技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物技术领域，具体涉及一株高产丁醇的拜氏梭菌及其在以木质
纤维素原料
发酵生产丁醇中的应用。
背景技术
[0002] 丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部
门有广泛的用途。而且作为一种有潜
力的可以替代
汽油的可再生生物
能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。
[0003] 丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。
[0004] 其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的
瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和
溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙
酮丁醇梭菌和拜氏梭菌。丙酮丁醇梭菌对
抑制剂耐受性低，因此主要用于对
淀粉类和糖类的发酵生产丁醇。拜氏梭菌对环境适应性好，但糖的利用率较低，因此丁醇产量不高，需要通过生物技术手段提高拜氏梭菌的糖摄取量。Mermelstein 等(Biotechnol.Bioeng.1993，42:176-183) 利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株提高了37％。可见，进行菌株改良是提高丁醇产量，增强发酵竞争力的关键手段之一。
[0005] 由于我国人口众多，用传统的原料( 玉米和
甘蔗) 发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的
生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质
纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素，作为可再生资源，越来越受到关注。
[0006] CN201210089406.2公开了一株高产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。但是，在以木糖渣酶解液为
碳源时，总溶剂产量为
16g/L，丁醇产量为8.2g/L。
发明内容
[0007] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20及其应用。该菌株可以利用经氢
氧化
钙脱毒后的木质纤维素酶解液发酵高产丁醇，具有糖利用率高，丁醇产量高等特点。
[0008] 本发明高产丁醇的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9354。
[0009] 本发明所述拜氏梭菌CM20的筛选方法，是将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉平板和
葡萄糖平板筛选得到高活力产丁醇菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、
乙醇的目标菌株。
[0010] 本发明所述拜氏梭菌CM20在生产丁醇中的应用。
[0011] 本发明所述拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇中的应用，包括如下内容：
[0012] （1）将木质纤维素原料进行预处理；
[0013] （2）对预处理后的原料进行酶解，获得含多组份糖的酶解液；
[0014] （3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理；
[0015] （4）以脱毒后的酶解液为碳源，补加
营养元素配成P2发酵培养基；
[0016] （5）将拜氏梭菌CM20接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇。
[0017] 步骤（1）所述的木质纤维素原料含有纤维素、半纤维素以及木质素，可以采用秸秆、木屑、
能源植物等，优选采用玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械
粉碎、
辐射、
微波、酸处理、
碱处理、
蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。蒸汽爆破预处理具体如下：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.2-1.7MPa的压力下维持5-10分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆。
[0018] 步骤（2）将预处理后的木质纤维素原料和pH为4.0-5.0，浓度为0.1-0.5M的
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液比10%-15%（w/v）混合，经过脱氧处理后高压灭菌，然后加入纤维素酶进行酶解。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit，其中包括纤维素酶复合物(NS 50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010)，纤维素酶的加入量为500IU/g汽爆秸秆，酶解的pH值为4.8-5.0，
温度为45-55℃。
[0019] 步骤（3）采用直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至10-11，于50℃，110rpm摇床中振荡1小时，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。
[0020] 步骤（4）以脱毒后的酶解液为发酵培养基的碳源，控制培养基中还原糖浓度为60-80g/L，补加营养元素配成P2发酵培养基。
[0021] 步骤（5）发酵条件为厌氧发酵，接种量为5%-10%（v/v），发酵温度为33-37℃，发酵时间为72-84小时，即得到生物溶剂（丙酮，丁醇和乙醇）。
[0022] 本发明以拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052为出发菌株，经紫外诱变获得突变菌CM20，利用突变株发酵氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液，总溶剂（丁醇、丙酮和乙醇）产量可达19g/L，明显高于原始菌株13.1g/L，也高于相同条件下以葡萄糖为碳源时的总溶剂产量（16g/L）。本发明拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇的总溶剂产量明显增加，
稳定性好，对利用木质纤维素原料生产丁醇的大规模工业应用具有重要意义。
[0024] 本发明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。
具体实施方式
[0025] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0026] 实施例1 拜氏梭菌CM20菌株的紫外诱变筛选过程
[0027] 将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉葡萄糖固体平板筛选得到高活力菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。
[0028] 具体过程如下：以Clostridium beijerinckii NCIMB 8052为出发菌株，首先在P2（葡萄糖为底物）液体发酵培养基中培养，待生长至指数期后，取600微升菌液，在厌氧条件下进行诱变，紫外诱变条件为UV：15W，高度：10cm，时间：2-3min。诱变后的菌液适当稀释涂布筛选平板，挑选淀粉圈大的突变株继续诱变，经过若干轮的诱变，获得一株活性高的突变株，命名为CM20。
[0029] 淀粉葡萄糖固体平板：在P2发酵培养基添加1wt%的琼脂，碳源是2wt%淀粉和4wt%葡萄糖混合物。
[0030] 以葡萄糖为碳源，葡萄糖含量为60g/L，补加以下营养元素配成P2发酵培养基：
酵母粉1g/L，
磷酸氢二
钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七
水合
硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚
铁0.01g/L，
氯化钠0.01 g/L，对
氨基苯
甲酸0.001 g/L，维生素B1 0.001 g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6 7，接种量5%（v/v）。获得的突变株CM20~和出发菌株NCIMB 8052发酵72h结束后，糖利用率和丙酮丁醇产量比较如表1所示。
[0031] 表1 突变株CM20和出发菌株NCIMB 8052发酵效果比较
[0032]菌株 总溶剂产量，g/l 丁醇产量，g/l 糖利用量，g/l
CM20 16.4 11.1 55
NCIMB 8052 12.9 7.8 42
[0033] 由表1可知，以葡萄糖为碳源时，丁醇产量为11.1g/l，比原始菌株的7.8g/l高出了3.3g/l，相较原始菌株，丁醇产量提高了42%。
[0034] 实施例2 拜氏梭菌CM20菌株的传代稳定性
[0035] 在以葡萄糖为碳源的P2发酵培养基中，检测拜氏梭菌CM20的传代稳定性。
[0036] 在7次连续转接培养中，CM20利用葡萄糖为碳源生产丁醇与总溶剂的产量比较稳定，具有良好的传代稳定性，具体结果如表2所示。
[0037] 表2 突变株CM20的传代稳定性检测结果
[0038]
[0039] 以葡萄糖为碳源时，总溶剂产量为15.3-17.6g/l，丁醇产量为10.6-12.1g/l，说明该突变株CM20遗传性状稳定。
[0040] 实施例3 突变株CM20 16sRNA的序列鉴定和菌株鉴定
[0041] 以葡萄糖为碳源的P2发酵培养基培养突变株CM20，对数生长期时涂布平板，得到单克隆，无菌牙签挑单克隆至PCR管内作为PCR模板，进行16sRNA的序列的扩征，引物选用通用引物，27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG和1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T。PCR循环条件是：95℃，10min；95℃，20s；55℃，20s；72℃，1min；32个循环；72℃，10min。扩增出的条带送华大基因公司测序，序列用NCBI
网站进行比对，序列和Clostridium
beijerinckii NCIMB8052的16sRNA有100%的相似性，证明突变株是Clostridium beijerinckii。
[0042] 实施例4 采用玉米秸秆对突变株CM20产丁醇能力进行检测
[0043] （1）将玉米秸秆进行预处理：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.5MPa的压力下维持5分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆，主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成。
[0044] （2）对汽爆秸秆进行酶解：预处理后的玉米秸秆和pH为4.0，浓度为0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液比10%（w/v）混合，经脱氧处理后于115℃灭菌20min。待冷却至室温后，加入纤维素酶（500IU/g汽爆秸秆），于50℃、110rpm摇床酶解72h。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit，其中包括纤维素酶复合物(NS 50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010)，酶解pH值为4.5。
[0045]
水解液中还原糖浓度的检测主要使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法。将样品还原糖浓度稀释至1.5g/l以下，取稀释后溶液150µl，加入DNS 200µl，沸水煮10min，冷却后向反应液中加入1ml蒸馏水，取350µl于酶标板中，540nm下测吸光度。以0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5g/l的葡萄糖为标准样品，以DNS法测得的吸光度值与糖浓度绘制标准曲线，根据标准曲线计算所得样品还原糖的量。
[0046] 标准曲线为：y=0.012+0.655×(A-A0)，R2=0.9964；
[0047] 其中，A0为空白吸光度，A为样品吸光度，y为水解液中还原糖含量。
[0048] 根据标准曲线，测得酶解液中还原糖浓度为90g/l左右，加水稀释至还原糖浓度为60g/l。
[0049] （3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理：直接加入氢氧化钙固体调节酶解液的pH至10.5，于50℃，110rpm摇床中1h，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。主要原理为：弱碱性的Ca(OH)2能够中和部分低分子量的
有机酸，处理过程中形成的钙盐沉淀能够
吸附部分抑制剂，通过离心的方式得以分离，且Ca2+能够增强细胞膜稳定性，对细胞内糖运输相关基因、产溶剂相关基因都有重要影响。
[0050] （4）以酶解液为碳源，控制还原糖浓度为60g/L，补加以下营养元素配成P2发酵培养基：酵母粉1g/L，
磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2 g/L，七水合
硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01 g/L，对氨基
苯甲酸0.001 g/L，维生素B1 0.001 g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6 7。
~
[0051] （5）将拜氏梭菌CM20按照5%的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇：发酵条件为厌氧发酵，发酵温度为37℃，发酵72小时，即得到生物溶剂（丙酮，丁醇和乙醇）。
[0052] 以脱毒酶解液为碳源时，相对于原始菌株，总溶剂产量从13.1g/l提高到19g/l，丁醇产量从8.7g/l提高到11.8g/l。
[0053] 比较例1
[0054] 采用本发明的突变株CM20，处理步骤及操作条件同CN201210089406.2实施例5，以木糖渣为原料。发酵结束后，总溶剂产量为16.5g/l，丁醇含量为9.3g/l。
[0055] 比较例2
[0056] 处理步骤及操作条件与实施例4相同，不同之处在于：酶解液不进行脱毒，直接用于发酵。以未脱毒酶解液为碳源时，发酵结束后，相对于原始菌株，总溶剂产量从8.1g/l提高到9.7g/l，丁醇产量从5.7g/l提高到6.9g/l。
