技术领域
[0001] 本
发明涉及分子
生物学领域，具体而言，涉及一种通用型核酸提取试剂盒。
背景技术
[0002] 血液是人类生命的延续，医院在进行血液收集和储备的过程中需要对血液进行病毒筛查以保证医护人员和输血者的安全。
[0003] 此前临床上普遍使用的血液检测技术是酶联免疫法(ELISA Enzyme-Linked Immunosorbnent assay)，此方法存在窗口期，容易导致漏检。近年来，核酸扩增技术已经慢慢普及并为直接检测病毒提供了新的方法。和ELISA不同，核酸扩增技术检测的灵敏度更高，大大缩短了病毒携带者的“窗口期”以及检出变异株。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到，检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断
疾病是否处于隐性或亚临床状态。目前核酸检测技术已经逐渐得到重视并被广泛采用。
[0004] 核酸检测技术核心步骤之一是核酸提取。使用
磁珠法纯化核酸是较为常见的方法，其原理在于使用亲
水性的磁珠对裂解后的样品核酸进行充分
吸附，再利用磁吸附的方式使超顺性的磁珠从样品溶液中分离出来，通过洗脱得到目的核酸。
[0005] 现有核酸提取方法虽取得进步，但仍存在较多
缺陷，具体包括：1)提取时需要加入大于样本比例的裂解液，稀释了样本；2)提取步骤需要5-10步，操作复杂，同时需无水
乙醇漂洗、烘干等步骤，容易污染；3)由于
蒸发等原因，各样品之间容易造成偏差；4)提取方法的通用性差，大多只能提取DNA或RNA中的一种；5)一些产品的仍然在使用叠氮钠(NAN3)作为
防腐剂，具有致癌性。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种通用型核酸提取试剂盒以及使用方法，所述试剂盒及其使用方法具有通用强，裂解比高、操作简易、一致性和
稳定性好的优点。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009] 一种通用型核酸提取试剂盒，所述通用型核酸提取试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂；
[0010] 所述第一试剂为包括2.0-5.0M胍盐、2.0-5.0mM
金属离子络合剂、100.0-300.0mM非离子
表面活性剂和1.0-5.0M异丙醇的水溶液；
[0011] 所述第二试剂为包括20.0-40.0mM
柠檬酸和10.0-30.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；
[0012] 所述第三试剂为包括2.0-10.0mM柠檬酸和1.0-5.0mM金属离子络合剂的水溶液，pH值为3.5-4.5；
[0013] 所述第四试剂为包括5.0-30.0mM三羟甲基
氨基甲烷和1.0-15.0mM三羟甲基氨基甲烷
盐酸盐的水溶液。
[0014] 本发明所述通用型核酸提取试剂盒中的试剂以及组分是通过大量实验筛选，付出创造性劳动后获得的。其中，所述第一试剂的裂解效率极高，1.0体积的样本只需1.0体积或更少的裂解液(极限情况为0.5)配比就能充分裂解，市面上少有(如CN201810867325.8裂解液：样本配比为2:1、CN201710068589.2配比为5:2等)，降低了成本和提高了反应容器的选择空间；第二、三试剂能有效清洗吸附有核酸的磁珠的杂质；第四试剂可高效洗脱磁珠吸附的核酸。
[0015] 本发明所述第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂彼此之间还具有良好的协同配合作用，使得所述试剂盒具有以下优点：
[0016] (1)良好的通用性，既可提取DNA型核酸病毒，例如HBV，还可提取RNA型核酸病毒，例如HCV和HIV；
[0017] (2)简化核酸提取方法，将核酸提取步骤由5-10步缩短为3步，且每步时间都相对极短，显著提高了提取效率。
[0018] (3)试剂盒本身具有良好的稳定性，同时，其在核酸提取过程中表现出一致性好，重复性高的优点。
[0019] 在一些具体的实施方式中，所述第一试剂的所述胍盐的浓度为3.0-4.0M，优选为3.5M；所述金属离子络合剂的浓度为2.0-3.0mM，优选为2.5mM；所述非离子表面活性剂的浓度为130-200mM，优选为166.1mM；所述异丙醇的浓度为3.0-4.0M，优选为3.3M。
[0020] 在一些具体的实施方式中，所述第二试剂的所述柠檬酸的浓度为25.0-35.0mM，优选为31.1mM；所述金属离子络合剂的浓度为15.0-25.0mM，优选为19.0mM；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0。
[0021] 在一些具体的实施方式中，所述第三试剂的所述柠檬酸的浓度为3.0-7.0mM，优选为5.7mM；所述金属离子络合剂的浓度为2.5-4.0mM，优选为3.7M；所述第二试剂的pH值为3.7-4.2，优选为4.0。
[0022] 在一些具体的实施方式中，所述第四试剂的所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-20mM，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为1.0-10.0mM。
[0023] 在一些具体的实施方式中，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100，所述第一试剂、第二试剂和第三试剂中的金属离子络合物为柠檬酸钠。
[0024] 在一些具体的实施方式中，所述第二试剂和所述第三试剂中还包括Proclin950，所述Proclin950的体积浓度为0.05～0.2％(v/v)，优选为0.1％(v/v)。
[0025] 本发明所述试剂盒在第二、第三试剂中加入Proclin950，兼具防腐和安全无毒的优点。
[0026] 在一些具体的实施方式中，所述第四试剂中还包括Carrier RNA，所述Carrier RNA的浓度为0.2-2.0μg/μl，优选为1μg/μl。
[0027] 在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括蛋白酶K、磁珠、矿物油和核酸内标中的一种或多种。
[0028] 本发明所述试剂盒将核酸提取的其他试剂组装至试剂盒，能够进一步提高试剂盒的便捷性。
[0029] 在一些具体的实施方式中，所述磁珠为
硅基磁珠，粒径大小为1-1.5μm，优选为1.2μM；所述矿物油为石
蜡油；所述核酸内标为盔甲核糖核酸。
[0030] 本发明前述试剂盒中第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂的浓度为其工作浓度。可选地，前述试剂盒中的第一试剂、第二试剂、第三试剂和/或第四试剂还可等同替换为可稀释为前述浓度的第一试剂、第二试剂、第三试剂和/或第四试剂的母液。
[0031] 本发明还涉及一种使用前述试剂盒提取核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)第一试剂和蛋白酶K裂解样本，加入磁珠吸附裂解释放的核酸；(2)第二试剂和第三试剂依次洗涤吸附核酸的所述磁珠；(3)第四试剂洗脱所述磁珠吸附的核酸。
[0032] 在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述样本、第一试剂、蛋白酶K和磁珠的体积比为1：(0.5-1.2)：(0.01-0.05)：(0.01-0.05)，其中蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL；优选地，所述体积比为1：1：0.02：0.02。
[0033] 在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述磁珠与第二试剂的体积比为1：(10-100)，优选为1：50；所述磁珠与第三试剂的体积比为1：(10-100)，优选为1：50。
[0034] 在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述磁珠与第四试剂的体积比为1：(3-10)，优选为1：6。
[0035] 在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述裂解包括：将样品与各试剂混合，振荡15-45s，优选30s，使样本充分降解；所述吸附包括：加入磁珠后，振荡15-45s，优选30s，之后吸附4-8min，优选6min；
[0036] 在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述洗涤包括：加入第二试剂或第三试剂，振荡15-45s，优选30s，之后吸附15-45s，优选为30s；
[0037] 在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述洗脱包括：加入第四试剂，振荡15-45s，优选30s，之后弃磁珠，即得核酸提取液。
[0038] 在一些具体的实施方式中，裂解样本时还加入核酸内标与矿物油，其中所述样本、核酸内标和矿物油的体积比为1：(0.01-0.05)：(0.05-0.15)，优选为1：0.02：0.1。
[0039] 在一些具体的实施方式中，所述方法用于提取DNA型病毒核酸和/或RNA型病毒核酸；优选地，所述DNA型病毒核酸为HBV，所述RNA型病毒核酸选自HCV或HIV。
[0040] 由于使用前述试剂盒，本发明所述核酸提取方法具有通用性强、裂解比高、操作简易、一致性和稳定性好的优点，其中在简化提取步骤和优化提取结果方面的效果尤为显著，具体表现为：
[0041] (1)本发明所述方法在核酸裂解、洗涤等步骤相较于常见方法表现出显著的高效率(市面上常见的裂解结合时间约为15-30mins，本发明裂解时间为30s，结合时6.5mins，共7mins)(如中国
专利号CN201610848178.0裂解时间为20mins、CN201610069995.6为30mins、CN201810408853.7裂解8mins结合15mins)。
[0042] (2)本发明所述方法的提取过程中无需加入无水乙醇，无需烘干，降低了操作的繁琐性以及
气溶胶污染的可能。
[0043] (3)本发明所述方法进过大量实验验证优化后，整体流畅性极高，反应步骤从“需要加热且裂解时间长”到本发明的“优化配方无需加热及等待反应即混及走”，整个提取步骤一气呵成，保证了稳定性的同时也进一步的提高了效率。
[0044] 有益效果
[0045] 综上所述，与
现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046] (1)本发明所述试剂盒及其使用方法具有强通用性，可用于提取DNA型病毒和/或RNA病毒，例如，乙肝病毒、丙肝病毒和HIV病毒核酸。
[0047] (2)本发明所述试剂盒以及使用方法在提取核酸时，具有裂解比高、提取工艺简单，提取效率高，试剂稳定，检测结果一致性好，重复性高的优点。
[0048] (3)本发明所述试剂盒及其使用方法还进一步加入矿物油(尤其是
石蜡油)和Proclin950，其中矿物油能防止气溶胶蒸发、室内污染以致提高总体结果一致性，Proclin950替代叠氮化钠，降低了试剂的危害性。
附图说明
[0049] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0050] 图1为
实施例2中使用实施例1试剂盒对5x104IU/mL浓度的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0051] 图2为实施例2中使用实施例1试剂盒对5x103IU/mL浓度的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0052] 图3为实施例2中使用实施例1试剂盒对5x102IU/mL浓度的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0053] 图4为实施例3中使用正常操作的实施例1试剂盒对浓度为5.0x104IU/mL、5.0x103IU/mL、5.0x102IU/mL的HIV-1溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0054] 图5为实施例3中使用37℃
加速7天后的实施例1试剂盒对浓度为5.0x104IU/mL、5.0x103IU/mL、5.0x102IU/mL的HIV-1溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0055] 图6为实施例4中使用正常操作步骤及实施例1试剂盒对浓度为1x105IU/mL、1x104IU/mL、1x103IU/mL的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图；
[0056] 图7为实施例4中使用实施例1试剂盒开盖预混mix溶液并放置4小时候对浓度为1x105IU/mL、1x104IU/mL、1x103IU/mL的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)溶液进行提取后进行PCR检测后得到的曲线图。
具体实施方式
[0057] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
[0058] 实施例1通用型核酸提取试剂盒
[0059] 本实施例提供一种通用型核酸提取试剂盒，所述试剂盒由第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂、蛋白酶K、磁珠、矿物油和核酸内标组成，其中：
[0060] 第一试剂的组分如下所示：3.5M异硫氰酸胍、2.5mM的柠檬酸钠、166.1mM曲拉通X-100、3.3M异丙醇，
溶剂为水；
[0061] 第二试剂的组分如下所示：31.1mM无水柠檬酸、19.0mM柠檬酸钠、0.1％(v/v)Proclin950，溶剂为水；pH值为4.0；
[0062] 第三试剂的组分如下所示：5.7mM无水柠檬酸、3.7mM柠檬酸钠、0.1％(v/v)Proclin950，溶剂为水；pH值为4.0；
[0063] 第四试剂的组分如下所示：14.8mM三羟甲基氨基甲烷、5.0mM三羟甲基甲烷盐酸盐、1μg/μl的Carrier RNA；
[0064] 蛋白酶K：20mg/ml；
[0065] 磁珠：硅基磁珠，粒径为1.2μm；
[0066] 矿物油：石蜡油；
[0067] 核酸内标：盔甲核糖核酸。
[0068] 实施例2 HBV/HCV/HIV-1混合核酸的提取和检测
[0069] 使用实施例1所述通用型核酸提取试剂盒提取HBV/HCV/HIV-1混合核酸，所述方法包括以下步骤：
[0070] 1、不同浓度混合核酸样品的制备
[0071] 取浓度为5x107IU/ML的混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)原液，使用含1％Carrier RNA水进行稀释(990μl水+10μl Carrier RNA)，原液经十倍梯度稀释后分为A,B,C三个浓度梯度样本。
[0072] 经梯度稀释，A样本中混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)的含量为5x104IU/mL。B样本中混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)的含量为5x103IU/mL。C样本中混合病毒(HBV/HCV/HIV-1)的含量为5x102IU/mL。
[0073] 2、提取并检测A、B、C样本核酸
[0074] (1)往离心管中依次加入10μl蛋白酶K、10μl内标、待测样本500μl、500μl第一试剂、50μl矿物油A，振荡30s使充分裂解；加入10μl磁珠，震荡30s、磁珠吸附6mins。
[0075] (2)加入500μl第二试剂进入步骤(1)中的溶液，振荡30s后磁吸附30s，弃液保留磁珠；加入500μl第三试剂，振荡30s后磁吸附30s，弃液保留磁珠。
[0076] (3)加入60μl第四试剂进入步骤(2)中的溶液，振荡混匀30s，弃磁珠，得到的溶液即为A,B,C三个样本对应的核酸。
[0077] (4)将所得核酸与配置好的PCR反应液进行混匀，进行
荧光PCR检测。
[0078] 3、检测结果分析
[0079] 表1为样本A、B、C检测结果的CT值比对表格，图1，图2，图3对应样本A、B、C的PCR曲线图。从图中可以看出，本血液筛查提取试剂对三种浓度的样本均可检出。
[0080] 表1
[0081]
[0082]
[0083] 注：使用本发明所提供的提取试剂对三种浓度的混合病毒进行检测，每种浓度进行8个重复，分别得到的平均CT值，标注偏差，变异系数如表内所示。
[0084] 实施例3稳定性验证(37℃加速7天检测稳定性)
[0085] 为验证实施例1所述试剂盒的稳定性，设计进行以下两组实验：正常组及加速组。其中，正常组试剂的储存、使用以及全部的实验过程都控制在理想条件下，而对照组的试剂则于37℃环境下加速7天后，用来进行提取实验。
[0086] 待测样本选择HIV-1原液，进行三个浓度梯度十倍稀释，分别为：5.0x104IU/mL、3 2
5.0x10IU/mL、5.0x10IU/mL。
[0087] 两组实验提取步骤相同，具体提取步骤同实施例2。
[0088] 对上述两组实验提取得到的核酸进行实时荧光定量PCR检测，得到如图所示的结果，图4为正常组，图5为加速组，通过对比发现两组实验CT值差异不大(△CT＜1.0)，且经过加速实验后的加速组CT值反而略有提前，说明本发明内容的配方经37℃加速7天后并未产生性能降低或无法检出的现象，稳定性好。
[0089] 实施例4实时稳定性(提取试剂开盖后放置4小时)
[0090] 由于在实际临床过程中，医院一天检测的样本数量较多，获取样本的时间也有所差异，因此医院技术人员可能倾向于预先配置溶液，在获得足够样本后进行统一提取，此过程中可能由于溶液开盖放置时间较久导致提取结果出现差异。
[0091] 为验证实施例1所述试剂盒在此种情况下的稳定性，设计2组实验：正常组与测试组。其中，正常组为开盖后及时进行提取实验，测试组为开盖后完成体系配置，开盖放置4小时后对样本进行提取。
[0092] 待测样本选择三个浓度梯度稀释的HIV-1/HBV/HCV混合病毒溶液：1x105IU/mL、1x104IU/mL、1x103IU/mL，每组浓度做2个重复。
[0093] 两组实验步骤相同，区别仅在于测试组为试剂mix溶液配制完成后放置4小时再进行核酸提取，具体操作步骤及配方同实施例2。
[0094] 将两组实验提取得到的核酸进行实时荧光定量PCR实验，得到结果如表2，图6，图7所示。通过表2，图6，图7可知，经过4小时的开盖放置，测试组提取到的核酸经过PCR扩增后CT值相对正常组略微靠后(△CT＜1)，差异极小。说明开盖放置4小时对试剂的提取效率没有显著影响，两组数据CT值差异详见表2，图6为正常组PCR曲线图，图7为测试组PCR曲线图。
[0095] 表2
[0096]
[0097] 表2：使用正常组及测试组的本试剂对三种不同浓度的混合病毒进行PCR检测，分别得到的平均CT值，标准偏差，变异系数如表内所示。
[0098] 实验例1与市面上主流产品比对
[0099] 为研究本发明提取试剂盒的提取效果，我们选择分别使用本提取试剂盒以及凯杰公司提取试剂盒对同一组样本进行提取。
[0100] 样本选择为三个浓度十倍稀释的HIV-1溶液，分别为1x104IU/mL、1x103IU/mL、1x102IU/mL。
[0101] 本提取试剂配方及步骤同实施例1-2，凯杰提取试剂盒由血站相关技术工作人员操作。
[0102] 提取后的核酸与预先配好的PCR反应液混合后，使用荧光定量PCR对两种试剂盒提取的核酸进行检测。
[0103] 得到的结果如表3所示。根据表3可以看出本发明内容所研发的配方相比凯杰重复性更好(CV更小)，18个样的总体CT值不相上下甚至略有领先，标准偏差也更小。相对于凯杰，本发明拥有更快的提取速度，更高的稳定性以及更好的性价比。可以看出本发明提供的血液筛查试剂盒是十分具有竞争
力的。
[0104] 表3
[0105]
[0106] 注：使用本试剂盒与凯杰试剂盒进行比对，分别得到的平均CT值，标准偏差，变异系数如表内所示。
[0107] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
