一种平板培养基酶活性测定方法
阅读：326发布：2024-01-13
专利汇可以提供一种平板培养基酶活性测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种培养基中酶活性的测定方法，尤其涉及一种平板培养基酶活性测定方法，包括：①取固体培养基，加入缓冲液， 粉碎 ；②加入琼胶酶进行处理；③取琼胶酶处理液离心上清进行酶活性测定。本发明将琼脂在较低 温度 粉碎结合琼胶酶作用，可以很好地提取出需要测定的酶，解决了预灌装平板培养基中酶活性测定的问题，有利于预灌装平板培养基产品的 质量 控制。，下面是一种平板培养基酶活性测定方法专利的具体信息内容。
1.一种平板培养基酶活性测定方法，其特征在于：①取固体培养基，加入缓冲液，粉碎；
②加入琼胶酶进行处理；③取琼胶酶处理液离心上清进行酶活性测定。
2.根据权利要求1，其特征在于：平板培养基是胰酪大豆胨琼脂培养基，营养琼脂培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，普通肉汤琼脂。
3.根据权利要求1，其特征在于：悬浮固体培养基的缓冲液为磷酸盐缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，Tris-盐酸缓冲液。
4.根据权利要求1，其特征在于：粉碎琼脂的方法为在较低的温度，如4～25℃，采用研磨，机械搅拌，超声等方式，将琼脂块粉碎。
5.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶是α-琼胶酶或β-琼胶酶。
6.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶来源于微生物，如弧菌属、假交替单胞菌属、噬纤维菌属、假单胞菌属、交替单胞菌属、不粘柄菌属、链霉菌属、噬琼胶菌属、芽胞杆菌，不动杆菌，或者采用基因工程技术表达分离纯化的重组琼胶酶。
7.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶水解琼脂培养基的温度0～40℃，优选的是37～
40℃。
8.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶水解琼脂培养基的pH为3.0～10.0，优选pH6.0～8.0。
9.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶水解琼脂培养基的时间为1～600分钟，优选的是30～120分钟。
10.根据权利要求1，其特征在于：琼胶酶的用量是0.1～100U/ml，优选的是0.5～5U/ml。
一种平板培养基酶活性测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种培养基中酶活性的测定方法，尤其涉及一种平板培养基酶活性测定方法。
背景技术
[0002] 平板培养基(culture plate)是用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，也称为培养平板(plate)，也叫平面培养基、平皿培养基。平板培养基常用于微生物分离、测定菌丝生长速度、观察菌落的形态、拮抗实验、测定接种空间杂菌数。无菌培养基平皿作为一种传统微生物培养以及检测用培养基在科研和制药生产中使用十分普遍，例如微生物培养鉴定、无菌环境监测等。
[0003] 微生物污染是药品质量评估的重要指标，药品生产过程中主要污染来自于微生物，根据《药品生产质量管理规范》规定，药品生产企业洁净区环境需监控浮游菌和沉降菌。结合医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法(GB/T-16294-2010)，药品生产企业必须每天高效、准确地监测药品生产环境中的微生物负荷。为避免外源性污染进人药品生产车间，
2010年版GMP规定：制药企业需对洁净环境进行动态或静态监测，使用沉降菌平皿、空气浮游菌平皿和表面接触皿评估无菌生产的微生物状况。制药企业一般通过自配和购买无菌预灌装培养平皿满足其大量使用的需求。无菌预灌装培养平皿采用双层或三层抽真空包装，通过伽马射线终端灭菌，在使用时根据物料传递程序剥除外层包装，避免外源性的微生物和颗粒通过物料传递过程污染无菌生产区，因此受到无菌药品生产企业的青睐。
2010年版GMP规定：制药企业需对洁净环境进行动态或静态监测，使用沉降菌平皿、空气浮游菌平皿和表面接触皿评估无菌生产的微生物状况。制药企业一般通过自配和购买无菌预灌装培养平皿满足其大量使用的需求。无菌预灌装培养平皿采用双层或三层抽真空包装，通过伽马射线终端灭菌，在使用时根据物料传递程序剥除外层包装，避免外源性的微生物和颗粒通过物料传递过程污染无菌生产区，因此受到无菌药品生产企业的青睐。
[0004] 无菌产品在生产过程中需要进行环境监测，对于抗生物类药品生产车间环境监测所使用的培养基，沉降菌需要在环境中暴露4h，在放置过程中会有抗生素粉末落入，尤其在分装过程中粉末量大，而抗生素会抑制落入平皿中微生物的生长，需要在培养基平皿的配制过程中加入一定量的抗生素灭活酶，中和落入的抗生素粉末。使用时选取在生产过程中粉尘量大的采样点进行取样，一般为分装工序，在该位点放置无菌空皿，打开皿盖，放置4小时，然后进行培养评估环境中微生物污染情况。
[0005] 含抗生素灭活酶的预罐装平皿培养基酶活性是其质量关键，抗生素灭活酶需要在45～50℃温度条件下加入溶化的琼脂培养基中，待冷却凝固后如何进行固体培养基中酶活性的分析是加酶平板培养基面临的问题。
[0006] 中国发明专利CN 104263808 A公开了一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法，采用向平板中加入青霉素溶液，均匀覆盖平板，30～40℃反应后取反应液与中性羟胺溶液混合，反应一段时间后混合液加入硫酸铁胺，观察溶液颜色变化判断酶活性是否达到检测限。该方法将酶的底物抗生素加在固体培养基表面，属于液体和固体接触反应，其反应只能发生在固液界面，无法反应培养基中酶的活性。美国专利US 5,814,487公开了一种琼胶酶在核酸分离中的应用方法，在离液剂存在下琼脂加热到65～70℃液化，然后温度降到37℃，用琼胶酶作用，释放出核酸进行后续的提取。利用琼胶酶降解琼脂糖从琼脂糖凝胶中回收DNA和RNA，已经被证明是最好的方法之一。目前，已经有成熟的方法进行DNA的回收：PCR产物利用高品质低融点琼脂糖进行电泳，切下感兴趣的条带，将其放入小管里融化(温度一般在65℃～70℃)，冷却30s，加入适量琼胶酶，每100μL凝胶加入1.5μL琼胶酶(5000U/ml)，40℃左右保温直至琼脂糖完全液化，如此处理的DNA样品即可放入冰箱备用。
[0007] 但含有抗生素灭活酶的琼脂培养基如果加热到65～70℃，酶活性损失很大，后续的检测就无法准确确定平皿培养基中酶的活性。离液剂KI，NaI会影响后续的酶活性分析方法。
[0008] 本领域迫切需要一种能测定平皿培养基中酶活性的方法。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种含酶预灌装平板培养基中酶活性的测定方法，为了实现发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
[0010] 一种平板培养基酶活性测定方法：包括1，取固体培养基，加入缓冲液，粉碎；2，加入琼胶酶进行处理；3，取琼胶酶处理液离心，上清用于酶活性测定。
[0011] 本发明的固定培养基是胰酪大豆胨琼脂培养基(Tryptose soya Agar，TsA)，营养琼脂培养基(Nutrient Agar，NA)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)，普通肉汤琼脂。
[0014] 本发明的琼胶酶是α-琼胶酶或β-琼胶酶，来源于微生物，如弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、噬纤维菌属(Cytophaga)，假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、不粘柄菌属(Asticcacaulis)、链霉菌属(Streptomyces)、噬琼胶菌属(Agarivorans)、芽胞杆菌(Bacillus sp.)，不动杆菌(Acinetobacter sp.)，或者采用基因工程技术表达分离纯化的重组琼胶酶。
[0016] 本发明琼胶酶的用量是0.1～100U/ml，优选的是0.5～5U/ml。
[0017] 含酶固体培养基经本发明的方法处理后其中的酶得到释放，可以进一步用液体中酶活性测定方法进行分析，从而确定预灌装平板中酶活性，从而对产品质量进行评价和稳定性的考察，对于提高产品的稳定性和质量有着十分重要的意义。
[0018] 现有文献从琼脂中提取其它产品通常需要加热，并且认为琼脂要经过溶球态(molten)转变，琼胶酶才会对其作用。然而琼脂加热到65℃及以上会引起其中的酶很快失活。本发明将琼脂在较低温度粉碎结合琼胶酶作用，可以很好地提取出需要测定的酶，解决了预灌装平板培养基中酶活性测定的问题，有利于预灌装平板培养基产品的质量控制。具体实施例
[0019] 下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。
[0020] 实施利一 碘量法测定青霉素酶活性
[0021] 青霉素酶、头孢菌素酶、金属β-内酰胺酶均属于β-内酰胺酶类，可以用以下方法进行酶活性的测定。
[0022] 配制溶液：
[0023] 醋酸钠缓冲液(pH4.5)：取冰醋酸13.86mL，加水定容至250mL，另取结晶醋酸钠27.30g，加水定容至200mL，两液混合均匀。
[0024] 0.01mol/L碘滴定液：取碘1.27g，加入碘化钾3.6g，与少量水溶解后，用醋酸钠缓冲溶液定容至1000mL，摇匀待用。
[0026] 淀粉指示液：取可溶性淀粉0.5g，加水5mL搅匀后，缓缓倾入100mL沸水，边加边搅拌，继续煮沸2min，冷却，倾取上层清液，即得。
[0027] 酶活性测定：
[0028] 稀释酶液1mL与青霉素(10000u/L)2mL迅速混匀，在37℃水浴1h，将其全部移入加有25mL碘滴定液(0.01rnol/L)的三角瓶中，在室温暗处放置15min，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至将近无色时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。硫代硫酸钠滴定液消耗的体积为A(mL)。
[0029] 空白对照青霉素溶液2mL，在37℃放置1h，精密加入上述碘滴定液(0.01moL/L)25mL，在室温暗处放置15min，然后精密加青霉素酶稀释液1mL，用硫代硫酸钠(0.01moL/L)滴定，硫代硫酸钠滴定液消耗的体积为B(mL)。按照下式计算：
[0030] E＝(B-A)*M*F*D/V＝744D(B-A)
[0031] E：青霉素酶活力(u/mL)；
[0032] B：空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的体积(mL)；
[0033] A：样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的体积(mL)；
[0034] M：硫代硫酸钠滴定液的浓度，0.01mol/L：
[0035] F：lmmoL硫代硫酸钠相当于青霉素的单位数，其值为74394u/mmoL：
[0036] D：青霉素酶稀释倍数；
[0037] V：：酶液体积，1mL。
[0038] 实施例二 羟胺法测定β-内酰胺酶活性
[0039] 配制溶液：
[0040] 0.25mol/L盐酸羟胺：取盐酸羟胺1.7379，以水溶解，定容至100mL。
[0041] 碱性缓冲液(pH12.5)：取NaOH 4.32g，无水乙酸钠0.52g溶解后，定容至500mL。
[0042] 0.125mol/L中性羟胺(pH6.75)：0.25mol/L盐酸羟胺与碱性缓冲液等体积混合即成。
[0043] 0.25mol/L硫酸铁铵：取硫酸铁铵12.05g，以0.15mol/L硫酸溶液悬浮，加热使之溶解，冷却后以0.15mol/L硫酸定容至100mL，过滤除去不溶物。
[0044] 50mrnol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH6.0)：取柠檬酸钠7.35g，溶于约400mL水，以1mol/L盐酸调pH6.0后定容至500mL，该溶液用来配制青霉素液，保持青霉素的稳定性。
[0045] 青霉素标准曲线的绘制：
[0046] 取80万单位/瓶的青霉素钠0.4000g，用缓冲液溶解定容至100mL，分别取母液50、100、200、250、500、750μl，加缓冲液补充至1.0mL。依次加入0.125mol/L中性羟胺1.0mL、
95％乙醇1.0mL，反应3min，再加入0.25mmol/L硫酸铁胺2.0mL，混匀后，待反应不再产生气泡后，以缓冲溶液(pH6.0)代替青霉素标准液做为空白对照，测OD515nm吸收值，绘制标准曲线。
95％乙醇1.0mL，反应3min，再加入0.25mmol/L硫酸铁胺2.0mL，混匀后，待反应不再产生气泡后，以缓冲溶液(pH6.0)代替青霉素标准液做为空白对照，测OD515nm吸收值，绘制标准曲线。
[0047] 将青霉素酶溶液进行适当稀释，使酶活性大约在10000u/mL左右，取10mL稀释酶液与青霉素液(10000u/L)20mL混合均匀，37℃保温水浴，分别用羟胺法测定水浴0h和水浴1h的青霉素含量，并根据标准曲线计算出青霉素的降解量，进而根据公式推算出青霉素酶的活性。
[0048] E＝(C后-C前)*V1*D/V2＝3D(C后一C前)
[0049] E：酶活力单位数，u/mL：
[0050] C后：1h后测得OD515nm对应的青霉素浓度，u/mL；
[0051] C前：1h前测得OD515nm对应的青霉素浓度，u/mL；
[0052] V1：混合液的体积3mL；
[0053] D：酶液的稀释倍数；
[0054] V2：1mL酶液
[0055] 实施例三 大环内酯酶活性测定法
[0056] 采用分光光度法，对硝基苯丁酸酯(p-Nitrophenyl butyrate，p-NPB)在阿奇霉素酶的作用下产生的对硝基苯酚含量与其405nm的吸收值成正比，摩尔消光系数ε＝24,000 M-1 cm-1。在pH7.5，37℃条件下，一定时间内对硝基苯丁酸酯酶水解后吸收值的增加反应了酶活力。
[0057] 测活缓冲液为，50mM HEPES pH 7.5，0.2％ Triton X-100)，取预先37℃温度平衡后的测活缓冲液1ml，加入对硝基苯丁酸酯使其终浓度为1mM，加入样品10μl，37℃反应30min，测定反应液405nm的吸收值，以不含酶的样品缓冲液做空白。
[0058] 酶活性单位(U)定义为在pH 7.5，37℃条件下，每分钟水解产生1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量，
[0059] 实施例四 酶的热稳定性试验
[0060] 取青霉素酶、头孢菌素酶、金属β-内酰胺酶和大环内酯酶冻干粉各4支，按说明书溶解后分别放37℃、50℃、65℃和95℃，放置一定时间后进行酶活性测定，以未处理的酶活性测定结果作为100％，计算各温度酶活性残留百分比，结果见表1。结果表明，37℃放置1小时，酶活性损失不超过5％，50℃处理1小时后酶活性保留约一半，而65℃条件下酶失活比较快，1小时后酶活性不超过30％，在95℃酶几乎在短时间就完全失去活性，因此在较高温度溶化琼脂平板或短时间沸水液化琼脂后进行酶活性测定不可行，酶在处理过程中已经失去大部分活性或完全失去活性。
[0061] 表1 不同温度酶活性残留
[0062]
[0063]
[0064] 实施例五 含酶平板培养基的制备
[0065] 1、胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基配方
[0066]
[0067] 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。
[0068] 2、沙氏葡萄糖琼脂培养基
[0069]
[0070] 除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
[0071] 3、普通肉汤培养基
[0072]
[0073] 除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为pH 7.4±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
[0074] 灭菌后的琼脂培养基冷却至50～60℃，根据需要加入青霉素酶、头孢菌素酶、金属β-内酰胺酶或者大环内酯酶，混合均匀，青霉素酶溶解在琼脂培养基中的浓度为10万单位/mL，头孢菌素酶4万单位/ml，金属β-内酰胺酶50万单位/ml，大环内酯酶20U/ml。在无菌操作室，用灌装机将25mL的加酶培养基均匀平铺于平皿底板，冷却凝固，盖上平皿上盖。按照10皿/袋的包装规格叠好，真空密封，最后包装装箱后经钴60-γ射线灭菌，辐照剂量为20kGY。得到成品含酶培养基平皿。
[0075] 实施例六 含酶平板培养基酶活性的测定
[0076] 1、平板培养基中头孢菌素酶活性测定
[0077] 取含头孢菌素酶的平板琼脂培养基2g，加入不同量的琼胶酶溶液，再补加缓冲液使总体积为6ml。用玻璃匀浆器将琼脂粉碎，40℃水浴1小时，取1.5ml，加入3ml青霉素底物，采用碘量法进行头孢酶活性的测定，以不加琼胶酶的缓冲液组做对照，结果见表2，其中琼脂培养基中头孢菌素酶的理论含量为1.33万单位/ml。实验结果表明，琼胶酶可以帮助提高头孢菌素酶测定的回收率。
[0078] 表2 不同琼胶酶对酶活性测定的影响。
[0079]实验组 1 2 3 4 5 6
琼脂培养基(g) 2 2 2 2 2 2
琼胶酶(U/ml) 0 0.1 0.5 1 5 20
头孢菌素酶(万单位/ml) 0.56 0.87 0.91 0.93 1.30 1.31
回收率 42.1％ 65.4％ 68.4％ 70.0％ 97.7％ 98.5％
琼脂培养基(g) 2 2 2 2 2 2
琼胶酶(U/ml) 0 0.1 0.5 1 5 20
头孢菌素酶(万单位/ml) 0.56 0.87 0.91 0.93 1.30 1.31
回收率 42.1％ 65.4％ 68.4％ 70.0％ 97.7％ 98.5％
[0080] 2、平板培养基中青霉素酶活性测定
[0081] 取含青霉素酶的平板琼脂培养基2g，加入不同量的琼胶酶溶液，再补加缓冲液使总体积为6ml。冰浴条件下超声粉碎琼脂培养基，超声功率500W，30分钟，工作5S，间歇5S。超声粉碎后35℃水浴2小时，适当稀释后取1.5ml，加入3ml青霉素底物，采用碘量法进行青霉素酶活性的测定，以不加琼胶酶的缓冲液组做对照，结果见表3，其中琼脂培养基中青霉素酶的理论含量为3.33万单位/ml。实验结果表明，琼胶酶可以帮助提高头孢菌素酶测定的回收率。
[0082] 表3 不同琼胶酶对酶活性测定的影响。
[0083]实验组 1 2 3 4 5 6
琼脂培养基(g) 2 2 2 2 2 2
琼胶酶(U/ml) 0 0.2 0.5 1 10 30
头孢菌素酶(万单位/ml) 1.49 2.24 2.35 2.36 3.18 3.42
回收率 44.7％ 67.3％ 70.5％ 70.7％ 95.6％ 102.7％
琼脂培养基(g) 2 2 2 2 2 2
琼胶酶(U/ml) 0 0.2 0.5 1 10 30
头孢菌素酶(万单位/ml) 1.49 2.24 2.35 2.36 3.18 3.42
回收率 44.7％ 67.3％ 70.5％ 70.7％ 95.6％ 102.7％
[0084] 实施例七 琼胶酶活性测定
[0085] 标准曲线的制作
[0086] 准确称取105℃干燥至恒重的半乳糖0.3620g，加蒸馏水溶解定容至100mL。精确量取该溶液10ml置于100mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，做为标准半乳糖溶液，其浓度为2μmol/mL。按表4在25mL比色管中加入溶液，沸水浴反应5min后加入3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)，冷却定容后于540nm下测OD值，以OD540nm吸收值为纵坐标，半乳糖的量(μmol/mL)为横坐标绘制标准曲线。
[0087] 表4 半乳糖标准曲线加样表
[0088]
[0089] 琼胶酶活性的测定
[0090] 取琼胶酶溶液1ml于比色管中，再加入1ml磷酸缓冲液(pH7.6，20mM)，3ml用磷酸盐缓冲液)配制的浓度为1.2％的琼脂糖底物，40℃反应10min后，加入1.5mLDNS试剂，置于沸水浴中5min，然后用流动水迅速冷却，加水至25mL，在540nnl处测吸光值，以灭活的酶液加入底物并与DNS试剂混合煮沸作为空白对照。根据标准曲线分析，计算琼胶酶溶液的酶活力，每分钟降解琼脂糖产生1μl半乳糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。
[0091] 实施例八 离液剂对琼脂培养基粉碎的影响
[0092] 参考文献，取含头孢菌素酶的平板琼脂培养基2g，加入3ml 6M KI和3ml琼胶酶溶液，用玻璃匀浆器将琼脂粉碎，40℃水浴1小时，取1.5ml，加入3ml青霉素底物，采用碘量法进行头孢酶活性的测定，以不加琼胶酶的缓冲液组做对照，结果头孢菌素酶活性为0，即在高浓度的KI存在下酶活性测定方法受到很大干扰，无法进行酶活性测定。
[0093] 实施例九 产琼胶酶狐菌的培养及琼胶酶的分离
[0094] 一、人工海水
[0095] 柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠19.45g/L，氯化镁8.8g/L，硫酸钠3.24g/L，氯化钙1.8g/L，碳酸氢钠0.16g/L，溴化钾0.08g/L，氯化锶34.0mg/L，硼酸22mg/L，硅酸钠4.0mg/L，氟化钠2.4mg/L，磷酸氢二钠8.0mg/L，氯化铵1.1mg/L，硝酸0.9ul/L。
[0096] 二、平板培养基
[0097] 蛋白胨5g/L，酵母粉，1g/L，琼脂粉15g/L，人工海水1000mL
[0098] 培养基调pH7.6，灭菌后倒平板，白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)NBRC102603菌种冻干粉少量用无菌水溶解后划板，平板置于28℃培养箱内培养2d，然后置于4℃冰箱中保存。
[0099] 三、液体培养基
[0100] 蛋白胨5g/L，酵母粉，1g/L，琼脂粉5g/L，人工海水1000mL
[0104] 透析后所得酶液通过0.22μm的微孔滤膜以除去不溶性杂质，上样于20mmol/L pH 7.2 Tris-HCI缓冲液平衡的DEAE Fast Flow凝胶柱XK16进行离子交换层析，用同样缓冲液配制的含NaCI(0～0.5mol/L)的梯度溶液洗脱，流速约为10mI/min，检测波长为280nnl，收集洗脱峰，测定洗脱峰酶的纯度和酶活力。
[0105] 将DEAE洗脱峰取3mL上样于20mM pH 7.2 Tris-HCI缓冲液-0.25M NaCL平衡的Superdex 75凝胶柱(2.0cmX80cm)进行凝胶柱层析，用20mmol/L pH7.2 Tris-HCI-0.25M NaCL缓冲液洗脱，控制流速为1mL/min。洗脱液经紫外检测收集洗脱峰，SDS-PAGE检测酶纯度及活力。电泳结果显示酶纯度达到90％以上，酶活力达到77U/ml，酶比活性达到758u/mg。
[0106] 实施例十 重组琼胶酶的表达及纯化
[0107] 根据GenBank：M73783.1编码β-琼胶酶成熟肽基因序列464……1270全基因合成β-琼胶酶编码基因，经测序确证后将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32a的Nde I和BamH I位点之间不带标签表达。取1μl质粒DNA加入100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中转化，在Amp平板上涂布培养。挑取转化菌进行表达筛选，获得表达琼胶酶的大肠杆菌工程菌。
[0108] 培养基配方：Trypton(胰蛋白胨)10g/L、Yeast extract 5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。共配制2L，分装成8瓶，每瓶装250ml。培养基配好后于121℃温度下湿热消毒灭菌
20min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL(将Amp配成50mg/L的母液，用时按照1‰使用)，冷却后置4℃冰箱中备用。(Amp也可在临用前，即接菌前加入)。
20min。灭菌结束后待培养基冷却不烫手时于超净台中加Amp使其终浓度为50μg/mL(将Amp配成50mg/L的母液，用时按照1‰使用)，冷却后置4℃冰箱中备用。(Amp也可在临用前，即接菌前加入)。
[0109] 在超净台中无菌操作条件下挑取琼胶酶工程菌单菌落于25ml LB培养基(含amp)中，然后置于37℃下，180rpm摇床培养过夜。
[0110] 从培养过夜的种子培养物按1％接种量转接于LB培养基中(2.5mL种子液转接于250mL LB培养基)，接种8瓶。放大培养转接物置于37℃下，200rpm培养3小时，培养液的OD600约为0.8。然后加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，继续在22℃培养诱导10小时，然后离心收集菌体(5,000rpm×10min)。
[0111] 取约15g湿菌体，按1g湿菌体加10ml破菌液(50mM Tris-HCl buffer，10mM EDTA，0.1M NaOH，pH 7.0)悬浮菌体，即用150mL破菌液悬浮菌体，菌体悬浮液移入250ml的烧杯，然后冰浴超声破碎，超声功率约400W，每次超声5s，间歇5s，即占空比50％，共进行90个循环，共耗时约15～20min。10,000rpm离心15min，收集破菌上清。
[0112] DEAE柱层析柱平衡：平衡液(20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH 7.4)用平衡液平衡5cv(100ml)至流出液与平衡液电导及pH值一致，5ml/min。破菌上清3次透析后的样品
100mL，测定其蛋白浓度，用NaOH调节pH至7.4，补加NaCl调电导与平衡液一致，然后上层析柱，5ml/min，收集流出液。用平衡液洗涤30ml，5ml/min。用洗脱液(20mM Tris-HCl，0～
500mM NaCl，pH 7.4)洗脱10cv(200ml)，5ml/min，收集洗脱峰，并测定蛋白浓度和酶活性。
100mL，测定其蛋白浓度，用NaOH调节pH至7.4，补加NaCl调电导与平衡液一致，然后上层析柱，5ml/min，收集流出液。用平衡液洗涤30ml，5ml/min。用洗脱液(20mM Tris-HCl，0～
500mM NaCl，pH 7.4)洗脱10cv(200ml)，5ml/min，收集洗脱峰，并测定蛋白浓度和酶活性。
[0113] 取DEAE洗脱峰3mL上样于20mM pH 7.2 Tris-HCI缓冲液-0.25M NaCL平衡的Superdex75凝胶柱(2.0cmX80cm)进行凝胶柱层析，用平衡缓冲液洗脱，控制流速为1mL/min。洗脱液经紫外检测收集洗脱峰，SDS-PAGE检测酶纯度及活力。电泳结果显示酶纯度达到85％以上，酶活力达到61U/ml，酶比活性达到809u/mg。
[0114] 有部分琼胶酶存在于包含体中，经过裂解复性后再进行分离纯化。
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