一种细胞浓缩补料培养工艺
阅读：925发布：2024-02-18
专利汇可以提供一种细胞浓缩补料培养工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种细胞浓缩补料培养工艺，细胞培养过程进行补液和换液，其中，换液过程中，仅细胞被截留，目标产物随液体排出。本发明的培养工艺，在换液时，只截留细胞，不截留细胞分泌的产物，目标产物随着细胞培养上清一起排出反应器外，其与现有的浓缩补料培养工艺相比，对于自身 稳定性 较好的目标产物基本无差别，但对于自身稳定性较差的目标产物能够大大提高其产量。，下面是一种细胞浓缩补料培养工艺专利的具体信息内容。
1.一种细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，细胞培养过程进行补液和换液，其中，换液过程中，仅细胞被截留，目标产物随液体排出。
2.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述细胞培养过程进行补液和换液的步骤为：
细胞接种培养第2-3天，补液，第3-6天换液和补液，以后每天进行换液和补液的操作。
3.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述细胞接种至生产设备中培养，所述生产设备包括方瓶、摇瓶、反应器；
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进一步地，所述接种的密度为1×10cells/mL至9×10cells/mL。
4.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述补液体积均为初始培养体积的3％±0.5％。
5.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述细胞截留包括以下方式：离心、中空纤维膜截留或切向流技术。
6.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述目标产物包括以下中的任一种处理方式：
在无菌处理方式下将排出的液体储存在2-8℃条件下；
排出的液体浓缩之后无菌过滤后存储在4-8℃。
7.根据权利要求1所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述细胞为杂交瘤细胞、携带外源表达载体的中华仓鼠卵巢细胞；
进一步地，所述目标产物包括抗原、抗体；
进一步地，所述抗原包括HBsAg；
进一步地，所述抗体包括与登革热适配的抗体、PD-1抗体。
8.根据权利要求求7所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述细胞为杂交瘤细胞或表达HBsAg的中华仓鼠卵巢细胞，所述补料所用的溶液均为100g/L的水解乳蛋白；
所述细胞为表达PD-1抗体的中华仓鼠卵巢细胞，所述补料所用的溶液为Efficient feedTM C+；
进一步地，细胞培养的整个过程中控制葡萄糖浓度在1-6g/L之间。
9.根据权利要求1-8任一项所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，细胞培养的总时间为7-15天。
10.根据权利要求1-8任一项所述的细胞浓缩补料培养工艺，其特征在于，所述收集的液体还包括分离和纯化的步骤，得到目标产物；
进一步地，所述分离依次采用离心和滤膜的方式进行。
一种细胞浓缩补料培养工艺
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种细胞浓缩补料培 养工艺。
背景技术
[0002] 单克隆抗体可用于疾病的诊断和治疗，具有非常巨大的应用价 值。由于单克隆抗体分子量较大，需要复杂的翻译后修饰。而微生 物细胞不能够准确的进行翻译后修饰，因此目前单克隆抗体的生产 主要依靠哺乳动物细胞表达。
[0003] 目前业界用于哺乳动物细胞培养的方式主要分为四种：批次培 养(batch)、补料批次培养(fed-batch)、浓缩补料培养(concentration fed-batch)以及灌流培养(perfusion)。四种培养方式各有优势和缺 点：
[0004] 1)批次培养比较简单，但抗体表达量较低，生产成本较高，不 适用于产业化生产。
[0005] 2)补料批次培养是目前使用最普遍的生产方式，具有控制方便， 抗体表达量较高，生产成本适中的优势。但对于一些表达量较低的 项目，该培养工艺的成本还是显得较高。同时对于一些不稳定的抗 体或蛋白产品，该培养工艺就不再适用。
[0006] 3)浓缩补料培养目前还没有被广泛使用，只有少数技术水平较 高的公司在使用，具有单位罐体积生产效率高，成本低的优势。但 该工艺由于培养时间较长，抗体或蛋白一直被截留在反应器，所以 对一些不稳定的抗体或蛋白，该工艺就显得不适用。
[0007] 4)灌流培养最近开始被关注和使用，该工艺具有生产效率高， 生产成本低的优势，特别是对于不稳定的抗体或蛋白，该培养工艺 具有非常大的优势。但该工艺目前并没有被广泛使用，主要是由于 该工艺相比较前三个工艺显得非常复杂，增加了生产的难度，在工 业生产中非常难以实施。同时由于该工艺是连续的收样，也导致一 个完整的生产周期产生多批收获抗体或蛋白，使得批间可能具有较 大差异。
[0008] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0009] 为解决以上主流细胞培养工艺存在的问题，本发明提供了一种 新的细胞培养工艺，该细胞培养工艺是在浓缩补料培养 (concentration fed-batch)的基础上进行改进和创新，浓缩补料培养 是将细胞和目标产物都截留在反应器内，而本发明的培养工艺只将 细胞截留在反应器中，目标产物随着细胞培养上清一起排出反应器 外，其与现有的浓缩补料培养工艺相比，能够提高抗体生产效率， 并且大大提高了不稳定抗体的稳定性生产。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011] 一种细胞浓缩补料培养工艺，细胞培养过程进行补液和换液， 其中，换液过程中，仅细胞被截留，目标产物随液体排出。
[0012] 本发明提供的细胞浓缩补料培养工艺，是在浓缩补料培养 (concentration fed-batch)的基础上进行改进和创新，浓缩补料培养 是将细胞和目标产物都截留在反应器内，将不含有目标产物的细胞 培养上清排出反应器，以达到浓缩产品的目的，但这导致了目标产 物在反应器中存在较长时间，增加了目标产物相关的杂质，同时对 于一些不稳定的产品，该培养工艺就不再适用。
[0013] 本发明的培养工艺，在换液时，只截留细胞，不截留细胞分泌 的产物，目标产物随着细胞培养上清一起排出反应器外，其与现有 的浓缩补料培养工艺相比，对于自身稳定性较好的目标产物基本无 差别，但对于自身稳定性较差的目标产物能够大大提高其产量。
[0014] 进一步地，所述细胞培养过程进行补液和换液的步骤为：
[0015] 细胞接种培养第2-3天，补液，第3-6天换液和补液，以后每天 进行换液和补液的操作。
[0016] 根据不同细胞的培养需求不同，补液和换液时间不同。
[0017] 当细胞数量满足要求时接种到生产设备中进行培养。
[0018] 进一步地，所述细胞接种至生产设备中培养，所述生产设备包 括方瓶、摇瓶、反应器等。
[0019] 进一步地，所述接种的密度为1×105cells/mL至9×106cells/mL。
[0020] 即接种密度根据具体项目要求，一般为10万cells/mL至100万 cells/mL。
[0021] 进一步地，所述补液体积均为初始培养体积的3％±0.5％。
[0022] 换液是按照原培养体积进行更换，并且，换液前后的培养基是 等同的。该等同可以是相同，也可以是类似的，只要是符合或利于 细胞正常生长即可。
[0024] 细胞截留之后不需要进行抛弃处理，细胞密度也无需调整，直 接加入新的细胞液即换液，继续培养即可。
[0025] 本发明中，可以将含有目标产物的细胞培养上清从反应器中排 出，并储存于4-8℃，整个过程保持无菌；也可将排出的含有目标产 物的细胞培养上清及时进行纯化，然后无菌储存于4-8℃，然后在培 养结束之后将所有的细胞培养上清合并之后进行纯化，或者将纯化 之后的产物进行合并，得到最终的目标产物。
[0026] 进一步地，所述目标产物包括以下中的任一种处理方式：
[0027] 在无菌处理方式下将排出的液体储存在2-8℃条件下；
[0028] 排出的液体浓缩之后无菌过滤后存储在4-8℃。
[0029] 进一步地，所述细胞为杂交瘤细胞、携带外源表达载体的中华 仓鼠卵巢细胞。
[0030] 进一步地，所述目标产物包括抗原、抗体。
[0031] 进一步地，所述抗原包括HBsAg。
[0032] 进一步地，所述抗体包括与登革热适配的抗体、PD-1抗体。
[0034] 所述细胞为表达PD-1抗体的中华仓鼠卵巢细胞，所述补料所用 的溶液为Efficient feedTM C+。
[0035] 不同的细胞的培养液不同，如杂交瘤细胞的培养液为Hybridoma SFM培养基，中华仓鼠卵巢细胞的培养液为Dynamis培养基，当然， 其他适合于本发明的细胞培养的培养基也在本发明的保护范围内。
[0036] 进一步地，细胞培养的整个过程中控制葡萄糖浓度在1-6g/L之 间。如在不同的细胞中，控制葡萄糖浓度可以在1-3g/L、控制葡萄 糖浓度在1-4g/L、控制葡萄糖浓度在1-5g/L、控制葡萄糖浓度在 2-6g/L、控制葡萄糖浓度在2-5g/L等等。
[0037] 进一步地，细胞培养的总时间为7-15天。
[0038] 进一步地，所述收集的液体还包括分离和纯化的步骤，得到目 标产物。
[0039] 进一步地，所述分离依次采用离心和滤膜的方式进行。
[0040] 本发明提供的细胞培养工艺相比于现有的技术，重点在于其换 液过程中对细胞与目标产物的处理不同，其后续的分离和纯化步骤 按照现有技术常规方法进行即可。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0042] (1)本发明的工艺，相比较于补料培养(fed-batch)能够提高 抗体生产效率，降低抗体生产成本。
[0043] (2)本发明提供的工艺过程中不断的将目标产物泵出细胞生产 设备，并储存在2-8℃，对于不稳定的目标产物，相比较于浓缩补料 培养(concentration fed-batch)具有更大的优势。
[0045] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以 下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0046] 图1为本发明实施例1中不同组别处理的细胞培养过程中活细 胞密度图；
[0047] 图2为本发明实施例2中不同组别处理的细胞培养过程中活细 胞密度图；
[0048] 图3为本发明实施例3中不同组别处理的细胞培养过程中活细 胞密度图。
具体实施方式
[0049] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050] 实施例1
[0051] 所用细胞株为小鼠骨髓瘤细胞与小鼠B细胞融合而成的杂交瘤 细胞，能分泌用于诊断登革热的单克隆抗体(DEN-30DN)。
[0052] 细胞复苏之后进行细胞传代当细胞密度达到接种要求时按接种 30万个细胞/ml开始接种培养，所用基础培养为Hybridoma SFM培养 基，所述补料培养基为100g/L的水解乳蛋白，整个过程中控制葡萄 糖浓度在1-5g/L之间。
[0053] 对照1：采用补料培养(fed-batch)，培养至第2天时进行补料， 每天补料初始培养体积的3％，培养至第7天结束培养。
[0054] 对照2：采用浓缩补料培养(concentration fed-batch)，培养至第 2天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至72h时进行 换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及补料培养， 培养15天结束，整个过程中抗体被截留在反应器中。
[0055] 实施组：采用本发明的细胞培养工艺(细胞浓缩补料培养)，培 养至第2天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至第3 天时进行换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及 补料培养，培养15天结束，整个过程中抗体随着换液被排出反应器。 排出的细胞培养上清液储存在无菌储液袋里面，并保存于4-8℃下。
[0056] 培养结束后将实施组样品先进行混合，然后将所有样品经10000g 离心20分钟，之后再经0.45μm滤膜过滤。经Protein G一步纯化获 得最终的DEN-30DN单克隆抗体。
[0057] 其他也按照相应的分离和纯化步骤得到目标产物。
[0058] 细胞培养过程中的活细胞密度测定结果如图1所示。目标产物的 表达情况如表1所示。
[0059] 表1目标产物表达情况汇总
[0060]
[0061]
[0062] 通过实施例1，可以看出本发明提供的新工艺比补料培养工艺具 有更高的抗体生产效率。由于该登革抗体稳定性良好，所以新工艺相 对较于浓缩补料培养效果相似。
[0063] 实施例2
[0064] 所用细胞株为中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，将含有能表达乙肝表 面抗原(HBsAg)的质粒转入该CHO细胞系中，经筛选之后得到能 表达HBsAg的稳定细胞克隆。
[0065] 细胞复苏之后进行细胞传代当细胞密度达到接种要求时按接种 50万个细胞/mL开始接种培养，所用基础培养为Dynamis培养基， 所述补料培养基为100g/L的水解乳蛋白，整个过程中控制葡萄糖浓 度在1-6g/L之间。
[0066] 对照1：采用补料培养(fed-batch)，培养至第3天时进行补料， 每天补料初始培养体积的3％，培养至第15天结束培养。
[0067] 对照2：采用浓缩补料培养(concentration fed-batch)，培养至第 3天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至第5天时进 行换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及补料培 养，培养15天结束。整个过程中抗体被截留在反应器中。
[0068] 实施组：采用本发明的细胞培养工艺(细胞浓缩补料培养)，培 养至第3天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至第5 天时进行换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及 补料培养，培养15天结束。整个过程中抗体随着换液被排出反应器。 排出的细胞培养上清粗存在无菌储液袋里面，并保存于4-8℃下。
[0069] 培养结束后将实施组样品先进行混合，然后将所有样品经10000g 离心20分钟。之后再经0.45μm滤膜过滤。经疏水及分子筛纯化后获 得最终的HBsAg。
[0070] 其他也按照相应的分离和纯化步骤得到目标产物。
[0071] 细胞培养过程中的活细胞密度测定结果如图2所示。目标产物的 表达情况如表2所示。
[0072] 表2目标产物表达情况汇总
[0073]
[0074] 通过实施例2，可以看出本发明的新工艺比补料培养工艺具有更 高的抗体生产效率。由于乙肝表面抗原稳定性较差，所以，新工艺效 果明显优于浓缩补料培养。
[0075] 实施例3
[0076] 所用细胞株为中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，将含有能表达结合程 序性死亡蛋白-1(PD-1)的抗体的质粒转入该CHO细胞系中，经筛 选之后得到能表达PD-1抗体的稳定细胞克隆。
[0077] 细胞复苏之后进行细胞传代当细胞密度达到接种要求时按接种 50万个细胞/mL开始接种培养，所用基础培养为Dynamis培养基， 所述补料培养基为Efficient feedTM C+，整个过程中控制葡萄糖浓度在 1-6g/L之间。
[0078] 对照1：采用补料培养(fed-batch)，培养至第3天时进行补料， 每天补料初始培养体积的3％，培养至第15天结束培养。
[0079] 对照2：采用浓缩补料培养(concentration fed-batch)，培养至第 3天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至第6天时进 行换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及补料培 养，培养15天结束，整个过程中抗体被截留在反应器中。
[0080] 实施组：采用本发明的细胞培养工艺(细胞浓缩补料培养)，培 养至第3天时进行补料,补料体积为初始培养体积的3％；培养至第6 天时进行换液，注入新鲜培养基，再补料3％；之后每天进行换液及 补料培养，培养15天结束，整个过程中抗体随着换液被排出反应器。 排出的细胞培养上清储存在无菌储液袋里面，并保存于4-8℃下。
[0081] 培养结束后将实施组样品先进行混合，然后将所有样品经10000g 离心20分钟。之后再经0.45μm滤膜过滤。经亲和、阴阳离子纯化后 获得最终的PD-1抗体。
[0082] 其他也按照相应的分离和纯化步骤得到目标产物。
[0083] 细胞培养过程中的活细胞密度测定结果如图3所示。目标产物的 表达情况如表3所示。
[0084] 表3目标产物表达情况汇总
[0085]
[0086] 通过实施例3，可以看出新工艺比补料培养工艺具有更高的抗 体生产效率。由于PD-1抗体稳定性较好，所以，新工艺相对较于浓 缩补料培养效果相似。
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