本発明は、簡便で効率的な手段で、チオレドキシン含有抽出物を製造する方法に関する。 また、本発明は、酵母を用いたアルコール発酵産物から得られるチオレドキシン含有抽出物に関する。

チオレドキシンは、DNA合成に必須のリボヌクレオチドリダクターゼの補酵素として1964年に大腸菌から発見されたタンパク質チオール-ジスルフィド・オキシドレダクターゼの一つであり、あらゆる生物種に普遍的に認められる。 チオレドキシンは、それを電子受容体とするペルオキシレドキシン等と共に生体内で主要な抗酸化酵素の一つとして機能して、遺伝子発現の制御、細胞増殖の制御、細胞死の制御、細胞内に活性酸素種の消去、好中球の活性化阻害、好中球の遊走阻害等の生理活性を発現することが知られている。 更に、チオレドキシンは、老化、虚血障害、急性肺不全、糖尿病等の酸化ストレスに密接な関係を示す症状や疾病に対して抵抗性を示すことから、酸化ストレスに対して重要な保護作用を示すことも明らかにされている。 このように、チオレドキシンには各種有用な生理活性があり、機能性食品への利用が有効であると考えられている。

チオレドキシンを食品に利用する場合、ヒトに摂取又は投与されるという性質上、高度の安全性が要求される。 そのため、食品用のチオレドキシンの製造には、パンやビールの製造等に使用されており長年の食経験がある酵母を使用することが望ましい。 しかしながら、酵母はチオレドキシンを菌体内に蓄積するため、酵母からチオレドキシンを得るには、培養した酵母菌体をガラスビーズやフレンチプレスによる物理的手段又は細胞壁溶解酵素を用いる手段を用いて、菌体を破砕する工程が不可避である（例えば特許文献１参照）。 そのため、従来のチオレドキシンの製造方法では、酵母菌体の破砕によって、夾雑物が多く生じ、得られるチオレドキシンの純度が低くなるという問題点があった。 このような状況の下、酵母を使用して純度を高めたチオレドキシンを製造する方法として、酵母の菌体を破砕した後に、膜分画、クロマトグラフィー、塩析等の精製処理を組み合わせて実施する方法も提案されている。 しかしながら、これらの方法では、依然として、大量の夾雑物からチオレドキシンを分離することが不可能であるため、高純度のチオレドキシンが得られなかったり、煩雑な操作や高度の精製技術が必要になるといった問題点がある。 更に、酵母の破砕を行った場合、酵母臭が顕在化して、得られるチオレドキシン含有抽出物の香味が不可避的に劣悪化するという不具合がある。 このような従来技術を背景として、純度の高いチオレドキシンの製造に関しては、産業上実用可能な技術は、未だ確立されているとは言えないのが現状である。

一方、清酒等のアルコール発酵産物にはチオレドキシンが含まれていることは知られていないだけでなく、寧ろ、従来技術からは、前述するように、チオレドキシンは酵母の菌体内に蓄積されるため、清酒等のアルコール発酵産物には含まれていないと考えられていた。

特開２００６−６７８５０号公報

本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。 詳細には、本発明は、簡便で効率的な手段により、酵母由来のチオレドキシンを高純度で含む抽出物を製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、清酒や発酵調味料等の酵母アルコール発酵産物中には、チオレドキシンが選択的に酵母の菌体外に放出されており、酵母を破砕させることなく、高純度のチオレドキシンを含む抽出物を製造できることを見出した。 本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げるチオレドキシン含有抽出物の製造方法、及びチオレドキシン含有抽出物を提供する：
項１． 酵母を用いたアルコール発酵産物から分子量１００００Ｄａ以上の画分を回収する工程を含む、チオレドキシン含有抽出物の製造方法。
項２． 分子量１００００Ｄａ以上の画分の回収が、限外濾過により行われる、項１に記載の製造方法。
項３． 酵母を用いたアルコール発酵産物が、清酒、発酵調味料、ビール、発泡酒又はこれらの製造工程で生じるもろみである、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 酵母を用いたアルコール発酵産物から回収される分子量１００００Ｄａ以上の画分からなる、チオレドキシン含有抽出物。

本発明の製造方法によれば、酵母を破砕する工程が不要であり、清酒や発酵調味料、ビール、発泡酒等の酵母アルコール発酵産物から、低分子夾雑タンパク質の混在を大幅に低減されたチオレドキシン含有抽出物を簡便に製造することができる。 また、本発明の製造方法によれば、チオレドキシン含有抽出物を低コストで製造できるので、その産業上の有用性は極めて高い。

また、本発明の製造方法で得られるチオレドキシン含有抽出物には、チオレドシキンに加えて、食物繊維や糖質が含まれているので、チオレドキシンに基づく有用効果のみならず、他の含有成分に基づく有用効果をも奏することができる。

本発明のチオレドキシン含有抽出物の製造方法は、酵母を用いたアルコール発酵産物から分子量１００００Ｄａ以上の画分を回収する工程を含むことを特徴とする。

本発明において、チオレドキシン含有抽出物の製造原料として使用されるアルコール発酵産物は、チオレドキシン産生能を有するアルコール発酵性酵母の発酵により得られるものであることを限度として特に制限されない。 チオレドキシンは生物種に広く認められるタンパク質であり、遺伝子工学的手法又は自然変異等によりチオレドキシン産生能が欠損されていないことを限度として、あらゆる酵母を本発明に使用できる。 また、本発明に使用されるアルコール発酵性酵母は、ヒト等の他の生物由来のチオレドキシンが遺伝子工学的手法により導入されている酵母や、遺伝子工学的手法等によりチオレドキシン産生能が高められている酵母であってもよい。

本発明の製造方法に使用されるアルコール発酵性酵母として、具体的には、サッカロマイセス属（Saccharomyces）の酵母が挙げられる。 このような酵母としては、清酒酵母、ワイン酵母、醤油酵母、ビール酵母等の食用酵母であることが望ましく、中でも、清酒酵母は好適である。 このような酵母を使用することにより、安全で効率的なチオレドキシンの製造が可能になる。 また、上記アルコール発酵性酵母の中でも、アルコール耐性が低い酵母は、アルコール発酵産物中へのチオレドキシンの放出促進能が高く、本発明において好適である。

本発明に使用されるアルコール発酵産物は、上記酵母を用いてアルコール発酵させたものであればよく、例えば、上記酵母が生育可能な液体培地で上記酵母を培養したものであってもよい。 また、簡便には、清酒、発酵調味料、ワイン、ビール、発泡酒等の発酵産物、又はこれらの発酵産物の製造工程で生じるもろみを使用することができる。 但し、焼酎等の蒸留酒は、蒸留処理によりタンパク質自体が除去されているため、本発明において、使用されるアルコール発酵産物からは除外される。 当該アルコール発酵産物として、好ましくは、清酒、発酵調味料、ビール、発泡酒又はこれらの製造工程で生じるもろみが挙げられ、更に好ましくは清酒又は清酒製造工程で生じるもろみが挙げられる。

なお、上記アルコール発酵産物には酵母からチオレドキシンが放出されているため、本発明では、酵母が除去されているアルコール発酵産物を使用することもできる。

また、上記アルコール発酵産物におけるアルコール濃度としては、特に制限されるものではないが、例えば、アルコール発酵産物の総量に対して、４〜３０容量％、好ましくは１５〜２５容量％が例示される。 このようなアルコール濃度条件下では、酵母の菌体外へのチオレドキシンの放出が促進される傾向があり、上記アルコール濃度を満たすアルコール発酵産物では、より高い濃度でチオレドキシンが遊離されている。

上記アルコール発酵産物は、使用する酵母の種類、発酵産物の種類、最終アルコール濃度等に応じて、発酵条件を適宜設定して発酵処理を行うことにより製造される。 これらの発酵条件は、醸造の分野で公知である。

本発明では、上記アルコール発酵産物から分子量１００００Ｄａ以上の画分を回収することにより、目的物であるチオレドキシン含有抽出物を得る。 このようなチオレドキシン含有抽出物の回収に先立って、上記アルコール発酵産物に固形物が含まれている場合、圧搾、濾過、遠心分離等の公知の固液分離手段により当該固形物を除去しておくことが望ましい。

本発明において、上記アルコール発酵産物から回収する画分としては、チオレドキシンが含まれている限り、特に制限されないが、好ましくは分子量１００００〜１００００００Ｄａの画分であることが望ましい。

上記アルコール発酵産物から上記画分を回収する手段としては、特に制限されないが、簡便で好適な手段として、上記分子量で分画可能な膜を使用した限外濾過が挙げられる。 上記アルコール発酵産物に対して限外濾過を行う場合、上記分子量で分画可能な膜（例えば、分画分子量１００００Ｄａの膜）を使用した限外濾過を１回実施すればよいが、低分子夾雑物をより高度に除去するために、２〜１０回程度繰り返し行うことが望ましい。

斯くして得られるチオレドキシン含有抽出物は、更に、必要に応じて、ゲル濾過、塩析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の公知の精製処理に供することにより、チオレドキシンの純度を更に高めてもよい。 更に、当該チオレドキシン含有抽出物は、乾燥処理に供して、乾燥物の状態で使用してもよい。

当該チオレドキシン含有抽出物に含まれるチオレドキシン含量については、使用したアルコール発酵産物の種類等により異なり、一律に規定することはできないが、例えば、チオレドキシン含有抽出物の総量（乾燥重量換算）当たり、０．０１〜２０重量％が挙げられる。

当該チオレドキシン含有抽出物には、高濃度でチオレドキシンが含まれており、チオレドキシンに基づく有用効果を付与するための機能性素材として有用である。 また、当該チオレドキシン含有抽出物には、夾雑タンパク質が少なく、しかも、食物繊維及び糖質を含み、チオレドキシンの生理活性と相俟って、これら成分に基づく有用活性をも発揮することもできるので、機能性素材としての有用性が高い。 具体的には、当該チオレドキシン含有抽出物として、その総量（乾燥重量換算）当たり、食物繊維が１０〜８０重量％程度及び糖質が５〜８０重量％程度含まれているものが例示される。

上記チオレドキシン含有抽出物は、例えば、清酒、発酵調味料、飲料、食品、健康補助食品、化粧料等の各種組成物に添加して使用することができる。 このように、チオレドキシン含有抽出物が添加された組成物は、チオレドキシンに基づく有用効果、即ち、遺伝子発現の制御、細胞増殖の制御、細胞死の制御、細胞内に活性酸素種の消去、好中球の活性化阻害、好中球の遊走阻害、老化防止、糖尿病の予防又は改善等の有用効果を奏することができる。

上記チオレドキシン含有抽出物の各種組成物への添加量については、該組成物の種類や形態、期待される効果等に応じて適宜設定すればよい。 例えば、該組成物の総量当たりのチオレドキシン含量が０．０１〜１重量％となるように上記チオレドキシン含有抽出物を目的の組成物に添加すればよい。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
以下の方法に従って、清酒からチオレドキシン含有抽出物を製造した。 即ち、まず、清酒（火入貯蔵酒、チオレドキシン濃度0.4 mg/L）4kLを、限外濾過膜（分画分子量10000 Da：旭化成ケミカルズ株式会社 マイクローザ SLP-3053）によって濃縮し、濾過膜非透過の画分42 Lを回収した。 得られたチオレドキシン含有画分に等量の精製水を加え、これを再度、限外濾過膜（分画分子量10000 Da）によって濃縮して、濾過膜非透過の画分42 Lを回収した。 この操作を合計８回繰り返し実施し、最終的に34 Lのチオレドキシン含有抽出物を得た。 得られたチオレドキシン含有抽出物には、チオレドキシンが39.0 mg/Lの濃度で含まれており、チオレドキシンの収率は82.9 ％であった。

また、上記で得られたチオレドキシン含有抽出物100mlを凍結乾燥して粉末4.1 gを得た。 この粉末について、下記の方法に従ってインシュリン還元活性を測定し、チオレドキシン活性を評価した。
＜チオレドキシン活性の評価＞
1）Ａ液[1M Tris-HCｌ緩衝液（pH 7.5）25μl、100mM EDTA-Na (pH 7.5) 5μl、20mg/ml BSA 12.5μl、100ｍM DTT 5μl、水 2.5μl]と試料（200μｌ）を混合する。
2）上記混合液を37℃で15分間予備加熱する。
3) 上記2)で予備加熱した溶液100μlに、Ｂ液[1M Tris-HCｌ緩衝液（pH 7.5）80μl、100mM EDTA-Na (pH 7.5) 16μl 、20mM NADPH 100μl、1.0U/ml TRX Reductase 100μl、水 554μl]を添加し混合する。
4）上記3) の混合液を25℃で15分間予備加熱する。
5) 上記4)で予備加熱した溶液に、10mg/ml Insulin 100μlを添加し混合する。
6) 上記5)の溶液を、25℃で2分間インキュベートし、その間の340nmの吸光度の変化を測定する。
5)340nmにおける１分間当たりの吸光度上昇[Δ650nm/min]が１となる活性を１ unitとして活性を産出する。

この結果、チオレドキシン含有抽出物中のチオレドキシン単位重量当たりのインシュリン還元活性の比較では、オリエンタル酵母株式会社製のrTRX2:thioredoxin2, recombinant from yeastの活性の70％を示すことが確認された。 即ち、本結果から、本発明で得られるチオレドキシン含有抽出物は、従来、試験用の標準品として高価で市販されているチオレドキシンと、同程度の活性を示すことが明らかとなった。

また、チオレドキシン含有抽出物の乾燥粉末物について、成分分析を行った結果を表１に示す。 この分析結果から、夾雑タンパク質が少なく、食物繊維が50％を占めていることが確認された。 また得られた乾燥粉末物には香りはほとんど感じられず、水への溶解性も良好であった。

実施例２
上記実施例１と同方法で得られたチオレドキシン含有抽出物(pH7.0)に対して、DEAEイオン交換クロマトグラフィーによる精製を行った。 具体的には、DEAE-sepharose CL-6B（ファルマシア社製）を用い、下記の手順で実施した。
カラムの準備
DEAE-Sepharose 20mLをカラムに充填し、2.0重量％ NaOH 40ｍｌを流した後、中性になるまでイオン交換水を流した。 中性になったことを確認し5重量％ NaCl 40ｍｌを流し、更に中性になるまでイオン交換水を流した。
チオレドキシンの吸着・溶出
上記実施例１で得られたチオレドキシン含有抽出物(pH7.0)300ｍｌをカラムに流し、さらに20mLのイオン交換水を流した。 この間に得た流出液を素通り画分とした。 100mLのイオン交換水で洗浄した後、0.05〜0.5Mの塩化ナトリウム水溶液で溶出を行った。 溶出は各濃度の溶液を60mlずつ流し、画分ごとに溶出液を回収した。 各フラクションに含まれるチオレドキシンの検出は、各フラクション中のタンパク質成分をトリクロロ酢酸処理により回収し、SDS-PAGE及び抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットを行うことで実施した。

結果を図１に示す。 この結果から、0.05〜0.06Mの塩化ナトリウム溶出画分にチオレドキシンが濃縮されていることが確認され、DEAE-Sepharoseによるチオレドキシンの分離精製が可能であることが示された。

実施例２における結果、即ち、0.05〜0.5Mの塩化ナトリウム水溶液を用いて、DEAEイオン交換クロマトグラフィーを行って得られた各溶出画分中のチオレドキシンを検出した結果（ウェスタンブロットの像）を示す図である。