例如白细胞介素I、抗体、tPA和生长激素。该方法可用于产生具有改变的特异性或活性的蛋白质。该方法
还可以用于产生杂合核酸序列,例如,基因的启动子区、内含子、外显子、增强子序列、3’未翻译区或5’未翻译区。因此,该方法可用于产生具有增加的表达速率的基因。该方法在研究重复DNA序列中也是有用的。最后,该方法可用于制备核酶或适体。
[0449] 一方面,本文中描述的发明涉及还原性重配(reductive reassortment)、重组和选择的重复循环应用,其使得可以通过重组实现高度复杂的线性序列例如DNA、RNA或蛋白
质的定向分子进化。
[0450] 优化的定向进化系统
[0451] 本发明提供了一种非随机的基因修饰系统,命名为“优化的定向进化系统”,其用来产生具有新的或者改变的性质的多肽,如本发明的木聚糖酶和/或葡聚糖酶或者抗体。优化的定向进化涉及还原性重配、重组和选择的重复循环应用,其使得可以通过重组实现
核酸的定向分子进化。优化的定向进化允许产生大量的进化出的嵌合序列,其中产生的群
体显著地富集了具有预定数目遗传交换事件的序列。
[0452] 遗传交换事件是在嵌合序列中的一个点,在这里,从一个亲本变体到另一个亲本变体的序列转换发生。这样的点一般在来自两个亲本的寡核苷酸连接在一起形成单个序列
的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度,这样,序列的最终嵌合群体富集了选定数目的遗传交换事件。这也提供了对选择具有预定数目的遗传交换事件的嵌合变体的
更多控制。
[0453] 此外,这一方法与其它系统相比,提供了一种用于探究大数量的可能蛋白变体空13
间的方便手段。以前,例如,如果在反应中产生了10 个嵌合分子,测试这样大数目的嵌合突变体的特定活性将会非常困难。此外,子代群体的相当部分将具有很高数目的遗传交换
事件,其导致产生较不可能具有增高水平的特定活性的蛋白。通过应用这些方法,嵌合分子的群体可以富集那些含有特定数目的遗传交换事件的变体。因此,尽管在反应中可以仍然
13
产生10 嵌合分子,但是所选择的用于进一步分析的每一个分子很可能具有,例如,仅仅三个遗传学交换事件。因为得到的子代群体可以偏向于具有预定数目的遗传交换事件,所以
嵌合分子之间的功能多样性的界限缩小了。当要计算在最初的亲本多核苷酸中的哪一个寡
核苷酸可能影响到特定的性质时,这便提供了更加可控数目的变量。
[0454] 产生嵌合子代多核苷酸序列的一个方法是产生对应于每一个亲本序列的片段或者部分的寡核苷酸。每一个寡核苷酸优选包括独特的重叠区域,这样把所述寡核苷酸混合
在一起,得到具有以正确顺序装配的每个寡核苷酸片段的新的变体。另外的信息还可以例
如在USSN09/332,835;美国专利6,361,974中找到。
[0455] 对应于每一个亲本变体产生的寡核苷酸数目与在最终产生的嵌合分子中得到的交换的总的数目具有一定的关系。例如,为了发现如在高温下具有更高活性的嵌合变体,可以提供三个亲本核苷酸序列变体来进行连接反应。作为一个例子,对应于每一个亲本变体
的每一部分可以产生总共50个寡核苷酸序列。相应地,在连接再装配过程中,在每一个嵌
合序列中就有可能有多达50个交换事件。产生的每一个嵌合多核苷酸都以交替的顺序含
有来自各个亲本变体的寡核苷酸的可能性很低。如果每一个寡核苷酸片段以同样的摩尔量
存在于连接反应中,有可能在一些位置上来自同一亲本多核苷酸的寡核苷酸将与相邻的彼
此连接,而不导致遗传交换事件。如果在这一例子的任何连接步骤中,来自每一个亲本的每一种寡核苷酸的浓度都保持不变,那么将会有三分之一的机会(假定3个亲本)来自同一
个亲本变体的寡核苷酸将连接于嵌合序列内而不产生交换。
[0456] 因此,可以确定概率密度函数(PDF),预测在一个连接反应的每一步中可能发生的遗传交换事件群,其中给出了一套许多的亲本变体、对应于每种变体的许多寡核苷酸、以及在连接反应的每个步骤中的每种变体的浓度。在确定PDF中应用到的统计学和数学在下面被描述。通过应用这些方法,可以计算这样的概率密度函数,而且这样就富集了来源于特
定连接反应的具有预定数目的遗传交换事件的嵌合子代群体。此外,可以预先确定遗传交
换事件的目标数目,然后对该系统进行程序化,以计算在该连接反应的每一个步骤中,每种亲本寡核苷酸的起始量,从而得到以遗传交换事件的预先确定的数目为中心的概率密度函
数。这些方法涉及还原性重配、重组和选择的重复循环应用,使得能够通过重组实现编码多肽的核酸的定向分子进化。该系统允许产生大量的进化出的嵌合序列,其中产生的群体显
著地富集了具有预定数目遗传交换事件的序列。遗传交换事件是在嵌合序列中的一个点,
在这里,从一个亲本变体到另一个亲本变体的序列转换发生。这样的点一般是在两个亲本
的寡核苷酸连接在一起形成单个序列的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓
度,这样,序列的最终嵌合群体富集了选定数目的遗传交换事件。这也提供了对选择具有预定数目的遗传交换事件的嵌合突变体的更多控制。
[0457] 此外,这些方法与其它系统相比,提供了一种用于探究大数量的可能蛋白变体空间的方便手段。通过应用在这里描述的方法,嵌合分子的群体可以富集那些含有特定数目
13
的遗传交换事件的变体。因此,尽管在反应中可以仍然产生10 个嵌合分子,但是所选择
的用于进一步分析的每一个分子很可能具有,例如,仅仅三个遗传学交换事件。因为得到的子代群体可以倾向于具有预定数目的遗传交换事件,所以有关嵌合分子之间的功能多样性
的界限减少。当计算出在最初的亲本多核苷酸中的哪一个寡核苷酸可能影响到特定的性质
时,这便提供了更加可控制数目的变量。
[0458] 一方面,该方法通过产生对应于每一个亲本序列的片段或者部分的寡核苷酸,产生嵌合子代多核苷酸序列。每一个寡核苷酸优选包括独特的重叠区域,这样把所述
寡核苷酸混合在一起,得到每一寡核苷酸片段以正确顺序装配的新的变体。也可参见
USSN09/332,835。
[0459] 确定交换事件
[0460] 本发明的多个方面包括系统和软件,它们接收所需的遗传交换的概率密度函数(PDF)、待再装配的亲本基因的数目以及在再装配中的片段数目作为输入值。该程序输出是“片段PDF”,它可以用于确定用于产生重新装配的基因和那些基因的估计的遗传交换PDF
TM
的方案。在此描述的过程优选在MATLAB (TheMathworks,Natick,Massachusetts)中进行,TM
MATLAB 是一种用于技术计算的程序语言和开发环境。
[0461] 迭代处理
[0462] 在本发明的实践中,这些过程可以被迭代重复。例如,负责改变的或者新的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表型的核酸(或,所述核酸)被鉴定、再分离、再修饰、再测试活性。这一过程可以重复直到工程化得到所需的表型。例如,完整的生物化学合成代谢或分解代谢途径可以被工程化到细胞中,例如包括木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶
活性。
[0463] 类似地,如果确定了某特定寡核苷酸对于所期望的特性(例如新的木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶表型)根本不会造成影响,则可以通过合成包括待除去的序列的
更大的亲本寡核苷酸,从而将这段序列作为变量除去。由于将这一序列合并到更大的序列
中避免了任何遗传交换事件,所以在子代多核苷酸中,这一序列不再有任何变异。确定哪些寡核苷酸与所需的性质最有关系,以及哪些与所需的性质无关的重复实践可以更有效地探
寻所有可能的可能提供特定性质或者活性的蛋白变体。
[0464] 体内改组
[0465] 分子的体内改组在本发明的方法中使用,提供本发明的多肽的变体,例如抗体、木聚糖酶以及类似物。体内改组可以利用重组多聚体的细胞的天然特性进行。尽管体内重组已经提供了分子多样性的主要天然途径,但遗传重组仍然是一种相对复杂的过程,该过程
涉及1)同源性识别;2)链切割、链侵入和导致产生重组交叉(recombination chiasma)的
代谢步骤;和最后3)交叉消除,得到分离的重组分子。交叉的形成需要同源序列的识别。
[0466] 另一方面,本发明包括一种方法,用于由至少第一多核苷酸和第二多核苷酸产生杂合多核苷酸。本发明可被用于产生杂合多核苷酸,这通过将至少第一多核苷酸和第二多
核苷酸引入到合适的宿主细胞中实现,所述至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共享具有部
分序列同源性的至少一个区域。部分序列同源的区域促进了导致产生杂合多核苷酸的序列
再组织的过程。正如此处所用,术语“杂合多核苷酸”是从本发明的方法产生的任何核苷酸序列,其含有来自至少两个原始多核苷酸序列的序列。这样的杂合多核苷酸可以来自可促
进DNA分子间序列整合的分子间重组事件。此外,这样的杂合多核苷酸可以来自分子内还
原重配过程,该过程利用重复序列来改变DNA分子内的核苷酸序列。
[0467] 体内重装配集中在“分子间”的过程上,统称为“重组”,在细菌中,它一般被视为是“RecA-依赖性”现象。本发明可以依赖于宿主细胞的重组过程来重组和重装配序列,或者依赖于细胞介导还原过程的能力,通过缺失来减少细胞中的准-重复序列的复杂性。该“还原性重配”过程通过“分子内的”、RecA-依赖过程而发生。
[0468] 因此,在本发明的另一方面,通过还原性重装配过程,产生新型的多核苷酸。该方法包括产生含有连续序列(起始的编码序列)的构建物,它们插入到合适的载体中,并且然后将它们引入到合适的宿主细胞。单个分子同一性的重装配通过在构建物中具有同源性区
域的连续序列间的组合过程,或者准-重复单位间的组合过程而发生。重装配过程重组和/
或降低重复序列的复杂性和程度,并且导致产生新型的分子种类。可以应用各种处理来提
高重装配速效率。这些处理包括用紫外光,或者损坏DNA的化学试剂处理,和/或使用表现
增高水平的“遗传不稳定性”的宿主细胞系。因此,这样的重装配过程可以涉及同源重组或者准-重复序列指导它们自身进化的天然特性。
[0469] 重复或者“准重复(quasi-repeated)”序列在遗传不稳定性中起作用。在本发明中,“准重复”是并不限于它们起初的单元结构的重复。准重复单元可以在构建物中以序列的阵列出现;以相似序列的连续单元出现。一旦连接,在连续序列之间的连接处变得基本上不可见,并且得到的构建物的准重复性质在分子水平现在是连续的。细胞在准重复序列之
间进行的缺失过程降低了得到的构建物的复杂性。准重复单位提供了一个实际上没有限制
的模板库,在模板上可以发生滑移事件。含有准重复的构建物因此有效地提供了足够的分
子弹性,缺失(和潜在的插入)事件实际上可以在准重复单元内的实际上任何地方发生。
[0470] 当准重复序列全部以相同方向连接,例如,头对尾或者反之亦然,细胞就不能区别各个单元。因此,还原过程可以在整个序列中发生。相反地,例如,当所述单元以头对头存在,而不是头对尾,倒置勾画了相邻单元的末端,这样缺失的形成将有利于不连续单元的失去。因此,本方法优选的是序列处于相同的方向。准重复序列的随机定向将会导致重装配效率的损失,而序列的一致定向将提供最高的效率。然而,虽然具有较少的相同方向的连续序列降低效率,但是仍然可以为新型分子的有效回收提供足够的弹性。可以用相同定向以
允许更高效率的准重复序列制备构建物。
[0471] 应用各种方法中的任何一种,序列可以以头对尾的定向进行装配,包括以下方法:
[0472] a)可以使用包括poly-A头和poly-T尾的引物,当制成单链时,包括poly-A头和poly-T尾的引物将提供定向。这通过具有由RNA制备引物的头几个碱基来完成,而且因此
用RNAseH容易去除。
[0473] b)可以应用包括独特的限制酶切割位点的引物。这需要多个位点、一组独特的序列、和重复的合成和连接步骤。
[0474] c)引物的内部少数碱基可以被硫醇化,并且用外切酶来产生合适的具有尾巴的分子。
[0475] 重装配序列的回收依赖于具有减低的重复指数(RI)的克隆载体的确定。被重装配的编码序列可以随后通过扩增回收。产物被再克隆和表达。具有减低的RI的克隆载体
的回收可以通过如下实现:
[0476] 1)应用仅仅当构建物的复杂性下降时才能稳定地维持的载体。
[0477] 2)通过物理方法对缩短的载体进行物理回收。在这一情况下,克隆载体将应用标准的质粒分离程序进行回收,或者在具有低分子量截留的琼脂糖凝胶或者柱子上利用标准
程序进行大小分离。
[0478] 3)插入物的大小下降时,对含有可以选择的断裂基因的载体进行回收。
[0479] 4)应用表达载体以及适当的选择,使用定向选择技术。
[0480] 相关的生物体的编码序列(例如,基因)可以表现出高度的同源性,并且编码相当多样化的蛋白产物。这些类型的序列特别可作为准重复序列用在本发明中。然而,尽管下
面所描述的例子证明了几乎相同的起始编码序列(准-重复)的再装配,这一过程并不限
于这种几乎相同的重复。
[0481] 下面的例子说明了本发明的方法。描述了来自三个(3)独特种的编码性核酸序列(准-重复)。每一序列编码具有一套不同特征的蛋白质。每一个序列在序列的唯一位置
只有一个或者几个碱基对的不同。准-重复序列分别地或者共同被扩增并且被连接到随机
的装配体中,以便所有可能的排列和组合可以在连接的分子群体中可获得。准-重复单位
的数目可以通过装配条件来控制。在构建物中,准-重复单位的平均数目被定义为重复指
数(RI)。
[0482] 一旦形成,构建物可以,或可以不按照已公开的方法在琼脂糖凝胶上按大小分离,插入到克隆载体,并且转染到合适的宿主细胞中。然后细胞进行繁殖,并且进行“还原性重装配”。如果需要,还原性重装配过程的速率可以通过引入DNA损伤来刺激。RI的降低是通过一种“分子内”的机制在重复序列间形成缺失来介导,还是通过“分子间”的机制由类似重组的事件来介导是不重要的。最终的结果是分子被重装配,得到所有可能的组合。
[0483] 一方面(任选地),本方法包括一个额外的步骤,即对改组库的文库成员进行筛选,以确定个别的改组文库成员——其具有与一种预定的大分子如蛋白质受体、寡糖、病毒颗粒或者其它的预定的化合物或者结构结合或者另外地相互作用,或者催化特定的反应
(如,酶的催化结构域)的能力。
[0484] 从这样的文库所鉴定得到的多肽可以用于治疗、诊断、研究和相关目的(例如,催化剂,用于增加水溶液的渗透性的溶质等等)和/或可以进行改组和/或选择的一个或者多个另外的循环。
[0485] 在另一方面,可以预见,在重组或重装配之前,或者在重组或重装配的过程中,通过本发明的方法产生的多核苷酸可以用试剂或方法处理,这些试剂或方法促进突变引入到原始的多核苷酸中。引入这样的突变将会增加得到的杂合多核苷酸及由其编码的多肽的多
样性。促进诱变的所述试剂或方法可以包括,但不限于:(+)-CC-1065,或者合成的类似物如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)(参见Sun和Hurley,(1992);能够抑制DNA合成的N-乙酰
化或者脱乙酰基的4’-氟-4-氨基联苯加合物(见,例如,vande Poll等(1992));或者能
够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4-氨基联苯加合物(也见,van de Poll等
(1992),751-758页);三价铬、三价铬的盐、可以抑制DNA复制的多环芳香(PAH)DNA加合物,如7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)、三(2,3-二溴丙基)磷酸盐(“Tris-BP”)、1,2-二
溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9-10-环氧化
物(“BPDE”)、铂(II)卤素盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]-喹啉(“N-羟
基-IQ”)、和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-f]-吡啶(“N-羟基-PhIP”)。
用于减慢或者停止PCR扩增的示例性方法由紫外线(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺
嘌呤)组成。特别包含的方法是DNA加合物或者来自多核苷酸或者多核苷酸库的含有DNA
加合物的多核苷酸,在进一步的处理前,其可以通过包括加热含有所述多核苷酸的溶液的
过程被释放或者去除。
[0486] 另一方面,本发明涉及产生具有生物活性的重组蛋白的方法,其通过在根据本发明产生杂合或再装配多核苷酸的条件下处理含有编码野生型蛋白的双链模板多核苷酸的
样品进行。
[0487] 产生序列变体
[0488] 本发明也提供了用于产生本发明核酸(例如木聚糖酶)序列的序列变体的其它方法。本发明也提供了使用本发明的核酸和多肽分离木聚糖酶的其它方法。一方面,本发明
提供了本发明木聚糖酶编码序列(例如基因、cDNA或信息)的变体,其可以通过任何方法
来改变,包括如上所述的例如随意或随机方法、或非随机或“定向进化”方法。
[0489] 被分离的变体可以是天然发生的。变体也可以在体外产生。变体也可以应用遗传工程技术来产生,如定点诱变、随机的化学诱变、核酸外切酶III缺失方法和标准的克隆技术。可选择地,可以应用化学合成或者修饰方法来产生这样的变体、片段、类似物或者衍生物。本领域技术人员也熟悉制备变体的其它方法。这些方法包括这样的程序,其中,从天然分离物中获得的核酸序列经过修饰而产生编码具有某些特征的多肽的新核酸,所述的特征
增加这些多肽在工业、医学、实验(研究)、药学、食物和饲料及食物和饲料补充剂加工以及其它应用和加工中的价值。在这样的程序中,大量的变体序列被获得和表征,这些变体序列与从天然分离物中得到的序列相比,有一个或者多个核苷酸的差异。这些核苷酸的差异可
能引起相对于天然分离物的核酸编码的多肽的氨基酸变化。
[0490] 例如,变体可以通过使用易错PCR产生。在易错PCR中,PCR在DNA聚合酶的复制保真性较低的情况下进行,这样便在全长的PCR产物中得到较高的点突变率。易错PCR在
例如,Leung,D.W.等,Technique,1:11~15,1989和Caldwell,R.C.和JoyceG.F.,PCR Methods Applic.,2:28-33,1992中描述。简要地说,在这样的程序中,待诱变的核酸与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶以及适当浓度的dNTP混合,从而在全长的PCR产物中得到高的点突变率。例如,反应可以使用20fmol待诱变的核酸进行,每种PCR引物
30pmol,反应缓冲液包含50mM KCl、10mM TrisHCl(pH8.3)和0.01%明胶、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5单位的Taq聚合酶、0.2mMdGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP和1mM dTTP。PCR可以进行
30个循环,每个循环为94℃1分钟;45℃1分钟;和72℃1分钟。然而,应该意识到,这些
参数可以适当地变化。诱变的核酸被克隆到一个适当的载体,并评价由诱变核酸编码的多
肽的活性。
[0491] 变体也可以用寡核苷酸诱导的定向突变产生,在任何感兴趣的克隆DNA中产生位点特异性的突变。寡核苷酸诱变在,例如,Reidhaar-Olson(1988)Science 241:53-57中描述。简要地说,在这样的程序中,合成多个具有将要被导入被克隆的DNA中的一个或多个突变的双链寡核苷酸,将这些寡核苷酸插入到待诱变的克隆DNA中。回收含有诱变DNA的克
隆,并评估它们编码的多肽的活性。
[0492] 另一种产生变体的方法是装配PCR。装配PCR涉及由小DNA片段的混合物来装配PCR产物。大量不同的PCR反应在相同的容器中平行地发生,一个反应的产物引发另一个反
应的产物。装配PCR已经被描述,例如在美国专利5,965,408中。
[0493] 还有另一种产生变体的方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中,由于基于序列同源性的DNA分子随机片段化,在不同的但是高度相关的DNA序列的DNA分子之间,在体外
强行发生同源重组,然后通过PCR反应的引物延伸,交换得到固定。有性PCR诱变在,例如,Stemmer(1994)Proc.Natl.Asad.Sci.USA 91:10747-10751中描述。简要地说,在这样的程序中,多个待重组的核酸用DNase消化,产生具有50到200个核苷酸的平均大小的片段。纯
化具有所需的平均大小的片段,并重悬于PCR混合物中。在有利于核酸片段之间发生重组
的条件下进行PCR反应。例如,PCR可以这样进行:将纯化的片段以10-30ng/μl的浓度重
悬于含有0.2mM的各种dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM的Tris-HCl,pH 9.0以及0.1%的Triton X-100的溶液中。每100∶1的反应混合物加入2.5单位的Taq聚合酶,用以下
的条件进行PCR:94℃60秒,94℃30秒,50-55℃30秒,72℃30秒(30-45次),然后72℃
进行5分钟。然而,可以意识到,这些参数可以进行适当的变化。在一些方面,寡核苷酸可以被包括在该PCR反应中。在其它方面,DNA聚合酶I的Klenow片段可以用于第一组PCR
反应,而Taq聚合酶可以用于后续组的PCR反应。重组序列被分离,并评估它们编码的多肽
的活性。
[0494] 变体也可以通过体内诱变产生。在一些方面,感兴趣的序列中的随机突变通过在细菌菌株中增殖该感兴趣的序列而产生,所述细菌菌株例如在一个或者多个DNA修复途径
中具有突变的大肠杆菌菌株。这样的“突变”菌株具有比野生型亲本更高的随机突变率。在一种这样的菌株中进行DNA的繁殖,最终可产生DNA中的随机突变。适于在体内诱变中应
用的突变菌株在,例如,PCT公开号WO 91/16427中有描述,其在1991年10月31日公开,
题目为“Methods for Phenotype Creation from MultipleGene Populations”。
[0495] 变体也可以通过应用盒式诱变产生。在盒式诱变中,双链DNA分子的一个小的区域被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替代。所述寡核苷酸一般含有完全和/或部
分随机的天然序列。
[0496] 递归整体诱变也可以用于产生变体。递归整体诱变是一种用于蛋白质工程(蛋白诱变)的算法,它的开发是为了产生表型相关的突变体组成的多样性群体,其成员在氨基
酸序列上有所不同。该方法应用反馈机制来控制连续多轮的组合式盒式诱变。递归整体诱
变在如Aikin,A.P.和Youvan,D.C.,PNAS,USA 89:7811-7815,1992中有描述。
[0497] 在一些方面,用指数整体诱变产生变体。指数整体诱变是一个用于产生具有高百分比的独特且具功能性的突变体的组合文库的过程,其中一小组的残基被平行随机化,
以在每一个被改变的位置确认产生功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变在如Delegrave,
S.和Youvan,D.C.,Biotechnology Research.11:1548-1552,1993中有描述。随机和定点诱变在如,Arnold,F.H.,Current Opinion in Biotechnology 4:450-455,1993中有描述。
[0498] 在一些方面,变体利用改组方法产生,其中编码不同多肽的多个核酸的部分被融合在一起,产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列,如在美国专利5,965,408——其提交于1996年7月9日,题为“Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis”;以及美国
专利5,939,250——其提交于1996年5月22日,题为″Production of EnzymesHaving
Desired Activities by Mutagenesis”中所描述的。
[0499] 本发明的多肽的变体可以是这样的变体,其中本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换,这样置换的氨基酸残基可
以是由遗传密码编码或不由其编码的氨基酸。
[0500] 保守置换是那些在多肽中一个给定的氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代的置换。通常看来,保守置换为下列替代:脂肪族氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用另一个脂肪族氨基酸替代;丝氨酸用苏氨酸替代,或苏氨酸用丝氨酸替代;酸性残
基如天冬氨酸和谷氨酸用另一个酸性残基替代;具有酰胺基团的残基,如天冬酰胺和谷氨
酰胺用另一个具有酰胺基团的残基替代;碱性残基如赖氨酸和精氨酸用另一个碱性残基来
交换;芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸用另一个芳香族残基替代。
[0501] 其它的变体是那些变体,其中本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基包括取代基。
[0502] 还有其它的变体是那些变体,其中多肽与另外的化合物连接,所述化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。
[0503] 其它变体是那些变体,其中额外的氨基酸被融合到多肽上,例如前导序列、分泌序列、蛋白原序列或有助于多肽的纯化、富集或稳定的序列。
[0504] 在一些方面,片段、衍生物和类似物保持了与本发明多肽及与其基本上相同的序列的相同的生物功能或活性。在其它方面,片段、衍生物或类似物包括蛋白原,这样,片段、衍生物或类似物可以通过蛋白原部分的切割来激活,以产生活性多肽。
[0505] 优化密码子以便在宿主细胞中获得高水平的蛋白表达
[0506] 本发明提供了修饰编码木聚糖酶的核酸来改变密码子使用的方法。一方面,本发明提供了修饰编码木聚糖酶的核酸中的密码子来增加或者降低其在宿主细胞中的表达的
方法。本发明也提供了编码木聚糖酶的核酸,该核酸经过修饰从而增加其在宿主细胞中的
表达;经过这样修饰的木聚糖酶;以及制备修饰的木聚糖酶的方法。该方法包括鉴定编码
木聚糖酶的核酸中的“非优选的”或“较不优选的”密码子,并且用编码相同氨基酸的“优选密码子”作为替换密码子替换一个或者多个这些非优选或者较不优选的密码子,并且在所
述核酸中至少一个非优选或较不优选的密码子被编码相同氨基酸的优选密码子替换。优选
密码子是在宿主细胞基因的编码序列中被较多使用的密码子,而不优选的或者较不优选的
密码子是指在宿主细胞基因的编码序列中较少使用的密码子。
[0507] 用于表达本发明的核酸、表达盒以及载体的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此,本发明提供了在所有这些细胞中优化密码子使用的方法、密码子被改变的核酸,以及由所述的密码子被改变的核酸编码的多肽。示例性的
宿主细胞包括革兰氏阴性细菌,如埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌;革兰氏阳性细菌,如
加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球
菌(Lactococcus cremoris)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。示例性的宿主细胞
也包括真核生物体,如,各种酵母,如酵母菌属某种(Saccharomyces sp.),包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕
赤酵母(Pichia pastoris)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉森酵母
(Hansenulapolymorpha)、黑曲霉(Aspergillusniger)和哺乳动物细胞和细胞系以及昆虫
细胞和细胞系。其它示例性宿主细胞包括细菌细胞,例如埃希氏大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各个
种;真菌细胞,例如曲霉菌属(Aspergillus);酵母细胞,例如毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或许旺酵母属中的任何种,包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或粟酒裂殖酵母;昆虫细
胞,例如果蝇S2和草地夜蛾Sf9;动物细胞,例如CHO、COS或黑色素瘤细胞或腺病毒。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。因此,本发明还包括被优化来在这些生物
体和物种中表达的核酸和多肽。
[0508] 例如,从细菌细胞中分离出的编码木聚糖酶的核酸密码子被修饰,以便该核酸在不同于获得木聚糖酶的细菌的细菌细胞、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中被优化地表达。优化密码子的方法在本领域是已知的,参见如,美国专利5,795,737;
Baca(2000)Int.J.Parasitol.30:113-118;Hale(1998)Protein Expr.Purif.12:
185-188;Narum(2001)Inect.Immun.69:7250-7253。 也 参 见 Narum(2001)Infect.
Immun.69:7250-7253,描述了在小鼠系统中优化密码子;Outchkourov(2002)Protein
Expr.Purif.24:18-24,描述了在酵母中优化密码子;Feng(2000)Biochemistry39:
15399-15409,描述了在大肠杆菌中优化密码子;Humphreys(2000)Protein Expr.Purif
20:252-264,描述了大肠杆菌中优化影响分泌的密码子使用。
[0509] 转基因非人动物
[0510] 本发明提供了转基因非人动物,其包含本发明的核酸、多肽(例如木聚糖酶)、表达盒或载体或转染细胞或转化细胞。本发明也提供了产生和应用这些转基因非人动物的方
法。
[0511] 转基因非人类动物可以是,例如包含本发明核酸的山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠、马、狗、鱼和小鼠。这些动物可以用作例如体内模型来研究木聚糖酶的活性,或者作为模型来在体内筛选改变木聚糖酶活性的试剂。要在转基因非人动物中表达的多肽的编码序
列可以设计为组成型的,或者在组织特异性、发育特异性或者可诱导的转录调控因子的
控制之下。转基因非人动物可以应用本领域任何已知的方法设计和产生;参见,如,美国
专 利 6,211,428;6,187,992;6,156,952;6,118,044;6,111,166;6,107,541;5,959,171;
5,922,854;5,892,070;5,880,327;5,891,698;5,639,940;5,573,933;5,387,742;
5,087,571,它们描述了制造和应用转化的细胞和卵以及转基因小鼠、大鼠、兔、羊、猪、鸡、山羊、鱼和牛。也参见,如,Pollock(1999)J.Immunol.Methods231:147-157,描述了在转基因产奶动物的乳汁中生产重组蛋白;Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17:456-461,描述了转基因山羊的产生。美国专利6,211,428,描述了制备和应用在其脑中表达含有DNA序列的
核酸构建物的转基因非人哺乳动物。美国专利5,387,742,描述了把克隆的重组子或者合成的DNA序列注射至小鼠受精卵中,移植注射的卵至假孕的雌鼠中,并生长成为转基因鼠,它的细胞表达与阿尔茨海默氏病的病理相关的蛋白。美国专利6,187,992,描述了制备和应用转基因小鼠,它的基因组包括编码淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的
基因的断裂。
[0512] “基因敲除动物”也可以被用于实践本发明的方法。例如,一方面,本发明的转基因或修饰动物包括“基因敲除动物”,例如“基因敲除小鼠”,其被工程改造以至于不表达内源基因,该基因被表达本发明木聚糖酶的基因或包含有本发明木聚糖酶的融合蛋白的基因代替。
[0513] 转基因植物和种子
[0514] 本发明提供了转基因植物和种子,其包含本发明的核酸、多肽(例如木聚糖酶)、表达盒或载体或转染或转化的细胞。本发明也提供了包含本发明核酸和/或多肽(例如木
聚糖酶)的植物产品或副产品,包括任意植物部分在内,例如水果、油、种子、叶、提取物和类似物,例如其中本发明核酸或多肽与植物、植物部分、种子等是异源的。转基因植物(其包括植物部分、水果、种子等)可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。
本发明也提供了制备和应用这些转基因植物和种子的方法。表达本发明的多肽的转基因植
物或者植物细胞可以按照本领域任何已知的方法构建。参见例如,美国专利6,309,872。
[0515] 本发明的核酸和表达构建物可以通过任何方式导入到植物细胞中。例如,核酸或者表达构建物可以导入到所希望的植物宿主的基因组中,或者,核酸或表达构建物可以是
附加体。可以导入到所希望的植物的基因组中,这样,宿主的木聚糖酶的产生被内源性的
转录或者翻译控制元件调控。本发明也提供了“基因敲除植物”,其中例如同源重组导致的基因序列插入破坏了内源性基因的表达。产生“基因敲除”植物的方法在本领域是熟知的,参见例如,Strepp(1998)Proc Natl.Acad.Sci.USA 95:4368-4373;Miao(1995)Plant J 7:
359-365。参见下面关于转基因植物的讨论。
[0516] 本发明的核酸可以用来将所需的性质赋予基本上任何植物,例如产淀粉的植物,如马铃薯、小麦、大米、大麦以及类似的植物。本发明的核酸可以用于操纵植物的代谢途径,以优化或者改变宿主的木聚糖酶表达。这可以改变植物中的木聚糖酶的活性。可选地,本发明的木聚糖酶可以在转基因植物的生产中被应用,以产生该植物不能天然产生的化合物。
这可以降低生产成本或者产生新的产物。
[0517] 一方面,生产转基因植物的第一步涉及制备用于在植物细胞中表达的表达构建物。这些技术在本领域是熟知的。它们可以包括选择和克隆启动子、便于核糖体有效结合
mRNA的编码序列,以及选择适当的基因终止子序列。一个示例性的组成型启动子是来自花
椰菜花叶病毒的CaMV35S,它一般在植物中导致高水平的表达。其它的启动子是更特异的,并且对植物内部或者外部环境中的暗示有反应。一个示例性的光诱导的启动子是来自编码
主要叶绿素a/b结合蛋白的cab基因的启动子。
[0518] 一方面,修饰核酸来实现在植物细胞中更大的表达。例如,本发明的序列很可能具有比在植物中见到的更高的A-T核苷酸对百分率,而一些植物优选G-C核苷酸对。因此,编码序列中的A-T核苷酸可以用G-C核苷酸取代,而不显著改变氨基酸序列,从而可以增加基
因产物在植物细胞中的产生。
[0519] 为了鉴定已经成功整合了转基因的植物细胞或者组织,可以将选择性标记基因加入到基因构建物中。这可能是必要的,因为在植物细胞中完成基因的整合和表达是一个小
概率事件,仅仅在较少百分率的靶组织和细胞中发生。选择性标记基因编码对试剂有抗性
的蛋白,所述试剂一般对植物有毒性,如抗生素或者除草剂。当在含有适当的抗生素或者除草剂的培养基上生长时,只有已经整合了选择性标记基因的植物细胞可以成活。至于其它
的插入基因,为了有恰当的功能,标记基因也需要启动子和终止序列。
[0520] 一方面,制备转基因植物或种子包括将本发明的序列以及一方面(任选地)标记基因整合到目标表达构建物(如,质粒)中,同时安置启动子和终止子序列。这可以包括通
过合适的方法将修饰的基因转移至植物中。例如,构建物可以应用如电穿孔和微注射植物
细胞原生质体的技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中,或者构建物可以应用弹道方法
(ballistic methods),如,DNA微粒轰击(DNAparticle bombardment)的方法直接引入到植物组织中。例如,参见如,Christou(1997)Plant Mol.Biol.35:197-203;Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6:17-30;Klein(1987)Nature 327:70-73;Talcumi(1997)Genes Genet.Syst.72:63-69,讨论了应用微粒轰击将转基因引入到小麦中;以及Adam(1997)如上,应
用微粒轰击将YAC引入至植物细胞中。例如,Rinehart(1997)如上,用微粒轰击来产生转
基因棉花植物。用于加速微粒的设备在美国专利5,015,580中有说明;而且,可以商购得
到BioRad(Biolistics)PDS-2000微粒加速设备;也参见,John,美国专利5,608,148;和
Ellis,美国专利5,681,730,描述了微粒介导的裸子植物的转化。
[0521] 一方面,原生质体可以被固定,并用核酸例如表达构建物注射。尽管源自原生质体的植物再生对于谷类并不容易,但是应用体细胞胚胎发生由原生质体来源的愈伤组织进行植物再生在豆类中是有可能的。机化组织可以使用基因枪技术用裸DNA转化,其中,DNA被
包裹于钨微射弹(tungsten microprojectiles)上,射出物的大小为细胞大小的1/100,它
携带DNA深入到细胞和细胞器中。转化的组织然后被诱导再生,一般通过体细胞胚胎发生
技术。这一技术已经在包括玉米和水稻的几个谷类物种中成功应用。
[0522] 核酸,例如表达构建物,也可以应用重组病毒引入到植物细胞中。植物细胞可以用病毒载体转化,如,烟草花叶病毒衍生的载体(Rouwendal(1997)Plant Mol.Biol.33:
989-999),参见Porta(1996)“Use of viral replicons for the expression of genesin plants”,Mol.Biotechnol.5:209-221。
[0523] 可选地,核酸,如表达构建物,可以与合适的T-DNA侧翼区组合,并导入到传统的根瘤农杆菌宿主载体中。根瘤农杆菌宿主的毒力功能将在植物细胞受该细菌感染时,
引导构建物和邻近的标记插入至植物细胞DNA中。根瘤农杆菌介导的转化技术,包括
disarming和应用二元载体,在科学文献中有详细的说明。参见,如,Horsch(1984)Science
233:496-498;Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803(1983);Gene Transfer to Plants,Potrykus,ed.(Springer-Verlag,Berlin 1995)。根瘤农杆菌细胞的DNA被包含在细菌染色体中,也被包含在称为Ti(肿瘤诱导)质粒的另一种结构中。Ti质粒含有一段命
名为T-DNA的DNA(约20kb长)和一系列毒力(毒性)基因,T-DNA在感染过程中被转移
到植物细胞中,毒力基因则引导所述感染过程。根瘤农杆菌仅可以通过伤口感染植物:当一种植物的根或者茎受伤时,它释放某种化学信号,作为对这种信号的响应,根瘤农杆菌的毒力基因被激活,并引发一系列从Ti质粒转移T-DNA至植物染色体所必需的事件。T-DNA然
后通过伤口进入到植物细胞。一个推测是T-DNA一直等到植物DNA复制或者转录,然后将
自身插入到暴露的植物DNA中。为了应用根瘤农杆菌作为转基因载体,必须去除T-DNA的
肿瘤诱导部分,而保留T-DNA的边界区域和毒力基因。转基因然后插入到T-DNA的边界区
域之间,从这里转移到植物细胞并且整合到植物的染色体中。
[0524] 本发明提供了应用本发明的核酸进行包括重要的谷类植物在内的单子叶植物 的 转化,参 见Hiei(1997)Plant Mol.Biol.35:205-218。 也参 见 如,Horsch,
Science(1984)233:496 ;Fraley(1983)Proc.Natl Acad.Sci USA 80:4803 ;
Thykjaer(1997)如上;Park(1996)Plant Mol.Biol.32:1135-1148,讨论了将T-DNA整合到基因组DNA中。也参见D′Halluin,美国专利5,712,135,描述了包含在谷类或者其它单子
叶植物的细胞中的具有功能的基因的DNA的稳定整合过程。
[0525] 一方面,第三步可以涉及完整植物的选择和再生,所述植物能够将整合的靶基因传递至下一代。这样的再生技术依赖在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操作,通
常依赖杀虫剂和/或除草剂标记,其已同所期望的核苷酸序列一起引入。源自培养的原生
质体的植物再生在以下文献中有说明,Evans等,ProtoplastsIsolation and Culture,
Handbook of Plant Cell Culture,124-176 页,MacMillilanPublishing Company,New York,1983;和 Binding,Regeneration of Plants,PlantProtoplasts,21-73 页,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或者其中的一部分得到。这样的再生技术在Klee(1987)Ann.Rev.ofplant Phys.38:467-486中有概括性的说
明。为了从转基因组织如未成熟的胚胎获得整个植物,它们可以在一系列含有营养物和激
素的培养基中在可控制的环境条件下培养,即称为组织培养的过程。一旦整个植物再生并
且产生种子,便开始评测其子代。
[0526] 在表达盒稳定地整入到转基因植物之后,其可以通过有性交换(sexualcrossing)引入到其它的植物中。可以应用任何的标准繁殖技术,这依赖于待杂交的物种。因为本发
明核酸的转基因表达导致表型变化,包含本发明的重组核酸的植物可以和另一植物有性杂
交而得到最终产物。因此,本发明的种子可以来自本发明的两个转基因植物之间的杂交,或者来自本发明的植物和其它植物之间的杂交。当两个亲本植物都表达本发明的多肽(例如
木聚糖酶)时,所需的效应(例如,表达本发明的多肽来产生一种开花行为被改变的植物)
可以被增强。所需的效应可通过标准的繁殖方法传到以后的植物世代中。
[0527] 本发明的核酸和多肽被表达于或者插入到任何植物或者种子中。本发明的转基因植物可以是双子叶植物或者单子叶植物。本发明的单子叶转基因植物的例子是草,如牧草
(蓝草,早熟禾属(Poa)),饲料草如羊茅属,黑麦草属,温带草,如翦股颖属(Agrostis),和谷类,如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、蜀黍和玉米(maize)(玉米(corn))。本发明的双子叶转基因植物的例子是烟草、豆类,如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、蚕豆和大豆,以及十字花科植物(Brassicaceae科),如花椰菜,油菜籽,和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。这样,本发明的转基因植物和种子包括宽范围的植物,包括,但不限于,以下属的种:腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天冬属(Asparagus)、茄属(Atropa)、
燕麦属(Avena)、油菜属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属
(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆
属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大
麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草
属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属
(Manihot)、马郁兰属(薄荷属,Majorana)、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannisetum)、鳄梨属(Persea)、
菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属
(Prunus)、萝卡属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、可可属(Theobromus)、胡卢巴属
(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和黍属(Zea)。本发明的转基因植物和种子可以是任意单子叶或双子叶植物,例如单子叶玉
米、甘蔗、大米、小麦、大麦、柳枝稷或芒属植物;或双子叶油籽作物、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈油、甜菜、花生、树、白杨或羽扇豆。
[0528] 在可选择的实施方式中,本发明的核酸在含有纤维细胞的植物(和/或它们的种子)中表达,包括,如,棉、丝棉树(木棉、吉贝木棉)、沙漠柳、石炭酸灌木、winterfat、轻木(balsa)、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、马尼拉剑麻和亚麻。在可选择的实施方式中,本发明的转基因植物可以是棉属(Gossypium)的成员,包括任何棉(Gossypium)种的
成员,如,亚洲棉(G.arboreum)、草棉(G.herbaceum)、海岛棉(G.barbadense)和陆地棉
(G.hirsutum)。
[0529] 本发明也提供了用于产生大量本发明多肽(例如木聚糖酶或抗体)的转基因植物(和/或它们的种子)。例如,参见Palingren(1997)Trends Genet.13:348;Chong(1997)
Transgenic Res.6:289-296(利用植物生长素诱导的双向甘露氨酸合成酶(mas1′,2′)
启动子,应用根瘤农杆菌介导的叶盘(leaf disc)转化方法在转基因马铃薯植物中生产人
乳汁蛋白β-酪蛋白)。
[0530] 应用已知的程序,技术人员可以通过检测在转基因植物中转基因mRNA或蛋白的增加或减少来筛选本发明的植物(和/或它们的种子)。检测和定量mRNA或蛋白的方法在
本领域是熟知的。
[0531] 多肽和肽
[0532] 在一个方面,本发明提供具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的分离的、合成的或重组的多肽和肽,或能够产生与木聚糖酶或葡聚糖酶——包括本发明的
酶——特异性结合的抗体的多肽和肽,其包括本发明的氨基酸序列,它们包括与下列多
肽具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、
63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、
93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或100%(完全)序列同一性的那些:本发明的示例性多肽(如上所限定,包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:
8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:
20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24),或本发明的任意多肽,包括具有表1中所列出的和本文中所描述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQ IDNO:2,还包括具有基于示例
性SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:
24的各种序列同一性的一类多肽;以及这些示例性多肽具有下列酶促活性(例如SEQ ID
NO:2的木聚糖酶,由例如SEQ ID NO:1编码;SEQ ID NO:14的阿拉伯糖苷酶,由例如SEQ ID NO:13编码,等等):
[0533]SEQ ID NO: 名称 活性
1、2 xyl 11 木聚糖酶
11、12 对照木聚糖酶 木聚糖酶
13、14 阿拉伯糖苷酶
15、16 木聚糖酶
17、18 寡聚酶
19、20 B-葡糖苷酶
21、22 阿拉伯糖苷酶
23、24 β-木糖苷酶
3、4 内切葡聚糖酶
5、6 寡聚酶
[0534]
[0535] 本发明还提供编码酶的核酸,它们的共同新颖性在于它们编码包含“X14模块”的木聚糖酶的亚型或分化体。在一个方面,本发明还提供编码酶的核酸,它们的共同新颖性在于它们编码包含“X14模块”的分化体(参见,例如J.Bacteriol.2002August;184(15):
4124-4133)。包含X14的木聚糖酶成员包括具有表1中所列出的和本文中所描述的一个或
更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQ ID NO:2。
[0536] 在一个方面,本发明提供嵌合酶,包括木聚糖酶、葡聚糖酶和/或糖苷酶,它们具有异源糖结合模块(CBM),例如用于本发明的加工中和用于各种工业、医学、药学、研究、食物和饲料及食物和饲料补充剂加工以及其它应用中。例如,在一个方面,本发明提供酶,例如水解酶,包括糖基水解酶(如木聚糖酶、葡聚糖酶),其含有本发明酶的一个或更多个
CBM,包括上面论述的CBM样X14模块。在另一个方面中,本发明不同酶之间的CBM,例如X14模块可以进行交换;或可选择地,本发明的一种或更多种酶的一个或更多个CBM可以剪接
到酶,例如水解酶,例如任意糖基水解酶,如木聚糖酶中。
[0537] 利用不溶性底物的糖基水解酶是模块化的,通常包含附着到一个或更多个非催化糖结合模块(CBM)的催化模块。性质上,CBM被认为促进糖基水解酶与其靶底物多糖的相互
作用。例如,如上面所论述,X14是木聚糖结合模块。因此,本发明提供具有异源、非天然底物的嵌合酶;包括具有多种底物的嵌合酶,所述底物的性质为它们的“剪接型(spliced-in)”异源CBM,例如本发明的剪接型X14模块——从而得到对木聚糖和半乳糖的嵌合酶新特异
性,或与木聚糖和半乳糖的结合增强。本发明嵌合酶的异源CBM可以设计成模块化的,即附着到催化模块或催化结构域(例如活性位点),所述催化模块或催化结构域也可以与该酶
异源或同源。
[0538] 已经显示,只利用木聚糖酶或葡聚糖酶(例如本发明的酶)的催化模块是有效的。因此,本发明提供组成为或包括模块化CBM/活性位点模块(例如X14)的肽和多肽,所述模
块化CBM/活性位点模块可以同源配对或作为嵌合(异源)活性位点-CBM对而连接。因
此,本发明的这些嵌合多肽/肽可以用于改进或改变单个酶,例如木聚糖酶的性能。本发
明的嵌合催化模块(包含例如本发明的至少一个CBM,例如X14)可设计成将酶靶向底物的
特定区域,例如靶向浆料的特定区域。例如,在一个方面,这可以通过制备木聚糖酶与各种CBM的融合物(或者本发明的木聚糖酶与异源CBM,或本发明的CBM与另一种酶,例如水解
酶如木聚糖酶的融合物)来实现。例如,CBM4、CBM6和CBM22已知结合木聚糖并且可以提
高木聚糖酶在浆料生物漂白中的有效性(参见,例如Czjzek(2001)J.Biol.Chem.276(51):
48580-7,注意到,CBM4、CBM6和CBM22与木聚糖有关以及CBM主要与木聚糖相互作用)。在
另一个实施方式中,木聚糖酶与CBM3a或CBM3b的融合——其结合晶态纤维素——可以帮
助木聚糖酶渗透浆料的复合多糖基质并且到达难以接近的木聚糖。任意CBM可以用于实践
本发明,例如如Boraston(2004)Biochem.J.382:769-781所评述的那样:
[0539] 家族 蛋白质 PDB代码
[0540] CBM1 纤维素酶7A(里氏木霉(Trichoderma reesei)) 1CBH
[0541] CBM2 木聚糖酶10A(粪纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)) 1EXG
[0542] 木聚糖酶11A(粪纤维单胞菌) 2XBD
[0543] 木聚糖酶11A(粪纤维单胞菌) 1HEH
[0544] CBM3 支架蛋白(解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)) 1G43
[0545] 支架蛋白(热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)) 1NBC
[0546] 纤维素酶9A(褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)) 1TF4
[0547] CBM4 昆布多糖酶16A(海栖热袍菌(Thermotoga maritima)) 1GUI
[0548] 纤维素酶9B(粪纤维单胞菌) 1ULO;
[0549] 1GU3
[0550] 纤维素酶9B(粪纤维单胞菌) 1CX1
[0551] 木聚糖酶10A(海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus 1K45
[0552] marinus))
[0553] CBM5 纤维素酶5A(菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)) 1AIW
[0554] 壳多糖酶B(褪色沙雷氏菌(Serratia marcescens)) 1E15
[0555] CBM6 木聚糖酶11A(热解纤维梭菌) 1UXX
[0556] 木聚糖酶11A(粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)) 1NAE
[0557] 木聚糖酶11A(粪堆梭菌) 1UY4
[0558] 内切葡聚糖酶5A(混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)) 1UZ0
[0559] CBM9 木聚糖酶10A(海栖热袍菌) 1I8A
[0560] CBM10 木聚糖酶10A(纤维弧菌(Cellvibriojaponicus)) 1QLD
[0561] CBM12 壳多糖酶Chi1(环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)) 1ED7
[0562] CBM13* 木聚糖酶10A(橄榄灰绿链霉菌(Streptomyces 1XYF
[0563] olivaceoviridis))
[0564] 木聚糖酶10A(变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)) 1MC9
[0565] 蓖麻毒素B-链(蓖麻(Ricinus communis)) 2AAI
[0566] 相思豆毒素(相思豆(Abrus precatorius)) 1ABR
[0567] CBM 14 Tachycitin(中国鲎(Tachypleus tridentatus)) 1DQC
[0568] CBM15 木聚糖酶10C(纤维弧菌) 1GNY
[0569] CBM17 纤维素酶5A(食纤维梭菌(Clostridium cellulovorans)) 1J83
[0570] CBM18* 凝集素(小麦(Triticum aestivum)) 1WGC
[0571] 抗菌肽(Amaranthus caudatus) 1MMC
[0572] 壳多糖酶/凝集素(大荨麻(Urtica dioica)) 1EIS
[0573] CBM20* 葡糖淀粉酶(黑曲霉(Aspergillus niger)) 1AC0
[0574] β-淀粉酶(蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)) 1CQY
[0575] CBM22 木聚糖酶10B(热解纤维梭菌) 1DYO
[0576] CBM27 甘露聚糖酶5A(海栖热袍菌) 1OF4
[0577] CBM28 纤维素酶5A(芽胞杆菌属某种(Bacillus sp.1139)) 1UWW
[0578] CBM29 非催化蛋白1(Pyromyces equi) 1GWK
[0579] CBM32 唾液酸酶33A产绿小单胞菌(Micromonospora 1EUU
[0580] viridifaciens)
[0581] 半乳糖氧化酶(树状葡枝霉(Cladobotryum dendroides)) 1GOF
[0582] CBM34* α-淀粉酶13A(普通高温放线菌(Thermoactinomyces 1UH2
[0583] vulgaris))
[0584] 新支链淀粉酶(嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus 1J0H
[0585] stearothermophilus))
[0586] CBM36 木聚糖酶43A(多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus 1UX7
[0587] polymyxa))
[0588] *这些家族含有太多的结构条目以致不能将它们全部列出,因此仅给出了代表。
[0589] 因此,本发明提供嵌合水解酶,例如糖苷酶与不同(例如异源)CBM的融合,以将该酶靶向特定的不溶性多糖,提高在应用中的性能。在一个方面,嵌合糖苷酶包含本发明的酶。在一个方面,嵌合酶包含不同CBM的融合以提高浆料生物漂白性能,例如以实现漂白化学品更高百分比的减少。本发明还提供这样的方法,所述方法包括将不同的CBM与不同木
聚糖酶重组(例如本发明的CBM和/或本发明的木聚糖酶),以及筛选所得到的嵌合体,以
找到用于具体应用或底物的最佳组合。
[0590] 其它变化也在本发明的范围内,例如其中1、2、3、4或5或更多个残基被从本发明任意多肽的羧基端或氨基端移除。另一种变化包括修饰任意残基以增加或减少多肽的pI,例如移除或修饰(例如成为另一种氨基酸)谷氨酸。该方法作为一般方案用于改进酶的性
质而不产生调节问题,原因是氨基酸没有突变;以及这种一般方案可以与本发明的任意多
肽一起使用。
[0591] 本发明提供具有木聚糖酶活性的分离的、合成的或重组的多肽,其中所述多肽具有本发明任意多肽的序列修饰,包括本发明的任意示例性氨基酸序列,包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24,以及还包括具有表1中所列出的和本文中所述的氨基酸残基改变(突变)的SEQ ID NO:2。序列改变也
可以包括任意氨基酸修饰以改变多肽的pI,例如谷氨酸的缺失或修饰,或从谷氨酸改变为
另一种残基。
[0592] 本发明进一步提供分离的、合成的或重组的多肽,其与本发明的示例性序列具有序列同一性(例如至少约50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、
61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、
76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全(100%)序列同一性)。
[0593] 在一个方面,多肽具有木聚糖酶或葡聚糖酶活性;例如,其中木聚糖酶活性可以包括水解多糖,例如木聚糖中的糖苷键。在一个方面,多肽具有木聚糖酶活性,其包括催化内部β-1,4-木糖苷键的水解。在一个方面,木聚糖酶活性包括内-1,4-β-木聚糖酶活性。在一个方面,木聚糖酶活性包括水解木聚糖以产生较小分子量的木糖和木糖寡聚体。在一
个方面,木聚糖包括阿拉伯木聚糖,如水溶性阿拉伯木聚糖。
[0594] 本发明提供具有葡聚糖酶活性的多肽。在一个方面,本发明多肽或肽(其包括本发明核酸编码的蛋白质或肽)的葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性,例如内-1,4-和/
或1,3-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性。在一个方面,内切葡聚糖酶活性包括催化1,
4-β-D-糖苷键的水解。在一个方面,葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶活性包括内-1,4-和/或
1,3-β-内切葡聚糖酶活性或内-β-1,4-葡聚糖酶活性。在一个方面,葡聚糖酶活性(例
如内-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基
纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键、在混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖和含纤维素部分的其它植物材料中的β-1,4键的水解。在一个方面,葡聚糖
酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性包括水解葡聚糖或其它多糖,以产生较小分子量的多糖或
寡聚体。在一个方面,葡聚糖包括β-葡聚糖,如水溶性β-葡聚糖。
[0595] 本发明提供这样的多肽,所述多肽具有甘露聚糖酶(例如内-1,4-β-D-甘露聚糖酶)活性,例如,催化β-1,4-甘露聚糖如未取代的线性β-1,4-甘露聚糖的水解。甘露
聚糖酶活性测定可以使用任意已知的方法测定,例如刚果红方法,如例如Downie(1994)“A new assay for quantifying endo-beta-mannanase activity using Congo red dye.
Phytochemistry,July 1994,vol.36,no.4,p.829-835所述的;或如美国专利6,060,299中所述,例如通过将待测试溶液施加到被打在琼脂板中的4mm直径的孔,所述琼脂板含有
0.2%AZCL半乳甘露聚糖(carob)或用于内-1,4-β-D-甘露聚糖酶分析的任意底物。
[0596] 本领域中已知的任意木聚糖酶、葡聚糖酶和/或甘露聚糖酶分析可以用于测定多肽是否具有木聚糖酶、葡聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性以及是否在本发明的范围内。例
如,还原糖分析如Nelson-Somogyi方法或二硝基水杨酸(DNS)方法可以用于对产品糖
(以及因此,木聚糖酶活性)测验。在一个方面,通过在缓冲的pH和设定温度下混合和温
育酶制剂的稀释液与已知量的底物来实施反应。除了将木聚糖(例如燕麦或桦树)溶液
替换为CMC或滤纸外,木聚糖酶分析与纤维素酶分析相似。DNS分析比Nelson-Somogyi
分析更容易使用。DNS分析对于纤维素酶活性是令人满意的,但易于过高评价木聚糖酶
活性。Somogyi-Nelson方法在还原糖的测定中更加精确,以测量比活性和对优化生长条
件下产生的木聚糖酶的总量进行定量,参见,例如Breuil(1985)Comparison of the 3,
5-dinitrosalicylic acid andNelson-Somogyi methods of assaying for reducing
sugars and determining cellulaseactivity,Enzyme Microb.Technol.7:327-332;
Somogyi,M.1952,Notes on sugardetermination,J.Biol.Chem.195:19-23。本发明例如基于参考文献Nelson,N.(1944)J.Biol.Chem.153:375-380和Somogyi,M.(1952)J.Biol.
Chem.195:19-23,例如通过Nelson-Somogyi而并入任意还原糖分析的应用。
[0597] 本发明多肽包括活性或失活形式的木聚糖酶。例如,本发明的多肽包括在“成熟”或例如通过蛋白原加工酶如蛋白原转化酶来产生“活性”成熟蛋白对前原序列加工之前的蛋白原。本发明的多肽包括由于其它原因而不具有活性的木聚糖酶,所述其它原因例如在
通过翻译后加工事件诸如内切或外切肽酶或蛋白酶作用、磷酸化事件、酰胺化、糖基化或硫酸化或二聚化事件等等进行“活化”之前。本发明的多肽包括所有的活性形式,包括木聚糖酶的活性子序列,例如,催化结构域或活性位点。
[0598] 鉴定“前原”结构域序列和信号序列的方法是本领域熟知的,参见例如Van deVen(1993)Crit.Rev.Oncog.4(2):115-136。例如,为了鉴定前原序列,从细胞外空间纯化蛋白,并且测定N-末端蛋白序列并与未加工形式比对。
[0599] 本发明包括具有或没有信号序列和/或前原序列的多肽。本发明包括具有异源信号序列和/或原前序列的多肽。前原序列(包括用作异源前原结构域的本发明序列)可以
位于蛋白质的氨基末端或羧基末端。本发明还包括含有本发明序列的分离或重组的信号序
列、前原序列和催化结构域(例如,活性位点)。
[0600] 序列同一性百分比可以是多肽的全长,或者所述同一性可以是在至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个残基的区域上。本发明的多肽还可短于示例性多肽的全长。在可选的方面,本发明提供大小范围在
约5个残基至多肽全长之间的多肽(肽,片段),所述多肽例如酶,如木聚糖酶;示例性大小为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、
250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个残基,例如本发明的示例性木聚糖酶的连续残基。
[0601] 本发明的肽(例如本发明示例性多肽的子序列)可以用作例如标记探针、抗原、耐受原(toleragen)、基序、木聚糖酶活性位点(例如“催化结构域”)、信号序列和/或前原结构域。
[0602] 本发明的多肽和肽可以分离自天然来源,可以是合成的,或者可以是重组产生的多肽。肽和蛋白可以在体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可以使用本技术领域已知
的任何方法产生和分离。本发明的多肽和肽也可以使用本技术领域熟知的化学方法全部或
部分合成。例如参见Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223;Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232;Banga,A.K.,Therapeutic Peptides and
Proteins,Formulation,Processing and DeliverySystems(1995)Technomic Publishing Co.,Lancaster,PA。例如,肽合成可以使用各种固相技术进行(例如参见Roberge(1995)
Science 269:202;Merrifield(1997)Methods Enzymol.289:3-13),自动合成可以例如使用ABI 431A肽合成仪(PerkinElmer),根据制造商提供的说明书来实施。
[0603] 本发明的肽和多肽也可被是糖基化。所述糖基化可以在翻译后通过化学方法或者通过细胞的生物合成机制而加上,其中后者包括应用已知的糖基化作用基序,所述糖基化
作用基序可以对于所述序列是天然的,或者可以作为肽而被加入,或者是在核酸编码序列
中加入。糖基化作用可以是O-联接的或者是N-联接的。
[0604] 如本文所使用,“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列,或指寡肽、肽、多肽或蛋白序列中任意一种的片段、部分或亚基,以及指天然发生的或合成的分子。“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列,或寡肽、肽、多肽或蛋白序列中任意一种的片段、部分或亚基,以及指天然发生的或合成的分子。如本文所使用,术语“多肽”是指通过肽键或修饰的肽键即肽等排体(peptide isosteres)彼此结合在一起
的氨基酸,可以含有除20个由基因编码的氨基酸之外的修饰的氨基酸。所述多肽可以通
过天然过程,如,翻译后加工或者通过本领域所熟知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以
发生在所述多肽的任何地方,包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解,相同类型的修饰可以在给定的多肽中以相同的或者不同的程度在几个位点处发生。一个给
定的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、
酰胺化作用、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂质或者脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化作用、形成二硫键、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化作用、木聚糖水解酶处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用,和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中,如精氨酰化。(参见,如,Creighton,T.E.,Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.,W.H.Freeman 和 Company,
NewYork(1993);Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,11-12页(1983))。本发明的肽和多肽也包括所有“模拟物”和“肽模拟物”形式,正如下面进一步详细描述的。
[0605] “重组的”多肽或蛋白是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白;即,由用编码期望多肽或蛋白的外源DNA构建物转化的细胞产生的多肽或蛋白。本发明的“合成的”核酸(包括寡核苷酸)、多肽或蛋白包括那些通过例如下面所述的任意化学合成制备的多肽或
蛋白。固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十
世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc.,85:
2149-2154,1963)(也参见Stewart,J.M.和Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical Co.,Rockford,III,11-12页),并且这些方法已经被用于商
业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearch Biochemicals)。这些商
业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:
3998(1984)的教导,并将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端,而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时,一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中,所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附着或
固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤,即是,反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中,将氨基酸构建成所要的肽。此外,大量的可利用的FMOC肽合成系统是
可利用的。例如,应用Applied Biosystems,Inc.的Model 431A自动肽合成仪可以在固体
支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得,或者通过直接的合成或
者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
[0606] 如本文所用,“片段”或“酶促活性片段”是氨基酸序列(其编码蛋白)的一部分,其保持至少一种与之相关的蛋白质的功能活性。片段可以具有与天然发生的蛋白质相同或基本上相同的氨基酸序列。“基本上相同(Substantially the same)”是指氨基酸序列大
部分,但不是完全地相同,但保留至少一种与之相关序列的功能性活性。一般而言,如果两个氨基酸序列至少约85%相同,则它们是“基本上相同”或“基本上同源”。还包括具有与自然存在的蛋白不同三维结构的片段。这种片段的例子是“原形式(pro-form)”分子,例如低活性原蛋白,其可通过切割被修饰以产生具有显著更高活性的成熟酶。
[0607] 本发明的肽和多肽,如以上所定义的,包括所有的“模拟物(mimetic)”和“肽模拟物(peptidomimetic)”形式。术语“模拟物”和“肽模拟物”是指具有与本发明的多肽实质上相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物。该模拟物或者完全由合成的非天然的氨基酸类似物组成,或者是由部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物构成的
嵌合分子。所述模拟物也可以包括任意数量的天然氨基酸保守置换,只要这样的置换本质
上不改变该模拟物的结构和/或活性。对于作为保守性变体的本发明多肽,常规实验将可
以确定一种模拟物是否在本发明的范围内,即,其结构和/或功能并没有实质上的改变。因此,一方面,如果一种模拟组合物具有木聚糖酶活性,那么它在本发明的范围内。
[0608] 本发明的多肽模拟组合物可以包含非天然结构成分的任何组合。在可供选择的方面,本发明的模拟组合物包括以下三种结构基团中的一种或全部:a)不是天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团;b)替代天然发生的氨基酸残基的非天然残基;或者c)诱导二
级结构拟态(mimicry)的残基,即,诱导或者稳定二级结构,如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象,以及类似的结构。例如,当本发明的多肽的所有残基或者一些残基通过非天
然肽键的化学方式连接时,该多肽可以表征为模拟物。各个肽模拟物残基可以通过肽键、
其它的化学键或者偶联方式连接,如,通过戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或者N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可以替
代传统的酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括,如,基亚甲基(如,-C(=O)-CH2-代
替-C(=O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、次乙基、烯烃(CH=CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或者酯(参见如,Spatola(1983)在
Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides andProteins,第7卷,267-357页,“Peptide Backbone Modifications”Marcell Dekker,NY)。
[0609] 本发明的多肽也可以由于含有全部或者一些替代了天然发生的氨基酸残基的非天然氨基酸残基而被表征为模拟物。在科学和专利文献中充分描述了非天然的残基;用作
为天然氨基酸残基的模拟物的一些示范性的非天然组合物及指导在下面有描述。芳香族氨
基酸的模拟物可以通过用以下进行替代来产生,如,D-或L-基丙氨酸;D-或L-苯基甘
氨基,D-或L-2 thieneyl丙氨酸;D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸;D-或L-3 thieneyl
丙氨酸;D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸;D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸;D-或L-(2-吡嗪
基)-丙氨酸;D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸;D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸;D-(三氟甲
基)-苯基丙氨酸;D-p-氟-苯基丙氨酸;D-或L-p-二苯基苯基丙氨酸;D-或L-p-甲氧
基-二苯基苯基丙氨酸;D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸;和,D-或L-烷基丙氨酸,其中的
烷基可以是取代的或非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异基(sec-isotyl)、异戊基或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括,如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
[0610] 酸性氨基酸的模拟物可以通过用以下的置换来产生,如,保持负电荷的非羧酸氨基酸;(膦酰基)丙氨酸;硫酸化的苏氨酸。羧基侧链基团(如,天冬氨酰基或者谷氨酰基)
也可以通过与碳二亚胺(R′-N-C-N-R′)反应进行选择性地修饰,所述碳二亚胺如1-环
己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二
亚胺。天冬氨酰基或者谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺
酰基残基。碱性氨基酸的模拟物可以通过用如,(除了赖氨酸和精氨酸外)氨基酸氨酸、
瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸,或者(胍基)烷基-乙酸置换产生,其中烷基如以上定义。腈衍
生物(如,含有取代COOH的CN-部分)可以取代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺酰基和
谷氨酰胺酰基可以脱氨基成为相应的天冬氨酰基或者谷氨酰基残基。精氨酸残基模拟物可
以通过精氨酰基与例如一种或者多种常规试剂优选在碱性的条件下反应而产生,所述的常
规试剂包括如苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环-己二酮或者茚三酮。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰基与例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反应而产生。N-乙酰基咪唑基和四硝
基甲烷可以分别用于形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物
可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相应的胺反应
而产生;得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过半胱氨酰残
基与例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸;氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、
3-硝基-2-吡啶基二硫化物;甲基2-吡啶基二硫化物;p-氯汞苯甲酸盐;2-氯汞-4硝基
苯酚,或者,氯-7-硝基苯并-氧杂-1,3-二唑反应而产生。可以通过赖氨酰基与例如琥珀
酸或者其它的羧酸酸酐反应而产生赖氨酸模拟物(和可以改变氨基末端残基)。赖氨酸和
其它的含有α-氨基的残基模拟物也可以通过与亚氨酸酯例如methyl picolinimidate、
磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基-苯磺酸、O-甲基异脲、2,4,戊二酮的反应,和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应而产生。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜
反应而产生。脯氨酸的模拟物包括,例如,2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸,或者3,3,-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰基与例如二乙基原碳酸酯或对溴苯甲酰甲基溴化物反应而产生。其它的模拟物包括,例
如,由脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用产生的模拟物;由丝氨酰或者苏氨酰残基的羟基的磷
酸化作用产生的模拟物;由赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α氨基基团的甲基化作用产生的模
拟物;由N-末端胺的乙酰化作用而产生的模拟物;由主链酰胺残基的甲基化或用N-甲基
氨基酸取代而产生的模拟物;或者,由C-末端羧基的酰胺化而产生的模拟物。
[0611] 本发明的多肽的残基例如氨基酸也可以用相反手性的氨基酸(或者肽模拟物残基)替代。因此,天然发生的L-构型(也可以被称为R或者S,取决于化学实体的结构)的
任何氨基酸都可用相同化学结构类型但是具有相反手性的氨基酸或者肽模拟物替代,相反
手性的氨基酸称为D-氨基酸,但也可以称R-或者S-型。
[0612] 本发明也提供了通过天然过程,如,翻译后加工(如,磷酸化,酰化以及类似作用)或者通过化学修饰技术来修饰本发明的多肽的方法,以及得到的被修饰的多肽。修饰可以发生在所述多肽的任何地方,包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解,相同类型的修饰可以在给定的多肽中在几个位点处以相同的或者不同的程度存在。一个给定
的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接黄素、共价连接血红素组分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化作用、二硫键形成、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用,和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中,如精氨酰化。参见,如,Creighton,T.E.,Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.,W.H.Freemanand Company,New York(1993);
Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,11-12页(1983)。
[0613] 固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc.,85:
2149-2154,1963)(也参见Stewart,J.M.和Young,J.D.,Solid PhasePeptide Synthesis,第二版,Pierce Chemical Co.,Rockford,III,11-12页),并且这些方法近来已经可以用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearch Biochemicals)。这样的
商业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:
3998(1984)的教导,它们将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端,而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时,一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中,所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附
着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤,即是,反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中,将氨基酸构建成所要的肽。此外,大量的可利用的FMOC肽合成系
TM
统是可利用的。例如,应用Applied Biosystems,Inc.的Model 431A 自动肽合成仪可以
在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得,或者通过直接的
合成或者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
[0614] 本发明包括带有或不带有信号的本发明的木聚糖酶。包括本发明的信号序列的多肽可以是本发明的木聚糖酶或另一木聚糖酶或另一酶或其它多肽。
[0615] 本发明包括固定化的木聚糖酶、抗木聚糖酶抗体及其片段。本发明提供了抑制木聚糖酶活性的方法,例如使用本发明的显性负突变体或抗木聚糖酶抗体。本发明包括含有
本发明的木聚糖酶的异源复合物,例如融合蛋白、异二聚体等等。
[0616] 本发明的多肽可以在多种条件下具有木聚糖酶活性,例如在极端pH和/或温度、氧化剂以及类似的条件下。本发明提供了产生可供选择的木聚糖酶制剂的方法,所述制剂
具有不同的催化效率和例如对温度、氧化剂和改变洗涤条件的稳定性。一方面,木聚糖酶变体可以使用定点诱变和/或随机诱变的技术来产生。一方面,定向进化可以用于产生大量
不同的具有可供选择的特异性和稳定性的木聚糖酶变体。
[0617] 本发明的蛋白也可用作研究试剂,以鉴定木聚糖酶调节剂,例如木聚糖酶活性激活剂或抑制剂。简单的说,将测试样品(化合物、培养液、提取物和类似物)加入到木聚糖
酶分析中,以确定它们抑制底物切割的能力。用该方式鉴定的抑制剂可用于工业和研究中,以减少或阻止不期望的蛋白水解。对于木聚糖酶,抑制剂可以被组合以增加活性谱。
[0618] 本发明的酶也可用作消化蛋白质的研究试剂或用在蛋白测序中。例如,可以使用木聚糖酶将多肽破碎成更小的片段,以便使用例如自动测序仪进行测序。
[0619] 本发明也提供了应用本发明的核酸、多肽和抗体来发现新木聚糖酶的方法。一方面,筛选噬菌粒文库,以便基于表达来发现木聚糖酶。另一方面,筛选λ噬菌体文库,以便基于表达来发现木聚糖酶。通过筛选噬菌体或噬菌粒文库,可以检测到毒性克隆;更方便地利用底物;减少工程改造宿主的需要,绕过由文库中大的切除带来任何偏差的可能性;以
及获得在低克隆密度下更快的生长速率。噬菌体或噬粒文库的筛选可以是在液相中或者固
相中进行。一方面,本发明提供了在液相中的筛选。与固相筛选相比,这给予了分析条件上的更大灵活性;额外底物的灵活性;对于弱的克隆的更高灵敏性;和更容易实现的自动化。
[0620] 本发明提供了使用本发明的蛋白和核酸以及机器人自动化来进行筛选的方法,机器人自动化使得在例如一天的短时间内能进行数千个生物催化反应和筛选分析,并且保证
了高水平的精确度和可重复性(参见下面关于阵列的讨论)。结果,衍生化合物的文库可以
在数周内产生。对于包括小分子在内的分子的修饰的进一步教导,参见PCT/US94/09174。
[0621] 本发明的另一方面是分离的或纯化的多肽,其包含本发明之一的序列及与其基本上相同的序列或包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段。如上所讨论,这些多肽可通过如下获得:将编码多肽的核酸插入至载体以使该编码序列可操作地连接至能够驱动编码的多肽在合适的宿主细胞中表达的序列。例如,表达载
体可包括启动子,用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包含用于扩增
表达的适合序列。
[0622] 本发明的另一方面是多肽或其片段,其具有与本发明的多肽之一及与其基本上相同的序列或包含其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或大于约95%同源性。同源性可使用上文
所述的任何程序测定,所述程序比对进行比较的多肽或片段并测定它们之间的氨基酸同一
性或相似性程度。应意识到的是,氨基酸“同源性”包括例如那些如上所述的保守氨基酸置换。
[0623] 与本发明的多肽之一或包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、或150连续的氨基酸的片段具有同源性的多肽或片段,可通过使用如上所述的技术分离编码
它们的核酸来获得。
[0624] 可选地,同源的多肽或片段可通过生物化学富集或纯化方法来获得。可能的同源多肽或片段的序列可通过木聚糖水解酶消化、凝胶电泳和/或微测序来测定。预期的同源
多肽或片段的序列可以使用如上所述的任何程序,与本发明的多肽之一或包含其至少约5、
10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150连续的氨基酸的片段比较。
[0625] 本发明的另一方面是用于鉴定本发明的片段或变体的分析,所述片段或变体保持本发明多肽的酶功能。例如,所述多肽的片段或变体可用于催化生物化学反应,其显示片段或变体保留本发明多肽的活性。
[0626] 用于测定变体的片段是否保持本发明多肽的酶活性的分析包括以下步骤:在使得多肽片段或变体发挥功能的条件下将多肽片段或变体与底物分子接触,以及检测底物水平
的降低或多肽和底物之间的反应的具体反应产物水平的增加。
[0627] 本发明的多肽或包含其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150连续氨基酸的片段可用于各种应用中。例如,多肽或其片段可用于催化生物化学反应。根据本发明的一方面,提供了利用本发明的多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于水解糖苷键的方法。在这些方法中,在促进葡糖苷键水解的条件下,将含有葡糖苷连接的底物(例如淀粉)与本
发明的多肽之一或基本与其相同的序列接触。
[0628] 本发明开发了酶的独特的催化性质。鉴于生物催化剂(即,纯化的或者粗制的酶,非存活的或者存活的细胞)在化学转化中的应用一般需要确定与特定的起始化合物反应的特定的生物催化剂,本发明应用的经选择的生物催化剂和反应条件是对于存在于很多起
始化合物如小分子中的官能团具有特异性的。每种生物催化剂对于一种官能团或者几种相
关的官能团是特异的,并且可以与含有这一官能团的许多起始化合物反应。
[0629] 生物催化反应可以从单一的起始化合物产生一个衍生物的群体。这些衍生物可以进行另一轮的生物催化反应来产生第二个衍生化合物的群体。通过生物催化的衍生作用的
每一次迭代,可以产生起始小分子或化合物的数千种变化。
[0630] 酶可以在起始化合物的特定位点发生反应而不影响分子的其它部分,该过程通过传统的化学方法很难实现。这种高度的生物催化特异性提供了用于在文库中鉴定单个活性
化合物的手段。该文库是通过用于产生该文库的一系列生物催化反应来表征的,这也称为
“生物合成历史”。对该文库的生物活性的筛选和对生物合成历史的追踪确定出产生活性化合物的特定反应顺序。重复该反应顺序,并确定合成出的化合物的结构。这种确认方式,不同于其它的合成和筛选方法,并不需要固定化技术,并且化合物可以利用实际上任何类型
的筛选分析在溶液中自由合成和测试。重要的是,注意到酶反应在官能团上的高度特异性
允许“追踪”特定的酶促反应,由所述酶促反应构成了生物催化产生的文库。
[0631] 许多程序化的步骤可使用机器人自动化来实施,这使得每天可执行数千个生物催化反应和筛选分析,并保证高水平的准确性和可重复性。结果,一方面,在几周内便产生了衍生化合物的文库,而采用现有的化学方法则需要几年的时间。
[0632] 在一个特定的方面,本发明提供了修饰小分子的方法,包括将在此所述的由多核苷酸编码的多肽或其酶活性片段与小分子接触,产生修饰的小分子。检测被修饰的小分子
的文库以确定显示出所需活性的修饰小分子是否存在于文库内。产生具有所需活性的修饰
小分子的特异性生物催化反应的鉴定可通过系统性地去除用来产生一部分文库的每个生
物催化反应,然后检测在这一部分文库中产生的小分子是否存在或不存在具有所需活性的
修饰小分子。产生具有所需活性的修饰小分子的特异生物催化反应可一方面(任选地)被
重复。生物催化反应可用一组生物催化剂来进行,它们可与在小分子的结构中发现的各种
不同结构部分反应,每个生物催化剂对一个结构部分或一组相关的结构部分是特异的;每
个生物催化剂可与含有各种不同的结构部分的许多不同的小分子反应。
[0633] 木聚糖酶信号序列、前原结构域和催化结构域
[0634] 本发明提供了木聚糖酶信号序列(例如信号肽(SPs))、前原(prepro)结构域和催化结构域(CDs)。本发明的SPs、前原结构域和/或CDs可以是分离的、合成的或重组的肽或
可以是融合蛋白的一部分,例如作为嵌合蛋白中的异源结构域。本发明提供了编码这些催
化结构域(CDs)、前原结构域和信号序列(SPs,例如具有包括本发明的多肽的氨基末端残
基或由本发明的多肽的氨基末端残基组成的序列的肽)的核酸。一方面,本发明提供了包
括肽的信号序列,该肽包括下列序列或由下列序列组成,所述序列如本发明的多肽的残基
1到12、1到13、1到14、1到15、1到16、1到17、1到18、1到19、1到20、1到21、1到22、
1到23、1到24、1到25、1到26、1到27、1到28、1到28、1到30、1到31、1到32、1到33、
1到34、1到35、1到36、1到37、1到38、1到39、1到40、1到41、1到42、1到43、1到44、1
到45、1到46、1到47、1到48、1到49、1到50所示的序列。
[0635] 本发明的木聚糖酶信号序列(SP)和/或前原序列可以是分离的肽,或与另一种木聚糖酶连接的序列或非木聚糖酶多肽,例如作为融合(嵌合)蛋白。在一个方面,本发明提
供了包含本发明木聚糖酶信号序列的多肽。在一个方面,包含本发明木聚糖酶信号序列SP
和/或前原序列的多肽包含与本发明的木聚糖酶异源的序列(例如,包含本发明的SP和/
或前原序列以及来自另一种葡聚糖酶或非葡聚糖酶蛋白的序列的融合蛋白)。在一个方面,本发明提供了具有异源SP和/或前原序列如具有酵母信号序列的序列的本发明的木聚糖
酶。本发明的木聚糖酶可以在载体例如pPIC系列载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中含有
异源SP和/或前原序列。
[0636] 在一个方面,本发明的SP和/或前原序列在鉴定新的木聚糖酶多肽之后被鉴定出来。蛋白被分选和转运至其正确的细胞位置的通路通常被称为蛋白靶向通路(protein
targeting pathways)。在所有这些靶向系统中最重要的元件之一是新合成的多肽的氨基
末端上的短氨基酸序列,称为信号序列。这种信号序列指引蛋白至其在细胞中的适合位置,并在转运过程中或在蛋白到达其最终目的地时被去除。大多数的溶酶体蛋白、膜蛋白或分
泌蛋白都具有氨基末端信号序列,这些信号序列标示着它们将转位至内质网腔内。已测定
出这组中的蛋白的100多个信号序列。信号序列的长度可以从约11至41个或约13至36个
氨基酸残基之间变化。识别信号序列的各种方法对于本领域技术人员是已知的。例如,在一个方面,新的木聚糖酶信号肽通过称为SignalP的方法来鉴定。SignalP应用了既可识别信
号肽,又可识别其裂解位点的组合神经网络。参见,例如Nielsen(1997)″Identification of prokaryotic andeukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage
sites.″Protein Engineering10:1-6。
[0637] 可以理解的是,在一些方面,本发明的木聚糖酶可以没有SP和/或前原序列,或“结构域”。一方面,本发明提供了缺少所有或部分的SP和/或前原结构域的本发明的木聚糖酶。在一个方面,本发明提供了编码来自一种木聚糖酶的信号序列(SP)和/或前原序列
的核酸序列,其可操作地连接于不同的木聚糖酶的核酸序列,或者一方面(任选地),可以
期望来自非木聚糖酶蛋白的信号序列(SP)和/或前原结构域。
[0638] 本发明也提供了分离的、合成的或重组的多肽,其包含本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)以及异源序列。所述异源序列是与SP、前原结构域和/或CD天然不相关的序列(例如与木聚糖酶)。与SP、前原结构域和/或CD天然不相关的序列
可以在SP、前原结构域和/或CD的氨基末端、羧基末端,和/或SP和/或CD的两个末端
上。在一个方面,本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽,其包含(或组成为)含有本
发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的多肽,条件是它不连接与其天
然相关的任何序列(例如木聚糖酶序列)。类似地,在一个方面,本发明提供了编码这些多
肽的分离的、合成的或重组的核酸。因此,在一个方面,本发明的分离的、合成的或重组的核酸包括本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列以及异源序
列(即,与本发明信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)天然不相关的序列)。
异源序列可在SP、前原结构域和/或CD编码序列的3’末端、5’末端和/或两个末端上。
[0639] 杂合(嵌合)木聚糖酶以及肽库
[0640] 在一方面,本发明提供杂合木聚糖酶和融合蛋白,包括肽库,其包含本发明的序列。本发明的肽库可以被用于分离靶的肽调节剂(例如,激活剂或抑制剂),所述靶诸如木
聚糖酶底物、受体、酶。本发明的肽库可以被用于鉴别靶的形式结合伴侣,如配体,例如细胞因子、激素及类似物。在一方面,本发明提供嵌合蛋白,所述嵌合蛋白包含本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)或其组合以及异源序列(见上述)。
[0641] 在一方面,本发明的融合蛋白(如肽部分)被构象稳定化(相对于线性肽),从而允许其对靶具有较高的结合亲和力。本发明提供了本发明的木聚糖酶和其它肽的融合物,
所述其它肽包括已知的和随机的肽。它们可以以这样的方式融合:木聚糖酶的结构没有被
显著地干扰,并且所述肽在代谢上或结构构象上是稳定的。这使得能够产生这样的肽文库,即该肽文库在细胞内的存在和其数量可容易被监测。
[0642] 本发明的氨基酸序列变体可以通过预先确定的变异的性质来表征,所述预先确定的变异的性质是使它们与天然存在的形式区分开的特征,例如木聚糖酶序列的等位基因的
或种间的变异。在一方面,本发明的变体显示出与天然存在的类似物相同性质的生物活性。
可选地,可以选择具有改良特性的变体。在一方面,尽管引入氨基酸变异的位点或区域是预先确定的,但该突变本身不需要被预先确定。例如,为了最优化在给定位点的突变性能,可以在靶密码子或区域进行随机诱变并且筛选表达的木聚糖酶变体,以寻求期望活性的最佳
组合。在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是熟知的,如本文描述的,例如M13引物诱变和PCR诱变。可以使用例如木聚糖水解分析方法来进行突变体的筛选。
在可选的方面,氨基酸置换可以是单个残基;插入可以是大约1到20个氨基酸的水平,尽管可以进行大得多的插入。缺失的范围可以在大约1到大约20、30、40、50、60、70个残基或更多残基。为了获得具有最佳特性的最终衍生物,置换、缺失、插入或其任何组合可以被使用。
一般地,这些改变在少数氨基酸上进行,以使分子的改变最小化。然而,在某些情况下可以容忍较大的改变。
[0643] 本发明提供了木聚糖酶,其中多肽骨架结构、二级或三级结构,如α-螺旋或β-折叠结构,已经被修饰。在一方面,电荷或疏水性已经被修饰。在一方面,侧链大小已经被修饰。通过选择较不保守的置换来产生功能或免疫特性的实质变化。例如,可以进行这
样的置换,它们将更加显著地影响:发生变化的区域的多肽骨架的结构,例如α螺旋或β
折叠结构;分子的电荷或疏水位点,其可以是活性位点;或侧链。本发明提供了在本发明的多肽中的置换,其中(a)亲水残基,例如丝氨酰或苏氨酰,被疏水残基例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰置换(或者相反);(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何别的残基置换(或者相反);(c)具有正电性侧链的残基,例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰被带负电的残
基,例如谷氨酰或天冬氨酰置换(或者相反);或者(d)具有大体积侧链的残基,例如苯丙
氨酸,被不具侧链的氨基酸例如甘氨酸置换(或者相反)。所述变体可以表现出相同性质的
生物学活性(即,木聚糖酶活性),尽管变体可被选择以根据需要改变木聚糖酶的特征。
[0644] 在一方面,本发明的木聚糖酶包括表位或纯化标记、信号序列或其它的融合序列等。在一方面,本发明的木聚糖酶可以与随机的肽融合,形成融合多肽。“融合”或者“可操作地连接”在此是指随机肽和木聚糖酶连接在一起,其连接方式对木聚糖酶结构稳定性的
破坏最小,例如,其仍保持木聚糖酶活性。所述的融合多肽(或者编码该融合多肽的融合多核苷酸)也可以包含进一步的成分,包括在多个环处的多个肽。
[0645] 在一方面,肽和编码它们的核酸被随机化,或者是被完全随机化,或者在它们的随机化中有偏向,例如,在核苷酸/残基的总的频率或者每个位置的频率方面有偏向。“随机化”是指每一核酸和肽分别由基本上随机的核苷酸和氨基酸组成。在一方面,产生肽的核酸可以化学合成,并且因此可以在任何位置整合任何核苷酸。因此,当核酸被表达而形成肽时,任何氨基酸残基可以被整合在任何位置。可以设计合成过程来产生随机化的核酸,从
而允许在核酸的长度范围内形成所有的或大多数的可能组合,由此形成随机核酸文库。该
文库可以提供结构上充分多样的随机化表达产物群体,从而影响概率上充分的细胞响应范
围,以提供一种或多种表现出期望响应的细胞。因此,本发明提供了一个足够大的相互作用文库,以使其成员中的至少一个将具有使其对一些分子、蛋白或者其他因子有亲和性的结
构。
[0646] 木聚糖酶是一方面(任选地)由信号肽、糖结合模块、木聚糖酶催化结构域、连接体和/或另一催化结构域组成的多结构域酶。
[0647] 本发明提供了产生可以编码生物学活性杂合多肽(例如,杂合木聚糖酶)的嵌合多肽的方法。在一方面,原始的多核苷酸编码生物学活性多肽。本发明的方法通过利用细
胞加工产生新的杂合多肽,所述细胞加工整合原始多核苷酸序列,使得得到的杂合多核苷
酸编码显示源自原始生物学活性多肽的活性的多肽。例如,原始的多核苷酸可以编码来自
不同微生物的特定酶。由来自一个生物体的第一多核苷酸编码的酶、或变体可以例如在特
定的环境条件下,例如高盐条件下,有效地发挥功能。由来自不同生物体的第二多核苷酸编码的酶、或变体可在不同的环境条件下,如超高温条件下有效地发挥功能。含有来自第一和第二原始多核苷酸的序列的杂合多核苷酸可以编码这样的酶,所述酶显示出由原始多核苷
酸编码的两种酶的特性。因此,由杂合多核苷酸编码的酶可在第一和第二多核苷酸编码的
每一种酶所共有的环境条件下,例如高盐和极端温度下有效地发挥功能。
[0648] 本发明多核苷酸编码的酶,包括但不限于,水解酶如木聚糖酶。在1991,糖苷水解酶首次被分成家族,参见,例如Henrissat(1991)Biochem.J.280:309-316。从那以后,分类已经不断地更新,参见,例如Henrissat(1993)Biochem.J.293:781-788;Henrissat(1996)Biochem.J.316:695-696;Henrissat(2000)PlantPhysiology 124:1515-1519。存在87种被鉴定的糖苷水解酶家族。在一个方面,本发明的木聚糖酶可以分在家族8、10、11、26和30中。在一个方面,本发明还提供编码木聚糖酶的核酸,它们的共同新颖性在于源自共同的家族,例如家族11。
[0649] 由本发明的方法得到的杂合多肽可显示出在原始酶中不具有的特异酶活性。例如,在编码水解酶活性的多核苷酸重组和/或还原性重配后,从由杂合多核苷酸编码的所
得杂合多肽中可筛选由每个原始酶获得的特异水解酶活性,即,水解酶作用的键的类型以
及水解酶发挥作用的温度。因此,例如所述水解酶可以被筛选以确定那些可区分杂合水解
酶和原始水解酶的化学官能度,如:(a)酰胺(肽键)即,木聚糖酶;(b)酯键,即酯酶和脂肪酶;(c)乙缩醛,即糖苷酶,以及确定例如杂合多肽发挥作用的温度、pH或盐浓度。
[0650] 原始多核苷酸的来源可以分离自个体生物体(“分离物”)、已经在确定的培养基中生长的生物体收集物(“富集培养物”)、或者未经培养的生物体(“环境样品”)。应用
不依赖于培养物的方法从环境样品获得编码新的生物活性的多核苷酸是最优选的,因为其
使得能够接近具有生物多样性的未被利用的来源。
[0651] “环境文库”可以从环境样品产生,其代表天然存在的生物体的基因组集合,其存储于可以在适合的原核宿主中繁殖的克隆载体中。因为被克隆的DNA起初是直接从环境样品提取的,所以所述文库并不限于可以在纯培养物中生长的小部分原核生物。另外,存在于这些样品中的环境DNA的标准化使其可以更加公正地代表来自存在于原始样品的所有物
种的DNA。这可以大大增加从所述样品的次要组成中发现令人感兴趣的基因的效率,所述次要组成与优势种相比,其所代表的可能小几个数量级。
[0652] 例如,从一个或者多个未经培养的微生物中获得的基因文库被筛选以发现感兴趣的活性。编码感兴趣的生物活性分子的潜在途径首先在原核细胞中以基因表达文库的形式
捕获。编码令人感兴趣的活性的多核苷酸从这样的文库中分离出来并导入到宿主细胞中。
该宿主细胞在促进重组和/或还原性重配的条件下生长,产生潜在的具有新的或者增强活
性的活性生物分子。
[0653] 此外,可进行亚克隆以进一步分离感兴趣的序列。在亚克隆中,DNA的一部分被扩增、消化——通常是通过限制性酶——以切割所需的序列,所需的序列被连接进接受载体中,并被扩增。在亚克隆的每个步骤中,该部分被检测感兴趣的活性,以保证编码结构蛋白的DNA不被排除。插入物可在亚克隆的任何步骤中被纯化,例如,在连接入载体之前通过凝胶电泳,或在含有接受载体的细胞和不含有接受载体的细胞被置于选择性培养基中时,所
述培养基含有例如抗生素,其可杀死不含有接受载体的细胞。将cDNA插入物亚克隆进载
体中的具体方法在本领域中是熟知的(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。在另一方面,本发明的酶是亚克隆。这种亚克隆与亲代克隆的差别在于,例如,长度、突变、标志物(tag)或标记(label)。
[0654] 应当理解的是,本发明的一些木聚糖酶可以包含或可以不包含信号序列。可以期望包括可操作地连接到不同木聚糖酶核酸序列的编码来自一种木聚糖酶的信号序列的核
酸序列,或一方面(任选地),可以期望来自非木聚糖酶的信号序列。
[0655] 可以从其制备多核苷酸的微生物包括原核微生物,如真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaebacteria)以及低等真核微生物如真菌、一些藻类和原生动物。多核苷酸可以
分离自环境样品,在这种情况下,核酸可以被回收而不需培养某一种生物体,或者是从一种或者多种培养的生物中回收。在一方面,这样的微生物可以是适于极端环境的,如,嗜高温的、嗜冷的、兼性嗜冷菌(psychrotroph)、嗜盐的、嗜压的和嗜酸的。编码从极端微生物中分离出来的酶的多核苷酸可以被应用。这样的酶可以在地表温泉和深海的热火山口中在超
过100℃的温度发挥作用,在北极的水域中在低于0℃的温度起作用,在死海的饱和的盐环
境下起作用,在沉积物和地热富硫矿泉中在pH值在0附近起作用,或者在污水污泥
在pH值超过11下起作用。例如,从极端微生物中克隆和表达的几种酯酶和脂肪酶在很宽
的温度和pH范围内表现出高活性。
[0656] 如上所述选择和分离的多核苷酸被导入进合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是能够促进重组和/或还原性重配的任何细胞。被选择的多核苷酸优选已经在包括有合适的
控制序列的载体中。宿主细胞可以是高等的真核细胞,如哺乳动物细胞,或低等真核细胞,如酵母细胞,或优选地,宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞。将构建物导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染,或电穿孔来实现(Davis等人,1986)。
[0657] 作为合适宿主的代表性例子,可能被提及的有:细菌细胞,如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);真菌细胞,如酵母;昆虫细胞如果蝇S2(Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9);动物细胞如CHO、COS或
者黑色素瘤细胞;腺病毒和植物细胞。通过本文的教导,适合宿主的选择被认为是在本领域技术人员的范围内。
[0658] 特别提及可以用于表达重组蛋白的各种哺乳动物细胞培养系统,哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系,其在“SV40-transformed simian cellssupport the replication of early SV40 mutants”(Gluzman,1981)中有说明,和其它的能够表达相容性载体的细胞系,例如,C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子和增强子,以及任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列,以及5’侧翼的非转录序列。源于SV40剪接的DNA序
列和多聚腺苷酸化的位点可以被用于提供所需的非转录的遗传学元件。
[0659] 在另一方面,预见本发明的方法可以被用于产生编码来自一个或者多个操纵子或者基因簇或者其部分的生物化学途径的新的多核苷酸。例如,细菌和许多真核生物具有用
于调控基因的协作机制,所述基因的产物参与相关的过程。基因成簇排列在单一染色体
上,在结构上称为“基因簇”,并且它们在单个调控序列的控制下一起转录,所述调控序列包括起始整个簇的转录的单个启动子。因此,基因簇是一组或者相同或者相关的相邻基因,
一般是指功能上相同或相关。通过基因簇编码的生物化学途径的一个例子是聚酮化合物
(polyketides)。
[0660] 基因簇DNA可以从不同的生物体中分离出来并且连接到载体中,尤其是含有表达调控序列的载体,所述表达控制序列可以控制和调控可检测蛋白或者来自所连接的基因簇
的蛋白相关系列活性的产生。对于外源DNA引入具有非常大的容量的载体的应用特别适合
用于这样的基因簇,在这里通过包括大肠杆菌的f-因子(或者致育因子)的例子加以描
述。该大肠杆菌的f-因子是一种质粒,在接合过程中它能实现自身的高频率转移,f-因子
对于获得和稳定扩增大的DNA片段,如来自混合的微生物样品的基因簇是理想的。本发明
的一个方面是使用被称作“F-质粒(Fosmid)”的克隆载体,或者细菌人工染色体(BAC)载
体。它们源于大肠杆菌f因子,能够稳定地整合大的基因组DNA片段。当整合来自混合的未
经过培养的环境样品的DNA时,这就有可能得到稳定的“环境DNA文库”形式的大的基因组
片段。用于本发明的另一类型的载体是黏粒载体。黏粒载体最初是设计用来克隆和扩增基
因组DNA的大片段。进入黏粒载体的克隆在Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Mannual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有详细说明。一旦连
接到适当的载体,含有不同的聚酮化合物合成酶基因簇的两个或者更多个载体可以被引入
到适合的宿主细胞中。这些基因簇所共有的具有部分序列同源性的区域将促进导致序列重
新组织为杂合基因簇的过程。然后可以对新的杂合基因簇进行筛选,以寻找在起初的基因
簇中没有发现的增强的活性。
[0661] 因此,在一方面,本发明涉及用于产生具有生物活性的杂合多肽以及筛选具有增强活性的这样的多肽的方法,通过:
[0662] 1)以可操纵的连接导入至少第一多核苷酸和以可操纵的连接导入第二多核苷酸到合适的宿主细胞中,所述的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共有具有部分序列同源性
的至少一个区域;
[0663] 2)在促进序列再组织的条件下培养宿主细胞,得到可操纵连接的杂合多核苷酸;
[0664] 3)表达由所述杂合多核苷酸编码的杂合多肽;
[0665] 4)在有利于鉴定增强的生物活性的条件下筛选所述的杂合多肽;和
[0666] 5)分离编码该杂合多肽的多核苷酸。
[0667] 筛选各种酶活性的方法对于本领域技术人员是已知的并且在整个本说明书中被讨论。当分离本发明的多肽和多核苷酸时,可以采用这些方法。
[0668] 筛选方法和“在线”监控设备
[0669] 在实践本发明的方法中,多种仪器和方法可以与本发明的多肽和核酸一起使用,例如,用来筛选多肽的木聚糖酶活性(例如,测定如在酶谱中酪蛋白的水解,荧光从明胶的释放,或者p-nitroanalide从多种小肽底物的释放),用来筛选作为木聚糖酶活性的潜在
调节剂的化合物,诸如激活剂或抑制剂,用来筛选与本发明的多肽结合的抗体、与本发明
的核酸杂交的核酸,用来筛选表达本发明的多肽的细胞,等等。除了下面详细描述的用于
筛选样品的阵列形式以外,也可使用可选形式来实施本发明的方法。这样的形式包括,例
如质谱仪、色谱仪,例如,高通量HPLC和其它形式的液相色谱,和更小的形式,如1536-孔板、384-孔板等等。高通量筛选仪器可被改装并用来实施本发明的方法,见美国专利申请
20020001809。
[0670] 毛细管阵列
[0671] 本发明的核酸或多肽可被固定或应用于阵列上。阵列可用来筛选或监测组合物(例如,小分子、抗体、核酸等)的文库,以发现它们结合本发明的核酸或多肽或者调节
TM
本发明的核酸或多肽的活性的能力。毛细管阵列,如GIGAMATRIX ,戴弗萨公司(Diversa
Corporation),San Diego,CA;和描述在例如美国专利申请20020080350Al;WO 0231203A;
WO 0244336A中的阵列,提供了容纳和筛选样品的可供选择的装置。在一方面,毛细管阵列包括多个毛细管,它们形成相互邻接的毛细管的阵列,其中每个毛细管含有至少一个壁,其限定了一个用以保留样品的腔。这个腔可以是圆柱形的、正方形的、六边形的或其它任何几何形状,只要其壁能够形成腔以保留液体或样品。毛细管阵列的毛细管可相互靠近联合在
一起形成平面结构。毛细管可通过融合(例如,当毛细管由玻璃制成时)、粘合、键合或面对面的夹合而结合在一起。此外,毛细管阵列可以包括在阵列中相邻毛细管之间放置的间质
材料(interstitial material),从而形成含有多个穿通孔(through-holes)的固体平面
装置。
[0672] 毛细管阵列可由任何数量的单个毛细管形成,例如,100至4,000,000个毛细管。进一步,具有大约100,000或更多个单个毛细管的毛细管阵列可形成标准大小和形状的
Microtiter 板,其适合于标准的实验室设备。通过利用毛细作用或使用细针的微注射,人工或自动地将腔充满。随后可以从单个毛细管中移出感兴趣的样品用于进行进一步的分析
或表征。例如,安置细的针状探头,使其与选择的毛细管流体连通,从而可以向腔内加入材料或从腔中移走材料。
[0673] 在单区筛选分析(single-pot screening assay)中,分析组分在插入到毛细管阵列中之前被混合在一起,产生目的溶液。当至少一部分阵列被浸入感兴趣的溶液中时,通过毛细作用充满腔。在每个毛细管中的化学或生物学反应和/或活性被监测,以发现可检测
事件。可检测事件常常被称为“命中事件(hit)”,其常常可以通过光学检测与产生“非命中事件(non-hit)”的毛细管区分开来。因此,毛细管阵列可大量地并行检测“命中事件”。
[0674] 在多区筛选分析(multi-pot screening assay)中,多肽或核酸,例如,配体可被导入进第一组分中,该组分被导入进毛细管阵列的至少一部分毛细管中。然后可将气泡引入进第一组分后面的毛细管中。然后将第二组分导入进毛细管内,其中所述的第二组分与
第一组分通过气泡相隔。然后可通过在毛细管阵列的两侧施加静水压挤破气泡将第一和第
二组分混合在一起。然后监测毛细管阵列中由两个组分的反应或非反应而导致的可检测事
件。
[0675] 在结合筛选分析(binding screening assay)中,目标样品可作为用可检测颗粒标记的第一液体导入进毛细管阵列的毛细管中,其中为了使可检测颗粒与腔结合,毛细管
的腔涂覆了结合材料。然后第一液体可从毛细管中移去,其中结合的可检测颗粒仍保留在
毛细管内,可以将第二液体导入进毛细管内。然后监测毛细管中由颗粒与第二液体的反应
或非反应而导致的可检测事件。
[0676] 阵列或“生物芯片”
[0677] 本发明的核酸和/或者多肽可以固定于或者应用于阵列,例如“生物芯片”。可以应用阵列来筛选或者监测组合物(例如,小分子、抗体、核酸等等)的文库,所述筛选或者监测是针对它们结合本发明的核酸或多肽或者调控本发明的核酸或多肽的活性的能力。例如,在本发明的一个方面,一个被监测的参数是木聚糖酶基因的转录体表达。细胞的一种或多种或所有的转录体可以通过包含细胞转录体、或代表细胞转录体的核酸、或与细胞转录
体互补的核酸的样品的杂交,通过与阵列或“生物芯片”上的固定化核酸的杂交来测定。通过在微型芯片上应用核酸“阵列”,细胞的一些或所有的转录体可以同时被定量。可选择地,包含基因组核酸的阵列也可以用于确定通过本发明的方法制造的新的工程菌株的基因型。
“多肽阵列”也可以用于同时定量多种蛋白。本发明可以用任何已知的“阵列”进行实践,所述“阵列”也被称为“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”,或者它们的变型。阵列一般是多个“点”或者“靶元素”,每一个靶元素包括确定数量的一种或多种生物分子,例如,固定于基材表面的确定区域、用于特异结合样品分子如mRNA转录
体的寡核苷酸。
[0678] 如本文所用,术语“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”是多个靶元素,每个靶元素包括固定在基材表面限定区域上的限定量的一种或多种多肽(包括抗体)或核酸,如下面进一步详细论述的那样。
[0679] 在实践本发明的方法中,任何已知的阵列和/或制备和应用阵列的方法都可以被全部或者部分地并入,或者引入它们的变型,例如在下列文献中描述的:
美 国 专 利 6,277,628、6,277,489、6,261,776、6,258,606、6,054,270、6,048,695、
6,045,996、6,022,963、6,013,440、5,965,452、5,959,098、5,856,174、5,830,645、
5,770,456、5,632,957、5,556,752、5,143,854、5,807,522、5,800,992、5,744,305、
5,700,637、5,556,752、5,434,049;也 参 见,例 如 WO 99/51773、WO 99/09217、WO
97/46313、WO 96/17958;也 参 见,例 如 Johnston(1998)Curr.Biol.8:R171-R174;
Schummer(1997)Biotechniques 23:1087-1092;Kern(1997)Biotechniques 23:120-124;
Solinas-Toldo(1997)Genes,Chromosomes & Cancer 20:399-407;Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.21:25-32。也参见公开的美国专利申请号20010018642、20010019827、
20010016322、20010014449、20010014448、20010012537、20010008765。
[0680] 抗体和基于抗体的筛选方法
[0681] 本发明提供了分离的、合成的或重组的抗体,其特异地结合本发明的木聚糖酶。这些抗体可以用于分离、鉴定或量化本发明的木聚糖酶或相关的多肽。这些抗体可以用于分离本发明范围内的其它多肽,或其它相关的木聚糖酶。抗体可以被设计成结合木聚糖酶的
活性位点。因此,本发明提供了使用本发明的抗体抑制木聚糖酶的方法(参见上文关于本
发明的抗木聚糖酶组合物的应用的论述)。
[0682] 本发明提供本发明的酶片段,包括本发明多肽的免疫原性片段。本发明提供包含本发明多肽或肽和佐剂或载体以及类似物的组合物。
[0683] 所述抗体可以在免疫沉淀、染色、免疫亲合柱等等中被应用。如果需要的话,编码特异抗原的核酸序列可以通过免疫产生,随后分离多肽或核酸,进行扩增或克隆,并且将多肽固定在本发明的阵列上。可选择地,本发明的方法可以用于修饰由细胞产生的待修饰的抗体的结构,如,抗体的亲和性可以被增加或降低。而且,制备或修饰抗体的能力可以是通过本发明方法改造到细胞中的表型。
[0684] 术语“抗体”包括由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因衍生(derived)、仿造(modeled after)或基本上由之编码的肽或多肽或者其片段,它们能特异地结合抗原或表位,见例如,Fundamental Immunology,第三版,W.E.Paul,ed.,RavenPress,N.Y.(1993);Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括结合抗原的部分,即,保留与抗原结合的能力的“抗原结合位点”(例如,片段、子序列、互补决定区(CDRs)),包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,包括在铰链区由二硫键连接的两个
Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和
VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:
544-546);和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也被包括在术语“抗体”中。
[0685] 免疫、产生和分离抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的方法是本领域技术人员已知的,并且在科学和专利文献中有描述,参见,如Coligan,CURRENTPROTOCOLS IN
IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY(1991);Stites(eds.)BASICAND CLINICAL IMMUNOLOGY(第
7 版 )Lange Medical Publications,Los Altos,CA(“Stites”);Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES ANDPRACTICE(第2版)Academic Press,New York,NY(1986);
Kohler(1975)Nature256:495;Harlow(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,
Cold SpringHarbor Publications,NewYork。除了使用动物的传统的体内方法外,抗
体也可以在体外产生,例如,应用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见如,
Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15:62-70;Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45。
[0686] 本发明的多肽或者含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段,也可以被用于产生与所述多肽或片段特异结合的抗体。得到的抗体可应用于免疫亲和层析方法,以分离或纯化多肽,或确定多肽是否存在于生物样品中。在这样的方法中,蛋白质制备物,如提取物,或生物样品与能够同本发明的多肽之一或含有其至少5、
10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段特异结合的抗体接触。
[0687] 在免疫亲和步骤中,抗体被连接到固态支持物,如珠子或其它柱基质。在抗体特异性结合本发明的一种多肽或其片段的条件下,蛋白质制备物被置于与抗体接触。经清洗去除非特异性结合的蛋白质之后,特异性结合的多肽被洗脱。
[0688] 在生物样品中蛋白质结合抗体的能力可以通过使用本领域技术人员所熟悉的各种方法中的任何一种来确定。例如,结合可以通过用可检测标记物,例如荧光试剂、酶标记或放射性同位素标记抗体来确定。可选择地,抗体与样品的结合可以通过应用具有这样的
可检测标记的二抗来检测。特定的分析包括ELISA分析、夹心分析、放射免疫分析以及蛋白质印迹法。
[0689] 针对本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个或更多个连续氨基酸的片段产生的多克隆抗体可通过直接将多肽注射进动物中或通过将多肽给予动物,例如非人动物而获得。这样获得的抗体然后可结合多肽本身。以这种方式,甚至仅编码多肽的片段的序列也可用来产生可与整个天然多肽结合的抗体。这种抗体然后
可用来从表达多肽的细胞中分离多肽。
[0690] 为了制备单克隆抗体,可使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein,Nature,256:495-497,1975)、三体瘤技术、
人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,Immunology Today 4:72,1983)和EBV-杂交瘤技
术(Cole等人,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。
[0691] 描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可被改动,以使之适于产生本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的单链抗体。可选择地,转基因小鼠可用来表达这些多肽或其片段的人源化抗体。
[0692] 产生的针对本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的抗体可被用于筛选来自其它生物体和样品的类似多肽。在这样
的技术中,来自生物体的多肽与抗体接触,并且检测可与抗体特异性结合的那些多肽。上
述的任何方法可用来检测抗体的结合。一种这样的筛选试验在“Methods for Measuring
Cellulase Activities”,Methods in Enzymology,Vol160,pp.87-116中描述。
[0693] 试剂盒
[0694] 本发明提供了包含组合物,如本发明的核酸、表达盒、载体、细胞、转基因种子或植物或植物部分、多肽(如木聚糖酶)和/或抗体的试剂盒。试剂盒还可以含有教导本发明的方法学以及工业、研究、医学、药学、食物及饲料和食物及饲料补充剂加工以及其它应用及加工的说明性材料,如在此所述的。
[0695] 全细胞工程改造和测定代谢参数
[0696] 本发明的方法提供了细胞的全细胞进化或全细胞工程改造,以通过修饰细胞的遗传组成开发出具有新表型,如新的或修饰的木聚糖酶活性的新细胞株。可以通过将本
发明的核酸,如本发明的酶的编码序列加入到细胞而修饰遗传组成。如参见WO0229032;
WO0196551。
[0697] 为了检测新的表型,在“实时”或者“在线”的时间范围内在细胞中监测被修饰的细胞的至少一种代谢参数。在一方面,多个细胞,如细胞培养物被“实时”或者“在线”监测。在一方面,“实时”或者“在线”监测多个代谢参数。代谢参数可以应用本发明的木聚糖酶进行监测。
[0698] 代谢流分析(MFA)是以已知的生物化学框架为基础。以质量守恒定律和关于细胞内代谢的假稳态假说(PSSH)为基础,构建线性独立代谢矩阵。在实践本发明的方法时,建
立代谢网络,包括:
[0699] ·所有途径底物、产物和中间代谢物的特性;
[0700] ·使途径代谢物互变的所有化学反应的特性,途径反应的化学计量学;
[0701] ·催化反应的所有酶的特性,酶反应动力学;
[0702] ·途径组分之间的调控性相互作用,如变构效应相互作用,酶-酶相互作用等;
[0703] ·酶或者酶的任何其它超大分子组织在细胞内的区室化,以及
[0704] ·任何浓度梯度的代谢物、酶或者效应分子的存在,或者它们运动的扩散障碍。
[0705] 一旦针对给定的细胞株建立了代谢网络,如果在线代谢数据可用,通过矩阵概念的数学显示可以被引入以评估细胞内的代谢流。代谢表型取决于细胞内整个代谢网络的
变化。代谢表型取决于途径利用相对于环境条件、遗传调控、发育状态和基因型等等的变
化。在本发明方法的一些方面,在在线MFA计算之后,通过研究途径利用来分析细胞的动力学行为、它们的表型和其它性质。例如,在酵母发酵中,如果葡萄糖供应增加,氧气减少,呼吸途径的利用将会被降低和/或者停止,而发酵途径的利用将占优势。在途径分析之后,
细胞培养物的生理状态的控制将成为可能。通过确定如何改变底物供给、温度、诱导物的
使用等来控制细胞的生理状态沿着所需的方向进行,本发明的方法可以帮助确定如何操纵
发酵。在实践本发明的方法时,MFA结果也可以与转录体组(transcriptome)和蛋白质组
(proteome)的数据比较,以设计用于代谢工程改造或基因重排等等的实验和方案。
[0706] 在实践本发明的方法时,可以产生和检测任何经修饰的或者新的表型,包括在细胞中新的或者改进的特征。可以监测代谢或生长的任何方面。
[0707] 监测mRNA转录体的表达
[0708] 在本发明的一个方面,工程化的表型包括增加或者降低mRNA转录体(如,木聚糖酶信息)的表达或者在细胞中产生新的(如,木聚糖酶)转录体。这一增加或减少的表
达可以通过测定本发明的木聚糖酶的存在,或者通过木聚糖酶活性分析来追踪。mRNA转
录体或信息也可以通过本领域已知的任何方法来检测或者定量,包括,例如Northern印
迹、定量扩增反应、杂交至阵列以及类似的方法。定量扩增反应包括如定量PCR,包括如
定量反转录聚合酶链式反应或RT-PCR;定量实时RT-PCR,或“实时动力学RT-PCR”(参见
Kreuzer(2001)Br.J.Haematol.114:313-318;Xia(2001)Transplantation 72:907-914)。
[0709] 在本发明的一个方面,工程化的表型通过敲除同源基因的表达来产生。可以敲除所述基因的编码序列或者一个或多个转录控制元件,如启动子或增强子。这样,转录体的表达可以完全去除或者仅被降低。
[0710] 在本发明的一个方面,工程化的表型包括增加同源基因的表达。这可以通过敲除负调控元件或者诱变正调控元件而实现,负调控元件包括以顺式或者反式起作用的转录调
控元件。细胞的一种或多种或所有的转录体可以通过包含细胞转录体、或代表细胞转录体
的核酸、或与细胞转录体互补的核酸的样品的杂交,通过与阵列上的固定化核酸的杂交来
测定。
[0711] 监测多肽、肽和氨基酸的表达
[0712] 在本发明的一个方面,工程化的表型包括增加或者降低多肽(如木聚糖酶)的表达或者在细胞内产生新的多肽。这一增加或者减少的表达可以通过确定存在的木聚糖酶
的量,或者通过木聚糖酶活性分析来追踪。也可以通过本领域任何已知的方法来检测并定
量多肽、肽和氨基酸,所述方法包括如核磁共振(NMR)、分光光度法、射线照像术(蛋白放
射性标记)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱,各种免疫学方法,如免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析,凝胶电泳(如,SDS-PAGE)、用抗体染色、荧光激活的细胞分选器(FACS)、热解质谱、傅立叶变换红外光谱、拉曼光谱、GC-MS和LC-电喷以及cap-LC-串
联-电喷质谱,以及类似的方法。应用这些方法或者它们的变化也可以筛选新的生物活性,在美国专利6,057,103中有描述。而且,如下面详细论述的那样,可以应用蛋白阵列测定细胞的一种或者多种或者所有的多肽。
[0713] 工业、能源、药学、医学、食品加工和其它应用
[0714] 本发明的多肽可以用于任何工业、农业、食物及饲料和食物及饲料补充剂加工、药学、医学、研究(实验室)或其它过程。本发明提供了应用本发明的酶的工业过程,例如在药物或营养(饮食)补充剂工业、能源工业(例如,制造“清洁”生物燃料)中,在食品和饲
料工业中,例如在制造食品和饲料产品和食品和饲料添加剂的方法中。在一方面,本发明提供了在医疗工业中应用本发明的酶,例如制造药物或饮食辅助剂或补充剂,或食物补充剂
和添加剂的过程。此外,本发明提供了应用本发明的酶生产生物燃料的方法,所述生物燃料包括例如生物醇,如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇,因而包含“清洁的”燃料生产。本发明的酶可以连续地、分批地或通过补料分批的方法(fed-batch method)添加到工
业过程。在另一个方面中,本发明的酶可以在工业过程中回收,从而降低酶需求。
[0715] 例如,木聚糖酶可以用于化学浆料的生物漂白和处理中,例如,如美国专利5,202,249中所述;或用于木材或纸浆的生物漂白和处理,例如,如美国专利5,179,021、
5,116,746、5,407,827、5,405,769、5,395,765、5,369,024、5,457,045、5,434,071、
5,498,534、5,591,304、5,645,686、5,725,732、5,759,840、5,834,301、5,871,730 和
6,057,438中所述;或用于降低木材中木质素和对木材改性,例如,如美国专利5,486,468
和/或5,770,012中所述;或用作面粉、面团和面包改良剂,例如,如美国专利5,108,765
和/或5,306,633中所述;或用作饲料添加剂和/或补充剂,例如,如美国专利5,432,074;
5,429,828;5,612,055;5,720,971;5,981,233;5,948,667;6,099,844;6,132,727和/或
6,132,716中所述;或用于制造纤维素溶液,例如,如美国专利5,760,211中所述;或用于洗涤剂组合物;或用于水果、蔬菜和/或泥浆和粘土化合物,例如,如美国专利5,786,316中所述。本发明的木聚糖酶还可以用于水解半纤维素,例如,如美国专利4,725,544中所述。
[0716] 本发明的木聚糖酶可以是高度选择性催化剂。它们能够以灵敏的立体选择性、区域选择性和化学选择性催化反应,这些是传统合成化学无法比拟的。而且,酶是非常多用
的。本发明的木聚糖酶可以被修改以适合在有机溶剂中发挥作用,在极端pH(例如,高pH
和低pH)、极端温度(例如,高温和低温)、极端盐度水平(例如高盐度和低盐度)中作业,
并且催化与结构上和其天然的、生理学底物无关的化合物的反应。
[0717] 木材、纸和浆料处理
[0718] 本发明的木聚糖酶可以用于任何木材、木制品、废木材或木材副产品、纸、纸制品、纸浆或木浆、牛皮纸浆、或木材或纸回收处理或工业过程,例如任何木材、木浆、废纸、纸或浆料处理或木材或纸脱墨过程。在一个方面,本发明的木聚糖酶可用来处理/预处理纸浆或回收纸或纸浆等等。在一个方面,本发明的酶通过在处理/预处理纸浆、回收的纸或纸浆等中应用而用来增加纸的“亮度”。纸的等级越高,亮度就越大;纸亮度可以影响光学扫描设备的扫描能力;因此,本发明的酶和过程可以用来制造高级的、“亮”纸,例如用于光学扫描设备,包括喷墨、激光和照片打印质量纸。
[0719] 例如,通过应用本领域中已知的木聚糖酶,本发明的酶可以用于任何工业过程中,例如处理废纸,如例如USPN 6,767,728或6,426,200中所述;风干(seasoning)木
材,例如在食品工业中的应用,如例如USPN 6,623,953中所述;由造纸级(paper-grade)
硬木浆生产木糖,如例如USPN 6,512,110中所述;用水介质中的木聚糖酶处理含纤维
的木质纤维素原料,如例如USPN 6,287,708中所述;溶解纤维素纤维的浆料,如例如
USPN 6,254,722中所述;对打印纸脱墨和脱色或除去木浆颜色,如例如USPN 6,241,849、
5,834,301或5,582,681中所述;应用木聚糖酶漂白化学纸浆或木质纤维素浆料,如例
如USPN 5,645,686或5,618,386中所述;用于处理木浆,所述木浆包括未完全洗涤的粗
浆(brownstock),如例如USPN 5,591,304中所述;对废木质纤维素材料进行纯化和脱木
质素,如例如USPN 5,503,709中所述;由回收的纤维素纤维制造纸或纸板,如例如USPN
5,110,412中所述;对原木进行脱皮,如例如USPN 5,103,883中所述;生产具有改进的撕碎性质的绒毛浆,如例如USPN 5,068,009中所述,等等。本发明的木聚糖酶可以用于加工或
处理任何纤维素材料,例如来自木材、棉花、大麻、亚麻或亚麻布的纤维。
[0720] 在一个方面,本发明提供应用本发明木聚糖酶进行的木材、木浆、纸、纸浆、废纸或木材或纸回收处理过程。在一个方面,本发明的木聚糖酶可应用于减少对化学脱色(漂白)剂如二氧化氯的需要和高碱及高温环境中。在制浆过程的蒸煮阶段中,大部分木质素被溶
解。在漂白过程中,剩余的木质素从浆料中除去。在一方面,浆料的木聚糖酶漂白(例如使用本发明的酶)基于木聚糖的部分水解,木聚糖是半纤维素的主要成分。酶促作用(例如
本发明酶的酶促作用)释放半纤维素结合的木质素并且在随后的漂白过程——其例如应用
氯和氧化学品——中提高木质素自浆料中的提取率。在一个方面,本发明的木聚糖酶可以
用来在固定水平的漂白化学品下增加浆料的最终亮度。在另一个方面中,本发明的木聚糖
酶可以用来增加浆料的卡伯值。
[0721] 本发明提供应用本发明的木聚糖酶对木材、木浆、纸、纸浆、废纸或木材或纸回收处理的过程(方法),其中处理时间(木聚糖酶与浆料、纸、木材等接触的时间量)和/或滞留时间可以是约1分钟至12小时或约5分钟至1小时或约15至30分钟之间的任意时
间;或处理和/或滞留时间可以是多至约0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12或更多小时的任意时间。
[0722] 在一方面,本发明的木聚糖酶是热稳定的碱性内切木聚糖酶,其在一方面能够实现超过25%的牛皮纸浆对二氧化氯需求的减少,同时纸浆产量损失低于0.5%。在一方面,边界参数是pH 10、65-85℃,并且在酶荷载量小于0.001wt%下,处理时间为60分钟以下;
在可选择的方面,处理和/或滞留时间少于约0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11或12。
[0723] 可以在例如pH 10和60℃,就水解染料标记的木聚糖的能力,对木聚糖酶库进行测试。然后,在这些条件下经测试为阳性的酶可以在例如pH 10和70℃被评价。可选地,酶可以在70℃,在pH 8和pH 10被测试。在发现浆料和纸工业中期望的木聚糖酶时,来自高
温或高碱性环境的文库被作为目标。具体地,筛选这些库以寻找在碱性pH和大约45℃的温
度起作用的酶。在另一方面,本发明的木聚糖酶可用于浆料和纸工业中,以降解木质素半纤维素键,从而释放木质素。
[0724] 本发明的酶可以用来对印刷废纸如报纸脱墨,或用来对非接触印刷废纸,例如静电印刷和激光印刷纸,以及接触和非接触印刷废纸的混合物脱墨,如USPN6,767,728或
6,426,200;Neo(1986)J.Wood Chem.Tech.6(2):147中所述。本发明的酶可以用在由造
纸级硬木浆生产木糖的过程中,所述生产如下进行:将包含在浆料中的木聚糖萃取到液相
中,使包含在所得液相中的木聚糖经历足以将木聚糖水解成木糖的条件,以及回收所述木
糖,其中萃取步骤包括至少一种处理:用木聚糖酶处理浆料或碱溶性材料的水性悬浮液,
如例如USPN 6,512,110中所述。本发明的酶可以用在溶解来自纤维素纤维如回收的纸制
品的浆料的过程中,所述回收的纸制品由硬木材纤维、硬木材纤维和软木材纤维的混合物、废纸,例如由未印刷的封套、脱墨的封套、未印刷的账薄纸、脱墨的账薄纸等制成,如例如USPN6,254,722中所述。
[0725] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶还可用在任何木材、木制品、纸、纸制品、纸浆或木浆、牛皮纸浆或木材或纸回收处理或工业过程,例如任何木材、木浆、废纸、纸或浆料处理或木材或纸脱墨过程中,作为抗菌剂或微生物驱避剂。可选择地,本发明的木聚糖酶可以是木材、木制品、纸、纸制品、纸浆或木浆、牛皮纸浆或回收的纸组合物和/或包含一种或更多种木材、木制品、纸、纸制品、纸浆或木浆、牛皮纸浆或回收的纸组合物的组合物的一部分,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂或微生物驱避剂的作用。
[0726] 处理纤维和纺织品
[0727] 本发明提供应用本发明的一种或更多种木聚糖酶处理纤维和织物的方法。木聚糖酶可以用在任何纤维处理或织物处理方法中,这在本领域中是公知的,参见例如美国专利
6,261,828;6,077,316;6,024,766;6,021,536;6,017,751;5,980,581;美国专利公开号
20020142438A1。例如,本发明的木聚糖酶可以用于纤维和/或织物脱浆中。在一个方面,织物的触感和外观采用包括使该织物与本发明的木聚糖酶在溶液中接触的方法而得到改善。
在一个方面,在压力下用溶液处理织物。例如,本发明的木聚糖酶可以用于除去污渍。
[0728] 本发明的木聚糖酶可以被用于处理任何纤维素物质,包括纤维(例如来自棉花、大麻、亚麻或亚麻布的纤维)、缝制和未缝制的织物,例如,由棉、棉掺和物或天然的或人造的纤维素(例如源自包含木聚糖的纤维素纤维,如源自木浆)或其掺和物制成的针织品、纺
织品、斜纹粗棉布、纱线以及毛巾料。掺和物的实例是棉花或人造丝/粘胶丝与一种或多种辅助材料(companion material)诸如羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(例如,人造丝/粘胶丝、苎麻、大麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱塞尔纤维(lyocell))的掺和物。
[0729] 本发明的纺织品处理方法(应用本发明的木聚糖酶)可以与其它纺织品处理例如煮练和漂白联合使用。煮练是从棉纤维,例如,角质层(主要由蜡组成)和初生细胞壁(主
要由果胶、蛋白质和木葡聚糖组成)中除去非-纤维素物质。适当的去除蜡对于获得高润
湿性是必要的。这是染色需要的。通过本发明的方法去除初生细胞壁改善了蜡去除并且确
保更均匀的染色。用本发明的方法处理纺织品能够在漂白过程中提高白度。在煮练中使用
的主要化学品是在高温下和高浓度下使用氢氧化钠。漂白包括使纺织品氧化。漂白典型地
涉及使用作为氧化剂的过氧化氢,从而或者获得充分漂白的(白色的)织物或者确保染料
的干净色调
[0730] 本发明还提供碱性木聚糖酶(例如,在碱性条件下有活性的木聚糖酶)。这些酶在纺织品加工、植物纤维(例如,植物韧皮部纤维)脱胶、果胶废水、造纸以及咖啡和茶
发酵的处理中具有广泛的应用。参见,例如,Hoondal(2002)AppliedMicrobiology and
Biotechnology 59:409-418。
[0731] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶也可以用在任何纤维和/或织物处理过程中,作为抗菌剂或微生物驱避剂。可选择地,本发明的木聚糖酶可以是纤维和/或织物组合物中的一部分,其中本发明的木聚糖酶在纤维和/或织物中起抗菌剂或微生物驱避剂的
作用。
[0732] 洗涤剂、消毒剂和清洁组合物
[0733] 本发明提供包含本发明一种或更多种多肽(例如木聚糖酶)的洗涤剂、消毒剂或清洁剂(cleanser/cleaning/cleansing)组合物以及制备和应用这些组合物的方法。本
发明中并入了制备和应用洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物的所有方法,参见例如美国专利
6,413,928;6,399,561;6,365,561;6,380,147。洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物可以是一部分和两部分水性组合物、非水液体组合物、注塑固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片剂、凝胶和/糊剂和浆液形式。本发明的木聚糖酶也可以被用作固体或液体形式的洗涤剂、消毒
剂或清洁剂添加剂产品。这种添加剂产品意图补充或促进传统洗涤剂组合物的性能,并且
可以在清洁过程的任何阶段被加入。
[0734] 假定洗涤剂溶液具有期望的酶活性,那么实际的活性酶含量取决于洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物的制造方法并且该含量不是关键的。在一方面,在最终溶液中存在的木
聚糖酶的量在每克所述洗涤剂组合物大约0.001毫克至0.5毫克的范围内。选择用于本发
明的方法和产品中的具体的酶取决于最终应用的条件,包括产物的物理形式、使用pH、使用温度、以及待降解或改变的污物类型。酶可以被选择以提供用于任何给定的一组应用条件
的最佳活性和稳定性。在一方面,本发明的木聚糖酶在大约4至大约12的pH范围内以及
在大约20℃至大约95℃的温度范围内是有活性的。本发明的洗涤剂可以包括阳离子、半极
性非离子或两性离子表面活性剂;或它们的混合物。
[0735] 本发明的木聚糖酶可以被配制成粉末状的和液体洗涤剂、消毒剂或清洁剂,其在按重量计大约0.01至大约5%(优选0.1%至0.5%)的水平具有4.0至12.0之间的pH。
这些洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物也可以包括其它的酶,如木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、或内切糖苷酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳糖酶、果胶酸裂合酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。这些涤剂、消毒剂或清洁剂组合物也可以包括染料、着色剂香味剂、漂白剂、缓冲剂、助洗剂、酶“促进剂”(参见例如美国专利申请20030096394)和稳定剂。
[0736] 将本发明的木聚糖酶添加到传统的清洁组合物中不产生任何特定的应用限制。也就是说,只要酶在预期应用的pH和/或温度有活性或能忍受预期应用的pH和/或温度,适
合洗涤剂的任何温度和pH也适合本发明的组合物。此外,本发明的木聚糖酶可以用于无洗
涤剂的清洁组合物中,同样或单独或与助洗剂和稳定剂组合应用。
[0737] 本发明提供了清洁组合物,包括用于清洁硬表面的洗涤剂组合物、用于清洁织物的洗涤剂组合物、洗碟组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物以及隐形眼镜清洗液。
[0738] 在一方面,本发明提供了洗涤物体的方法,所述方法包括在足以洗涤的条件下,将本发明的多肽与物体接触。本发明的木聚糖酶可以被包括作为洗涤剂、消毒剂或清洁剂添加剂。本发明的洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物可以,例如,被配制为包含本发明多肽的手洗或机械洗衣洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物。适合预处理玷污的织物的洗衣添加剂可以
包括本发明的多肽。织物柔软剂组合物可以包括本发明的木聚糖酶。可选地,本发明的木聚糖酶可以被配制为用于普通家用硬表面清洁操作的洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物。在可
选的方面,本发明的洗涤剂、消毒剂或清洁剂添加剂和洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物可以包括一种或多种其它的酶,如木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、角质酶、酯酶、另一种木聚糖酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶,如乳糖酶、和/或过氧化物酶(也参见上述)。本发明的酶的性质被选择以与所选的洗涤剂相容(即,
pH最适宜,与其它的酶和非酶成分相容,等等),并且所述酶(一种或多种)以有效量存在。
在一方面,本发明的木聚糖酶被用于从织物除去有恶臭的物质。可以被用于实践本发明的
各种洗涤剂组合物和制备它们的方法在如美国专利第6,333,301;6,329,333;6,326,341;
6,297,038;6,309,871;6,204,232;6,197,070;5,856,164中被描述。
[0739] 当被配制为适合用于洗衣机洗涤方法的组合物时,本发明的木聚糖酶可以包括表面活性剂和助洗剂化合物。它们可以另外包括一种或多种洗涤剂成分,例如,有机聚合化合物、漂白剂、额外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、污物悬浮剂和抗再沉淀剂以及缓蚀剂。
本发明的洗衣组合物也可以包括软化剂,如额外的洗涤剂成分。当被配制为洗衣洗涤剂组
合物时,包含糖酶的这种组合物可以提供织物清洁、污物去除、白度保持、软化、色表、染料转移抑制和清洁卫生。
[0740] 本发明的洗衣用洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物的密度可以在组合物的大约200至1500克/升,或大约400至1200克/升,或大约500至950克/升,或大约600至800
克/升的范围;这可以在大约20℃测量。
[0741] 在一个方面,本发明的洗衣用洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物的“紧密”形式最好由密度,以及对组合物而言由无机填充剂盐的量来反映。无机填充剂盐是粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中,该填充剂盐以相当大的量,典型地以按总的组合物的重量计17%至35%的量存在。在紧密组合物的一个方面,填充剂盐以按组合物
的重量计不超过总组合物的15%,或不超过10%,或不超过5%的量存在。无机填充剂盐可以选自碱和碱土金属的硫酸盐和氯化物,例如,硫酸钠。
[0742] 本发明的液体洗涤剂组合物也可以是“浓缩形式”。在一方面,与传统的液体洗涤剂、消毒剂或清洁剂相比,该液体洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物可以含有少量的水。在可选的方面,浓缩的液体洗涤剂的水含量按该洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物的重量计少于40%,或少于30%,或少于20%。本发明的洗涤剂、消毒剂或清洁剂化合物可以包括如WO
97/01629所述的制剂。
[0743] 本发明的木聚糖酶可以在制备各种洗涤剂、清洁、消毒剂或清洁剂组合物中有用。一些已知的化合物是适合的表面活性剂,包括非离子、阴离子、阳离子或两性离子洗涤剂,其可以被应用,例如,如在美国专利第4,404,128;4,261,868;5,204,015中所述。此外,木聚糖酶可以被用于,例如肥皂或液体肥皂应用,盘碟护理制剂、隐形眼镜清洁液或产品、肽水解、废物处理、纺织品应用、在蛋白质生产中的融合-切割酶和类似物中。与另一种洗涤剂木聚糖酶相比,木聚糖酶可以在洗涤剂组合物中提供增强的性能,也就是,所述酶组可以增加某些酶敏感污物如草或血液的清洁,如在标准洗涤循环之后通过通常的评价所确定。
木聚糖酶可以被配制为已知的粉末的和液体洗涤剂,所述粉末的和液体洗涤剂在按重量计
大约0.01至大约5%(例如大约0.1%至0.5%)的水平具有6.5至12.0之间的pH。这些
洗涤剂清洁组合物也可以包括其它的酶,如已知的木聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、脂肪酶或内切糖苷酶、氧化还原酶如过氧化氢酶和漆酶以及助洗剂、稳定剂、香料和颜料。
[0744] 在一方面,本发明提供了具有木聚糖酶(本发明的木聚糖酶)活性的洗涤剂、消毒剂或清洁剂组合物,用于水果、蔬菜和/或泥和粘土化合物(参见,例如,美国专利
5,786,316)。
[0745] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶还可以用于任何洗涤剂、消毒剂或清洁剂(清洁溶液)制造过程,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生物驱避剂。可选择地,本
发明的木聚糖酶可以用于任何清洁或洗涤过程中,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生
物驱避剂。在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶被包括在任何洗涤剂或清洁剂组合物
中,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂或微生物驱避剂的作用。
[0746] 处理食品和食品加工
[0747] 本发明的木聚糖酶在食品加工工业中具有大量的应用。例如,在一方面,本发明的木聚糖酶被用于改进从富油植物原料例如富油种子中提取油,例如,从大豆中提取豆油,从橄榄中提取橄榄油,从油菜籽提取油菜籽油和/或从葵花籽中提取葵花油。
[0748] 本发明的木聚糖酶可以被用于分离植物细胞材料中的成分。例如,本发明的木聚糖酶可被用于将富含木聚糖的材料(例如,植物细胞)分离为成分。在一方面,本发明的木
聚糖酶可以被用于将富含木聚糖或富含油的农作物分离成有价值的蛋白质和油以及外壳
部分。分离过程可以通过采用本领域已知的方法进行。
[0749] 本发明的木聚糖酶可以被用于制备水果或蔬菜汁、糖浆、提取物和类似物,以增加产率。本发明的木聚糖酶可以被用于各种植物细胞壁来源的材料或废料,例如来自谷物、谷类、葡萄酒或果汁生产的废料,或农业残余物如蔬菜皮、豆荚、甜菜浆、橄榄浆、马铃薯浆和类似物的酶促处理(例如,含木聚糖的植物材料的水解)。本发明的木聚糖酶可以被用于改变处理的水果或蔬菜的稠度和外观。本发明的木聚糖酶可以被用于处理植物材料,从而促
进包括食品的植物材料的加工,促进植物成分的纯化或提取。本发明的木聚糖酶可以被用
于提高饲用价值、降低水结合能力,提高在废水工厂中的降解性和/或改善植物原料向青
贮饲料的转化,等等。
[0750] 在一方面,本发明的木聚糖酶被用于烘焙应用,例如饼干和薄脆饼干,以水解木聚糖如阿拉伯木聚糖。在一方面,本发明的木聚糖酶用于产生非粘性的面团,所述非粘性
面团容易用于机械加工并易于减小饼干的大小。本发明木聚糖酶可用于水解阿拉伯木
聚糖酶,以防止烘焙产品的快速再水化,导致松脆性降低和货架期减少。在一方面,本发
明的木聚糖酶作为添加剂用在面团加工中。在一方面,本发明的木聚糖酶被用于面团调
理(conditioning),其中在一方面,木聚糖酶在大约25-35℃的温度范围内并且在中性
pH(7.0-7.5)附近具有高活性。在一方面,面团调理酶可以在极端的烘焙温度(>500℉)
失活。本发明的酶可以结合任何面团加工方案来应用,例如如美国专利申请20050281916
中那样。
[0751] 在一方面,本发明的木聚糖酶作为添加剂用在面团加工中,以在面团pH和温度条件下发挥最佳的作用。在一方面,本发明的酶被用于面团调理。在一方面,本发明的木聚糖酶在25-35℃的温度范围内并且在中性pH(7.0-7.5)附近具有高活性。在一个方面,酶在极
端的烘焙温度例如,>500℉下失活。
[0752] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶还可以用于任何食品或饮料处理或者食品或饮料加工过程,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生物驱避剂。在本发明的另一方
面,本发明的木聚糖酶可以被包含在任何食品或饮料组合物中,其中本发明的木聚糖酶在
组合物中起抗菌剂或微生物驱避剂的作用。
[0753] 动物饲料和食品或饲料或食品添加剂(补充剂)
[0754] 本发明提供了应用本发明的木聚糖酶,处理动物饲料和食品以及食品或饲料添加剂(补充剂)的方法,动物包括哺乳动物(例如,人)、鸟类、鱼类等等。本发明提供了包含
本发明木聚糖酶的动物饲料、食品以及添加剂(补充剂)。一方面,应用本发明的木聚糖酶
处理动物饲料、食品和添加剂,可以有助于动物饲料或添加剂(补充剂)中营养物的利用,
例如淀粉、蛋白质等。通过分解难以消化的蛋白质或者直接地或间接地暴露淀粉(或其它
营养物),所述木聚糖酶使得营养物对其它内源或外源的酶更可及。所述木聚糖酶还可以简单地引起容易消化和易于吸收的营养物和糖的释放。
[0755] 当被加入到动物饲料时,本发明的木聚糖酶改进了植物细胞壁材料在体内的分解,部分原因在于肠内粘度的降低(参见,例如,Bedford等,Proceedings ofthe1st
Symposium on Enzymes in Animal Nutrition,1993,pp.73-77),从而实现动物对植物营养物的更好利用。因此,通过在饲料中应用本发明的木聚糖酶,动物的生长速率和/或饲料转化率(即,消化的饲料重量相对于体重增加量)被提高。
[0756] 本发明的动物饲料添加剂可以是颗粒化的酶产品,其可容易地与饲料成分混合。可选地,本发明的饲料添加剂可以形成预混合物的成分。本发明颗粒化的酶产品可被包覆
或未包覆。酶颗粒的颗粒大小可以与饲料和预混合成分的颗粒大小一致。这提供了将酶掺
入到饲料中的安全且方便的手段。可选地,本发明的动物饲料添加剂可以是稳定的液体组
合物。这可以是基于水或油的浆液。参见例如美国专利6,245,546。
[0757] 在动物饲料或食品的改变中,本发明的木聚糖酶可以在体外(通过改变饲料或食品的成分)或者在体内处理食品或饲料。木聚糖酶可以被加入到含有大量木聚糖的动物饲
料或食品组合物,例如,包含来自谷物、谷类和类似物的植物原料的饲料或食品中。当被加入到饲料或食品中时,木聚糖酶显著提高含木聚糖材料,例如植物细胞壁的体内分解,从而实现动物(例如,人)对植物营养物更好地利用。在一方面,提高了动物的生长速率和/或
饲料转化率(即,所消化的饲料重量相对于体重增加量)。例如,含部分或不可消化的木聚
糖的蛋白质完全或部分地被本发明的木聚糖酶,例如结合另外一种酶,例如β-半乳糖酶
所降解,成为肽和半乳糖和/或半乳糖寡聚体。这些酶消化产物更易于被动物消化。因此,本发明的木聚糖酶可以有助于饲料或食物能量的利用。同样,通过促进含木聚糖蛋白质的
降解,本发明的木聚糖酶可以提高糖类和非糖类饲料或食品组分如蛋白质、脂肪和矿物质
的可消化性和摄取。
[0758] 在另一方面,本发明的木聚糖酶可以通过在转基因饲料作物(如,例如,转基因植物、种子和类似物),如谷类、谷物、玉米、大豆、油菜籽、羽扇豆和类似物中直接表达所述酶来供应。如上所论述,本发明提供了包含编码本发明多肽的核酸序列的转基因植物、植物部分和植物细胞。在一方面,所述核酸被表达,以使本发明的木聚糖酶以可回收的量产生。木聚糖酶可以从任何植物或植物部分回收。可选地,包含重组多肽的植物或植物部分可以被这样使用,用于提高食物或饲料的质量,例如,提高营养价值、适口性和流变特性,或者用来破坏抗营养因子
[0759] 在一方面,本发明提供了应用本发明的木聚糖酶在动物食用之前从饲料中除去寡糖的方法。在该过程中,形成了可代谢能量价值增加的饲料。除了本发明的木聚糖酶之外,可以使用半乳糖苷酶、纤维素酶以及它们的组合。在一方面,可以以等于按饲料原料的重量计大约0.1%到1%的量加入所述酶。在一方面,饲料是谷物、小麦、谷类、大豆(例如大豆粉)原料。参见,例如,美国专利6,399,123。
[0760] 在另一方面,本发明提供了利用木聚糖酶作为动物饮食中的营养补充剂的方法,所述方法通过如下进行:制备包含重组木聚糖酶——其包含本发明序列的至少30个连续
氨基酸——的营养补充剂,并且将所述营养补充剂施用给动物,来增加包含在被动物摄取
的食品中的木聚糖的利用。
[0761] 仍在另一方面,本发明提供可食用的丸状酶输送基质,以及用于将木聚糖酶例如作为营养补充剂输送到动物的方法。酶输送基质容易在水介质,如,例如动物的消化液中释放木聚糖酶,如具有本发明氨基酸序列或其至少30个连续氨基酸的酶。本发明的酶输送基
质由粒状可食用载体制备,所述载体选自这些成分:如耗尽油的谷类胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、豆壳、葵花籽粉、玉米粉、大豆粉、次粉和类似物,其容易将包含在其中的重组酶分散到水介质中。在使用中,可食用的粒状酶输送基质被施用给动物以将木聚糖酶输送给动
物。合适的基于谷类的基质可以包括或源自任何合适的可食用谷类,如小麦、玉米、大豆、高粱、紫花苜蓿、大麦等。示例性的基于谷类的基质是基于玉米的基质。基质可以源自任何合适的谷类部分,但是优选是被批准用于动物饲料用途的谷类胚芽,如在湿磨或干磨过程中
得到的玉米胚芽。谷类胚芽优选包括废胚芽(spent germ),所述废胚芽是油已经排出的谷
类胚芽,油如通过挤压或己烷或其它溶剂萃取而排出。可选地,谷类胚芽通过螺旋式压榨器提取,也即是,油已经通过挤压而除去。
[0762] 本发明的酶输送基质是分离的多个微粒、小丸或颗粒形式。“颗粒”的含义是被压缩或压紧的微粒,如通过制丸、挤压或类似的压制从基质中去除水分。微粒的这种压缩或压紧也促进微粒的微粒内粘结力。例如,可通过在制丸机中将基于谷类的基质进行制丸来制备颗粒。由此制备的小丸被研磨粉碎成适合用作动物饲料辅料的颗粒大小。因为所述基
质本身被批准用于动物饲料,所以其可以用作动物饲料中的输送酶的稀释剂。
[0763] 酶输送基质可以是颗粒的形式,所述颗粒的颗粒大小范围为大约4到大约400目(USS);更优选大约8到大约80目;以及最优选大约14到大约20目。如果谷类胚芽通过溶
剂萃取被耗尽,可能有必要在造粒机中使用润滑剂如玉米油,但是,如果所述胚芽被螺旋式压榨器提取,这种润滑剂通常是不必要的。在本发明的其它方面,通过其它的压紧或压缩方法如,例如,通过挤压基于谷类的基材模和将挤压物磨碎至合适的颗粒大小来制备基质。
[0764] 酶输送基质可以进一步包括多糖成分,作为粘结剂,以增强基质颗粒的粘结性。粘结剂被认为提供了额外的羟基,其增强了基质颗粒内谷类蛋白质之间的键合。进一步认为,所述额外的羟基通过增强蛋白质与淀粉以及与其它蛋白质的氢键合起作用。粘结剂可以以适合增强酶输送基质颗粒的粘结性的任何量存在。合适的粘结剂包括糊精、麦芽糊精、淀粉如玉米淀粉、面粉、纤维素、半纤维素和类似物质的一种或多种。例如,基质(不包括酶)中的谷类胚芽和粘结剂的百分比按重量计为78%的玉米胚芽和20%的玉米淀粉。
[0765] 因为本发明的酶-释放基质是用生物可降解的原料制成的并且含有水分,所以所述基质可能受到损坏,如被霉菌损坏。为了防止或抑制这种霉菌,基质可以包含霉菌抑制
剂,如丙酸盐,其可以以足以抑制酶-释放基质中的霉菌的任何量存在,因而提供了在不需要冷藏的稳定制剂中的输送基质。
[0766] 包含在本发明酶输送基质和方法中的木聚糖酶优选是如本文所述的热稳定木聚糖酶,从而在升高的温度和/或蒸汽可以用来制备丸化的酶输送基质的生产期间抵抗木聚
糖酶的失活。在摄取包含本发明的酶输送基质的饲料期间,含水消化液将引起活性酶的释
放。其它类型的热稳定酶和热稳定的营养补充剂也可以被掺入到输送基质中,从而在任何
类型的含水条件下释放。
[0767] 出于许多不同的目的,可以对本发明的酶基质颗粒施加涂层,如为了向动物饲料中添加调味剂或营养补充剂,为了在胃内条件下延缓动物饲料补充剂和酶的释放,以及类
似的目的。或者,可施加涂层来实现功能性的目的,例如在需要延缓酶从基质微粒的释放或控制酶将被释放的条件时。涂层材料的组分可以是这样的,其可选择性地被其敏感的试剂
(如热、酸或碱、酶或其它化学物质)分解。可选择地是,对不同的这样的分解剂敏感的两种或更多种涂层可被连续地施加于基质颗粒。
[0768] 本发明也涉及制备酶释放基质的方法。根据本发明,该方法包括提供基于谷类的基材的多个分散颗粒,其颗粒大小适合用作酶释放基质,其中所述颗粒包括由本发明的氨
基酸序列或其至少30个连续氨基酸编码的木聚糖酶。优选地,该方法包括将酶释放基质的
颗粒压制或压缩成小粒,其可以通过造粒方法来完成。霉菌抑制剂和粘结剂,当被使用时,可在任何合适的时间被加入,并且可以以所需的比例与基于谷类的基材在将基于谷类的基
材造粒之前混合。造粒机进料中的含水量可以在上面关于最终产物含水量所述的范围中,
并且可以是大约14-15%。一方面,水分以酶的含水制剂的形式加入至原料中,使该原料达到此含水量。在造粒机中的温度可以用蒸汽达到大约82℃。造粒机可在任何条件下进行操
作,使得对原料进行足够的操作以提供丸粒。对于从含酶组合物中去除水分来说,造粒方法本身是一个成本上有效的方法。
[0769] 在一方面,造粒机在100磅/分钟的压力下,在82℃用1/8英寸×2英寸的模进行操作,以提供丸粒,然后其在造粒机的粉碎部件中被粉碎以提供多个分散颗粒,所述分散颗粒具有能够通过8目筛但是保留在20目筛上的颗粒大小。
[0770] 本发明热稳定的木聚糖酶可以用于本发明的丸粒。它们可以具有高的最适温度和高的耐热性,以使酶反应可以在迄今未进行的温度下完成。编码根据本发明的木聚糖酶的
基因(例如,如在本发明任何序列中示出的)可以被用于制备具有与本发明木聚糖酶的那
些性质不同的性质(在最适pH、最适温度、耐热性、溶剂稳定性、比活性、对底物的亲和力、分泌能力、翻译速率、转录控制等方面)的木聚糖酶(例如,应用如本文所述的GSSSM)。此
外,本发明的多核苷酸可以被用于筛选通过此处描述的方法制备的变体木聚糖酶,从而确
定具有期望的活性,如提高的或改变的热稳定性或耐热性的那些变体。例如,美国专利第
5,830,732号描述了用于确定木聚糖酶的耐热性的筛选试验。
[0771] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶也可以用于任何动物饲料、动物食品或饲料添加剂生产过程中,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生物驱避剂。在本发明的另
一方面,本发明的木聚糖酶可以包含在任何动物饲料、动物食品或饲料添加剂组合物中,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂或微生物驱避剂的作用。
[0772] 废物处理
[0773] 本发明的木聚糖酶可以用于各种其它工业应用,例如,用于废物处理。例如,在一方面,本发明提供了应用本发明木聚糖酶的固体废物消化方法。该方法可以包括减少基本上未处理的固体废物的质量和体积。固体废物可在酶溶液(包括本发明的木聚糖酶)存在
的情况下在控制的温度下用酶促消化方法进行处理。这导致没有因添加微生物引起的明显
细菌发酵的反应。固体废物被转变为液化的废物和任何残余的固体废物。得到的液化废物
可与所述的任何残余的固化废物分离。参见,例如美国专利5,709,796。
[0774] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶也可以用于任何废物处理过程中,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生物驱避剂。在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶可
以被包含在任何废物处理组合物中,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂或微生物
驱避剂的作用。
[0775] 口腔护理产品
[0776] 本发明提供了包含本发明木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的口腔护理产品。示例性的口腔护理产品包括牙膏、牙用乳膏(dentalcream)、凝胶或牙粉、洁齿剂(odontics)、漱口水、刷牙之前或之后的漱口制剂、口香糖、含片或糖果。参见,例如,美国专利6,264,925。
[0777] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——也可以用于任何口腔护理制造过程中,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生
物驱避剂。在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾
酒”——可以包含在任何口腔护理组合物中,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂
或微生物驱避剂的作用。
[0778] 酿酒和发酵
[0779] 本发明提供了包含本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的酿造(例如发酵)啤酒方法。在一个示例性的方法中,含淀粉的原料被分解并
加工以形成麦芽。本发明的木聚糖酶可以在发酵过程中的任意点使用。例如,本发明的木
聚糖酶可以用于大麦麦芽的加工中。啤酒酿造的主要原料是大麦麦芽。这可以是一个三
阶段过程。首先,大麦谷物被浸渍以增加水含量,例如增加到大约40%左右。第二,所述谷物可以在15-25℃温育3到6天而发芽,此时酶合成在赤霉素的控制下被刺激。一方面,本
发明的木聚糖酶在该过程的这个(或任意其它)阶段被加入。本发明的木聚糖酶可以用
在任何啤酒或酒精饮料生产过程中,如,例如美国专利5,762,991;5,536,650;5,405,624;
5,021,246;4,788,066中所述。
[0780] 在一个方面,本发明的酶用于改善过滤性和麦汁粘性以及用于获得胚乳组分更完全的水解。本发明酶的应用也会增加提取收率。酿酒的过程涉及:大麦谷物的发芽(麦粒
发芽),然后是储存的糖类的提取和分解,以得到被酵母用于酒精发酵的单糖。存在于大麦胚乳和酿酒辅料中的糖类储藏物的有效分解需要几种不同酶的活性。
[0781] 在一个方面,本发明的酶在例如40℃至70℃温度范围内略酸的pH(例如5.5-6.0)下具有活性;以及,在一个方面,在95℃下失活。这些条件下的活性是最佳的,但对功效而言不是必需的要求。在一个方面,本发明的酶在40-75℃和pH 5.5-6.0下具有活性;在70℃下稳定至少50分钟,以及在一个方面,在96-100℃下失活。本发明的酶可以与其它酶,例如β-1,4-内切葡聚糖酶和淀粉酶一起使用。
[0782] 在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——也可以用于任何酿酒和发酵过程中,其中所述木聚糖酶被用作抗菌剂或微生物驱
避剂。在本发明的另一方面,本发明的木聚糖酶可以包含在任何酿酒和发酵组合物中,其中本发明的木聚糖酶在组合物中起抗菌剂或微生物驱避剂的作用。
[0783] 生物质转化和生物燃料生产
[0784] 本发明提供应用本发明的酶,包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”在内,将生物质转化成生物燃料,如生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇和/或生物丁醇以及类似物的方法和过程。因此,本发明提供燃料,例如生物燃料,如生物乙醇,其包含本发明的多肽——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”在内,或本发明核酸编码的多肽。在可选的方面,所述燃料源自植物材料,其任选地包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗,以及任选地所述燃料包括生物乙醇或汽油-乙醇的混合。
[0785] 本发明提供制造燃料的方法,其包括使包含木聚糖、半纤维素、纤维素或可发酵糖的组合物与本发明的多肽,或本发明核酸编码的多肽,或本发明制造的混合物或“鸡尾酒”或产品中任意一种接触。在可选的实施方式中,包含木聚糖、半纤维素、纤维素或可发酵糖的组合物包括植物、植物产品或植物衍生物,以及植物或植物产品可以包括蔗糖植物或植物产品、甜菜(beets/sugarbeets)、小麦、玉米、大豆、马铃薯、大米或大麦。在可选的实施方式中,所述多肽具有活性,该活性包括催化内部β-1,4-木糖苷键或内β-1,4-葡聚糖键的水解;和/或将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。在一个方面,所述燃料包括生物乙醇或汽油-乙醇的混合物,或生物丙醇或汽油-丙醇的混合物,或生物丁醇或汽油-丁醇的混
合物,或生物甲醇或汽油-甲醇的混合物,或其任意组合。
[0786] 本发明提供制造生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇和/或生物丙醇的方法,其包括使包含木聚糖、半纤维素、纤维素或可发酵糖的组合物与本发明的多肽,或本发明核酸编码的多肽,或本发明制造的混合物或“鸡尾酒”或产品中任意一种接触。在可选的实施方式中,包含纤维素或可发酵糖的组合物包括植物、植物产品或植物衍生物,以及植物或植物产品可以包括蔗糖植物或植物产品、甜菜(beets/sugarbeets)、小麦、玉米、大豆、马铃薯、大米或大麦,以及所述多肽可以具有活性,该活性包括纤维素酶、葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0787] 本发明提供酶整体(enzyme ensembles)或“鸡尾酒”,用于将纤维素和半纤维素聚合物、木聚糖以及多糖解聚成可代谢的碳部分,所述酶整体或“鸡尾酒”包含本发明的多肽,或本发明核酸编码的多肽。在可选的实施方式中,所述多肽具有活性,该活性包括催化内部β-1,4-木糖苷键或内β-1,4-葡聚糖键的水解;和/或将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖。本发明的酶整体或“鸡尾酒”可以是组合物的形式(例如制剂,液体或固体),例如作为制造的产品。本发明进一步提供酶、酶整体或“鸡尾酒”,用于将纤维素和半纤维素聚合物、木聚糖以及多糖解聚成诸如糖的更简单部分,其然后通过微生物发酵产生诸如琥珀酸、乳酸或乙酸的产品。
[0788] 本发明提供组合物(包括制造的产品、酶整体或“鸡尾酒”),其包含水解半纤维素和纤维素的酶的混合物(或“鸡尾酒”),其中水解木聚糖的酶包括本发明每种木聚糖酶中至少一种和纤维素酶、葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡聚糖苷酶中至少一种、几种
或全部。在可选的实施方式中,本发明的水解木聚糖和/或水解半纤维素的混合物包含本
发明每种木聚糖酶中至少一种和β-木聚糖苷酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶中至少一种或两
种。
[0789] 本发明提供组合物(包括制造的产品、酶整体或“鸡尾酒”),其包含水解木聚糖、半纤维素和/或纤维素的酶的混合物(或“鸡尾酒”),所述酶混合物包括本发明纤维素酶、葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶以及木聚糖酶中的至少一种、几种或全部。
[0790] 本发明提供组合物(包括制造的产品、酶整体或“鸡尾酒”),其包含水解木聚糖、半纤维素和/或纤维素的酶的混合物(或“鸡尾酒”),所述酶混合物包括纤维素酶;葡聚糖酶;纤维二糖水解酶;阿拉伯呋喃糖苷酶;木聚糖酶;β-葡糖苷酶;β-木糖苷酶;以及本发明的至少一种酶中的至少一种、几种或全部。
[0791] 本发明提供组合物(包括制造的产品、酶整体或“鸡尾酒”),其包含酶的混合物(或“鸡尾酒”),除本发明的至少一种酶之外所述酶混合物还包括:(1)葡聚糖酶,其切割内部β-1,4键,形成更短的葡糖寡糖,(2)纤维二糖水解酶,其以“外切(exo)”方式起作用,向前释放纤维二糖单元(β-1,4葡萄糖-葡萄糖二糖),和/或(3)β-葡糖苷酶,用于从短
的纤维寡糖(例如纤维二糖)释放葡萄糖单体。
[0792] 生物质转换和清洁生物燃料的生产
[0793] 本发明提供了应用本发明酶的组合物和过程,其包括本发明的酶的混合物或“鸡尾酒”,以用于将生物质或任何有机材料,例如任何包含木聚糖的材料或木质纤维素材料
(例如,包含木聚糖、纤维素、半纤维素和/或木质素的任何组合物)转换为除了饲料、食品、食品或饲料补充剂(添加剂)、药物和化学品以外的燃料,如生物燃料(例如,生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇和/或生物丙醇),包括生物柴油。因此,本发明的组合物和方法提供了使用石油产品的有效且可持续的替代品或添加物,例如,作为生物燃料(如生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇和/或生物丙醇)与汽油和/或柴油燃料的混合物。
[0794] 本发明提供了表达本发明的酶的细胞和/或生物(例如,其中所述细胞或生物包含作为异源核酸的本发明的序列),用于参与涉及天然生物质(例如,植物)转化的化学循
环。在一方面,用于转化的酶和方法被用在酶整体(或“鸡尾酒”)中,以有效地将包含木聚糖的组合物、或木聚糖、纤维素和半纤维素聚合物解聚成可代谢的碳部分。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法,使这些重要的新“生物质转化”和替代性能源工业过程可行。
[0795] 本发明提供了方法、本发明的酶和酶的混合物或“鸡尾酒”,用于处理材料,例如包括纤维寡糖、阿拉伯木聚糖寡聚体、木质素、木质素纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素和/或可发酵糖的生物质材料,这包括使组合物与本发明的多肽,或由本发明的核酸编码的多肽接触,其中任选地,所述材料源自农作物(例如小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木),是食品或饲料生产的副产物,是木质素纤维素废品、或是植物残渣或废纸或废纸产品,并且任选地所述植物残余物包括茎、叶、壳、皮、玉米或玉米穗、玉米秸秆、玉米纤维、干草、稻草(例如,水稻杆或小麦杆)、甘蔗渣、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮、木材、木屑(wood thinning)、木片、木浆、废浆、木材废物、木材刨花和锯屑、建筑和/或爆破废物和残片(例如木材、木材刨花和锯屑),并且任选地,所述纸废品包括废弃或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料以及再生纸材料。此外,城市废物,例如城市固体废物的纸质部分、城市木材废物和城市绿色废物以及包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料可以被应用。任选地,材料例如生物质材料的处理产生生物醇类,例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。
[0796] 可选地,本发明的多肽可以在生物质植物材料或原料本身中表达。
[0797] 本发明的方法也包括获得转化的生物质(例如,木质素纤维素)材料(由本发明的酶处理)并且通过发酵和/或通过化学合成使其成为燃料(例如,生物燃料,如生物乙
醇、生物丁醇、生物甲醇、生物丙醇或生物柴油)。在一方面,所产生的糖类进行发酵和/或不可发酵的产物被气化
[0798] 本发明的方法也包括应用本发明的酶转化藻类、初级植物油(virginvegetableoil)、废植物油、动物脂肪和软脂(例如,牛脂、猪油和黄色软脂)或污水,并且通过发酵和/或通过化学合成或转化使其成为燃料(例如生物醇类,例如生物乙醇、生物甲
醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。
[0799] 本发明的酶(包括例如生物体,如微生物,例如真菌、酵母或细菌,以及植物和植物细胞及植物部分,例如种子,其产生并且在一些方面分泌本发明的重组酶)可以被用于或被包括/并入在任何有机物质/生物质转化过程的任何阶段,例如,在任何一个步骤、几
个步骤,或者被包括在所有的步骤中,或所有下列生物质转化过程的方法中,或所有这些生物燃料替代品中:
[0800] 直接燃烧:材料通过直接加热燃烧并且是最简单的生物质技术;如果生物质来源在附近,可能是非常经济的。
[0801] 1热解:是在没有氧存在的情况下通过加热对生物质进行热降解。在一方面,生物质被加热至大约800到1400华氏度之间的温度,但是没有氧被引入以支持燃烧,导致气体、燃料油和炭的产生。
[0802] 2气化:生物质可以被用于通过加热或厌氧消化产生甲烷。合成气,一氧化碳和氢的混合物,可以源自生物质。
[0803] 掩埋气:通过填埋物中掩埋的垃圾腐败(厌氧消化)产生。有机废物在分解时,产生气体,所述气体由大约50%的甲烷组成,甲烷是天然气的主要成分。
[0804] 厌氧消化:将有机物质转化为甲烷和二氧化碳的混合物,甲烷是天然气的主要成分。在一方面,生物质如废水(污水)、肥料或食品加工废物与水混合且在没有空气的情况
下进料到消化罐中。
[0805] 发酵
[0806] 醇类发酵:燃料醇通过将纤维素物质和/或淀粉转化为糖,将糖发酵成醇类,然后通过蒸馏分离醇水混合物来产生。原料可以被转化为糖并且然后通过用酵母发酵转化为醇,所述原料如专用作物(例如,小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木)、农业残余物和废物(例如,水稻杆、玉米秸秆、小麦杆、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废物(例如,硬木和软木屑、来自木材加工的硬木和软木残余物、木材刨花和锯屑)、城市废物(例如,城市固体废物的纸质部分、城市木材废物以及城市绿色废物)、木材废物(例如,锯木厂废物、纸浆厂废物、建筑废物、爆破废物、木材刨花和锯屑)、和废纸或包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料。可选地,包含糖的材料可以通过发酵被直接转化为醇类。
[0807] 酯交换作用:将油转化为生物柴油的示例性反应称为酯交换作用。酯交换过程使醇(如甲醇)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应,形成脂肪酸烷
基酯(生物柴油)和甘油。该反应需要热和强碱催化剂,如氢氧化钠或氢氧化
[0808] 生物柴油:生物柴油是由植物油、动物脂肪或再循环油脂制造的脂肪酸烷基酯的混合物。生物柴油可以以纯的形式用作交通工具的燃料,但是其通常被用作石油柴油添加
剂,以降低来自柴油动力交通工具的微粒、一氧化碳、碳氢化合物和空气有毒物质的水平。
[0809] 水解:包括应用本发明的酶催化的化合物的水解,所述化合物例如生物质,如木质素纤维素材料。
[0810] 热点联产(Cogeneration):是采用单一的燃料和设备,同时生产一种以上形式的能量。在一方面,生物质热点联产比单独的生物质生产具有更具潜力的增长,因为热点联产产生热和电。
[0811] 在一方面,本发明的多肽具有足够的酶活性,例如木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性,用于从有机原料产生生物柴油或燃料(例如,生物醇,例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)或在该过程中可以与其它酶一起使用,所述有机原料例如生物质,如源自植物和动物的组分,包括任何农业作物或其它可更新的原料,农业残余物或动物废物、城市和工业废物的有机成分、或建筑或爆破废物或残片、或微生物如藻类或酵母。
[0812] 在一方面,本发明的多肽被用在将有机原料,例如生物质,如木质素纤维素生物质转化为生物燃料,如生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇、生物丙醇的过程中,或者另外被用在水解或消化生物材料的过程中,这样它们可以被用作生物燃料(包括生物柴油或生物乙醇、生物丁醇、生物甲醇或生物丙醇),或用于使生物质更容易被加工成燃料。在可选的方面,本发明的多肽被用在酯交换方法的过程中,所述酯交换方法使醇类(如甲醇、丁醇、丙醇、乙醇、)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应,形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。在一方面,生物柴油由大豆油或再循环的厨房用油制成。动物脂肪、
其它的植物油和其它的再循环油也可以被用于生产生物柴油,这取决于它们的成本和可用
性。在另一方面,各种脂肪和油的掺和物被用于生产本发明的生物柴油燃料。
[0813] 本发明的酶也可以被用在甘油精炼中。甘油副产品含有未反应的催化剂和用酸中和的肥皂。水和醇被除去以产生50%到80%的粗甘油。残留的污染物包括未反应的脂肪
和油,其可以使用本发明的多肽处理。在本发明大型生物柴油工厂中,甘油可以被进一步纯化到例如99%或更高的纯度,用于制药和化妆品工业。
[0814] 应用本发明的多肽——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——制造的燃料(包括生物醇类,如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)可以与燃料含氧化物一起使用以改善燃烧特性。加入氧可导致更完全的燃烧,其减少了一氧化碳的排放。这是用生物燃料(例如本发明的燃料)代替石油燃料的另一个环境益处。应用本发明的组合
物和/或方法制造的生物燃料可以与汽油掺和,形成E10掺和物(大约5%到10%的乙醇和
大约90%到95%的汽油),但是其可以以更高的浓度使用如E85,或以其纯的形式使用。应
用本发明的组合物和/或方法制造的生物燃料可以与石油柴油掺和,形成E20掺和物(20%
的生物柴油和80%的石油柴油),尽管可以使用高达B100(纯的生物柴油)的其它掺和水
平。
[0815] 在一个方面,本发明的多肽被用在将有机原料,例如生物质,如木质素纤维素生物质转化为甲醇、丁醇、丙醇和/或乙醇的过程中。本发明还提供从包含有机原料,例如生物质,如木质素纤维素生物质的组合物制造乙醇(“生物乙醇”)、甲醇、丁醇和/或丙醇的过程。有机原料,例如生物质,如木质素纤维素生物质原料可以从农作物获得,如食品或饲料生产的副产物,或如生物质废产物,诸如植物残余物和废纸或建筑和/或爆破废物或残
片。用本发明的多肽处理的合适的植物残余物的例子包括谷类、种子、茎、叶、壳、皮、玉米穗、玉米秸秆、稻草、草(例如,印度草如蓝刚草(Sorghastrum nutans);或柳枝稷(switch grass),例如黍(Panicum)的种,如柳枝稷(Panicum virgatum))和类似物,以及木材、木
片、木浆和锯屑。适合用本发明的多肽处理的废纸的例子包括废弃的复印纸、计算机打印
纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸等等,以及报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料。建筑和爆破废物和残片的例子包括木材、木材碎屑、木材刨花和锯屑。
[0816] 在一个方面,本发明的酶和方法可以与从生物质制备甲醇、丁醇、丙醇和/或乙醇的更“传统的”方法一起使用,例如,这样的方法,其包括通过使干燥的生物质材料在反应器中与由强酸和金属盐的稀释溶液组成的催化剂接触而水解生物质(例如,木质素纤维素材料);这可以降低纤维素水解的活化能或温度,以获得更高的糖产率;参见,例如,美国专利
6,660,506和6,423,145。
[0817] 使用本发明的酶的另一种示例性方法包括:通过在一定的温度和压力下在含水介质中使材料经受第一阶段的水解步骤而水解含有木聚糖、半纤维素、纤维素和/或木质素
的生物质(例如,木质素纤维素材料),所述温度和压力被选择来实现半纤维素的初步解聚
而不将纤维素大部分解聚成葡萄糖。该步骤产生一种浆,其中含水液相含有由半纤维素解
聚得到的溶解的单糖,而固相含有纤维素和木质素。第二阶段水解步骤可以包括使得至少
大部分纤维素解聚的条件,该步骤产生含有溶解的/可溶的纤维素解聚产物的含水液相。
参见例如美国专利5,536,325。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
[0818] 使用本发明的酶的另一种示例性方法包括:通过一个或多个用大约0.4%至2%的强酸进行稀酸水解的阶段来处理生物质材料;以及通过碱性去木质作用来处理酸水解的
生物质材料的未反应的固体木质素纤维素成分,以产生可生物降解的热塑性塑料和衍生物
的前体。参见例如美国专利6,409,841。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
[0819] 使用本发明的酶的另一种示例性方法包括:在预水解反应器中预水解生物质(例如,木质素纤维素材料);向固体木质素纤维素材料加入酸性液体,制备混合物;将该混合物加热至反应温度;维持反应温度足够的时间,以将木质素纤维素材料分馏成含有至少大
约20%的来自木质素纤维素材料的木质素的溶解部分以及含有纤维素的固体部分;当处
于或接近固体部分中的纤维素变得更易于进行酶促消化的反应温度时,从固体部分除去溶
解部分;以及回收溶解部分。参见例如美国专利5,705,369。本发明的酶可以在该示例性
方法的任何阶段加入。
[0820] 本发明提供了制备基于液体烃的发动机燃料组合物(例如,用于火花点火发动机)的方法,所述液体烃掺混有利用本发明的酶或方法制备的燃料级醇。在一方面,利用本发明的酶制造的燃料包括例如液体煤气-醇掺合物或液体天然气-醇掺合物。在一方面,
共溶剂是生物质衍生的2-甲基四氢呋喃(MTHF)。参见,例如美国专利6,712,866。
[0821] 在一方面,用于生物质(例如,木质素纤维素材料)的酶促降解的本发明的方法,例如用于从生物质或任意有机原料生产生物燃料例如乙醇的方法,还可以包括使用生物质
材料的超声处理;参见,例如美国专利6,333,181。
[0822] 在另一方面,用于从生物质(例如,纤维素)基质生产生物燃料例如乙醇(生物乙醇)的本发明的方法包括:提供以包含生物质(例如,纤维素)基质、本发明的酶和发
酵剂(例如,在反应容器内,如半连续固体给料的生物反应器)的浆形式的反应混合物,
并且该反应混合物在足以引发和维持发酵反应的条件下进行反应(如在美国专利申请第
20060014260号中所述)。在一方面,实验或理论计算可以确定最佳的给料频率。在一方面,额外数量的生物质(例如,纤维素)基质和酶以根据所述最佳给料频率的间隔(一次或多
次)被提供到反应容器中。
[0823] 用于制造本发明的生物燃料和生物柴油的一个示例性方法被描述在美国专利申请第20050069998;20020164730中;并且在一方面,包括如下的阶段:磨碎生物质(木质素纤维素材料)(例如磨碎到15-30毫米的大小);使获得的产物在反应器中受到水蒸气爆炸
预处理(例如,在190-230℃的温度)1到10分钟;在旋风分离器中收集预处理的材料或相
关制造产物;并且通过在压滤机中过滤分离液体和固体部分,将所述固体部分引入到发酵
沉积物中并且加入一种或几种本发明的酶,以及在一方面也加入另一种酶,例如纤维素酶
和/或β-葡糖苷酶(例如,溶解在pH4.8的柠檬酸盐缓冲液中)。
[0824] 应用本发明的酶制备包括甲醇、丁醇、丙醇和/或乙醇在内的本发明的生物燃料和生物柴油的另一个示例性方法包括:预处理包含生物质(例如,木质素纤维素)原料的起
始材料,所述生物质原料至少含有木聚糖、半纤维素和/或纤维素。在一方面,起始材料包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或成分或废物或食品或饲料生产副产物。起始材料(“原料”)在破坏植物纤维结构以实现生物质(例如,半纤
维素和/或纤维素)至少部分水解的条件下发生反应。破坏性条件可以包括,例如使起始
材料在pH 0.5至2.5经受180℃至270℃的平均温度大约5秒至60分钟的时间;或在pH
0.5至2.5经受220℃至270℃的温度5秒至120秒的时间,或等同条件。这产生了以增加
的可及性被酶例如本发明的纤维素酶消化的原料。美国专利6,090,595。
[0825] 利用本发明的酶水解生物质(例如,木质素纤维素材料)的示例性条件包括在大约30℃至48℃之间的温度下和/或大约4.0至6.0之间的pH下反应。其它示例性条件包
括在大约30℃至60℃之间的温度下和/或大约4.0至8.0之间的pH。
[0826] 生物燃料和生物方法生产的醇
[0827] 本发明提供了包括液体和气体(例如,合成气)和生物方法生产的醇在内的生物燃料和合成燃料,以及应用本发明的组合物(例如,酶和核酸,和转基因植物、动物、种子以及微生物)和方法制造它们的方法。本发明提供了包含本发明的酶、核酸、转基因植物、动物(例如,微生物,如细菌或酵母)和/或种子的生物燃料和生物生产的醇。在一方面,这
些生物燃料和生物方法生产的醇从生物质产生。
[0828] 本发明提供了生物方法生产的醇,如通过本发明的方法生产的乙醇、甲醇、丙醇和丁醇,其包括本发明的微生物和酶通过发酵(水解)作用产生醇类燃料。
[0829] 作为液体或气体汽油的生物燃料
[0830] 本发明提供了气体、或汽油,如合成气形式的生物燃料和合成燃料。在一方面,本发明的方法包括使用本发明的酶用于天然生物质转化的化学循环——例如,用于生物质的水解——以制造生物燃料,例如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇或生物甲醇,或合成燃料,其形式为液体或作为气体,如合成气。
[0831] 例如,本发明提供了制造生物燃料气体和合成气体燃料(“合成气”)的方法,所述生物燃料气体和合成气体燃料包括采用本发明的多肽或应用本发明的方法制造的生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇和/或生物甲醇;在一方面,本发明的这种生物燃料气体与天然气体(也可以从生物质生产)一起混合,例如基于氢或烃的气体燃料。
[0832] 在一方面,本发明提供了将生物质加工成合成燃料,如合成气的方法,合成气如通过气化从生物质生产的合成气。在一方面,本发明提供了从甘蔗,例如甘蔗渣制造乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇气体的方法。在一方面,这种燃料或气体被用作发动机燃料,例如汽车发动机、卡车发动机、飞机发动机、船发动机、小发动机等的燃料。在一方面,本发明提供了从植物,例如玉米,或植物产物如干草或秸秆(例如,水稻秸秆或小麦秸秆,或任何谷类植物的任何干秆)或农业废物制造乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇的方法。可以从植物,例如玉米,或植物产物,例如干草或秸秆,或农业废物制造纤维素乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇(例如,如通过Iogen Corporation,Ontario,Canada加工)。
[0833] 在一方面,应用本发明的方法和组合物制造的乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇可以用作燃料(例如,汽油)添加剂(例如充氧剂)或直接用作燃料。例如,通过本发明的方法制造的乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇——包括燃料——可以与乙基叔丁基醚(ETBE),或ETBE混合物如含有47%乙醇作为生物燃料的ETBE,或与MTBE(甲基叔丁基醚)一起混合。在另一
方面,通过本发明的方法制造的乙醇、丙醇、丁醇和/或甲醇——包括燃料——可以与下列物质混合:
[0834]IUPAC名 通用名
丁-1-烯 α-丁烯
顺-丁-2-烯 顺-β-丁烯
反-丁-2-烯 反-β-丁烯
2-甲基丙烯 异丁烯
[0835] 可以应用”A.B.E”(丙酮、丁醇、乙醇)发酵,进一步加工通过本发明的方法(例如,使用本发明的酶)制造的丁醇和/或乙醇;在一方面,丁醇是唯一的液体产物。在一方
面,这种丁醇和/或乙醇在现有的汽油发动机(没有对发动机或汽车进行改进)中“直接”
燃烧,产生比乙醇更多的能量和较少腐蚀性及较小的水可溶性,而且能够通过现有的结构
分配。
[0836] 本发明也提供了其中一种、几种或所有的醇通过包含至少一种本发明方法(例如,使用本发明的酶)的过程来制备的混合醇,例如包含乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇和庚TM
醇的混合物,如ECALENE (Power Energy Fuels,Inc.,Lakewood,CO),例如:
[0837]
[0838] 在一方面,一种、几种或所有的醇通过使用本发明的酶的本发明的过程来制备,并且所述过程可以进一步包括生物质-到-液体的技术,例如,汽化过程来生产合成气,随后进行催化合成,或进行生物质到混合醇燃料的生物转化。
[0839] 本发明也提供了这样的过程,所述过程包括使用本发明的酶结合(或被结合到)“天然气到液体”或GTL、或“煤到液体”或CTL、或“生物质到液体”或BTL、或“油砂到液体”或OTL的过程;并且在一方面,本发明的这些过程被用于制造合成燃料。在一方面,本发明的这些过程之一包括:应用例如所谓的“Fischer Tropsch”过程(一种催化的化学反应,其中一氧化碳和氢被转化为各种形式的液体烃;使用的典型催化剂基于铁和钴;本过程的
主要目的是生产作为合成润滑油或作为合成燃料使用的合成石油替代品),从生物质中生
产生物燃料(例如,合成燃料)。在一方面,本发明的这种合成生物燃料可以包含氧,并且可以作为高质量柴油和汽油的添加剂使用。
[0840] 在可选的方面,本发明的过程使用各种预处理,其可以被分为三类:物理的、化学的和复合的(物理的+化学的)。任何化学品都可以被用作预处理剂,例如酸、碱、气体、纤维素溶剂、醇、氧化剂和还原剂。在这些化学品中,碱是最普遍的预处理剂,因为它相对便宜并且产生较少的纤维素降解。普通的碱氢氧化钠和石灰也可以用作预处理剂。虽然氢氧化钠显著增加了生物质的可消化性,但是其难以再循环,相对昂贵,并且处理起来有危险。相反地,石灰具有许多优点:其是安全的并且非常便宜,能够通过用二氧化碳对洗涤水进行碳酸盐化处理而回收。
[0841] 在一方面,本发明提供了多酶系统(包括本发明的至少一种酶),所述多酶系统能够水解生物质例如甘蔗如甘蔗渣中的多糖,糖厂加工的甘蔗成分。在一方面,通过本发明的酶处理所述生物质,所述本发明的酶由生物(例如,转基因动物、植物、转化的微生物)和/或表达本发明的酶的副产品(例如,收获的植物、果实、种子)制得。在一方面,所述酶是由待加工成燃料的植物或生物质制备的重组酶,例如本发明提供了包含本发明的酶的转基因
甘蔗渣。在一方面,这些组合物和产物在本发明的方法中使用,所述方法包括用于天然生物质转化,例如,用于生物质水解来制备生物燃料,如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物甲醇、以液体或气体形式的合成燃料如“合成气”的化学循环。
[0842] 在一方面,本发明提供了由厌氧微生物厌氧消化有机材料过程产生的生物燃料,例如生物气,其中所述过程包括使用本发明的酶或本发明的方法。这种生物燃料,例如生物气,可以从生物可降解废物材料产生,或者通过应用被喂给厌氧蒸煮器以补充气体产量的
能源作物来产生。固体产品——消化物——也可以被用作生物燃料。
[0843] 在一方面,本发明提供了生物燃料,例如,包含甲烷的生物气,其中所述过程包括使用本发明的酶或本发明的方法。这种生物燃料,例如生物气,可以在工业厌氧蒸煮器和机械生物处理系统中回收。可以应用本发明的酶或本发明的方法,进一步处理(垃圾)掩埋气;在处理之前,掩埋气可以是在填埋场中通过天然发生的厌氧消化产生的较不清洁形式
的生物气。矛盾地是,如果垃圾掩埋气被允许排放到大气中,那么其将是潜在的温室气体。
[0844] 本发明提供了从各种废物制造生物方法产生的油和气体的方法,其中所述过程包括使用本发明的酶或本发明的方法。在一方面,这些方法包括热解聚废物,从而提取甲烷和其它类似于石油的油;或者包括,例如,生物反应器系统,所述生物反应器系统利用无毒的光合藻类吸纳烟囱废气和生产生物燃料,如生物柴油、生物气和相当于煤的干燃料,例如,如由GreenFuel Technologies Corporation,Cambridge,MA所设计的。
[0845] 本发明提供了制造生物方法产生的油——包括原油——和可以用于柴油发动机的气体的方法,其中所述方法包括使用本发明的酶和本发明的方法。在一方面,这些方法可以将石油,例如原油精炼成煤油、石油、柴油和其它馏分。
[0846] 本发明提供了从下列物质制造生物产生的油的方法(使用本发明的酶或本发明的方法):
[0847] ·直链植物油(Straight vegetable oil)(SVO)
[0848] ·废弃植物油(WVO)——在数量上主要由商业厨房产生的废弃烹饪油和油脂。
[0849] ·生物柴油,从动物脂肪和植物油的酯交换获得,在石油柴油发动机中直接可用。
[0850] ·生物衍生的原油,和通过包括非油基材料在内的复合有机材料例如,废物如旧轮胎、废料、木材和塑料的热解聚作用制备的生物气和碳固体。
[0851] ·高温分解油,其可以在闪速热解过程(flash pyrolysis process)中只采用加热从生物质、木材废物等生产(所述油在用于传统的燃料系统或内部燃烧发动机中之前必须
被处理)。
[0852] ·木材、木炭和干粪。
[0853] 医学和研究应用
[0854] 由于溶菌性质,本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——可被用作抗菌剂。本发明的木聚糖酶可以被用于消除沙门氏菌或保护动物免受沙门氏菌伤
害,如例如PCT申请WO0049890和WO9903497中所述。在本发明的另一方面,本发明的木聚
糖酶还可以用作抗菌的表面清洁剂或微生物驱避剂。
[0855] 其它工业和医学应用
[0856] 如上所论述,本发明的木聚糖酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——可以用于例如许多工业过程、医学和研究(实验室)应用,以及食品、动物饲料和饮料应用中。
新的木聚糖酶通过筛选现有的文库和由不同的嗜温和中等嗜热地点以及从目标来源——
包括消化道菌群、动物废物中的微生物、土壤细菌和高碱性生境构建的DNA文库而发现。应用动物饲料物质中的阿拉伯木聚糖基质和/或不溶性多糖部分的生物陷阱(biotrap)和初
级富集策略也是有用的
[0857] 两种筛选模式(基于活性的和基于序列的)被用于发现新的木聚糖酶。基于活性的方法是应用底物如偶氮木聚糖(Megazyme)在琼脂板上直接筛选木聚糖酶活性。可选地,
可以使用基于序列的方法,其依赖于生物信息学和分子生物学来设计探针,用于杂交和生
物淘选。参见例如,美国专利第6,054,267、6,030,779、6,368,798、6,344,328号。对来自筛选的命中(hit)进行纯化、测序、表征(例如,确定最佳的特异性、温度和pH),应用生物信息学进行分析,亚克隆并且表达,以获得基本的生物化学表征。这些方法可以用于筛选木聚糖酶,所述木聚糖酶可用于大量的应用中,包括面团调理和用作动物饲料添加剂酶。
[0858] 在表征从筛选获得的酶时,可以评价其在面团加工和烘焙应用中的示例性应用。表征可以包括,例如底物特异性的测量(木聚糖、阿拉伯木聚糖、CMC、BBG)、温度和pH稳定性以及比活性。商业上的酶可以用作基准。在一方面,本发明的酶在pH≥7和25-35℃具
有显著的活性,对不溶性的木聚糖没有活性,在50-67%的蔗糖中稳定并具有活性。
[0859] 在另一方面,可以从候选酶的表征评价作为饲料添加剂的效用。表征可以包括例如底物特异性的测量(木聚糖、阿拉伯木聚糖、CMC、BBG)、温度和pH稳定性、比活性以及胃稳定性。在一方面,饲料被设计用于单胃动物,并且在另一方面,饲料被设计用于反刍动物。
在一方面,本发明的酶在pH 2-4和35-40℃具有显著的活性,在胃液中半衰期为30分钟以
上,在85℃制剂(在缓冲液或细胞中)半衰期为5分钟以上并且被用作单胃动物饲料添加
剂。在另一方面,本发明的酶具有下列特征的一个或多个:在pH 6.5-7.0和35-40℃具有
显著的活性,在瘤胃液中半衰期为30分钟以上,制剂稳定性如干粉一样稳定并且被用作反
刍动物饲料添加剂。
[0860] 酶对广泛的天然和非天然底物有活性,因而使得能够对实质上任何有机铅化合物进行改性。此外,不象传统的化学催化剂,酶是高度对映异构-和区域选择性的。酶所显示的高度的官能团特异性使技术人员能够跟踪生成新的活性化合物的合成顺序中的每一个
反应。酶也能够催化与它们在自然界中的生理功能无关的多种不同的反应。例如,过氧化
物酶催化酚被过氧化氢的氧化。过氧化物酶也可以催化与该酶的天然功能无关的羟基化反
应。其它的例子是催化多肽分解的木聚糖酶。在有机溶液中,一些木聚糖酶还可以对糖进
行酰化,这是与这些酶的天然功能无关的功能。
[0861] 本发明利用了酶的独特催化性质。鉴于生物催化剂(即,纯化的或粗的酶,无生命的或活的细胞)在化学转化中的应用通常需要鉴定与具体起始化合物反应的特定生物催化剂,本发明利用了对存在于许多起始化合物中的官能团特异的经选择的生物催化剂和反
应条件。每一种生物催化剂对于一种官能团或几种相关的官能团是特异的,并且能够与许
多包含这种官能团的起始化合物反应。生物催化反应从单一起始化合物产生衍生物群。这
些衍生物可以进行另一轮生物催化反应,以产生第二个衍生化合物群。每一次生物催化衍
生化的重复,可以产生数以千计的原始化合物的变异。
[0862] 酶在起始化合物的特异位点反应而不影响该分子的其余部分,这是使用传统的化学方法非常难以达到的过程。这种高度的生物催化特异性提供了鉴定文库内单个活性化合
物的方法。所述文库由一系列用于产生该文库的生物催化反应来表征,即所谓的“生物合成历史”。就生物学活性筛选文库和追踪生物合成历史鉴定出产生活性化合物的具体反应顺
序。重复该反应序列并且确定所合成的化合物的结构。不象其它的合成和筛选方法,这种
鉴定方式不需要固定技术,以及化合物可以被合成并应用实际上任何类型的筛选试验在溶
液中被自由测试。重要的是,注意到,酶反应对于官能团的高度特异性允许“追踪”构成生物催化产生的文库的特异酶促反应。
[0863] 许多程序步骤应用机器人自动化进行,机器人自动化使每天能够执行数以千计的生物催化反应和筛选试验,并确保高水平的正确性和重复性。结果,衍生化合物文库可以在数周内产生,而使用目前的化学方法将需要数年产生该衍生文库。(对于分子修饰,包括对小分子修饰的进一步教导,参见PCT/US94/09174)。
[0864] 在一个方面,本发明提供组合物,其包含至少一种能够形成水凝胶的黏膜粘合聚合物和至少一种水溶性聚合物以及一种或更多种本发明的酶。该制剂可以用于本发明的任
何工业、食品或饲料加工或医学或研究应用中,即应用本发明酶或核酸的任何应用中。在一个方面,所述制剂在水溶液中形成具有黏膜粘合性质的水凝胶;其可以在一段延长的时间
内释放酶、能够产生本发明酶或本发明抗体的微生物。可选择地,水凝胶可以捕获酶、能够产生本发明酶或本发明抗体的微生物并且在限定(例如延长)的时间内释放它们。
[0865] 本发明将关于下列实施例进行进一步描述;然而,应理解,本发明不限于这样的实施例。实施例
[0866] 实施例1:用小麦阿拉伯木聚糖作为底物的木聚糖酶测定
[0867] 下列实施例描述了示例性木聚糖酶测定,其可以用于,例如确定酶是否在本发明的范围内。本发明的酶,例如具有表1中所列出的和本文中所描述的一个或更多个氨基酸
残基改变(突变)的SEQ ID NO:2,还包括具有基于示例性SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的各种序列同一性的一类多肽,可以使用小麦阿拉伯木聚糖作为底物在pH 8(磷酸钠缓冲液)和70℃下进行测定。
[0868] 实施例2:熔解温度和木聚糖酶活性的测定
[0869] 差示扫描量热法(DSC)
[0870] 本发明的每种酶——例如具有表1中所列出的和本文中所描述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQ ID NO:2——的熔解温度转变中点(Tm)可以通过差示扫描量
热法(DSC)进行测定。减去基线的DSC数据可以对蛋白浓度归一化。
[0871] 在 一 个 测 定 中,量 热 法 可 以 使 用 Model 6100 NANO II DSCTM 仪器 (CalorimetrySciences Corporation,American Fork,UT) 进 行, 所 述
TM TM
仪 器 应 用 DSCRUN (DSCRun) 软 件 包 获 取 数 据、应 用 CPCALC (CpCalc) 进
TM
行分 析、应用CPCONVERT (CpConvert) 从微 瓦 特转 化成 摩 尔热 容 以及 应 用
TM
CPDECONVOLUTE (CpDeconvolute)进行解卷积(deconvolution)。可以以1℃/min的扫描
速度用在20mM磷酸钾(pH 7.0)和100mM KCl中的1mg/ml重组蛋白实施分析。在所有DSC
实验期间,可以保持5atm的恒定压力,以防止加热时溶液可能排气。在用填充有缓冲液的
两个小室进行实验前可以常规地记录仪器的基线。热诱导的转变的可逆性可以通过在冷却
第一轮后立即重新加热量热计小室中的溶液来进行测试。
[0872] 可选择地,DSC测量可以使用VP-DSC微量热计(Micro-Cal)以一式两份进行。在一个方面,需要的样品体积是540μL。在50mM HEPES,pH 7.2中,蛋白质的浓度可以在0.1至0.5mg/mL之间;透析缓冲液样品可以被保留用于基线对照。可以将每个样品从40℃加
热到110℃。样品和/或缓冲液可以以90℃/h的扫描速度进行加热和冷却。多次记录缓
冲液基线直至系统达到稳定状态。Tm值是释放最大量热的温度。
[0873] 木聚糖酶活性测定
[0874] 酶活性可以使用400μL 2%偶氮木聚糖作为底物,在550μL CP(柠檬酸盐-磷酸盐)缓冲液,pH 6.0中,在指定的温度下进行测定。作为pH函数的活性测量值可以使用
50mM Britton和Robinson缓冲溶液(pH 3.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)进行测定,所述缓冲溶液如下制备:将0.1M磷酸溶液、0.1M硼酸和0.1M乙酸的溶液进行混合,然后用1M氢
氧化钠调节pH。可以通过添加50μL 0.1mg/ml的纯化酶来起始反应。可以从0至15分钟
获取时间点,其中50μL反应混合物被添加到200μL沉淀溶液(100%乙醇)。当所有时间
点已经获取时,混合样品,温育10分钟并且在4℃下以3000g离心10分钟。可以将上清液
(150μL)整分到新鲜的96孔板中并且在590nm处测量吸光度。可以相对于时间绘出A590
值的图,并且由线的斜率确定最初比率。
[0875] 多糖指纹分析
[0876] 多糖指纹可以通过应用糖类凝胶电泳的多糖分析(PACE)来测定。山毛榉材木聚糖(0.1mg/mL,100μL,Sigma,Poole,Dorset,UK)或木聚寡糖(1mM,20μL,Megazyme,Wicklow,Ireland)可以用总体积为250μL的酶(1-3μg)处理16小时。反应在0.1M乙酸
铵pH 5.5中进行缓冲。不含底物或酶的对照在相同的条件下进行,以在酶、多糖/寡糖或标记试剂中鉴任何定非特异性化合物。通过煮沸20min来停止反应。对于每种条件,独立进行至少2次测定。实施应用ANTS(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸,Molecular Probes,Leiden,The Netherlands)的衍生化、电泳和成像,如(Goubet,F.,Jackson,P.,Deery,M.and Dupree,P.(2002)Anal.Biochem.300,53-68)所述。
[0877] 适合度(fitness)计算
[0878] 对于给定的酶变量n,适合度(Fn)可以这样来计算:等加权相对于所有变量中每一参数的最大差分变性温度转变中点(Tm)的增加和酶活性的增加(或降低):Fn=FTn+FVn,其中FTn=变量的Tm适合度因子以及FVn=变量的活性适合度因子。每一种(Tm和活性)适
合度因子是相对于所有变量中Tm或比率的最大差分。FTn=(Tm-TmL)/(TmH-TmL),其中对于给定的变量n,Tmn是Tm,并且TmL是所有变量中最低的Tm和TmH是所有变量中最高的Tm,以及
FVn=(Vn-VL)/(VH-VL),其中对于给定的变量n,Vn是相对的比率,并且VL是所有变量中最低的比率和VH是所有变量中最高的比率。
[0879] 实施例3:用本发明的木聚糖酶预处理纸浆
[0880] 在一个方面,本发明的木聚糖酶用于处理/预处理纸浆或回收的纸或纸浆、废木材或木屑等。在一个方面,本发明的酶通过处理/预处理纸浆或回收的纸或纸浆等而用于
增加纸的“亮度”。
[0881] 在一个方面,本发明的木聚糖酶用来处理/预处理纸浆或回收的纸或纸浆等,以降低卡伯值。卡伯值被定义为表示纸相对木质素含量的数值——卡伯值越高,木质素含量
越高。在一些方面,卡伯#降低具有益处——当处理未漂白的浆料(卡伯#70-90),当然后
用于,例如加工,如在板制造中。在一些方面,X阶段中卡伯的降低可以减少蒸煮或蒸煮至更高目标卡伯#中使用的碱。在一些方面,这导致更高的浆料强度、较少的机器精炼和更高的机器速度。在一些方面,在箱纸板碾磨机中应用消化添加剂(表面活性剂)看到这些结
果;这可以允许更好的液体渗透,以及可以降低导致更高浆料强度的有效碱负荷、减少精炼和机器速度增加200fpm(英尺/分钟)。
[0882] 该实施例描述了示例性常规筛选方案,用以确定木聚糖酶在预处理纸浆中是否有用;例如当用于预处理牛皮纸浆时在减少漂白化学品(例如二氧化氯,ClO2)的使用中是否
有用。
[0883] 筛选方案有两个可选择的测试参数:在氧脱木质素步骤后(O2后浆(post-O2pulp))木聚糖酶处理的影响;以及在不包括氧脱木质素的过程中(O2前粗浆
(pre-O2brownstock))木聚糖酶的影响。
[0884] 本发明提供浆料或纸处理条件,所述条件模拟工业情形例如工厂中的过程条件:例如,约pH 8.0;70℃;持续时间为60min。例如,本发明的示例性过程示意性地描述在图5的流程图中;也参见图6。然而,本发明方法的过程条件可以调整为任意温度、持续时间和/或pH,这取决于所用的本发明的示例性酶和所述过程的目的;例如,存在多种调节本发明的各种浆料和纸过程中pH的方法:
[0885] ■添加酸和/或碱:
[0886] ■盐酸(HCl)
[0887] ■氢氧化钠(NaOH)
[0888] ■H2SO4(硫酸)
[0889] ■NaHSO4(硫酸氢钠)
[0890] ■H2SO3(亚硫酸)
[0891] ■H3PO4(磷酸)
[0892] ■HF(氢氟酸)
[0893] ■CH3CO2H(醋酸)
[0894] ■H2CO3(碳酸)
[0895] ■H2S(硫化氢)
[0896] ■NaH2PO4(磷酸二氢钠)
[0897] ■NH4Cl(氯化铵)
[0898] ■HCN(氢氰酸)
[0899] ■Na2SO4(硫酸钠)
[0900] ■NaCl(氯化钠)
[0901] ■NaCH3CO2(乙酸钠)
[0902] ■NaHCO3(碳酸氢钠)
[0903] ■Na2HPO4(磷酸氢钠)
[0904] ■Na2SO3(亚硫酸钠)
[0905] ■NaCN(氰化钠)
[0906] ■NH3(氨水)
[0907] ■Na2CO3(碳酸钠)
[0908] ■Na3PO4(磷酸钠)
[0909] ■起气泡,例如CO2(其溶解时与水形成酸)
[0910] 木聚糖酶对O2前粗浆的剂量响应测定
[0911] 木聚糖酶阶段(X-阶段)的条件如下:
[0912] pH 8
[0913] 温度70℃
[0914] 时间60min
[0915] 卡伯因子0.24
[0916] 对于无酶的对照,卡伯因子是0.30
[0917] 洲际O2前粗浆木聚糖的预处理
[0918] 在Do中ClO2剂量响应的测定
[0919] 实验概要
[0920] O2前粗浆
[0921] 初始卡伯31.5
[0922] X阶段条件
[0923] 木聚糖酶用量0.7U/gm
[0924] 温度70℃
[0925] pH 8
[0926] 处理时间1hr
[0927] 浆料稠度10%
[0928] 漂白顺序XDEp
[0929] 卡伯因子0.22、0.26和0.30(在浆料上的%D:2.63、3.12和3.60)
[0930] 在Do中ClO2剂量响应的测定:
[0931] 木聚糖酶0.7U/g,pH 8.0,70℃,1hr
[0932] 浆料:O2前粗浆,初始卡伯31.5
[0933] ClO2的节约百分比对于工业具有很少的重要性。它们主要关注的是每吨OD浆料所需的ClO2的lbs。这是有意义的——当技术人员认为,用高初始卡伯粗浆看到的较低的
节省百分比在所节省ClO2的lbs方面比低初始卡伯浆料的较高的减少百分比更有价值时,
所述低初始卡伯浆料将需要较低的ClO2总用量来达到目标亮度。
[0934] 对于漂白的对照浆料的亮度、产率和卡伯因子之间的关系:
[0935] 用渐增剂量的ClO2漂白以实现更高的目标亮度,导致浆料收率的损失增加。这成为问题,是因为在该过程阶段的浆料具有每吨几乎$400的价值并且纤维素的损失耗费金
钱。
[0936] 木聚糖酶(例如本发明的木聚糖酶)的益处是,使用较低的ClO2剂量可以降低收率损失,只要木聚糖酶本身的作用不抵消增加。
[0937] 用木聚糖酶预处理O2前粗浆的剂量响应数据
[0938] 实验概要
[0939] ·北方木材O2前粗浆
[0940] -起始卡伯28.0
[0941] -起始稠度32.46%
[0942] -起始亮度28.37
[0943] ·X阶段条件
[0944] -木聚糖酶用量0至2.70U/gm
[0945] -温度58℃至61℃
[0946] -pH 8.2至8.5
[0947] -处理时间1hr
[0948] ·漂白顺序XDEp
[0949] -卡伯因子0.24
[0950] ·对于0.24至0.30之间的卡伯因子,所计算的节省的ClO2
[0951] 该实验的目的是评价在未洗涤的SPF粗浆上的木聚糖酶。结果可以显示,用XYLB(E.c)处理的浆料的最终亮度剂量依赖性增加,并且在较低Kf,0.24下在木聚糖酶存
在的情况下所达到的亮度接近在较高Kf,0.30下渐进地所达到的亮度。
[0952] 实施例4:新型生物漂白试验,用于评价木聚糖酶在提高浆料亮度方面的性能
[0953] 该实施例描述了示例性方案,“生物漂白试验”,其可以用于确定多肽是否具有木聚糖酶活性以及是否在本发明的范围内。该试验可以用于评价本发明示例性酶在提高浆料例如牛皮纸浆的亮度方面的性能,所述本发明示例性酶例如具有表1中列出的和本文中
所述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQ ID NO:2,或与示例性SEQ ID NO:2、
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24具有序列同一性(如本文中所述)的序列。
[0954] 本发明提供生物漂白方法,例如三阶段生物漂白方法,其紧密地模拟实际制浆漂白工厂的条件,如图5中所说明;包括图6中所说明的过程。该漂白顺序称为(X)DoEp,其中X表示木聚糖酶处理阶段(使用,例如本发明的酶),D表示二氧化氯漂白阶段,以及Ep表
示碱性过氧化物提取阶段。可以使用许多不同的原料,例如,南方软木材牛皮纸粗浆(无氧脱木质素作用)和硬木材牛皮纸浆(例如枫木和白杨)。在完成每一轮生物漂白后,接着浆
料可以用来生产TAPPI(纸浆与纸工业技术协会,全世界纸浆、纸和转化工业技术协会)-标
准的手抄纸。每一手抄纸的GE%亮度可以被测量,以及亮度值可以用来表示每种酶在酶预
处理阶段(X)对浆料作用、如何好。
[0955] 浆料生物漂白:如图5中所说明,应用3-阶段(X)DoEp顺序,在密封的塑料袋中,以10-g分批对浆料进行漂白。三个阶段的处理条件可以总结如下:
[0956] X阶段:10%(w/v)稠度,65℃和pH=8,60min
[0957] Do阶段:4%(w/v)稠度,60℃,30min;对于酶处理的样品,卡伯因子=0.18,以及对于没有酶的对照,卡伯因子为0.18和0.21。
[0958] Ep阶段:10%(w/v)稠度,75℃,90min;苛性碱用量:1.7%(wNaOH/w OD浆料)以及H2O2用量:0.5%(w/w)
[0959] 如图5中所示出的,在一个方面,洗涤原浆,以将pH降低至pH 8.5;将浆料加压过滤并且分入袋中。在每一阶段,可以在期望的温度下在水浴中温育袋以及每10min取出每一个袋并且充分地捏和,以确保均匀的块和在浆料块内均匀的热转移。在每一处理后,可以过滤浆料,用2L DI水洗涤并且在接受下次处理前再次进行过滤。浆料的水分含量可以应
用Mettler-Toledo水分分析器(FisherScientific,USA)进行测量。
[0960] 如图5中所示出的,在一个方面,在浆料加压过滤和分入袋之后,在X阶段中,浆料可以被重悬浮、加压过滤、进行pH调节;以及然后与酶一起在10%固体下,65℃温育1小时;然后捏和10分钟。在Do阶段,浆料可以被重悬浮、洗涤、pH设置为4.0以及加压过滤;
然后用ClO2在4%固体(即,4%(w/v)稠度)下60℃浸渍30min;然后捏和10分钟。在
Do阶段,对于酶处理的样品,卡伯因子=0.18,以及对于没有酶的对照,卡伯因子为0.18和
0.21。在Ep阶段,浆料可以被重悬浮、洗涤以及加压过滤;然后与NaOH和H2O2一起在10%
固体(即,10%(w/v)稠度)下75℃温育90min;然后捏和10分钟。苛性碱用量:1.7%(w
NaOH/w OD浆料)和H2O2用量:0.5%(w/w)。在捏和后,形成手抄纸。
[0961] 手抄纸:如图5中所示出的,在一个方面,可以形成手抄纸(4m浆料,pH约6.5);手抄纸可以根据TAPPI方法T-272sp-97应用TAPPI标准设备(KalamazooPaper Chemicals,Richland,MI)由未漂白的和已漂白的浆料制成。每一手抄纸的GE%亮度可以根据TAPPI
TM
方法T-452om-98(在457nm参考)应用BRIGHTMETERMICRO S-5/BC (Technidyne Corp.,
New Albany,IN)进行测量。
[0962] 实施例5:新型生物漂白过程
[0963] 该实施例描述了本发明的新型生物漂白过程,如图6中所说明。该过程可以应用任何木聚糖酶进行实施,包括本发明的多肽,所述多肽包括与本发明的示例性酶,例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24具有
50%至99%或更高序列同一性的多肽,还包括具有SEQ ID NO:2序列的任何多肽,所述SEQ ID NO:2具有表1中列出的和本文中所述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)。
[0964] 本发明的该示例性过程可以具有包含“粗浆”的原材料,所述过程可以描述为:1)原料制备——将进入纸研磨机的圆木去皮、切碎并且过筛,以除去过厚的碎片、细屑、结节和杂质,2)制浆——将木屑在氢氧化钠和硫化钠的浓缩溶液中在压力下于160℃至190℃蒸煮几小时,以便分离纤维素纤维并且通过提取大部分不需要的木质素而增加纤维素含
量。该步骤的产物被称为″粗浆″。
[0965] 本发明的该示例性过程包括“漂白步骤”——除去残余木质素和其它发色团,以使浆料变白成目标亮度,准备制造纸或其它产品的多步骤过程。用优选攻击木质素的氧化化学品,例如氯和二氧化氯处理浆料。一方面,该过程包括浆料与二氧化氯反应的漂白顺序,“D0”阶段(也参见图5);在过氧化氢存在的情况下用碱萃取,“Ep”阶段(也参见图5,“Ep”阶段);与二氧化氯第二次反应,“D1”阶段;用碱和过氧化氢萃取,Ep阶段;以及与二氧化氯第三次反应,D2阶段。在该过程的实践中,针对所用氧化化学品的类型和量以及工序数
(然而,二氧化氯是目前应用最广泛的化学氧化剂),漂白可以经受许多变化。在一个方面,该过程包括在压力下用氧对蒸煮的浆料预处理;氧反应器可以在高压下-约200至230℉
以及pH 12至14(这是漂白中常用的第一步骤,称为“氧脱木质素作用”)。
[0966] 在一个方面,该方法包括精制。例如,在造纸前,漂白的浆料通过机械方法进行细化,以将纤维素纤维崩解成扁平的带状物,使其表面原纤化以及改善其造纸的物理特性。在制浆后过程的任何阶段,浆料可以被脱水、洗涤以及通过添加清洁的水或回收的蒸馏水调节到预先确定的稠度。
[0967] 可以在制浆后就将木聚糖酶(例如本发明的酶)添加在氧反应器中或恰好在氧反应器之前添加在贮藏容器中。木聚糖酶(例如本发明的酶)可以在漂白过程中的多个点
(一个或更多个或所有的点)进行添加。在一个方面,添加漆酶,以催化木质素的分解。可
以在过程的任何阶段,包括在氧反应器中添加漆酶。浆料可以释放多种成分,其本身调节
漆酶。可选地,在一个方面,可以添加有机或无机调节剂(参见,例如DE 19723890,其描述了包含有机调节剂和漆酶的氧化系统;可选的示例性调节剂包括作为示例性有机调节剂的
2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑-5-磺酸盐)(ABTS)和作为示例性无机调节剂的八氰基
钼酸钾[K4Mo(CN)8])。美国专利申请20030096394中所描述的调节剂也可以用在本发明的
过程中,包括能够提高漆酶和漆酶相关性酶的活性的任意化合物。
[0968] 在一个方面,添加酯酶例如脂肪酶或氧化还原酶例如过氧化物酶。此外,可以在反应器中改变pH和/或温度。在对本发明的反应监测时,可以使用任意木质素含量测量技术,例如参见美国专利申请20020144795,其描述了基于涉及木质素和氧化还原调节剂的催化反应的伏安测量来测量牛皮纸浆的卡伯值或木质素含量的方法。
[0969] 本发明的酶也可以用于如例如美国专利6,824,646中所述的碱性-氧漂白(氧脱木质素作用)过程,该过程包括用氧在水性碱溶液中漂白木质纤维素浆料以及用半纤维
素酶处理该浆料,同时将从酶处理步骤输送的液体部分与半纤维素酶处理的反应混合物分
离,并且通过分离膜例如,反渗透膜进行渗透处理,以将渗透的部分与未渗透的部分分离;
然后将渗透的部分喂入碱性-氧漂白(氧脱木质素作用)步骤,该步骤包含本发明酶的应
用。
[0970] 在本发明的该过程或任何其它过程(方法)的可选的方面,木聚糖酶(例如本发明的酶)用于减少漂白化学品,例如氯、二氧化氯、苛性碱、过氧化物或其任意组合;以及在可选的方面,在实践本发明的方法和应用本发明的酶中可以看到化学品减少多达约1%、
5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%或更多或100%。在一个方面,当木聚糖酶联合漆酶或其它酶应用,例如通过应用酶鸡尾酒时,可以实现化学品减少100%;注意本发明提供包含本发明的至少一种酶和一种或更多种其它酶的酶混合物或“鸡尾酒”,所述其它酶可以是另一种木聚糖酶或任意其它酶。
[0971] 在一方面,本发明的木聚糖酶用于减少二氧化氯,以允许在过程中对水进行循环;从而使用的水很少并且倒入下水道中的水很少。在一方面,本发明的木聚糖酶用于使更多
富含木质素的浆料进入漂白装置,获得较好的浆料收率和较好质量的浆料(即,在蒸煮过
程中破坏较少)。在一个方面,本发明的木聚糖酶用于增加纸的整体亮度。在一个方面,本发明的木聚糖酶用于降低纸的卡伯值。
[0972] 本发明的木聚糖酶可以用在所有木材类型上以及本发明的过程可以在所有木材类型上实施,所述所有木材类型包括例如具有例如氧脱木质素作用的硬木材、不具有氧脱
木质素作用的硬木材、具有氧脱木质素作用的软木材以及不具有氧脱木质素作用的软木材
等等。本发明的木聚糖酶可以用于再生纸和/或浆料的加工以及本发明的过程可以实施对
再生纸和/或浆料的加工。
[0973] 氧脱木质素作用通常需要在粗浆洗涤机和漂白装置之间添加反应塔。通常将氧和氢氧化钠添加到粗浆。如果前面是氧脱木质素作用,那么在漂白过程可以实现漂白化学品
减少50%。洗涤在氧脱木质素作用之后;可以回收或排出流出物。臭氧脱木质素作用可以
代替氧脱木质素作用而被使用。
[0974] 实施例6:新型生物漂白试验
[0975] 该实施例描述了这样的试验,所述试验可以证明在本发明多肽例如本发明示例性多肽,或本发明酶中的木聚糖酶活性,所述本发明酶例如具有表1中列出的和本文中所述
的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)的SEQ ID NO:2,还包括具有基于示例性SEQ ID
NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:
14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24的各种序列同一性的一类多肽。
[0976] 这些木聚糖酶活性研究可以基于Nelson(1944)J.Biol.Chem.153:375-380,“Reducing Sugar Assay for Xylanase”;以及Somogyi(1952)J.Biol.Chem.195:19-23描述的那些研究进行。这种“Nelson-Somogyi”试验可以用来测定活性单位;通过测定活性单位来证明本发明多肽中木聚糖酶活性的“Nelson-Somogyi”试验数据在下面列出。
[0977] 酶单位测定可以使用Nelson-Somogyi试验进行测定。生物漂白试验可以基于TAPPI(浆料与纸工业技术协会,参见如上)的方法进行。下面是参考TAPPI方案进行的描
述。
[0978] 浆 料:在 一 个 方 面,例 如 从 南 加 州 大 学 (North Carolina StateUniversity(Raleigh,NC))的木材和纤维科学部(Department of Wood and Fiber
Science)获得两批南方软木材牛皮纸粗浆。可以测定浆料卡伯值,如应用TAPPI方法
T-236om-99所分析,例如通常是21.4或29.7或在其之间;参见例如TAPPI测试方法
(2000-2001,2003173)。
[0979] 浆料漂白:可以用木聚糖酶预处理浆料并且应用3-阶段木聚糖酶/二氧化氯/碱性过氧化物顺序:(X)DoEp(参见如上的说明)在密封的塑料袋中以10g批次进行漂白。三
个阶段的处理条件可以是:
[0980] X阶段:10%(w/v)稠度,65℃,pH 8,60min.
[0981] Do阶段:4%(w/v)稠度,60℃,30min;对于酶处理的样品,使用0.18卡伯因子,以及对于没有酶的对照样品使用0.18和0.21的卡伯因子。在Do阶段中使用的二氧化氯的浓度应用等式(1)进行计算:
[0982]
[0983] 其中ClO2%等于每100g烘干的(OD)浆料中纯二氧化氯g。
[0984] KF是卡伯因子以及K#是TAPPI方法T-236om-99,TAPPI测试方法(2000-2001,2003173)所测定的浆料卡伯值,Ep阶段:10%(w/v)稠度,75℃90min;苛性碱用量是浆料
的1.7%(w/w)以及H2O2用量是浆料的0.5%(w/w)。
[0985] 在每一阶段,复制袋(replicate bag)可以在期望的温度下于水浴中进行温育,然后每10min进行一次去除和捏和,以确保均匀的块和在浆料块内均匀的热转移。在
每一阶段后,浆料可以例如通过衬有硬聚丙烯过滤器(297-微米目,Spectrum Labs,
Ft.Lauderdale,FL)的布氏漏斗进行过滤。可以将滤液循环一次,以得到细料,并且可以例如用2L DI水洗涤浆料饼。然后可以将浆料饼再悬浮在例如1.5L DI水中并且在X和Do阶
段之前可以分别将pH调节到例如pH 8和pH 4。浆料的含水量可以应用Mettler-Toledo
水分分析器(Fisher Scientific,USA)进行测量。
[0986] 手抄纸可以根据TAPPI方法T-272sp-97,TAPPI测试方法(2000-2001,2003173)应用TAPPI标准设备(Kalamazoo Paper Chemicals,Richland,MI)由漂白的浆料制
成。每一手抄纸TAPPI测试方法(2000-2001,2003173)的GE%亮度可以根据TAPPI方法
TM
T-452om-98例如应用Technidyne BRIGHTMETER MICRO S-5/BC (Technidyne Corp.,New
Albany,IN)进行测量。
[0987]
[0988] 程序
[0989] 1.制备试剂A
[0990] 2.向96孔PCR板的每一孔中吸入5uL 1M NaOH。将板保持在上。
[0991] 3.制备反应混合物。可选地,你可以配制多个样品的母混合物。此处为1×混合物。添加到1mL试管并且放置到96孔模块中。
[0992] a.50uL pH8磷酸钠缓冲液
[0993] b.250uL 1%底物(以使最终浓度为0.5%)
[0994] c.150uL H2O
[0995] 4.将反应混合物预加热到期望的温度3分钟。
[0996] 5.将0.5M磷酸盐缓冲液稀释成5mM pH 8,并且应用该缓冲液制备酶稀释液。
[0997] 6.向96孔微滴定板的孔中吸入75uL稀释的酶。
[0998] 7.向含反应混合物的1mL试管中吸入50uL稀释的酶。
[0999] 8.在期望的时间点,向含NaOH (NaOH将使pH升高到12,猝灭反应)的试管中吸入50uL每种反应混合物。
[1000] 9.添加50uL每种标准品,以分离也含NaOH的试管。标准品在0.25mM木糖至2.0mM木糖的范围内是线性的。使用至少4个标准品来产生标准曲线。
[1001] 10.向每一孔中添加50uL试剂A。应用MicrosealTM‘A’膜将板密封。
[1002] 11.在PCR机器中100℃加热板20min。在加热样品后使机器冷却到4℃。
[1003] 12.向每一试管添加50uL试剂B,混合。
[1004] 13.-注意在添加试剂B后形成大量CO2。应当小心不要使样品污染到邻近的孔。
[1005] 14.向96孔微滴定板的每个孔中吸入100uL每一样品或标准品。
[1006] 15.在560nm处读板。
[1007] 16.绘制标准曲线数据以及将标准品表示成umole木糖,即50uL 2.5mM木糖为.125μmole木糖。
[1008] 17.从每一时间点的样品数据中减去缓冲液对照并且绘制这些数据。
[1009] 18.时间点曲线斜率值除以木糖标准曲线斜率值。
[1010] 19.乘以10(占50uL样品(总试验体积的1/10)。
[1011] 20.除以试验中使用的体积(0.05),以得到每mL酶或U/mL酶每分钟释放的木糖的μmole。
[1012] 21.该数除以蛋白浓度,得到U/mg。
[1013] “Nelson-Somogyi”试验的“活性单位”数据可以用于确定生物漂白试验(基于TAPPI方法)中的施用剂量。
[1014] 如上所指出,本发明的酶和过程也可以结合酶促漂白的第二种方法使用,所述酶促漂白应用氧化酶如漆酶和/或过氧化锰酶(MnP)使浆料脱木质素。在所述第二种方法的
一个方面,在这些酶中优选漆酶,是因为MnP需要过氧化氢、锰(II)离子和螯合剂。漆酶在低的氧压力下可以使浆料脱木质素,而当如上所论述添加调节剂时更加有效。
[1015] 催化剂改进的脱木质素方法也可以结合本发明的方法使用,例如聚硫化物或蒽醌。蒽醌是制浆反应催化剂,其可以提高制浆的速度,增加收率以及减少制浆化学品用量多达10%。既使用蒽醌又使用聚硫化物是可能的。
[1016] 在一个方面,漆酶如上所论述结合本发明的方法来使用。例如,在本发明的过程中,漆酶用在氧反应器中,其中漆酶在氧反应器中分解木质素。尽管浆料可以释放自身
调节漆酶的各种组分,但在一方面添加有机或无机调节剂(参见上面的论述,例如可选
的示例性调节剂包括作为示例性有机调节剂的2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑-5-磺
酸盐)(ABTS)和作为示例性无机调节剂的八氰基钼酸钾[K4Mo(CN)8],或美国专利申请
20030096394中所述的调节剂)。在一个方面,也添加另一种水解酶,如酯酶(例如脂肪酶)
和/或氧化还原酶(例如过氧化物酶)。在可选的方面,在反应器中改变pH和/或温度。
[1017] 实施例7:证明本发明酶的酶活性的研究
[1018] 该实施例描述了证明本发明示例性木聚糖酶的酶活性的研究,其证明了本发明的多肽具有木聚糖酶活性,所述本发明的多肽包括与本发明的示例性酶,例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24具有50%至
99%或更高序列同一性的多肽,还包括具有SEQ ID NO:2序列的任意多肽,所述SEQ ID NO:
2具有表1中列出的和本文中所述的一个或更多个氨基酸残基改变(突变)。
[1019] 评价这些木聚糖酶的示例性试验:
[1020] 1.初级筛选-应用偶氮木聚糖(基于溶液的)底物
[1021] a.根据制造商推荐的试验方案,应用在100mM磷酸钠pH 8中的MEGAZYME 底物Birchwood偶氮木聚糖,通过偶氮木聚糖试验可以测定酶的酶活性。可以调节酶样品的浓
度,以便它们在pH8下具有相等量的木聚糖酶活性。
[1022] b.然后用在100mM硼酸钠缓冲液pH 10.4中的标准化样品重复偶氮木聚糖试验。
[1023] 2.初级筛选-ENZ-CHEK ULTRA木聚糖酶试验试剂盒TM(Invitrogen)
[1024] a.可以以与偶氮木聚糖试验(上面第1部分)相同的方式制备木聚糖酶样品。
[1025] b.可以通过采用例如Invitrogen以名称ENZ-CHEK ULTRA木聚糖酶试验试剂盒TM TM
(产品号E33650)出售的可购得的试验试剂盒,测量酶的酶活性水平。ENZ-CHEK 试剂盒
底物在木聚糖酶存在的情况下产生荧光信号,这可以通过使用试剂盒提供的标准品用于对
木聚糖酶活性定量。可以由任何制造商推荐的方案对测试木聚糖酶所使用的方案稍做修
改。所述修改可以主要涉及,例如在制造商推荐的不同pH和温度下测试木聚糖酶。
[1026] 3.次级筛选-示例性浆料试验
[1027] a.可以应用例如本文已描述的Nelson-Somogyi试验,在小麦阿拉伯木聚糖上测试来自偶氮木聚糖试验的酶的活性。然后可以在实验室规模的漂白试验中对它们进行测
试,以确定对于给定的浆料类型和二氧化氯荷载量,化学品节省的量是否均可以实现。可以在荷载量和pH水平的范围内,在TAPPI袋生物漂白试验(例如一式三份)中,测试满足期
望性能特征的酶。
[1028] 4.示例性酶特征筛选-温度曲线
[1029] a.可以在逐渐升高的温度下于pH 8和pH 10.4下应用偶氮木聚糖试验测定木聚糖酶的耐热性;以及应用该试验测试本发明的酶。可以记录每一温度下反应的初始速率和
绘图,以确定木聚糖酶的最佳性能温度。
[1030] b.剩余活性-可以用来测试酶热稳定性的另一种示例性试验是剩余活性方法,由此在具体的pH下于升高的温度下将酶样品处理一段特定的时间,然后在容许的温度下(通
常为37℃)在标准条件下进行测定。然后测定在具体温度下的半衰期并且测量在那些温度
条件下给定酶的适合度。
[1031] 实施例8:证明本发明酶的酶活性的研究
[1032] 该实施例描述了这样的研究,所述研究证明了本发明示例性木聚糖酶的酶活性,包括本发明任何多肽的酶活性在内,所述本发明任何多肽包括与本发明的示例性酶,例如
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、和/或SEQ ID NO:
24具有50%至99%或更高序列同一性的多肽,还包括具有SEQ ID NO:2序列的任何多肽,
所述SEQ ID NO:2具有表1中列出的和本文中所述的一个或更多个氨基酸残基改变(突
变)。
[1033] 利用GSSM技术的内切木聚糖酶SEQ ID NO:2(Xyl 11)的进化和木聚糖酶筛选鉴定了这样的点突变(Xyl 11突变体),具有增加的木聚糖酶活性,并且从碱性预处理的玉米
秸秆释放的糖增加——当50℃下在糖化鸡尾酒试验中36hrs后结合7种其它纤维素酶(下
表2)使用时。这些试验包含5%(w/v)碱性预处理的干燥玉米芯以及10.2mg/g固体纤维
素的总酶荷载量。
[1034] 表2:酶鸡尾酒的组分
[1035]
[1036] 新木聚糖酶突变体相对于0.6mg/g纤维素以及0.2mg/g纤维素荷载量的野生型而言提高了木糖的释放(图2)。在标准荷载量0.6mg/g纤维素下,这些新变体实现了多达
90%的单体木糖释放的转化速率——相对于野生型的63%。本发明的一些多肽(SEQ ID
NO:2的突变体)——具体而言,Xyl 11突变体11和Xyl 11突变体14——甚至在减少的荷
载量,0.2mg纤维素下也实现了高于90%的木糖释放。本发明的这些新型多肽(SEQ ID NO:
2的突变体)因此不仅提高木糖释放速率而且在酶荷载量减少的情况下也提高木糖释放速
率。对于可比较的糖化反应,应用不同的原料(柳枝稷、硬木材和软木材、能源甘蔗、甘蔗渣等)和鸡尾酒组分的不同比率,可以预料对木糖释放和酶荷载量的类似阳性效果,所述不
同的原料被施以碱或酸预处理并且具有不同的初始酶荷载量(1mg-100mg/g纤维素)。
[1037] 本发明酶可以用来加工/处理纤维素材料,所述纤维素材料用于例如生物醇(例如EtOH或乙醇)发酵;应用本发明的组合物和方法加工的纤维素材料可以主要由纤维素
(包含葡萄糖)和半纤维素组成-其主要包含木糖。在一个方面,葡萄糖以及木糖可以用作
EtOH发酵的糖源。在一个方面,本发明的木聚糖酶在酶促分解纤维素材料的半纤维素部分
中具有活性,释放单体木糖。在一个方面,本发明多肽的提高的木聚糖酶活性增加可用于发酵的木糖的量。
[1038] 在一个方面,由于除去了半纤维素,纤维素变得易与纤维素酶接触,这也可以增加纤维素向葡萄糖的转化。通过应用本发明的木聚糖酶,例如示例性内切木聚糖酶Xyl
11(SEQ ID NO:2)的序列改变,包括本文描述的示例性的18种氨基酸置换,相对于“野生
型”木聚糖酶可以实现增加的比活性,如上表1中所述。注意:在表1中,三级试验活性被表示为水解9.5h后达到的,在BCA试验中测量的,560nm处的吸光度。参考表1,当以木聚糖酶作为变量在鸡尾酒糖化试验中评价这些克隆(本发明的木聚糖酶)中的每一个时,这些克
隆(本发明的木聚糖酶)中的十四个提高了木糖转化率——当与相同的荷载量下野生型的
试验相比时,如表3(对于表3中参考的序列,参见表1,例如表1基于示例性SEQ ID NO:2
而列出了Xyl 11突变体5、Xyl 11突变体5等的序列;还指出,“Xyl 11(WT)”指“野生型”示例性SEQ IDNO:2)中所示出:
[1039] 表3:利用表2(如上)中显示的鸡尾酒进行的木糖转化。注意,在每一鸡尾酒中木聚糖酶组分(Xyl 11 WT或Xyl 11突变体)可以变化。
[1040] 木糖转化,0.2mg 木糖转化,0.6mg
[1041] 用于鸡尾酒中的Xyl 用于鸡尾酒中的Xyl
[1042] 36hr STDEV 36hr STDEV
[1043] 11或Xyl 11突变体 11或Xyl 11突变体
[1044] Xyl 11(WT) 51.57% 0.01 Xyl 11WT) 62.84% 0.02
[1045] Xyl 11 突变体 5 55.98% 0.00 Xyl 11 突变体 16 68.10% 0.01
[1046] Xyl 11 突变体 16 57.43% 0.01 Xyl 11 突变体 5 69.69% 0.00
[1047] Xyl 11 突变体 12 59.03% 0.02 Xyl 11 突变体 12 71.75% 0.01
[1048] Xyl 11 突变体 4 59.46% 0.00 Xyl 11 突变体 7 74.25% 0.00
[1049] Xyl 11 突变体 9 60.34% 0.01 Xyl 11 突变体 9 74.45% 0.00
[1050] Xyl 11 突变体 17 60.45% 0.01 Xyl 11 突变体 17 74.76% 0.01
[1051] Xyl 11 突变体 7 61.23% 0.02 Xyl 11 突变体 4 74.94% 0.01
[1052] Xyl 11 突变体 2 61.73% 0.02 Xyl 11 突变体 13 75.30% 0.01
[1053] Xyl 11 突变体 6 62.31% 0.00 Xyl 11 突变体 2 78.24% 0.05
[1054] Xyl 11 突变体 13 63.58% 0.01 Xyl 11 突变体 15 80.03% 0.00
[1055] Xyl 11 突变体 15 65.95% 0.00 Xyl 11 突变体 6 80.36% 0.09
[1056] Xyl 11 突变体 10 66.34% 0.00 Xyl 11 突变体 10 80.61% 0.01
[1057] Xyl 11 突变体 11 71.76% 0.01 Xyl 11 突变体 14 84.74% 0.01
[1058] Xyl 11 突变体 14 73.69% 0.03 Xyl 11 突变体 11 90.36% 0.06
[1059] 因此,本发明提供包含下列酶或由下列酶组成的酶鸡尾酒:内切葡聚糖酶、寡聚酶I(β-葡糖苷酶)、CBH1(GH家族7)、CBH2(GH家族6)、木聚糖酶(GH家族11)、阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酶(GH家族10)以及寡聚酶II(β-木糖苷酶);其中这些酶中的1、2、3、4、
5、6、7种和/或所有8种是本发明的多肽,以及应用这些鸡尾酒或本发明的任何鸡尾酒处理多糖组合物的方法,例如处理/加工木材、浆料、纸、废物等的方法,或制造生物燃料或食品或饲料的方法,或例如本文所述的任何其它工业过程或方法。
[1060] 用于鉴定本发明酶的筛选和试验
[1061] 下列筛选和试验用于鉴定本发明的示例性酶,以及在一个方面,这些筛选和试验可以被施用来确定任意多肽是否具有足以落入本发明范围内的木聚糖酶活性-当然假定
其也具有如本文所述的必需的序列同一性:
[1062] 木聚糖酶进化筛选:应用GSSM技术(Verenium Corporation,美国专利6,171,820),创建内切木聚糖酶Xyl 11(SEQ ID NO:2)的进化文库,该文库代表了该酶194个残基中每一个所有可能的氨基酸交换。每次应用简并寡核苷酸,在一个氨基酸位置来引
入点突变,以便可以用20种天然编码的氨基酸中每一种取代每一原始密码子。应用载体
pWZ82T(SEQ ID NO:25),将突变的变体转化到XL1-Blue(recA-株,Stratagene)中,然后
转化到荧光假单胞菌MB214(Dow Global TechnologiesInc.,美国专利公开20050130160)
中。使所有变体生长和表达(自荧光假单胞菌MB214)以及在96孔板中裂解。在96孔板
(200ul 200mM柠檬酸盐缓冲液,pH 5.5,0.5%干燥和研磨的碱预处理的玉米秸秆-CP-15,
50C)中,实施裂解物的水解反应。在1、3、5和10hrs时从反应中除去等分试样并且添加到
800mM碳酸盐缓冲液pH10,以停止反应。通过Johnston等1998(参见下面)所描述的还原
末端(BCA)测定来评价在每一时间点水解的程度,记录在560nm(A560)处的吸收。此外,
应用Xyl11(SEQ ID NO:2)特异性抗体的定量ELISA被用来将活性标准化成蛋白表达。功
能和定量测定均是自动化的,以进行高通量测定。在初级筛选中,将显示标准化活性的克
隆——其超过板上的Xyl 11(SEQ ID NO:2)对照至少个2标准差(>1.0+2STDV wt)——
继续进行二级筛选。在二级筛选中,应用初级筛选中相同的试验和命中标准,将所有初级命中事件以一式两份进行再筛选。然后,将两次重复所确证的克隆继续进行三级筛选。在三
级筛选中,再次应用BCA测定以一式两份对这些克隆进行测定,但这次蛋白质的限定浓度
不同(0.1、0.05和0.025mg/ml)。通过Bradford试验(例如Bradford 1976中所述,参见
下面),测定裂解物的总蛋白,然后通过对跑完限定量的总蛋白后的SDS PAGE凝胶进行密
度测定,来测定木聚糖酶的相对含量。然后,在糖化试验中,测定对于三级筛选中至少一种酶浓度超过wt活性——记录为在560nm(A560)处的吸收——的所有克隆。
[1063] 糖化/鸡尾酒试验:鸡尾酒反应在加盖的10ml玻璃瓶中进行,所述瓶包含两个金属球轴承。反应体积是5ml(200mM柠檬酸钠-1mM叠氮化钠pH 5.5)以及固体为5%(大
小40粒研磨的碱预处理的玉米秸秆)。酶组合物和荷载量是根据上面的表2,只是改变了
家族11内切木聚糖酶。将反应瓶以300rpm震荡下50℃温育36h。应用一组标准品和校正
曲线,通过HPLC(RI检测器,Shodex SP-0810柱,流速为0.5ml/min),测定释放的木糖单体的浓度。
[1064] -Johnston,D.B.;Shoemaker,S.P.;Smith,G.M. 和 Whitaker,J.R.:KineticMeasurement of Cellulase Activity on Insoluble Substrates Using Disodium
2,2’Bicinchoninate.Journal of Food Biochemistry(22)Issue 4pp.301-319,1998
[1065] -Bradford,M.M.(1976)A Rapid and Sensitive Method for the Quantitationof Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.Anal.Biochem.72:248-25
[1066] 尽管参考本发明的某些优选的方面已经对本发明进行了详细的描述,但应当理解的是,修改和变化在所描述和要求保护的精神和范围内。
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