一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用
阅读：1034发布：2020-06-06
专利汇可以提供一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种N-乙酰 氨 基 葡萄糖 脱乙酰酶及其编码基因与应用。本发明的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶是如下a)或b)或c)：a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的 蛋白质 ；b)如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本发明进一步涉及此类蛋白质在氨基葡萄糖制备中的用途。本发明还涉及包含这些编码此类蛋白质的核苷酸构建、载体和宿主细胞连同生产这些蛋白质的方法。本发明提供的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶可以高效 水 解 N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰制备氨基葡萄糖。，下面是一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种蛋白质，其特征在于，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；
b)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-267位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-267位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述一种蛋白质，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第
1-267位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：
与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。
3.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，为下述B1)-B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。
4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或
4)的DNA分子：
1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。
5.权利要求1所述蛋白质作为脱乙酰酶的应用。
6.权利要求1所述蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的应用。
7.一种重组菌，是将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉。
9.一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)在有益于产生该蛋白的条件下培养权利要求7或8所述重组菌的宿主细胞；
2)回收该蛋白。
10.一种生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：用权利要求1所述的蛋白质水解N-乙酰氨基葡萄糖，得到氨基葡萄糖。
一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0002] 氨基葡萄糖(C6H13NO5)又称葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是自然界含量最丰富的单糖之一。氨基葡萄糖是蛋白质或脂类糖基化反应中的重要前体，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。
[0003] 氨基葡萄糖主要应用于生物医药或功能食品，其在体内可以参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡有良好的疗效，具有改善关节活动，缓解疼痛的作用，预防和治疗各种类型的骨性关节炎，如膝关节、髋关节、脊柱、肩、手、手腕和踝关节等部位的及全身性的骨性关节炎。氨基葡萄糖还有吸收自由基、抗衰老、减肥、调节内分泌等多种有益的生理作用，可应用于食品、化妆品和饲料添加剂中，用途相当广泛。
[0004] 目前，氨基葡萄糖的规模化制备方法主要为甲壳素水解法和微生物发酵法。甲壳素水解法生产氨基葡萄糖有许多缺陷，尤其是大量酸、碱的使用对环境造成严重污染，其应用受到极大制约。微生物发酵法具有诸多优点，如原料来源不受限制，无致敏性、环境污染影响较小等。但由于发酵过程中微生物对氨基葡萄糖耐受性有限，发酵法生产的氨基葡萄糖一般以N-乙酰氨基葡萄糖形式存在，后续还需进一步脱乙酰得到最终的氨基葡萄糖产品。
[0005] 目前N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰普遍采用盐酸水解法，生产周期较长，产生大量的废酸及副产物，对氨基葡萄糖产品质量及环保均造成负面影响。而采用酶法对N-乙酰氨基葡萄糖进行脱乙酰处理具有反应条件温和，操作简单，生产效率高，无副产物，环境污染少，产品的食用安全性高等优点，是最为理想的氨基葡萄糖生产方法，具有广阔的应用前景。酶解法制备氨基葡萄糖具有许多优势，但目前尚无商品化专一性制备氨基葡萄糖的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶。
[0006] 中国专利CN107022538A公布了一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因。所述的基因CsnagA分离自天然菌株阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)0360。从保藏编号为CCTCC NO：M 2016162阪崎肠杆菌中分离基因组DNA，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。通过基因重组的方法，将该基因转入大肠杆菌构建基因工程菌，使其具有高效发酵生产氨基葡萄糖的能力，通过酶促生物合成法可生产氨基葡萄糖。
[0007] 目前N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的报道很少，发掘具有较高活性的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶，探索N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶制备氨基葡萄糖的酶解工艺，具有重要的工业应用价值和潜力。
发明内容
[0008] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶及其编码基因与应用。
[0009] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0010] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0011] 本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为TpDac，[0012] a)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；
[0013] b)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-267位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0014] c)如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-267位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
[0015] 其中，如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中第1-267位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有脱乙酰酶活性的蛋白质。
[0016] 为了使上述蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第1-267位氨基酸残基编码的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0017] 表1、标签的序列
[0018]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0019] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0020] 上述a)-c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0021] 上述a)-c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示第1-804位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0022] 本发明提供的蛋白质主要是一种微生物来源的蛋白质。
[0023] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
[0024] 本发明提供的生物材料为下述B1)-B5)中的任一种：
[0026] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0027] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0028] B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌；
[0029] B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系或含有B2)所述表达盒的细胞系或含有B3)所述重组载体的细胞系。
[0030] 其中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
[0031] 1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
[0032] 2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0033] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
[0034] 4)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。
[0035] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0036] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TpDac的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TpDac的核苷酸序列80％或者更高相似性的核苷酸，只要编码TpDac且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0037] 这里使用的术语“相似性”指与天然核酸序列的序列相似性。“相似性”包括与本发明SEQ ID NO.2所示第1-267位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高相似性的核苷酸序列。相似性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的相似性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的相似性。
[0038] 上述75％或75％以上相似性，可为80％、85％、90％或95％以上的相似性。
[0039] 上述生物材料中，B 2)所述含有B1)所述核酸分子的表达盒，即含有编码TpDac的核酸分子的表达盒(TpDac基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TpDac的DNA，该DNA不但可包括启动TpDac转录的启动子，还可包括终止TpDac转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。
[0040] 上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0041] 本发明的另一个目的是提供上述蛋白质的新用途。
[0042] 本发明提供了上述蛋白质作为脱乙酰酶的应用。
[0043] 本发明还提供了上述蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰基的应用。
[0044] 本发明的另一个目的是提供一种重组菌。
[0045] 本发明提供的重组菌是将上述蛋白质的编码基因导入宿主菌中得到的重组菌。
[0046] 上述重组菌中，所述蛋白质的编码基因是通过重组载体导入宿主菌；
[0047] 上述重组菌中，所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉。
[0048] 本发明还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的制备方法，包括如下步骤：
[0049] 1)在有益于产生该蛋白的条件下培养上述重组菌的宿主细胞；
[0050] 2)回收该蛋白，即N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶。
[0051] 本发明最后一个目的是提供一种氨基葡萄糖的制备方法。
[0052] 本发明提供的氨基葡萄糖的制备方法包括如下步骤：
[0053] 1)培养上述重组菌，得到N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶；
[0054] 2)运用该酶处理N-乙酰氨基葡萄糖糖浆、溶液或发酵液，得到氨基葡萄糖。
[0055] 上述方法中，所述糖浆、溶液或发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖的质量分数为0.1-35％。
[0056] 上述方法中，所述脱乙酰的条件为：pH 3.0-9.5，20-90℃，反应时间0.5-10小时。
[0057] 与现有技术相比，本发明所提供的蛋白质(在实施例中具体为重组蛋白TpDac)具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性；该蛋白质作为N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶可以高效水解N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰制备氨基葡萄糖。本发明提供的蛋白质具有良好的N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶酶学性质，在氨基葡萄糖制备以及食品、医药等行业中具有良好的应用价值。附图说明
[0058] 图1显示了重组TpDac经Ni-IDA亲和层析纯化的纯化图。
[0059] 其中，泳道M代表低分子量标准蛋白，泳道1代表粗酶液，泳道2代表经Ni-IDA亲和层析后的目的蛋白。
[0060] 图2显示了TpDac对N-乙酰氨基葡萄糖的脱乙酰基活性。反应时间为60min，图中显示N-乙酰氨基葡萄糖能完全脱乙酰基转化为氨基葡萄糖。图中GlcNAc代表N-乙酰氨基葡萄糖，GlcN代表氨基葡萄糖。
具体实施方式
[0061] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0062] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063] 实施例1、基因TpDac的获得及表达载体构建
[0064] 将SEQ ID NO.1中第1-801位所示的基因命名为基因TpDac，将该基因所编码的蛋白命名为蛋白TpDac，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0065] 依据SEQ ID NO.1所示DNA序列信息，人工合成目的基因。
[0066] 设计上游引物TpDac-up(5’-ATGGCGTTCGAGGAGTTTG-3’)和下游引物TpDac-down(5’-TTAGATAAGCTCGGCAAATGG-3’，)，PCR扩增得到目的DNA片段。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃后延伸10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收并测序验证。
[0067] 本发明还涉及包含编码目的蛋白TpDac的核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起产生重组表达载体，其包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列有效地连接。
[0068] 重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且引起多核苷酸表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相溶性。该载体可以是线装或环装质粒。载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了抗生素抗性或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
[0069] 在一个实施例中，本发明选取的表达载体为pET-28a(+),设计上下游引物分别为TpDac-up(5’-ATTGGGAATTCCATATGATGGCGTTCGAGGAGTTTG-3’，下划线示NdeⅠ酶切位点)和下游引物TpDac-down(5’-ATTCCGCTCGAGTTAGATAAGCTCGGCAAATGG-3’，下划线示XhoⅠ酶切位点)，PCR扩增得到目的DNA片段。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次；最后72℃后延伸10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收并测序验证。
[0070] PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切。将该双酶切后的产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)(美国Novagen公司，产品编号：69864-3)片段以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒，并将其转化至宿主大肠杆菌DH5α。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR的相同)验证为阳性的转化子测序。
[0071] 测序结果表明：重组质粒为在载体pET-28a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ位点间插入了SEQ ID NO.1中第1-804位所示的DNA片段。
[0072] 实施例2、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)的表达和纯化
[0073] 本发明还涉及用于表达TpDac的重组宿主细胞的构建，其包含本发明所述的编码TpDac的核苷酸。宿主细胞可为在本发明的蛋白质重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0074] 原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属、类芽孢杆菌属。
[0076] 在一个实施例中，本发明选取的表达宿主细胞为大肠杆菌。将实施例1中的重组质粒转化表达至宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，并将其接种至300mL的LB液体培养基(含50μg mL-1卡那霉素)，在37℃，200rpm条件下培养至OD600在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM，30℃诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mMTris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑,pH 7.9)重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声2s，间歇3s，120次)，再离心收集上清液即为粗酶液，粗酶液中含有重组蛋白TpDac，即N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)。
[0077] 基于pET28-a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白TpDac(即在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N端连接了His-Tag标签序列(HHHHHH)的重组蛋白)。具体纯化步骤如下：
[0078] 将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化的具体步骤为(流速为1mL min-1)：先用缓冲液A(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD280小于0.05，然后用缓冲液B(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，50mM咪唑，pH 7.9)洗脱至OD280小于0.05，最后用缓冲液C(20mM Tris-Hcl冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 7.9)洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化的重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)的溶液。
[0079] 经SDS-PAGE检测蛋白纯度(图1)。结果显示重组蛋白GsCho46A经Ni-IDA亲和柱一步纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为30kDa。
[0080] 重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶的活性检测采用HPLC法。具体步骤如下：反应条件：pH 7.0，60℃，N-乙酰氨基葡萄糖底物浓度1％，反应时间10分钟，加盐酸灭酶终止反应。HPLC检测反应液中氨基葡萄糖含量。酶活力单位(1U)定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的氨基葡萄糖所需的酶量。
[0081] 氨基葡萄糖转化率测定采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)：采用蒸发光散射检测器，检测器温度为40℃，柱温30℃；色谱柱型号为Shodex NH2P-50 4E(4.6×250mm)；流动相A相为水相，B相为乙腈；洗脱条件为0～15min 75％B，15～30min 75％-50％B，30～35min 50％-75％B，35～40min 75％B；流速：
1.0ml/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。
1.0ml/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。
[0082] 实验结果显示在上述反应条件下，重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)的比活力为262.1U/mg。
[0083] 实施例3、重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)在酶法制备氨基葡萄糖中的应用
[0084] 重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)水解N-乙酰氨基葡萄糖反应条件：pH 8.0，40℃，底物浓度1-3％，加酶量0.5mg/L，水解时间1h。水解液体积5L，搅拌转速80-
120rpm/min。分别于0，5，10，20，40，60min取样，加盐酸灭酶终止反应。
120rpm/min。分别于0，5，10，20，40，60min取样，加盐酸灭酶终止反应。
[0085] 薄层层析法(thin layer chromatography，TLC)监测水解产物
[0086] 采用Kieselgel 60硅胶板(Merck)分析水解产物，展层液为异丙醇：氨水：水(15:7.5:1，v/v/v)。样品点样1μL于硅胶板点样点，将硅胶板用展层剂展开，吹干后在其表面均匀用显色剂大茴香醛：乙醇：浓硫酸：乙酸(5:90:5:1,v/v/v/v)溶液浸湿，然后在130℃烘箱中烘烤5min显色。
[0087] 实验结果显示，TpDac能够水解N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖，经过一小时的水解，底物中的N-乙酰氨基葡萄糖几乎被完全脱乙酰为氨基葡萄糖(图2)。
[0088] 在制备氨基葡萄糖的另一个实施例中，重组N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(TpDac)水解N-乙酰氨基葡萄糖反应条件：pH 7.0，50℃，底物浓度5-10％，加酶量0.5mg/L，水解时间1h。水解液体积1L，搅拌转速80-120rpm/min。分别于0，5，10，20，40，60min取样，加盐酸灭酶终止反应。
[0089] 氨基葡萄糖转化率测定采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)：采用蒸发光散射检测器，检测器温度为40℃，柱温30℃；色谱柱型号为Shodex NH2P-50 4E(4.6×250mm)；流动相A相为水相，B相为乙腈；洗脱条件为0～15min 75％B，15～30min 75％-50％B，30～35min 50％-75％B，35～40min 75％B；流速：
1.0ml/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。
1.0ml/min；进样量为10μL。采用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖作为标准品定量反应底物及产物。
[0090] 实验结果显示在上述反应条件下N-乙酰氨基葡萄糖转化生成氨基葡萄糖的转化率达到98.87％。
[0091] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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