一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法
专利汇可以提供一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种筛选 植物 根际 土壤 拮抗细菌的方法，属于 微 生物 领域。所述方法包括：（1）利用梯度稀释法从样品根际土壤中分离获得细菌菌株；（2）使用划线纯化方法对分离获得的菌株进行纯化，获得细菌纯培养；（3）筛选，利用改良的 牛 津杯法筛选拮抗细菌，特点在于使用的是半固体培养基和改良的牛津杯法，进行拮抗细菌的筛选。植物根际土壤微生物种类丰富，而细菌间则可能存在相互拮抗现象，本 发明 则利用快速简便的方法将可能存在的拮抗细菌筛选出来。相较现行的其他方法，操作更为简单，效果更为显著。，下面是一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法专利的具体信息内容。
1.一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，其特征是包括植物根际土壤样品中细菌分离、纯化和拮抗细菌筛选；
所述植物根际土壤样品中细菌的分离包括下述步骤：
（1）土壤样品的处理：采集根际土壤后，加无菌水振荡处理获得菌悬液；
（2）稀释液涂布平板：将菌悬液进行10倍梯度稀释，获得不同梯度的稀释液，并将不同梯度的稀释液分别涂布于R2A固体培养基，然后将平板移入28℃恒温培养箱培养；
所述R2A固体培养基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，无水硫酸镁0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 ml，pH=7.4；
（3）分离与纯化：根据平板上菌落的颜色、形态、大小特征，将特征不同的细菌单菌落挑出，在R2A固体培养基上划线，然后培养细菌；
（4）对挑出的细菌菌株进行纯化，每一株细菌菌株纯化至少三次，直到获得纯菌落，依次编号，加入甘油后冷冻保存；
所述拮抗细菌筛选包括如下步骤：
（1）细菌菌液制备：将根际土壤中分离得到的所有菌株分别接种到R2A液体培养基中，温度是28 ℃， 转速是180 rmp摇床培养，待菌株达到对数生长后期，稳定前期后，收集菌液备用；
所述R2A液体培养基：胰蛋白胨0.25 g，酸水解酪蛋白0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸镁0.1 g，丙酮酸钠0.3 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH=7.4；
（2）指示菌处理：使用20 ml的琼脂浓度为6g/L 10 g/L，PH=7.4的R2A半固体培养基，~
加入20 μL的指示菌菌液，振荡混合均匀后倾倒平板；所述指示菌是从土壤中分离得到的细菌中选择任意一种；
所述R2A半固体培养基是在R2A液体培养基中加入琼脂，琼脂浓度为6 g/L—10 g/L；
（3）放入牛津杯：待混合菌液的R2A半固体培养基凝固后，直接在R2A半固体培养基表面垂直放置已灭菌的牛津杯，静置10 min，待牛津杯自然下沉；
（4）拮抗菌加入：依次在牛津杯中加入50 μL待测拮抗菌菌液及50 μL的无菌的R2A液体培养基；所述拮抗菌是在含有指示菌的平板上，指示菌之外的其它细菌均为拮抗菌；
静置3 h，移入培养箱中培养5d，观察是否有抑菌圈存在。
2.根据权利要求1所述一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，其特征是所述不同梯度的稀释液是0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液。
一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法
技术领域
背景技术
发明内容
1、样品土壤的处理：采集根际土壤后，加无菌水振荡处理获得菌悬液；
2、稀释液涂布平板：将菌悬液进行10倍梯度稀释（10-1,10-2,10-3，10-4,10-5），获得稀释液，将不同梯度的稀释液分别涂布于R2A固体培养基，然后将平板移入28℃恒温培养箱培养；
所述R2A固体培养基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，无水硫酸镁0.024 g，丙酮酸钠0.3 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 ml，PH=7.4。
5、静置3 h，移入培养箱中培养5 d，观察记录抑菌现象。
本发明在牛津杯中直接加入拮抗菌的菌液，最大程度的使得拮抗菌和指示菌之间可以直接接触；而加入新鲜培养基，保证了拮抗菌的生长及拮抗物质的连续产生；且采用半固体培养基混合菌液倾倒平板，解决了指示菌分布不均匀的问题；操作简单快捷，不易污染，效果好；同时在初步确定同一生境中存在细菌间相互拮抗现象后，为后续研究打下基础。本发明与传统的牛津杯法的效果对比，使用本发明获得的效果更明显。
具体实施方式
0.5 g，磷酸氢二钾0.3 g，硫酸镁0.1 g，丙酮酸钠0.3 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH=7.4。。
2）样品1放入50 ml离心管中，加无菌水30 ml，水平振荡3次，每次1min，间隔30 s；
3）静置10 min，取100 μL上清液加入到900 μL无菌水中，振荡混和均匀，即完成一次稀释；共稀释五次，获得6个梯度稀释液，即0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液；
4）取10-1、10-3、10-4、10-5四个梯度的稀释液各50 μL，分别涂布到R2A固体培养基上，放入28℃恒温培养箱中静置培养；
5）将不同梯度平板上颜色、形态、质地、大小不相同的单菌落分别挑出，依次编号。对挑出的菌株利用平板划线法进行纯化，纯化至少三次，直到获得纯培养后保种；该柠条根际土壤样品中共分离到9株菌株，分别编号CK01-CK09。
2、准备9个锥形瓶，分别配制琼脂浓度为10 g/L的半固体培养基，灭菌后放入55 ℃烘箱备用；
3、指示菌的处理：将20 μL菌液加入到R2A半固体培养基中，迅速振荡混匀后倒平板。一个平板对应一个菌株，样品1生境中共分离到9株细菌，即共需要9个指示菌平板；
4、放置牛津杯：待培养基凝固后用镊子将已灭菌的牛津杯（规格为内径0.78cm、外径
0.8cm、高1cm）垂直放置到培养基表面，每个平板放置8个牛津杯（除自身外，其它菌株分别加到其中一个牛津杯中）。静置10 min，待牛津杯自然下沉；
5、加拮抗菌菌液：按顺序依次在牛津杯中加入50 μL待测拮抗菌菌液及50 μL无菌的R2A液体培养基。一个菌株的菌液需要连续加样8次。直到9个平板全部加样完毕；
6、静置3 h后，移入28 ℃恒温培养箱，培养5天，观察抑菌圈大小；
7、记录每个平板上抑菌现象，制作拮抗现象表格，详情参见表1。
CK01- CK 09是分离自拧条根际土壤的9种细菌。其中，CK09鉴定为辣椒榕杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为No: CCTCC M 20191036；其余8种细菌未进行菌种鉴定。
2）样品放入50 ml离心管中，加无菌水30 ml，水平振荡3次，每次1 min，间隔30 s；
3）静置10 min，取上清液，并对其进行10倍梯度稀释，共稀释五次，获得6个梯度稀释液，0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液；
4）取10-1、10-3、10-4、10-5四个梯度的稀释液各50 μL，分别涂布到R2A固体培养基上，放入28 ℃恒温培养箱中静置培养；
5）将不同梯度平板上颜色、形态、大小等特征不同的单菌落分别挑出，依次编号，对挑出的菌株以平板划线法反复纯化，直到获得纯培养后保种；该样品中共分离到8株菌株，分别编号ZM01-ZM08。
2）准备8个锥形瓶，分别配制琼脂浓度为10 g/L的半固体培养基，灭菌后放入55 ℃烘箱备用；
3）指示菌的处理：同实施例A相同，将20 μL的菌液加入到R2A半固体培养基中，迅速振荡混和均匀后倒平板，同样按照一株细菌对应一个平板的规则，共准备8个指示菌平板；
4）放置牛津杯：培养基凝固后在其表面垂直放置已灭菌的牛津杯，每个平板中放置7个牛津杯（除自身外，其它菌株分别加到其中一个牛津杯中）。静置10 min，待牛津杯自然下沉；
5）加拮抗菌菌液：按顺序依次在牛津杯中加入50 μL待测拮抗菌菌液及50 μL无菌的R2A液体培养基。一个菌株的菌液需要连续加样7次，直到8个平板全部加样完毕；
6）静置3 h后，小心移入28 ℃恒温培养箱，培养5 d观察抑菌现象；
7）记录每个平板上的抑菌现象，制作表格，详情参见表2。
ZM01-ZM08是分离自玉米根际土壤的8种细菌，均未进行菌种鉴定。
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