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基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用

阅读：0发布：2022-01-10

专利汇可以提供基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了属于生物技术领域的一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用。所述制备方法为：将牦牛乳曲拉经粉碎、浸泡后采用物理辅助溶解技术进行预处理，然后调节pH至4‑7，离心后过滤，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；对其用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次水解后，离心取上清液进行超滤，得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液；浓缩后利用类蛋白反应对其进行脱苦处理，干燥后获得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。所述制备方法采用的原材料价格便宜，且获得的降糖降脂肽营养价值高、无副作用、吸收效果好，对糖尿病和高脂血症能够起到良好的辅助降糖降脂作用，在制备食源性降糖降脂食品或保健品中具有良好的应用前景。，下面是基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将牦牛乳曲拉原料粉碎至30-120目，按重量：体积比为1g:（10-30ml）加入30-50 ℃的水中，浸泡1-5 h，获得牦牛乳曲拉水溶液；采用物理辅助溶解技术对牦牛乳曲拉水溶液预处理后，调节其pH至 4-7，搅拌30-90 min；然后离心脱脂、去除杂质，收集上清液后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；
所述的物理辅助溶解技术的方式为：在压力为200-600 MPa，温度为35-65 ℃的条件下处理15-30 min；或在超声功率为1000-1500 W，温度为40-60 ℃的条件下处理20-40 min；
或在微波功率为100-700 W，温度为40-100 ℃的条件下处理10-300 s；
（2）调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2-4，加入胃蛋白酶，在25-65 ℃条件下进行酶解反应，反应时间为1-3 h；
（3）保持酶解反应体系的温度不变，调整反应体系的pH至6-8，加入胰蛋白酶，继续酶解1-3 h后，将反应体系升温至75-95 ℃，保持10-20 min，灭活其中的胃蛋白酶和胰蛋白酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液；
（4）将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后离心取上清液，并将上清液通过截流分子量为
3000-10000 Da的超滤膜，收集超滤液，得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液；
（5）将牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至质量浓度为30%-60%，调节温度至
20-65 ℃，加入蛋白酶进行类蛋白反应，反应0.5-3 h后，加热灭酶，得到苦味清淡的牦牛乳酪蛋白降糖降脂肽溶液；所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶或木瓜蛋白酶；
所述的蛋白酶加入量为：每100 g牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽加入50-1000 KU的蛋白酶；
（6）对牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液进行干燥处理，得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。
2.根据权利要求1所述的一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述胃蛋白酶的加入量为：每100 g牦牛乳曲拉加入500-1000 KU的胃蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述胰蛋白酶的加入量为：每100 g牦牛乳曲拉加入500-1000 KU的胰蛋白酶。
4.权利要求1-3任一项所述的一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法制备的降糖降脂肽。
5.权利要求4所述的降糖降脂肽在制备食源性降糖降脂食品或保健品中的应用。

说明书全文

基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，糖尿病、肥胖症、动脉硬化、脂肪肝等代谢性疾病的发病率逐年升高。据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)统计，截至2014年，全球糖尿病人数已达到3.82亿，预计到2035年，全球将有5.92亿人受到糖尿病的困扰。目前，我国糖尿病患者人数已达0.96亿。机体长期处于高血糖状态会诱发脂肪代谢紊乱，导致血脂异常，增加心血管疾病的发病率。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)公布数据显示，2012年全球约有1750万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的31％。2014发布的中国心血管病报告，我国心血管疾病患者人数为2.9亿，心血管疾病占居民各类疾病死因之首。目前治疗糖尿病和高血脂等代谢性疾病的药物均存在肝脏损伤、乳酸中毒及胃肠道不适等不良反应，因此迫切需要寻求开发天然、安全、高效的具有降糖降脂生物学活性的食源功能因子。

[0003] 曲拉是我国独有的乳资源，它是牦牛乳经脱脂后自然发酵制得的粗制奶酪，其酪蛋白含量高达70％以上。牦牛乳酪蛋白含有的多种生物活性序列，利用蛋白酶水解技术能够释放出来，产生具有降血压、抗氧化、抑菌、降糖降脂等生物学活性的多肽。

[0004] 牦牛乳酪蛋白的溶解需要在碱性pH体系下，在中性和弱酸性pH体系下溶解度很低。因此，为了充分溶解牦牛乳酪蛋白，实现蛋白酶对其高效水解，目前大多专利技术均加入大量碱液溶解酪蛋白，但是这种处理方式会导致酶解液中盐分含量过高，不仅影响产品的品质，而且高盐的摄入也会威胁人体的健康。也有利用纳滤技术对制备的牦牛乳酪蛋白降血压肽进行除盐，但此法操作繁琐且耗时、效率低，不利于工业化生产。

[0005] 此外，酪蛋白水解后会产生一系列分子量在6000Da以下，且含有疏水性氨基酸的多肽，这类多肽带有不同程度的苦味，影响其在食品领域中的应用。因此，需要对酶解产物进行脱苦处理。用活性炭吸附法可对牦牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解液进行脱苦处理，但这种方法会损失蛋白多肽中的功能成分而降低其生物学活性；以β-环状糊精为载体也可解决牦牛乳酪蛋白肽中疏水性多肽的苦味问题，然而，β-环状糊精的加入，不仅对蛋白肽体系引入了外源性物质，而且还会使体系产生一定的焦糊异味。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

[0008] 一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法，包括以下步骤：

[0009] (1)将牦牛乳曲拉原料粉碎至30-120目，按重量：体积比为1g:(10-30ml)加入30-50℃的水中，浸泡1-5h，获得牦牛乳曲拉水溶液；采用物理辅助溶解技术对牦牛乳曲拉水溶液预处理后，调节其pH至4-7，搅拌30-90min；然后离心脱脂、去除杂质，收集上清液后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0010] (2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2-4，加入胃蛋白酶，在25-65℃条件下进行酶解反应，反应时间为1-3h；

[0011] (3)保持酶解反应体系的温度不变，调整反应体系的pH至6-8，加入胰蛋白酶，继续酶解1-3h后，将反应体系升温至75-95℃，保持10-20min，灭活其中的胃蛋白酶和胰蛋白酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液；

[0012] (4)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后离心取上清液，并将上清液通过截流分子量为3000-10000Da的超滤膜，收集超滤液，得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液；

[0013] (5)将牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至质量浓度为30％-60％，调节温度至20-65℃，加入蛋白酶进行类蛋白反应，反应0.5-3h后，加热灭酶，得到苦味清淡的牦牛乳酪蛋白降糖降脂肽溶液；

[0014] (6)对牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液进行干燥处理，得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。

[0015] 步骤(1)中所述的物理辅助溶解技术的方式为：在压力为200-600MPa，温度为35-65℃的条件下处理15-30min；或在超声功率为1000-1500W，温度为40-60℃的条件下处理
20-40min；或在微波功率为100-700W，温度为40-100℃的条件下处理10-300s。

[0016] 步骤(2)中所述胃蛋白酶的加入量为每100g牦牛乳曲拉加入500-1000KU的胃蛋白酶；其中，1U定义为40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的量。

[0017] 步骤(3)中所述胰蛋白酶的加入量为每100g牦牛乳曲拉加入500-1000KU的胰蛋白酶；其中，1U定义为40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的量。

[0018] 步骤(5)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶或木瓜蛋白酶。

[0019] 步骤(5)中所述蛋白酶的加入量为：每100g牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽加入50-1000KU的蛋白酶；其中，1U定义为40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的量。

[0020] 所述的一种基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的制备方法获得的降糖降脂肽。

[0021] 所述的降糖降脂肽在制备食源性降糖降脂食品或保健品中的应用。

[0022] 所述的降糖降脂肽能单独使用或与天然降糖降脂活性成分复配使用。

[0023] 本发明的有益效果为：所述制备方法通过超高压/超声波/微波辅助技术结合模拟胃肠消化水解模式，有效提高了酪蛋白的水解度，实现了活性氨基酸序列的可控释放，提高其胃肠稳定性；采用的类蛋白反应修饰脱苦技术在无损多肽生物学活性的基础上解决了降糖降脂肽的苦味问题；而且所述制备方法采用的原材料价格便宜，降低了生产成本，获得的降糖降脂肽营养价值高、无副作用、吸收效果好，对糖尿病和高脂血症能够起到良好的辅助降糖降脂作用，在制备食源性降糖降脂食品或保健品中具有良好的应用前景。

具体实施方式

[0024] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。

[0025] 实施例1：

[0026] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入200mL 40℃的水浸泡3h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在压力为300MPa，温度为50℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液20min后，调节其pH至5，搅拌30min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0027] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2.0，加入胃蛋白酶50KU，40℃水浴条件下进行酶解反应，反应1h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶50KU，继续水解2h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为22.8％；

[0028] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后于4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，得到150mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为7.5g；

[0029] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至20mL，调整溶液温度至50℃，加入木瓜蛋白酶45KU反应1h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为2。

[0030] 上述实验步骤中各实验数据按照下述测定方法获得：

[0031] (1)水解度的测定(三硝基苯磺酸法)：

[0032] 吸取0.5mL已灭酶的牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，冷却后，利用1％十二烷基硫酸钠定容至25mL，静置。取0.125mL上述酶解液稀释液与1mL磷酸缓冲液(pH 8.2，0.2mol/L)和1mL的0.1％三硝基苯磺酸溶液混合，于50℃水浴摇床上避光反应。60min后加入2mL
0.1mol/L的HCl溶液终止反应，室温静置30min后，于420nm下测定其吸光度值。利用0-5.0×
10-3mol/L浓度的L-亮氨酸绘制标准曲线。利用下式计算水解度。

[0033]

[0034] 式中，h：表示水解物中每克被裂解的肽键毫摩尔数(meq/g protein)；htot：表示每克原料蛋白质中总的肽键毫摩尔数。

[0035] (2)灰分的测定(高温灼烧法)：

[0036] 称取3g牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉置于已恒重的坩埚中，加入1mL24％乙酸镁溶液，使牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉完全润湿。放置10min后，在水浴上将水分蒸干后，先在电热板上以小火加热使牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉充分炭化至无烟，然后置于马弗炉中，在550℃±25℃灼烧4h。冷却至200℃左右，取出，放入干燥器中冷却30min，称量。

[0037]

[0038] 式中：X1—试样中灰分的含量，g/100g；

[0039] m0—氧化镁(乙酸镁灼烧后生成物)的质量，g；

[0040] m1—坩埚和灰分的质量，g；

[0041] m2—坩埚的质量，g；

[0042] m3—坩埚和试样的质量，g；

[0043] (3)苦味值的测定(感官评价法)：

[0044] 将待测样品(牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉)以5％质量浓度溶于水中，按1:1比例进行梯度稀释；将载体样品按5％质量浓度溶于水中，按1:1比例进行梯度稀释；利用三点实验法进行感官评价，将同等稀释度的两个载体样品和一个待测样品随机编号，提供给受试者，检测能否区别它们的苦味程度；以不能尝出苦味差别的最小稀释倍数表示苦味值，该稀释倍数越大则苦味值越高，说明产品的苦味程度越重。

[0045] 实施例2：

[0046] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入200mL 40℃的水浸泡3h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在压力为350MPa，温度为50℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液20min后，调节其pH至5.5，搅拌30min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0047] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至3.0，加入胃蛋白酶80KU，45℃水浴条件下进行酶解反应，反应1h；调整酶解反应体系的pH至6.0，加入胰蛋白酶60KU，继续水解1.5h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为20.5％；

[0048] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，得到150mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为7.1g；

[0049] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至15mL，调整温度至50℃，加入风味蛋白酶55KU反应0.5h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为3。各数据的测定方法同实施例1。

[0050] 实施例3：

[0051] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入200mL 45℃的水浸泡1.5h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在超声功率为1500W，温度为40℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液20min后，调节其pH至6.5，搅拌50min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0052] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2.5，加入胃蛋白酶100KU，40℃水浴条件下进行酶解反应，反应0.5h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶80KU，继续水解1h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为21.2％；

[0053] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为8000Da的超滤膜，收集超滤液，得到150mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为7.2g；

[0054] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至18mL，调整温度至40℃，加入胰蛋白酶40KU反应1.5h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为5。各数据的测定方法同实施例1。

[0055] 实施例4：

[0056] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入150mL 45℃的水浸泡2h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在超声功率为1000W，温度为50℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液40min后，调节其pH至6.0，搅拌60min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0057] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至3.5，加入胃蛋白酶60KU，37℃水浴条件下进行酶解反应，反应2h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶100KU，继续水解2h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为22.5％；

[0058] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，得到100mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为7.2g；

[0059] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至20mL，调整温度至35℃，加入胃蛋白酶60KU反应1h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为6。各数据的测定方法同实施例1。

[0060] 实施例5：

[0061] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入300mL 45℃的水浸泡2h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在微波功率为400W，温度为80℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液100s后，调节其pH至5.5，搅拌90min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0062] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至4.0，加入胃蛋白酶100KU，37℃水浴条件下进行酶解反应，反应1.5h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶50KU，继续水解3h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为23.8％；

[0063] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为6000Da的超滤膜，收集超滤液，得到250mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为6.8g；

[0064] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至15mL，调整温度至50℃，加入风味蛋白酶35KU反应3h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为4。各数据的测定方法同实施例1。

[0065] 实施例6：

[0066] 1)称取10g粉碎至80目的牦牛乳曲拉，加入250mL 40℃的水浸泡2h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在微波功率为500W，温度为60℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液70s后，调节其pH至6.0，搅拌45min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0067] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至4.0，加入胃蛋白酶50KU，40℃水浴条件下进行酶解反应，反应0.5h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶80KU，继续水解2h后，将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为21.1％；

[0068] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为6000Da的超滤膜，收集超滤液，得到200mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为5.0g；

[0069] 4)将牦牛乳曲拉酪蛋白降糖降脂肽溶液浓缩至10mL，调整温度至50℃，加入木瓜蛋白酶50KU反应0.5h，加热灭酶。经干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为3。各数据的测定方法同实施例1。

[0070] 实施例7(对比例1)：

[0071] 称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入200mL 40℃的水浸泡3h，获得牦牛乳曲拉水溶液，调节其pH至9.0，搅拌30min；然后在转速为4000r/min的条件下离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液。

[0072] 调整牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2.0，加入胃蛋白酶50KU，37℃水浴条件下，进行水解反应，反应2h；然后调整反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶50KU，继续水解2h，水解过程中不断加入碱液维持反应体系pH不变；将反应体系升温至85℃，保持10min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液水解为15.4％。

[0073] 将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后，4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，浓缩后调整溶液温度至50℃，加入木瓜蛋白酶45KU反应1h，加热灭酶。干燥后得到牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽。测定产品的灰分含量超过5％，苦味值为3。测定方法同实施例1。

[0074] 实施例8(对比例2)：

[0075] 1)称取10g粉碎至60目的牦牛乳曲拉，加入200mL 40℃的水浸泡3h，获得牦牛乳曲拉水溶液；在压力为300MPa，温度为60℃的条件下处理牦牛乳曲拉水溶液25min后，调节其pH至5.5，搅拌40min；然后在转速为4000r/min的条件下，离心20min，收集上清后进行过滤，收集滤液，得到牦牛乳曲拉酪蛋白溶液；

[0076] 2)调节牦牛乳曲拉酪蛋白溶液的pH至2.0，加入胃蛋白酶40KU，40℃水浴条件下进行酶解反应，反应1.5h；调整酶解反应体系的pH至7.0，加入胰蛋白酶60KU，继续水解1.5h后，将反应体系升温至75℃，保持20min，灭酶终止反应，得到牦牛乳曲拉酪蛋白水解液，测定此时酶解液的水解度为25.3％；

[0077] 3)将牦牛乳曲拉酪蛋白水解液冷却后于4000r/min离心15min后取上清液，并将上清液通过截流分子量为10000Da的超滤膜，收集超滤液，得到150mL牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液，其中降糖降脂肽的含量为7.0g；

[0078] 4)称取1.8g β-环状糊精，加入100mL水，使其充分溶解，获得载体溶液；然后将牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽溶液加入到载体溶液中，室温搅拌2h后，经喷雾干燥制得牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽粉。测定产品的灰分含量小于2％，苦味值为15，并伴有一定的异味(焦糊味)。通过上述实施例和对比例可知，本发明的方法可有效提高牦牛乳酪蛋白的水解度，显著降低多肽产品中的灰分含量和苦味值。本发明的方法无需后续繁琐的脱盐环节，利于工业化生产，制得产品风味良好。

[0079] 实施例9：牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽的效果测定

[0080] 1.实验材料与方法

[0081] 1.1实验材料

[0082] 1)牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽

[0083] 实施例1制得的牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽。

[0084] 2)实验动物与饲料

[0085] C57BL/6小鼠，雄性，4周龄，40只，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司；高脂饲料与普通饲料，购自于美国Research Diets公司。

[0086] 3)主要试剂

[0087] 葡萄糖测试盒、总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒和低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

[0088] 1.2实验方法

[0089] 1)肥胖模型的建立

[0090] 40只C57BL/6小鼠以基础饲料适应性喂养1周后，根据体重进行随机分组。32只C57BL/6小鼠连续饲喂高脂饲料12周，建立肥胖C57BL/6小鼠模型。8只C57BL/6小鼠饲喂正常饲料，作为正常对照组。

[0091] 2)实验设计

[0092] 将32只C57BL/6肥胖小鼠，分为4组，每组8只，分别设为肥胖模型对照组、牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽低剂量组、牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽中剂量组和牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽高剂量组。具体实验动物分组和给药剂量如表1所述。

[0093] 表1 实验动物分组和灌胃剂量

[0094]组别喂养饲料灌胃物质剂量(mg/kg b.w.)
正常对照组正常饲料蒸馏水 /
肥胖模型对照组高脂饲料蒸馏水 /
牦牛乳酪蛋白肽低剂量组高脂饲料牦牛乳酪蛋白肽 50
牦牛乳酪蛋白肽中剂量组高脂饲料牦牛乳酪蛋白肽 100
牦牛乳酪蛋白肽高剂量组高脂饲料牦牛乳酪蛋白肽 200

[0095] 3)饲养方式

[0096] 每组8只C57BL/6小鼠，分为2只鼠笼饲养，5组实验同时进行，根据表1的设计饲喂不同饲料，正常给水。

[0097] 4)给药方式

[0098] 每周给药前测定大鼠体重，根据不同组别的不同给药剂量，溶于相同体积的蒸馏水中，以灌胃的方式给药。每天定时灌胃给药一次。实验连续6周，实验期间小鼠自由饮水和摄食。

[0099] 5)指标测定

[0100] 实验结束后，禁食12h，测定体重。麻醉后断头取血，收集血清，测定血清中空腹血糖、甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)。

[0101] 2.实验结果与分析

[0102] 不同处理组C57BL/6小鼠体重和血液各项生化指标，如表2所述。

[0103] 表2 不同处理组C57BL/6小鼠体重和血液各项生化指标

[0104]

[0105] 注：数值以平均值±标准差的形式表示；不同字母代表差异显著，p<0.05。

[0106] 实验前，高脂模型对照组以及各剂量组小鼠体重均显著高于正常对照组(p<0.05)，说明高脂膳食连续喂养小鼠12周能够成功建立肥胖小鼠模型。实验后，与高脂模型组相比，各剂量组小鼠体重均显著下降(p<0.05)，而且，呈现剂量依赖效应。

[0107] 与高脂模型组相比，中剂量组和高剂量组小鼠的空腹血糖显著低于高脂模型组(p<0.05)，与正常对照组之间差异不显著(p>0.05)。

[0108] 各剂量组小鼠TG、TC和LDL-c含量显著低于高脂模型组(p<0.05)，各剂量组之间差异不显著(p>0.05)。

[0109] 各剂量组小鼠HDL-c含量显著高于高脂模型组(p<0.05)，中剂量组、高剂量组与正常对照组之间差异不显著(p>0.05)。

[0110] 3.实验结论

[0111] 100mg/kg b.w.剂量的牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽，能够有效控制肥胖C57BL/6小鼠体重的增加，降低其空腹血糖以及血液中的TG、TC和LDL-c含量，升高其血液中的HDL-c含量。长期服用本发明所述的牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽对高血糖和高脂血症具有一定的辅助疗效。

[0112] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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基于牦牛乳曲拉的酪蛋白降糖降脂肽及其制备方法和应用

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