本发明涉及含有适当浓度之乳清蛋白质浓缩物的生物学活性乳清蛋白质组合物，其中乳清蛋白质浓缩物含有以基本上未变性状态存在的蛋白质，且其中乳清蛋白质浓缩物的生物学活性依赖于由其所有蛋白质成分所贡献的总体氨基酸和小肽分布型;本发明还涉及生产所说的乳清蛋白质组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a）挤奶后立即冷却到4℃并除去污物，

b）再次净化后，于起始温度20℃下用乳酸将pH降至大约4.6以沉淀凝乳块，

c）加入凝乳酶并将温度升高至大约30℃，保持20分钟以促进乳清由凝乳中排出，从而能在桶内以低速搅拌使之解析，

d）加热处理桶内保留的产物，进行巴氏灭菌并高速搅拌，

e）照射并分离乳清以及

f）使用截留分子量约为10，000道尔顿的膜超滤乳清。

本发明还涉及所说的乳清蛋白质组合物的各种应用。

在有对照组的实验中，第一次证明喂饲乳清蛋白质的小鼠可特异性地增强对羊红血细胞（SRBC）的免疫反应及对肺炎球菌感染的抵抗力，抑制DMH诱导的结肠癌的发展，并提高不依赖于其营养质量的组织谷胱甘肽（GSH）水平。

本发明显示了乳清蛋白浓缩物（W.P.C）之未变性构象与宿 主免疫增强作用之间的相互关联，从而给出了变性的化学指标，并证明了分子构象（未变性状态）对于提高GSH水平具有同样重要的作用，此为W.P.C.的另一主要生物学活性。

同时证明其他蛋白质源，例如与W.P.C.有同样高半胱氨酸含量的卵清并不能增进GSH合成，从而证明了W.P.C在所述的生物学活性方面的特异性。

未变性的W.P.C的GSH合成促进活性是可以长时间存在的（达3-4个月）。

从远古以来就已将乳清和乳清蛋白质用作营养物质。此外，在民间和古代医学中还使用乳清治疗多种疾病（1，2），其中有一个例子是，证明了终生喂饲乳清蛋白质食物的仓鼠可以长寿，但对其原因没有作出解释（3，4）。

所有这些情况似乎都表明显以某种方式与谷胱甘肽的改变相关联的，而谷胱甘肽是可对过氧化物自由基及其他毒性剂发挥抵御作用的普遍存在的要素。

定义

a）乳清蛋白质：

乳清蛋白质是一组在pH4.6和20℃条件下酪蛋白沉淀后仍溶于“乳清”中的乳蛋白质。牛乳中的乳清蛋白质有：

-乳白蛋白：

α-乳白蛋白的（α-L），占总蛋白质的2-5%，MW：14.2道尔顿×10-3血清的蛋白（SA），占总蛋白质的0.7-1.3%，MW：67道尔顿×10-3;

-乳球蛋白：

β-乳球蛋白（β-L），占总白蛋的7-12%，MW：18.3道尔顿×10-3;优球蛋白，占总蛋白质的0.8-1.7%，MW：180-252道尔顿×10-3;假球蛋白，占总蛋白质的0.6-1.4%，MW：180-289道尔顿×10-3;

免疫球蛋白：占总蛋白质的1.3-2.7%，MW：150-500道尔顿×10-3;

- /胨：占总蛋白质的2-6%;MW：4-20道尔顿×10-3。

工业上由乳清中分离的蛋白质混合物产物称为“乳清蛋白质浓缩物”（WPC）或分离物。MPC中的主要乳清蛋白按含量由高到低分别是β-L、α-L、免疫球蛋白和SA。

b）C＝酪蛋白;

c）SRBC＝羊红血细胞;

d）PFC＝空斑形成细胞（脾）;

根据脾脏中富集的PFC数目来估计对SRBC的体液免疫反应;

e）GSH＝谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸）;

f）DMH＝1，2-二甲肼;

DMH        LHCl＝二盐酸1，2-二甲肼

g）试验用的限定的配制食物中只是蛋白质的类型不同;

h）牛奶乳清每升约含6g蛋白质，其中大部分是乳糖、无机盐和水溶性维生素;

i）WPC＝乳清蛋白质浓缩物;

j）U-Lacp＝未变性的乳清蛋白质浓缩物;

k）D-Lacp＝变性的乳清蛋白质浓缩物（由j）制得的Lacprotan-80，商标为Protein        A.S）。

乳制品被广泛地用作良好的营养源。除了已被人们熟知的外，发酵全乳（酸牛奶）还有益于控制某些类型的肠道感染。还有某些针对特定疾病的饮食摄生法，据说在苏联的某些地区食用天然或发酵乳制品与长寿愿望有关。

远古以来，就知道给病人食用乳清来治疗生理失调。1603年，Baricelli（1）报导了用牛或羊乳清，有时混入蜂蜜或草药治疗疾病。所治疗的病征包括黄疸、皮肤感染、生殖-泌尿道的化脓性感染、淋病、癫癎、三日疟以及不同来源的热病状态。大多数这些病状态。大多数这些病征的一个共同特征似乎是都有脓毒性状况。虽然古代和中世纪的医生都认为用乳清治疗应进行几天以上，但涉及每天的服用量却有不同的看法。为此，Galen、Hippocrates和Dioscoride坚持每天最少两12盎司拉丁磅，根据胃的耐受能力可多达5磅。按照这个量，每天应吃1至2升乳清。另一方面，Baricelli则主张多次服用，用量限制在每天1磅，并根据胃排空情况每次给进。

此后，在17、18和19世纪欧洲发表了许多文章推崇乳清的治疗应用（2）。在19世纪中叶（当时正处在科学医药学的开始阶段）发表的一本意大利教科书中，对全乳和乳清作了有意义的区分。首先推荐用牛奶作为胃肠道狭窄病人的营养物质。在这方面，作者特 别强调只是由于牛奶的营养价值才使病人在对恶病质和结核病的“牛奶治疗”中获得补益。其次，因为推测牛奶能中和摄入的毒性物质而被用来治疗中毒。第三是建议用牛奶治疗溃疡，因为推断这种液体有包被和缓解胃肠道溃疡的能力。另一方面，不考虑其已被认识的较低营养价值，而提倡用乳清治疗肺炎和肠道及泌尿生殖道的急性炎症性疾病。最后作者提出乳清在治疗神经系统功能紊乱上是无效的（14）。

乳清和全乳的主要区别在于前者中几乎没有酪蛋白、酪蛋白结合的钙和磷酸盐、大部分脂肪及脂溶性维生素。“乳清蛋白质”在乳清中的实际浓度通常与在全乳中的浓度相近。由于乳清和全乳之间量上的差异而难于解释所提出的乳清之治疗作用的关键因素之所在，因为此时所能说明的只是乳清中缺乏某些重要的营养成分。

本发明人以前收集的一些资料（5-10）为推测“乳清”的治疗效果提供了科学背景。已显示了乳清蛋白质浓缩物（WPC）的肽分布型中特征性氨基酸在其免疫增强作用中的重要性。酪蛋白占牛乳总蛋白质含量的80%，而WPC只有20%。因此可以相信，将乳清中的WPC同酪蛋白分离开代表了关键性的质变，因为一旦消化过程由所有被摄入的蛋白质中释放出游离氨基酸，乳清蛋白质的氨基酸分布型便不会被酪蛋白的氨基酸分布型所改变。

提高对羊红血细胞的体液免疫反应和对肺炎球菌感染的抵抗力的方法

许多给人留下深刻印象的出版物都是讨论与营养缺乏有关的问题，包括蛋白质能营养不足，以及人和动物宿主的感染等。例如，喂饲蛋白质量不足食物的小鼠，可表现生长迟缓或体重减轻，并增加对 金黄色葡萄球菌的易感性（15）。有些研究涉及营养上相似但不足的食物中蛋白质类型对免疫反应的影响。更具体地是，在整个婴儿期进食以酪蛋白或乳清为主的配制食品可表现有差不多的营养不足（16）。另一方面，许多研究者报导，对低出生体重的新生儿喂以乳清配制食品要比喂以酪蛋白配制食品者氮贮留和生长更快（17）血清蛋白更高（18），且代谢性酸中毒的严重性更小（18、19）。有人报导在用乳清蛋白质喂养期间没有发生腹泻的病例（17-19）。FR-A-2296428明确指出，乳清蛋白质配制食品更易于消化，并在促进营养缺乏、低体重、腹泻婴儿的生长上更为有效，其中提出以下的实验证据：a）中止了一个6月龄婴儿自出生就开始的腹泻，并迅速逆转了“蛋白质热量营养不足”的非特异性征象（第6页，1.5）;b）中止了一个3月龄有抗生素抗性婴儿“肠道感染的复发”（第6页，第15行）;c）实施例1、4和5分别举例说明了在治疗贫血、促进生长和治疗高苯丙氨酸血症中的应用;d）中止了一个一月龄婴儿的腹泻并使其营养不良状态转为正氮平衡（第7页，10）。FR-A-2296428的权利要求5提出用乳清蛋白质“预防和治疗消化性功能紊乱、代谢性疾病、肠道感染及作为化妆品用于皮肤病治疗”。很显然，其中使用的术语“肠道感染”和“腹泻”是互相代用的。FR-A-2296428中没有涉及到免疫系统的问题。没有进行免疫学检测，也没有提出改善肠道或全身免疫力的非具体化的权利要求。没有报告对肠道微生物群的治疗后分析。

ER-A-2296428中没讨论免疫系统，并宣称“增高了对肠道感染的抵抗力”是基于终止腹泻、对此并未能解释成乳清蛋白 质饮食所提供的不依赖于其良好营养价值的特异性免疫增强作用。

虽然FR-A-2296428中没有指明在用含乳清食物喂养之前的营养典型，但很显然婴儿是处于严重营养不良状态的，并且所报告的喂以乳清配制食物后生长状态的改善可能是与血清白蛋白水平增加有关。

事实上，血清前白蛋白是检测早产儿蛋白质和热量不足的一个敏感指标（20）。自从Starling关于液体吸收的早期工作以来就已经认识到低白蛋白血症对肠道液体吸收及腹泻的影响（21，22）。除了这种高渗透型腹泻外，营养不良特别是蛋白质营养不良还可引起肠粘膜萎缩，因为肠上皮细胞主要是由腔内营养素提供营养的（23）。营养不良肯定会引起肠粘蛋白的降低（24）。损伤了保留粘膜粘蛋白含量和屏障作用之能力，被认为是降低对肠内感染（24）和胰蛋白酶（25，26）的抗性而引起腹泻的一个原因。

最后，还有如WO87/04050中所指出的这样一种可能性即新生哺乳动物的肠粘膜可以暂时地透过来自母乳的完整免疫球蛋白，但这方面的问题与本研究无关。所说的文献报导了一种由乳清中浓缩含免疫学活性（抗原结合活性）免疫球蛋白〔Ig〕之产品的方法，当其以占总固体物之7%的很高浓度喂养新生小牛时，根据小牛血Ig水平及对感染之抵抗力的增加，证明其在相当程度上转移了天然被动免疫力。WO87/04050号专利中所述的这种被动免疫力的暂时提高与引发动物的活性免疫系统有关，但该专利并没有证明被动免疫力与活性免疫力的发展间的因果关系。

传统医学与有关的几项研究表明，乳杆菌构成了肠道微生物的一个优势菌属，而且在肠内保留足够量的乳杆菌群可使致腐微生物的有 害影响减至最小（27）。基于这一考虑，人们便开始注意到乳杆菌和用乳酸菌发酵制得的乳制品对各种胃肠道疾病的治疗作用。此外，近年的研究表明，给小鼠饮用经干酸乳杆菌（Lactobacilluscasei）和嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）发酵的牛奶，可提高其对SRBC的全身性免疫反应。作者将这种免疫反应力的提高归因于发酵过程中由这些微生物所产生的某些物质，如某些代谢产物和酪蛋白肽，细菌酶和/或乳杆菌细胞壁内含有的物质（28）。在该动物实验模型中，不可能将细菌和乳品成分的相对作用区分开。

食物中乳清蛋白质浓缩物之免疫增强作用的机制

过去几年里，一直在试图弄清那些由可能直接或间接影响体液免疫反应性的食物蛋白类型引起的改变。在未用免疫原性刺激物攻击的小鼠中，发现食物中蛋白质的类型对检测各个参数有很小或完全没有影响。体重、食物消耗量、血清蛋白质、无机盐和微量金属元素、循环白细胞，特别是骨髓B淋巴细胞的产生均在正常范围之内（5-9）。

对进食乳清蛋白质导致免疫增强之可能机理的研究，向我们揭示了这样一种会有争论的可能性，即乳清蛋白质浓缩物可能贡献具有防御性的较广泛的生物学效应，如对肿瘤的易感性和对环境因子的一般性解毒作用。本研究表明，已观察到的免疫反应的提高与喂饲乳清蛋白质浓缩物的免疫小鼠比喂饲酪蛋白、富半胱氨酸酪蛋白或卵清蛋白质（均有相似食物浓度）的小鼠产生更多脾脏谷胺甘肽有关。食物半胱氨酸当在乳清蛋白质中被输送时，其在诱导超正常谷胺甘肽水平中的效力要比其作为游离氨基酸或存在于卵清蛋白质内的效力更大。与喂饲相应的酪蛋白食物即卵清蛋白质或Purina        Moust        Chow 的小鼠相比，发现喂饲乳清蛋白质的老年小鼠心和肝中谷胱甘肽水平更高些。

增加组织谷胱甘肽的方法

谷胱甘肽是一种有着许多重要功能的、普通存在的三肽硫醇（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸），这些重要功能包括外源生物质的解毒及保护细胞免遭氧中间体和自由基等需氧代谢付产物的损伤（31）。调整细胞内谷胱甘肽将影响到可被氧化性损伤抑制的淋巴细胞增殖性免疫反应（32）。谷胱甘肽使细胞免受辐射及烷基化剂的损伤。年龄相关或实验诱发的晶状体内谷胱甘肽减少与白内障形成有关（33）。氧化性DNA损伤可得以迅速而有效地修复。人体能够不间断地修复被氧化的DNA。小部分未修复的损伤可引起DNA的持久性改变，并可能是引起老年病及肿瘤的一个主要因素（34）事实上，有几种年龄相关的疾病可能是由自由基诱发的。基于对实验动物（36）和人体（37）的研究，较一致地报导组织谷胱甘肽水平随年龄增长而降低，反之，有关组织中维生素E及其他抗氧剂的年龄相关性改变的资料则常常是互相矛盾的（35）。

基于这些原因，已对影响细胞内谷胱甘肽合成的因素，特别是增加细胞谷胱甘肽水平的途径产生了很大兴趣。

谷胱甘肽由三种氨基酸组成：谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸的可用性是谷胱甘肽合成中的一个限制因素（38）。半胱氨酸可得自食物蛋白质并在肝脏中经转硫作用由蛋氨酸衍生而成。为了提高细胞的谷胱甘肽水平已尝试了多种方法。因为半胱氨酸会很快被氧化，有毒性并可真正引起谷胱甘肽减少，所以服用游离半胱氨酸并不是一种理想的方法（39）。给大鼠腹腔内注射N-乙酰基半胱氨酸 也产生了相似的问题，不过口服这种化合物显示可防止4-乙酰氨基酚诱发的谷胱甘肽损耗（39）。给予被输送并在细胞内被转化为半胱氨酸的化合物，如起到细胞内半胱氨酸输送系统作用的L-Z-氧噻唑烷-4-羟酸酯，对于增加细胞内谷胱甘肽是有用的（40）。注射后4小时肝谷胱甘肽增加一倍，8小时后转为正常水平，但16小时后则低于正常值（40）。为增加组织谷胱甘肽水平所作的另一次研究发现，给小鼠皮下注射γ-谷氨酰半胱氨酸（胱氨酸），40-60分钟后肾中谷胱甘肽约增加55%，但2小时后又转而接近对照值（41）。所给予的化合物被完整地输送并用作谷胱甘肽合成酶的底物。还有人报导，在给小鼠腹腔注射γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酰-甲基（或乙基）酯后约2小时，小鼠肝和肾谷胱甘肽水平增加一倍，而8小时后又回到正常水平。Meister给小鼠注射谷胱甘肽的～烷基酯使组织谷胱甘肽水平获得相似的增加（US-A-4，784，685）。这种酯被输送到组织细胞内并在细胞中去酯化，从而导致细胞谷胱甘肽水平的增加。用这种方法达到的组织谷胱甘肽渐增的动力学是与腹腔注射谷胱甘肽的甲基或乙基酯后的动力学改变相似的。在急性实验中已清楚地证明了这些方法的有效性（US-A-4，784，685）;在用L-2-氧噻唑烷-4-羧酸酯处理的小鼠中，注射乙酰氨基苯后并没有出现预料的组织谷胱甘肽水平降低，而是代之以组织谷胱甘肽水平和存活率的实际增加。提高组织谷胱甘肽水平的其他方法均建立在使用马来酸二乙酯或BSO耗尽后，再使谷胱甘肽浓度出现“过调节”（“Overshoot”）之基础上的。这些研究是在体外用小鼠细胞系做的。还发现使大鼠预先暴露于缺氧环境可增加肺谷胱甘肽水平。

给予谷胱甘肽本身对提高组织谷胱甘肽水平几乎没有作用，因为它显然不能被完整地输送穿过细胞膜。

由于存在与谷胱甘肽损耗的初始期有关的危险，所以上述某些增加细胞内谷胱甘肽浓度水平的方法是有毒害或有危险性的。这些包括使用γ-谷氨酰半胱氨酸（胱氨酸）、噻唑烷或谷胱甘肽酯（US-A-4，784，685）在内的方法为进行短期调整提供了一种有益的可能性。但迄今尚没有展示它们在造成持久性细胞谷胱甘肽增高中的长期效力，也没有证明它们不存在可能的长期毒性。在最常使用的短期致癌性和致突变性试验中，确实发现谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物是有积极治疗效果的。与我们的研究相关的是，最近的资料表明缺乏GSH前体即半胱氨酸而不是生物合成酶活性的降低，才是老年动物体内GSH含量不足的原因（43）。相似地，长期喂饲乙醇的大鼠肝细胞浆中GSH降低似乎并不是由于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性受到限制而引起的（44）。

抑制化学诱导的结肠癌生长的方法

已发现食物蛋白质缺乏可降低原发（46）或转移（46、47）瘤的发生率。大多数涉及蛋白质与肿瘤的确定的研究工作都利用了蛋白质食物供应不足这一实验手段。虽然有些证据表明蛋白质摄入量越多，肿瘤发病率越高（48，49），但有关提高蛋白质摄入量对肿瘤发生和发展之影响的资料是不明确的（50）。研究的焦点已集中在蛋白质的量及其氨基酸供应而不是蛋白质来源上（50）。只有很少有关在营养充分且相似的食物中蛋白质类型对肿瘤发展之影响的几个数据可以利用。我们的发明具体涉及营养上足够的食物中未变性食物牛乳清蛋白质浓缩物对DMH诱导的小鼠结肠癌之发展的影 响。

Jacquet等人（51）报导，对移植了T8上皮癌细胞的大鼠喂饲牛乳，可使其肿瘤生长平均减缓0.4倍。这一研究结果与某些流行病学调查的结果是一致的，即流行病学研究显示食用牛奶或乳制品可以减小肿瘤的危险（52，53）。接种艾氏腹水瘤细胞小鼠喂饲酸牛奶可使其肿瘤细胞的数目减少0.2-0.28倍（54）。还有人报导，喂饲牛乳蛋白质配制食物的小鼠在皮下注射DMH诱导的结肠癌细胞后，与喂饲其他类型蛋白质的小鼠相比较，表现肿瘤体积抑制了0.2至0.7倍（55）。给喂饲牛乳蛋白质的小鼠皮下注射疮疹病毒转化的细胞，结果记录到相近程度的肿瘤生长抑制作用（56）。但同一研究小组在几个月后提交的另一篇文章中提到：所得结果“与我们以前的发现有所不同”。在注射DMH的同种小鼠，喂饲半乳蛋白质并没有抑制肿瘤生长（57）。尽管保留了良好的营养质量，但食物牛乳蛋白质没有呈现以前所报导的抗肿瘤生物学性质（57）。作者对这种明显抵触的结果没有作进一步的解释。

最近发现，各种类型的干酪和酸乳抑制几种实验性小鼠肿瘤生长的程度，与喂食的时间长短成正比。根据肿瘤的类型，肿瘤减小了0.17至0.70倍不等（58）。

就所涉及的损伤类型及对化学治疗的反应特征来说，DMH诱发的结肠癌似乎与见于人体的结肠癌很相似（59，60）。

牛乳中大约80%的蛋白质是酪蛋白，其余20%是乳清蛋白质（61，62）。此外，使用传统方法制备酪蛋白，与酪蛋白共沉降的乳清蛋白质量约占牛乳中乳清蛋白质总量的40～60%（63）因此可以想到，使用酪蛋白时见到的较小的抗肿瘤效果可能是由于与 之共沉降的相对小量的乳清蛋白质造成的。

英国专利GB-A-1495940号（Willadsen）证明了一个牛源乳清蛋白质组分在小鼠体内的抗白血病作用。实验中，接种白血病细胞的小鼠，腹腔内注射其量估计约为每天0.04mg/蛋白质的试验材料（6000-20，000摩尔重量，此代表总乳清蛋白质的60%左右），共注射9天。

GB-A-1495940中所用的“对照”抗肿瘤无效蛋白质只是小于6，000摩尔重量或大于20，000摩尔重量的乳清组分，即血清白蛋白（66，000摩尔重量）和免疫球蛋白（153，000至1000，000）。大多数变应原性蛋白质分子量都在15，000至40，000道尔顿之间。牛乳中的主要变应原是β-乳球蛋白（MW        18，300）（64）。因此，显示有这种抗白血病作用的乳清蛋白质组分（摩尔重量20，000-6，000）应包括有β-乳球蛋白。完全可以想到，GB-A-1495940中所述的抗肿瘤效果是由于外来蛋白质抗原性刺激作用所引发的免疫调节所致。

发现人乳清蛋白质成分，乳铁传递蛋白，在体外依据培养条件的不同可对人结肠腺癌细胞系的生长发挥轻度抑制作用或刺激作用（65）。这种特殊蛋白质存在于人乳中，牛乳清中则完全没有或只有很微量。

乳品加工和乳清制备

牛乳挤出后立即冷却至4℃并保留在冷却罐内运到干酪加工厂。在初始温度20℃下用乳酸将pH降低到4.6左右，得到凝乳的沉淀。加入凝乳酶（一般每1000磅牛乳加3盎司）后，升温到 30℃并保持20分钟，以促进乳清从凝乳中排出，便于在大桶内低速搅拌以解析。

得到足够量的乳清后，用标准方式对留在桶内的产物进行巴氏灭菌以破坏细菌并高速搅拌以生产干酪。然后用γ幅射源照射乳清。根据乳清中细菌量不同，照射剂量一般为5至15KGy，以达到与标准巴氏灭菌法相同的灭菌效果，同时尽可能地减少蛋白质变性机会（根据可溶性蛋白质量的变化，即处理前后乳清中的蛋白质浓度来检测）。

因此，本发明的目的是提供一种具有特异生物学活性的乳清蛋白质组合物，所说的活性与该蛋白质的已知营养质量无关，并且将不受依赖于特定遗传或内分泌影响，以提高细胞谷胱甘肽含量、对羊红血细胞的体液免疫反应（PFC）、对肺炎球菌感染的抵抗力、对二甲基肼诱发之结肠癌的抗性，以及延长老年病患者的寿命。

本发明的一个目的是提供一种能用作人或动物营养物的乳清蛋白质组合物，如用作预防和/或治疗目的的代用品或添加剂。

本发明的另一个目的是提供一种通过超滤制备未变性WPC的方法。

本发明的另一个目的是提供一种通过口服含在牛源未变性乳清蛋白质浓缩物中的半胱氨酸前体，以提高细胞内谷胱甘肽水平的途径。给予相似量的游离半胱氨酸是无效的。另一方面，具有同样高半胱氨酸含量的同等量其他蛋白质如卵清，也不能有效地提高组织谷胱甘肽水平。因此，以其未变性形式（即其中半胱氨酸的位置与蛋白质的一级、二级和三级结构相关联）存在的特定的乳清蛋白质浓缩物物理-化学组合物，似乎是半胱氨酸作为细胞内合成甘胱甘肽前体物之生物 可利用性的一个关键性因素。

本发明的另一个目的是提供一种在不接触与使用其他已知方法有关之毒性物质的条件下增加细胞谷胱甘肽水平的方法：已经证明，小鼠、仓鼠和人长期摄入牛乳清蛋白质浓缩物是没有毒性的。

本发明的另一个目的是提供一个为了任何目的的组织谷胱甘肽的持久性升高，这些目的是现有技术中期望得到的预防性细胞谷胱甘肽水平的长期升高，如使细胞免遭自由基、外来有害化合物、药物解毒作用、幅射、免疫缺陷状态等的伤害。

这些问题可通过给予含有适当浓度乳清蛋白质浓缩物的乳清蛋白质组合物得以解决，其中乳清蛋白质浓缩物含有以基本上未变性状态存在的蛋白质，且其中乳清蛋白质浓缩物的生物学活性依赖于由其所有蛋白质成分贡献的总体氨基酸和小肽分布型。

值得特别说明的是，这里WPC是指牛和/或羊和/或人乳清蛋白质浓缩物。

根据本发明，其中提供了一种生产乳清蛋白质浓缩物组合物的方法，该方法包括下列步骤：

a）挤奶后立即将奶冷却到4℃并除去其中的污物，

b）再次净化后，于初始温度20℃下用乳酸将乳液的pH降至4.6左右，以沉淀凝乳，

c）加入凝乳酶并提高温度达大约30℃，保持20分钟以促进乳清由凝乳块中排出，便于在桶内低速搅拌以解析，

d）加热处理桶内保留的产物，进行巴氏灭菌并高速搅拌，

e）照射并分离乳清，以及

f）使用截留分子量约为10，000道尔顿的膜超滤乳清。

该方法的特征在于，被用于继后生产乳清蛋白质浓缩物的乳清部分未被加热，且由其中得到该部分的材料被缓慢搅拌以尽可能减少蛋白变性，且所说的超滤是在包括支撑许多所说膜的达到20个框架式铸模的生产线中进行的，从而得到一种最终未变性的蛋白质浓缩物干燥制品。

根据本发明乳清蛋白质组合物的应用如下：

1）以适当浓度作为乳或乳制品之代用品;

2）在适用于有乳糖吸收障碍之病人的产品中作为代用品;

3）作为乳制品，人或动物营养品之代用品或添加剂;

4）作为药物;

5）给人或动物口服治疗或预防上有效量的乳清蛋白质组合物以提高人或动物血管中谷胱甘肽合成速率，更新速率和/或浓度水平;

6）给人或动物口服治疗或预防上有效量的乳清蛋白质组合物以改善人和动物宿主的抵抗力;

7）作为抗肿瘤治疗组合物用于预防结肠癌。

我们的研究

几年前所作的观察增进了我们对氨基酸摄入对免疫系统的影响这一课题的兴趣。第一组小鼠饲以含复制酪蛋白之游离氨基酸混合物的特定配制食物;另一组小鼠则饲以适当限制苯丙氨酸及酪氨酸的相似食物，其中不足部分由非必需氨基酸混合物中的相应增量来补偿。第二组小鼠体重以与饲以酪蛋白等价混合物或Purina小鼠食物的小鼠同样的速率增长。但当用羊红血细胞攻击时，这些小鼠比用Purina或酪蛋白等价物喂养的小鼠产生了更多的抗羊红血细胞抗体和空斑形成细胞。

于是便提出了一个新的概念，即食物中氨基酸分布型的改变可影响不依赖于对宿主营养状态之任何全身性作用的免疫反应。但更重要的是，氨基酸分布型即蛋白质类型的改变显然可以提高体液免疫反应，使之高于通常认为的“正常”反应水平。

估价了营养上充分并且相似的食物中不同蛋白质类型对免疫反应的影响。发现喂饲含20%或28%乳清蛋白质胰酶水解产物（LAD，Nestle）之配制食物的小鼠比喂饲约含22%不同来源且有相似营养效力蛋白质之Purina小鼠食物的小鼠产生了更多抗羊红血细胞的空斑形成细胞。LAD浓度为20%时。免疫增强效果最大。

在估价蛋白质类型对免疫反应的影响时，每100g食物中含20g蛋白质（净重）最为适宜。就这个水平来说，大多数蛋白质可为小鼠生长提供每天最小需要量的必需氨基酸（11-13）。这一浓度是很重要的，因为在研究条件下该氨基酸必需量是不可变的。

在继后的研究中，对食物乳清蛋白质浓缩物（WPC）的作用和有相似营养效力之配制食物中其他纯化蛋白质的作用进行了比较。通过检测对羊红血细胞（SRBC）和马红血细胞（HRBC）的特异性体液免疫反应，研究了不等量食物WPC、酪蛋白（C）、大豆（S）、小麦（W）蛋白质和Purina鼠食物（储存食物）对C3H/HeN小鼠的免疫反应性的影响。这些食物的营养效力都是正常并相似的。结果发现饲以WPC食物之小鼠的免疫反应差不多比饲以相应C食物之小鼠的免疫反应高5倍。饲以C.S和W食物之小鼠的体液免疫反应实质上低于饲以储存食物者，而饲以L（WPC）之小鼠的免疫反应性更高些。上述所有被试蛋白质的免疫效果都是以 每100g饮食20g蛋白质的浓度获得的，而没有进一步将该浓度提高到100g饮食30和40g蛋白质。

因为试验中只用乳清蛋白质浓缩物与有限数目的其他蛋白质相比较，所以从绝对意义上说，我们当时不能确定在5个饲以乳清蛋白质饮食的无关品系小鼠中观察到的体液免疫反应增强作用是由于喂饲乳清蛋白质所引起的真正的免疫增强作用，还是因喂饲其他被试食物蛋白质引起的免疫抑制。

回顾过去的研究工作便可以说明，用作乳清蛋白质混合物之“对照”的这少数几种纯化的食物蛋白质（酪蛋白、大豆和小麦蛋白质），与继后试验的所有其他纯化的食物蛋白质比较，它们确实是免疫抑制性的，尽管在20%浓度下营养上是足够并且相似的。

事实上，后来又对乳清蛋白质和市场上最常见的纯化的食物蛋白质（酪蛋白、大豆、小麦、玉米、卵清、牛肉、鱼蛋白质、γ球蛋白β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、极大螺旋藻（Spirulina        maxima）或栅列藻（scenedesmus        alqae）蛋白质）作了比较试验，发现喂饲乳清蛋白质浓缩物的小鼠对外来抗原（SRBC）表现有最高的免疫反应性（图1）。这些蛋白质在20%浓度下营养上都是足够并且相似的。

总之，可以认为我们新发现的乳清蛋白质浓缩物的免疫增强生物学活性与这种蛋白质的已知营养品质无关，而所说的营养品质主要是基于蛋白质的可消化性和氨基酸含量。事实上，用于我们的实验中的乳清蛋白质浓缩物，在浓度为每100g饮食含20g蛋白质时与其他被试蛋白质的营养品质是相似的。

材料和方法

适用的乳清蛋白质浓缩物来源是商标为PROMOD的已知材料，其为一种由Ross        Laboratories公司（a        Division        of        Abbott        Laboratories，U.S.A）提供的蛋白质添加剂。这种浓缩的高质量蛋白质源可用于为需要增加蛋白质摄入的人提供额外蛋白质，或为以其正常饮食不能够适应其蛋白质需要量人提供蛋白质。其含有乳清蛋白质浓缩物及大豆卵磷脂并具有下列营养素：

营养素        每5g蛋白质（1匙）中含量

蛋白质        5.0g

脂肪        不超过0.60g

碳水化合物        不超过0.67g

水        不超过0.60g

钙        不超过23mg（1.15mEq）

钠        不超过13mg（0.57mEq）

钾        不超过65mg（1.66mEq）

磷        不超过22mg

卡        28

每100g蛋白质的典型氨基酸组成如下所示。100g        PROMOD蛋白质约产生105g氨基酸。

每100g蛋白质的典型氨基酸组成

必需氨基酸        非必需氨基酸

组氨酸1.9g        丙氨酸5.3g

异亮氨酸6.2g        精氨酸2.6g

亮氨酸10.8g        天冬氨酸11.2g

赖氨酸9.3g        半胱氨酸2.6g

蛋氨酸2.2g        谷氨酸18.2g

苯丙氨酸3.6g        甘氨酸2.1g

苏氨酸7.3g        脯氨酸6.5g

色氨酸1.9g        丝氨酸5.6g

缬氨酸6.0g        酪氨酸3.4g

用于我们的研究中的食物

可按下述配方制备：20g选择的纯蛋白质，56g含玉米糖浆、玉米油、木薯淀粉、维生素和无机盐的无蛋白质食物粉末（80056产品）（Mead-Johnson有限公司，U.S.A.），18g玉米淀粉，2g麦麸，0.05g        Nutramigen维生素-铁预混物（Bristol-Myers，Ontario，Canada），2.65g        KCl，0.84g        NaCl。我们的配制食物中的碳水化合物和脂类成分是相同的。在各种纯化的食物中只有蛋白质的类型是可变的（20g蛋白质/100g食物）。按照这个浓度，饮食中的所有不同的被试蛋白质均可提供小鼠生长所必需的基本氨基酸量（11）。各组实验中用的维生素和无机盐均相同，并以小鼠生长所必需的每日需要量加入（5-8，13）。表1中指出了小鼠饮食中建议的维生素需要量的可变值及其在某些配方中的含量。因此，用于我们实验中的配制食物均可提供足够的营养素，此可根据小鼠的正常体重增加、血清蛋白质含量（5-9），以及没有脱毛、皮炎、白内障、共济失调和脂肪肝等得以证明。当然，后面这些病症只见于很老的小鼠并且是与年龄老化有关的。

动物

为得自Jackson        Laboratories（Bar        Harbor，Maine）的7周龄雄性C3H/He〕小鼠。

免疫步骤

用5×106个每周从Institut Armand-Frappier Laval des Rapides，Quebec，Canada取得的羊红血细胞经静脉内注射免疫饲以试验食物的小鼠。

空斑形成细胞（PFC）检测法

用稍加改动的Cunningham和Szenberg（67）的方法检测IgM空斑形成细胞。通过50目不锈钢筛轻轻挤压脾组织以制备脾细胞悬液，并在添加10%热灭活牛血清（Grand Island Biological Company，Montreal，Quebec，Canada）的平衡盐溶液（BSS）中收集细胞。用BSS洗脾细胞并加BSS至15ml。将羊红血细胞洗两次并调整细胞悬液浓度至20%。用BSS按1/15稀释豚鼠血清（Grand Island Bilogical Company，Montreal，Quebec，Canada），作为补体来源。所有储备液均放置在冰水浴中备中。37℃下在试管内混合0.05ml脾细胞、0.15ml羊红血细胞和0.75ml补体溶液。立即抽出全部混合物并加入载玻片小室内，用液体石蜡密封并于37℃保温45至60分钟。计数空斑形成细胞的数目并将每个脾（0.05ml脾细胞悬液）中空斑形成细胞的数目乘以300以估算每个脾的PFC总数。数值代表每个脾总体而不是106个脾细胞，因为这样才能更准确地反映脾脏本身的功能状态。

免疫后第5天当反应达到峰值时，检测小鼠对羊红血细胞反应所产生的空斑形成细胞，或者于免疫后第3、4、5和6天检测以进行动力学研究。

统计学处理

当在两组间进行比较时，可使用Student试验来比较不同饮食组的平均空斑形成细胞数值，如有两组以上则作方差分析（ANOVA）因为存在组间方差的不均一性，故须使用Brown和Forsythe方法校正。

脾谷胱甘肽含量

使用Mettler        PM-300天平称取90mg小鼠脾组织，并保持各90mg样品差值不超过5mg（5%）。然后在5-磺基水杨酸（5%w/v）中制备脾组织匀浆。匀浆液在微量离心管中以10，000×g离心5分钟。在同一天按照Anderson的方法（42）检测上清液中GSH含量。结果用每克湿组织中GSH的微摩尔（μmol）数表示。

丁硫堇硫氧亚胺（buthionine        sulfoximine）实验某些实验中，在喂饲乳清蛋白质3周后用羊红血细胞免疫的前一天，给小鼠腹腔内注射450mg用作γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶之特异性抑制物的丁硫堇硫氧亚胺（BSO）（S-〔正丁基〕同型半胱氨酸硫氧亚胺）/Kg体重。同时在饮水中加进20μm        BSO。

组织谷胱甘肽检测法

在5-磺基水杨酸（5%W/V）中匀浆处理90毫克小鼠心或肝脏。匀浆液于微量离心管中以10，000×g离心5分钟。在同 一天用Anderson方法（42）检测上清液GSH含量。数值用μmol数/克湿组织表示（图6、8和9）。

以下参照附图对本发明作进一步的描述，其中：

图1和2显示用SRBC免疫后PFC产生呈现峰值时每只脾的空斑形成细胞（PFC）数。

图3显示各种来源的乳清蛋白质浓缩物和酪蛋白对脾PFC反应的影响。

图4显示热变性对WPC之免疫增强效应的抑制作用。

图5显示用SRBC免疫U-Lacp喂饲的小鼠后，其对SRBC的脾细胞免疫反应增强。

U-Lacp：未变性的乳清蛋白质浓缩物

D-Lacp：变性的乳清蛋白质浓缩物

“Danmark        Protein”生产的

Lacprcdan-80

U-Lacp＞D-Lacp，酪蛋白，酪蛋白+Cys，卵清蛋白：P＝0.0004

图6显示被免疫小鼠的脾谷胱甘肽水平，结果用喂以相应食物之未免疫小鼠数值的百分率表示。

＊未免疫的小鼠用4种食物喂饲3周，脾谷胱甘肽或身体生长无组间差异

＊＊饮食治疗3周后免疫：身体生长和血清蛋白无组间差异

＊＊＊U-Lacp：未变性的乳清蛋白质浓缩物

D-Lacp：变性的乳清蛋白质浓缩物

“Danmark        Protein”生产的

Lacprodan-80

免疫后第2、3、4和6天，喂饲U-Lacp的小鼠脾谷胱甘肽水平分别为13%（p＜0.01）、8%（p＜0.02）、21%（p＜0.01）和20%（p＜0.01），此高于喂饲D-Lacp之小鼠的相应值，即分别为12%（p＜0.01）、7%（p＜0.05）、20%（p＜0.001）和20%（p＜0.001），此又高于喂饲酪蛋白之小鼠的相应值，即分别是4%（N.S）、10%（p＜0.02）、21%（p＜0.001）和19%（p＜0.01），此又高于喂饲卵清蛋白质之小鼠的相应值。

图7显示给予BSO后对喂饲乳清蛋白质小鼠的影响。

图7给出了用106个羊红血细胞（SRBS）免疫后第5天显示空斑形成细胞产生之峰值的空斑形成细胞/脾（PFC）数值。用20gU-Lacp+丁硫堇硫氧亚胺（BSO）或酪蛋白（C）/100g食物进行饮食治疗3周后的效果。各数值均代表均数±标准差（n＝10）：U-Lacp+BSO或酪蛋白：p＜0.005右：用5×106个羊红血细胞（SRBC）免疫后第4天显示谷胱甘肽（GSH）之峰值的脾GSH含量。用20g U-Lacp+BSO或酪蛋白（C）/100g食物进行饮食治疗3周后的效果。各数值均代表均数±标准差（n＝10）。U-Lacp对U-Lacp+BSO或酪蛋白：p＜0.0005。U-Lacp＝未变性的乳清蛋白质浓缩物（Lacprodan-80）。

图8显9显示给雄性小鼠C57BL/6N1A长期喂饲后的肝 和心脏谷胱甘肽水平。

各数值均代表平均值±标准差（n＝10）

U-LACP：未变性的乳清蛋白质浓缩物

D-LACP：变性的乳清蛋白质浓缩物

食物消耗量、体重和血清蛋白无组间差异

图8中，U-LACP＞Purina，酪蛋白，卵清：

ANOVA（Sheffe试验）分析P＜0.05

U-LACP＞D-LACP：ANOVA（Sheffe

试验）分析P＜0.01

图9中，U-LACP＞酪蛋白，卵清：ANOVA（Sheffe试

验）分析P＜0.05

U-LACP＞D-LACP，Purina：ANOVA（Sheffe试验）分析P＜0.01

图10显示喂饲Purina、酪蛋白及乳清蛋白质之小鼠的存活率曲线。

图11显示经26天饮食治疗后对SRBC免疫之小鼠PFC反应的影响。

图1显示在用106个SRBC免疫后PFC产生出现峰值时每只脾的空斑形成细胞（PFC）数。其中显示了用每100g中分别含20g乳白蛋白（L）即乳清蛋白质浓缩物、酪蛋白（C）、巨大螺旋藻蛋白质（Sp）、大豆蛋白质（S）、小麦蛋白质（W）、栅列藻蛋白质（Sc）、玉米蛋白质（CO）、卵清蛋白质（E）、牛肉蛋白质（B）、鱼蛋白质（F）、Purina Mouse Chow（P），或100g中含20g 50%L+50%S（L/S）或 80%L+20%C，或20%L+80%C（L/C）之混合物的食物进行饮食治疗2周后产生的影响。各数值均用均值±标准差（SD）表示。

如图1所示，喂饲两周乳白蛋白（WPC）的小鼠对羊红血细胞的空斑形成细胞反应比喂饲其他类型蛋白质或Purina小鼠食物者高。喂饲乳白蛋白小鼠在静脉注射5×106个羊红血细胞后第5天，平均每只脾的空斑形成细胞数目分别为喂饲酪蛋白、螺旋藻、大豆蛋白质、小麦蛋白质、栅列藻、玉米蛋白质、卵清白蛋白、牛肉或鱼蛋白质饮食之小鼠的487%、494%、736%、927%、309%、284%、230%、214%和177%，并且是喂饲Purina小鼠的168%。这些差异在统计学上均特别显著（p＝0.0004）。喂饲Purina小鼠每只脾的空斑形成细胞数是喂饲玉米蛋白质小鼠的170%（p＝0.0005），而后一组的数值又是喂饲酪蛋白小鼠的171%（p＝0.0005）。喂饲鱼蛋白质、牛肉蛋白质和Purina的各组间没有显著差异。

在大豆蛋白质或酪蛋白中加入乳白蛋白（WPC）可使宿主的体液免疫反应性显著增加。喂饲大豆蛋白质和乳白蛋白50∶50混合物比喂饲纯大豆蛋白质者免疫反应性增加4倍。喂饲酪蛋白和乳白蛋白的80∶20混合物比喂饲纯酪蛋白饮食者免疫反应性高3倍，而喂饲上述同种蛋白质的20∶80混合物与喂饲纯酪蛋白饮食者高2倍。

总之，喂乳白蛋白饮食至少2周的小鼠，与喂其他有相似营养效力之多数可食商品动植物蛋白质食物者，可表现对羊红血细胞体液免疫反应力的持久性提高。只要饮食治疗继续进行，这种作用就保持 （已试验了多达2个月）。可以看出，喂饲不同纯化蛋白质饮食（蛋白质浓度为20g%）的各组小鼠，虽然对SRBC的免疫反应有很大差异，但其食物消耗、最后的体重及血清蛋白质含量并没有变化（见表2）。

图2显示用106个SRBC免疫后，当PFC的产生出现峰值时每只脾的空斑形成细胞（PFC）数。其中显示了用每100g食物20g乳清蛋白质浓缩物（WPC）、酪蛋白（C）、乳清蛋白质浓缩物水解产物、酪蛋白水解产物、β-乳球蛋白（βL）、α-乳球蛋白（αL）、γ-球蛋白（γG）或牛血清白蛋白（SA）进行3周饮食治疗后产生的影响。各数值均用均数±SD表示。当给予蛋白质水解产物时，喂饲乳清蛋白质饮食的小鼠中空斑形成细胞反应是喂饲酪蛋白小鼠的504%（p＝0.0004）（图2）。当给予游离氨基酸混合物时，喂饲乳清蛋白质氨基酸饮食的小鼠中空斑形成细胞反应是喂饲蛋白质氨基酸小鼠的332%（p＝0.0001）（图2）。我们的研究（图2）表明，饲以含乳清蛋白质四种主要成分中任何一种（βL、αL、γG、SA）（20g/100g）之食物的小鼠所产生的抗羊红血细胞空斑形成细胞反应，均不如饲以含20g乳清蛋白质/100g之食物小鼠的PFC反应强（P＝0.0002）。

导致食物中乳清蛋白质浓缩物之免疫增强作用的因素

a）乳清蛋白质混合物

这项研究表明，当用胰酶水解产物（20%游离氨基酸和80%分子量小于1000的寡肽）取代WPC和C时，与C比较WPC的免疫增强作用仍得以维持（图2）。这些结果还表明，饲以含WPC 混合物之四种主要蛋白质成分之一的食物，小鼠所产生的抗SRBC空斑形成细胞反应低于饲以相应乳清蛋白质混合物小鼠的PFC反应。因此可以认为，所观察到的WPC的免疫增强作用依赖于其所有蛋白质成分的贡献。基于这些理由，可以推测这种现象与对乳蛋白质的变态反应性或口服免疫的某些其他表现形式无关。

（b）乳清蛋白质浓缩物的未变性构象

最近观察的结果向我们揭示，所述的乳清蛋白质浓缩物的生物学活性与其营养品质无关，而实际上是取决于蛋白质的未变性构象。这一发现是偶然得到的，当时供应厂商给我们送来的一批乳清蛋白质浓缩物，使用后没有显示出以前所述的免疫增强作用，而其营养效力还是一样的。经过分析发现，这种制品的水溶性较差，而且有变性（D-Lacp）的全部特征性间接迹象，确实与以前表现有很强生物学活性的未变性乳清蛋白质（U-Lacp）样品有很大不同。图3所示的数据表明了乳清蛋白质浓缩物的变性程度与宿主PFC免疫反应之间的相互关系。表3进一步表明蛋白质的营养效力与变性作用无关。在天然状态下乳清蛋白质具有特定的构象，而当暴露在高于某临界水平的热环境中时这种天然构象就要被破坏。与酪蛋白相反，乳清蛋白质受热很容易变性。乳清蛋白质变性可导致其球形结构伸展而形成随机的螺旋构象。除加热外，其他加工处理如抽吸、混合、通气、真空蒸发和干燥可进一步促进变性。

在本发明的研究中，用下述方法估测乳清蛋白质浓缩物变性：

溶解度测定：将3%蛋白质溶液室温下分散于蒸馏水中（有时要调整pH），搅拌该溶液然后以40，000×g离心20分钟。用Lowry方法测定上清中的蛋白质含量。作为从上清部分回收的总蛋 白质的一部分计算百分溶解度。

透光度：用蒸馏水将原3%蛋白质溶液稀释到0.15%。混合后直接用分光光度计于750nm处测定空白（蒸馏水）和样品的透光度。

由图3可以看出，饮食中乳清蛋白质浓缩物的未变性状态与对SSRBC体液免疫反应的强度之间存在着正的相互关联。免疫反应的水平与乳清蛋白质浓缩物的营养效力无关，而与其未变性构象有关。因此，这种不依赖于乳清蛋白质浓缩物的生物学活性（免疫增强作用）进一步证实了我们前面所作短期实验（图1和2，表2）的结果。另外，通过加热使乳清蛋白质浓缩物（Promod）部分变性还进一步证实了热变性对免疫增强活性的抑制作用。如此处理使食物在不改变其营养效力的情况下显著地降低了其免疫增强特性（图4）。

对浓缩的乳清蛋白质溶液的初步热处理不会改善其总体易消化性;因此用于胰酶水解产物LAD制剂中的乳清蛋白质浓缩物是未变性的。LAD的游离氨基酸部分中没有半胱氨酸是与胰蛋白酶不能水解天然乳清蛋白质的二硫桥键（30）这一特征相一致的，而该二硫桥键是在变性过程中被裂解的。

饮食乳清蛋白质与肺炎球菌感染

因为我们的研究已表明饮食蛋白质类型可影响体液免疫反应，所以我们又进一步研究了饮食中U-Lacp对小鼠抗肺炎球菌感染能力的影响。肺炎球菌属是有荚膜的、身体须发动体液免疫反应来对抗的高毒力菌属。喂饲含20gU-Lacp/100g食物的C3H/HeJ小鼠与喂饲有相似营养效力的含20gC/100g食物的小鼠相比，在感染3型肺炎链球菌后，显示存活率有所提高（表 5）。

基于我们的各项实验研究，表明喂饲乳清蛋白质饮食的小鼠现3型肺炎链球菌感染的抵抗力与感染时动物的体重及感染前增加的体重无关（感染前动物用试验食物喂养了3周）。

饮食中乳清蛋白质浓缩物之免疫增强作用的机制

过去几年里，我们一直在试图弄清可能直接或间接影响体液免疫反应性之饮食蛋白质类型所诱发的改变。在每100g饮食含20g的浓度下，蛋白质提供了小鼠生长所需的足够必需氨基酸量。发现蛋白质类型的显著影响只是在于血浆中氨基酸分布型的改变，其与被消化蛋白质的氨基酸组成基本相一致，但半胱氨酸是一个突出的例外（表6和7）。

令人惊异的是，尽管WPC中半胱氨酸含量高8倍，但喂WPC饮食之小鼠与喂C饮食之对照组小鼠的血浆半胱氨酸水平并没有差异。过量半胱氨酸的代谢命运是一个令人感兴趣的问题。饮食半胱氨酸是合成淋巴细胞增殖所必需之谷胱甘肽（GSH）的一种限速底物。GSH要依赖于饮食蛋白质中半胱氨酸的供应。淋巴细胞的氧化还原状态可调节细胞内的已知最终参予淋巴细胞增殖的环GMP的浓度。

本研究显示，免疫的、喂饲乳清蛋白质饮食小鼠与喂饲酪蛋白或富半胱氨酸酪蛋白饮食的小鼠相比，在前者观察到的免疫反应增强作用与脾谷胱甘肽产生较多有关。饮食半胱氨酸当在乳清蛋白质中而不是作为游离半胱氨酸被输送时，其诱导超正常谷胱甘肽水平的效力才更大（图6）。

增加组纺谷胱甘肽的方法

进一步探论了饮食蛋白质、GSH和宿主免疫反应的相互关系。研究是否与乳清蛋白质浓缩物有同样高半胱氨酸水平的其他蛋白质源（如卵清）（表8），在提高组织GSH水平上有相似作用。结果发现，卵清蛋白质饮食并不能提高宿主免疫反应水平到平均值以上（图1）。尽管发现用U-Lacp喂养三周后没有改变脾中稳定的GSH水平，但与在喂饲营养上等价的D-Lacp（变性乳清蛋白质）、酪蛋白、富含半胱氨酸酪蛋白或卵清蛋白质食物的小鼠出现脾GSH水平降低的图形（图6）相比较，研究结果表明喂饲U-Lacp（未变性乳清蛋白质）的年青C3H小鼠抗SRBC脾细胞免疫反应的增强（图5）与抗原引发的淋巴细胞克隆扩增期间脾GSH的持续升高有关。四个对照组也呈现了较低的免疫反应（图5）。给予S-（正丁基）同型半胱氨酸硫氧亚胺（其致使脾谷胱甘肽水平减少一半）使喂饲乳清蛋白质（U-Lacp）饮食的小鼠体液免疫反应显著降低。从而进一步证明了谷胱甘肽在食物乳清蛋白质的免疫增强效应中的重要作用（图7）。

从17月龄开始喂饲各试验饮食3个月后，喂饲U-Lacp的小鼠肝和心GSH含量高于喂饲D-Lacp、酪蛋白、卵清蛋白质或Purina的各对照组小鼠（图8和9）。10周龄、17、20、21月龄喂饲Purina实验室食物的小鼠心和肝中GSH含量均相近。喂饲U-Lacp饮食的小鼠，在连续喂养3和4个月后心和肝中GSH含量高于“正常”值（图8和9）。

总之，年青的C3H/HeN小鼠在饲以U-Lacp饮食3个月后，在其抗原引发的淋巴细胞克隆扩增期间出现了脾GSH增加，而饲以D-Lacp、酪蛋白或卵清蛋白质饮食的对照组则脾GSH 含量相对减少（图6）。在老年C57BL/6NIA小鼠，长期喂饲U-Lacp饮食，可导致心和肝GSH水平出现适度但持久的增加（图8和9）。WPC的GSH增加活性只限于其未变性形式（U-Lacp）。这种性质并不只是由于WPC的高半胱氨酸含量，因为另一种具有相似半胱氨酸含量的蛋白质源（卵清）并没有表现这种生物学活性。根据对小鼠体重、血清蛋白质和食物消耗量的记录结果，发现U-Lacp的这种特性并不是特定地依赖于其营养效力，而可能是依赖于呈天然形式之蛋白质的一级、二级和三级结构。

图8和9数据显示，喂饲Purina的对照组小鼠肝和心谷胱甘肽浓度长时间仍保持恒定不变，而喂饲营养上等价的乳清蛋白质（U-Lacp）饮食前小鼠则出现适度但持久的组织GSH升高。

事实上，对细胞GSH的调节是很严格的，最多可能增加2倍，而且各种利用GSH的酶（如谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶）可能扩增GSH小量增加的效果，在喂饲富含乳清食物的小鼠中观察到的这种可再现的GSH浓度变化很可能具有重要的生物学意义。这种增加的长期持续性质可能对上述效应具有重要贡献。

抑制化学物质诱发与结肠癌生长的方法

从目前发现的乳清蛋白质浓缩物之生物学特性的不稳定性来看，可以相信用于我们后来实验（57）中的牛乳蛋白质混合物的乳清蛋白质部分受到了部分地或完全地变性。尽管现有技术提到的所有研究中使用的肿瘤类型及对照饮食均有所变异，但显然已报导的用乳制品喂养产生的肿瘤抑制作用与我们用含酪蛋白（作为蛋白质来源）之配制食物喂饲所得到结果差不多。

这一研究结果显示，与饲以Purina的对照组相比，饲以酪蛋 白饮食的小鼠中DMH诱发的结肠癌的数目和大小分别减少了0.3和0.4倍（表9）。然后，在喂饲有相似营养效力之乳清蛋白质饮食的小鼠中，与喂饲Purina之对照组小鼠相比，DMH诱导之结肠癌的数目和大小减少了四倍（表9）。在我们以前的研究报告中，已报导了与酪蛋白相比，乳清蛋白质在抗肿瘤效果上所具有的优越性。由上面讨论的研究工作可以看出，乳制品的抗肿瘤活性是在蛋白质组分中，特别是如本发明所证明的，是在乳的乳清蛋白质成分中。

估计口服给予我们的小鼠的乳清蛋白质浓缩物量约为每天0.8g蛋白质，这个量差不多是GB-A-1495940中所述注射量的20，000倍。

这一点可能是现有技术所不能与之相比的，即发现特定的蛋白质混合物（乳清蛋白质浓缩物）在经过长期喂饲、经生理途径消化并吸收后仍可发挥其抗肿瘤作用，从而基本上排除了抗原性材料的吸收（特别是在成年小鼠）。再者，以相似量口服给予其他外来蛋白质（如酪蛋白或含在Purina食物中的各种蛋白质）时，并没有表现出抗肿瘤作用。

我们研究始终表明，以其未变性形式存在的饮食乳清蛋白质浓缩物的抗肿瘤活性，与用在我们实验中的PFC分析直接相关。WPC的这种免疫增强活性是由其所有蛋白质成分贡献的。在我们的研究工作中，发现给小鼠喂饲在GB-A-1495940号专利中显示通过腹腔内注射可发挥抗肿瘤效应之WPC组分（6，000-20，000mol.wt.）（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白）后其所产生的抗SRBC的PFC反应明显低于喂饲乳清蛋白质浓缩物的小鼠（图2）。因此，可以进一步认为WPC的抗肿瘤作用与 WPC的免疫增强活性有关，即我们的研究结果与GB-A-1495940号专利报导的现象没有关联。

最后，在这两组研究中不只是浓度，而且因为给予的途径不同，所以生物学活性中间产物的类型和代谢命运也是不同的。

存活率研究：生物学活性依赖于WPC的未变性构象

（a）在有限的期间内年老小鼠的存活率：

我们的研究显示，在衰老开始时（21月龄）即给予未变性乳清蛋自质的小鼠与喂饲营养上等同之Purina小鼠食物的对照组相比，其平均存活时间约增加了30%（在有限的6-7个月观察期结束时，已有55%雄性C57BL/6NIA小鼠死亡）。喂饲Purina小鼠的存活率曲线与喂饲酪蛋白饮食者十分相似（图10）但在继后的四个月中，又将未变性乳清蛋白质饮食改为变性的乳清蛋白质浓缩物（D-Lacp）饮食。在此期间，保持乳清蛋白质饮食之小鼠的死亡时间变得与喂饲酪蛋白或Purina之对照组相似。如图3所示，整个研究中对PFC形成的重复生物检测进一步证实了饮食中WPC的未变性状态与宿主免疫增强之间的关系。在研究的第二部分中，当存活率曲线间的差异变窄时，虽然WPC（D-Lacp）的营养品质还保留，但其免疫增强特性没有了。在整个观察过程中，没有看到热量摄入和体重有明显的组间差异。因为生存力主要取决于个体的基因组，因此在有限期间内延迟死亡不大可能影响寿命。然而，至少从饮食的免疫增强作用这个概念来说，这一研究可看作是一个从试验（U-Lacp）到对照（D-Lacp）饮食方向交叉的信号，显示了WPC对老年小鼠存活率的生物学活性取决于其未变性状态，并且要与我们的研究中所用的PFC检测法直接相关的（如图3 中图解所示）。

（b）带有DMH诱发之结肠癌小鼠的短和长期存活率

在DMH处理的小鼠中，我们注意到了28周末时的死亡率与到实验（即与饮食蛋白质类型有关的实验）结束时的存活时间之间的差异。在实验观察的前七个月里，饲以未变性乳清蛋白质（U-Lacp）的小鼠没有死亡，而到这个期间结束时饲以酪蛋白和Purina的对照组则死亡33%。在继后的四个月中，喂乳清蛋白的小鼠改为饲以变性乳清蛋白质（D-Lacp），此期间发现，与对照组（酪蛋白食物）相比D-Lacp饮食对存活率似乎没有有利的影响（表10）。整个实验过程中反复进行了脾PFC的生物学分析，以用数据证实如以前报告的饮食对免疫功能的生理影响及这些影响的稳定性。在前七个月的实验观察期间一直肯定了U-Lacp饮食的免疫增强作用;但在此后四个月中（D-Lacp），则以前在喂饲U-Lacp饮食之小鼠中观察到的免疫增强作用已不复存在。与U-Lacp或D-Lacp饮食有关的PFC反应的数据是和图3中给出的结果一致的。因此，这项研究进一步证实了这种假定：即WPC对带病小鼠之存活力的生物学活性依赖于与我们使用的PFC检测直接相关的WPC之未变性状态。

维生素B2、B1在饮食乳清蛋白质浓缩物之免疫增强效应中的协同作用

虽然乳清蛋白质代表了半胱氨酸的一个最适来源，但GSH生物合成的限速底物，即维生素B2和B1，在GSH氧化还原循环的功能中也是很重要的因素。

谷胱甘肽在组织中主要以还原态存在（GSH：GSSG， 250），这种状态以借助与NADP+/NADPH氧化还原对相偶联的高效的GSH过氧化物酶和还原酶系统来维持的。通过在GSH过氧化物酶催化下将GSH氧化为GSSH，内源毒性H2O2被还原成H2O。消耗细胞NADPH，GSSG在NADPH：GSSG还原酶的作用下被有效地还原成GSH，从而维持了硫醇平衡。因此，GSSG还原酶具有很大的保护细胞免于受到内源活性氧之毒害的能力。

维生素B1（硫胺素）参予产生NADPH和戊糖之磷酸戊糖支路的转酮醇酶反应。

维生素B2（核黄素）：核黄素的辅酶衍生物，即黄素单核甘酸（FMN）和黄核腺嘌呤二核甘酸（FAD），都是由核黄素相继合成的。缺乏维生素B2的动物可呈现FMN及需要FAD的酶如GSH还原酶活性的显著降低。

在这个意义上，可以相信所有这些天然存在于乳清中的水溶性维生素，对于GSH氧化还原循环的最佳功能起着重要作用，正如在我们的实验中所显示的，当摄入乳清蛋白质时GSH合成和组织GSH的储存量均处于较高水平。

这一研究（图11）显示，饮食中维生素B1、B2的含量稍高于上面推荐的允许量时（表8a，饮食5、6）可对饮食乳清蛋白质浓缩物的免疫增强作用产生显著的影响。通过提供限率底物（半胱氨酸）的最佳生物可利用性，会提高GSH的合成与储备量。另一方面，摄入较正常需要量更多的维生素B1和B2，对于GSH氧化还原循环处于较高水平，从而使动物发展高于正常水平的抗SRBC免疫反应是必不可少的。虽然每种维生素在喂饲乳清蛋白质小鼠体内发 挥的作用是有限的，但它们在提高喂饲乳清蛋白质小鼠之免疫反应上的协同作用却是明显的（图11，饮食5、6;1）。同样的维生素对于喂饲酪蛋白小鼠的免疫反应则没有影响。虽然这些水溶性维生素都存在于乳清中，但因为其中存在维生素B2才呈现出特征性颜色的乳清更是单个最有效的维生素-核黄素的主要天然来源。

总之，从饮食中摄入高于推荐的每日允许量的维生素B1，特别是B2，将有利于提高喂饲乳清蛋白质小鼠的免疫反应：似乎维生素B2+B1可产生最强的效力。摄入这个水平或稍低于这个水平的这些维生素，虽然动物的体重和形体都正常，但对免疫攻击的反应却低于喂饲乳清蛋白质小鼠的最大反应能力。本发明的乳清蛋白质组合物含有所说的WPC以及维生素B1（1.5至2.0mg）和B2（1.5至2.0mg）。

在胃内，由于胃液的作用使乳清从乳中分离出来。乳清中水溶性维生素和蛋白质的输送和吸收要比乳凝块（凝乳）中的蛋白质（酪蛋白）和维生素成分快。因此乳清蛋白质和维生素（包括维生素B1和B2）能以与其他乳成分不同的速度进入体循环，并对免疫系统和GSH氧化还原循环发挥其协同作用。

本申请中所述的饮食乳清蛋白质的免疫增强及其他特异生物学特性是对热不稳定并依赖于蛋白质的未变性（天然）状态的（其也可受强烈振荡、溶剂、极端pH改变等的影响），而且与其不因变性处理而改变的营养品质无关。

与大多数其他变性的商品乳清蛋白质不同，用于我们实验中的Denmark公司生产的乳清蛋白质（Lacprodan-80）是90%未变性的（图11中的U.D.）。这种蛋白质受热表现出最大的变 性趋势，从而暴露其游离巯基基团。当我们使用一批在特别热而且潮湿的气候环境（1988年夏季）下，从Denmark公司经由美国长时间露天运输后得到的W.P.C.进行实验时，结果W.P.C.丧失了免疫增强特性（图11，2d-8d）。这些实验既表明了维生素B1和B2在饮食之免疫增强效应中的协同作用，同时也显示了推测部分变性之乳清蛋白质的负效应。以前的研究已经显示，饮食乳清蛋白质的免疫增强特性可能与半胱氨酸（其为谷胱甘肽合成的一种限速前体物）的细胞内运输及生物可利用性有关。可以想见，这种蛋白质的部分变性，在没有影响其营养品质的情况下，通过改变半胱氨酸和GSH合成而导致了其特异生物学活性的丧失。

原乳加工与乳清制备

挤奶后将其立即冷却到4℃并放在冷却罐内送往干酪厂。在初始温度20℃下，用乳酸降低pH至大约4.6，得到凝固块的沉降。加入凝乳酶（一般为3盎司/1，000磅牛乳）后，升高温度至大约30℃，保持20分钟以促进乳清由凝乳中排出，从而能在桶内以低速搅拌使之解析。

得到足够量的乳清后，用标准方法对留在桶内的产物进行巴氏灭菌以减少细菌并高速搅拌以生产干酪。然后用γ幅源照射乳清。根据乳清中细菌数的不同，照射剂量一般为5至15KGy，以达到与标准巴氏灭菌法相同的灭菌效果，同时尽可能地减少蛋白质变性机会（可根据可溶性蛋白质量的变化，即处理前后乳清中的蛋白质浓度来检测）。

我们的方法与标准方法间的不同在于，继后用于生产乳清蛋白质浓缩物的乳清部分未作加热处理，并缓慢搅拌从中制取乳清蛋白质的 材料，以尽可能减少蛋白质变性。通过保持高度溶解性避免乳清蛋白质与酪蛋白共沉淀，从而增加乳清的蛋白质含量以防止变性。然后将乳清冷却至6℃。

乳清蛋白质浓缩与分离

为了生产未变性的乳清蛋白质浓缩物，须通过超滤即使加压溶液流过一个多孔膜来分离并浓缩乳清，以便在温和条件下选择性地从乳糖、盐和水中分离出蛋白质。所说的膜只能允许相当小的分子通过。

为了防止滞留期过多微生物生长和蛋白质变性，工作温度应在10℃以下。可使用截留分子量约为10，000道尔顿的聚合材料（聚砜）制成的薄膜，以便保留分子量约15，000的蛋白质成分。为加快过滤速度，可对流过膜的液体加5巴（Kg/cm2）的压力。

组装一个框架式单元以支撑许多这种膜。生产线包括18个这样的单元。在后10个单元中，加入软化水并由软化水携带乳糖和无机盐通过膜而不被除去。为保留有足够的速度以减小浓差极化的结垢，可在各个阶段中使用再循环泵。

如此便得到含80%蛋白质（未变性的）的干燥的蛋白质浓缩物终产品。

与用于人有关的乳清蛋白质浓缩物的实验数据

在五个无关品系的雄性小鼠中试验了未变性乳清蛋白质浓缩物的免疫增强活性。

在一个不同品系的雄性小鼠中记录了乳清蛋白浓缩物的抗肿瘤效应。

Birt等人（3，4）的研究表明喂饲W.P.C.的两种性别 的仓鼠延长了寿命。

W.P.C的生物学活性似乎与特异性遗传及内分泌影响无关。此外，一般认为如果这一生物学现象发生在两个不同种中，则也应会出现于包括人在内的其他种中。

研究发现W.P.C可有效对抗的结肠癌类型，在组织外观及其对化学治疗的反应上是与人结肠癌相似的。

早产儿与足月婴儿不同，他们需要进食以乳清为主的配制饮食来防止代谢性酶中毒和维持生存。

与其他哺乳动物相比，大概更重要的是人乳有最高的乳清蛋白质/酶蛋白比例。推测人类正是通过对这种营养的专一形式的认识，才为其最好的代谢效益而加工处理未变性的乳清蛋白质的事实上，人们可以期望在啮齿动物身上观察到的这种良好生物学活性可能在人类宿主身上更为显著。