一种放线菌菌株YF-64及其应用
阅读：869发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种放线菌菌株YF-64及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 工程 技术领域，具体公开一种放线菌菌株YF‑64及其应用。通过显微观察和16S rDNA序列分析，将分离得到的抗锶放线菌YF‑64菌株鉴定为天蓝黄链霉菌Streptomyces coelicoflavus，其保藏编号为CCTCC M 2016581。本发明研究了YF‑64菌株对锶的 吸附 条件，当 接触 时间为50min，pH值为6，Sr2+初始浓度为50mg/L以及摇床转速为120r/min时，菌株的吸附量达到最大值，为44.29mg/g。FT‑IR分析结果表明，YF‑64菌株对锶的吸附有贡献的官能团主要有羟基、次甲基、羰基。本发明提供的YF‑64菌株可作为经济、高效、环境友好的生物吸附材料进行 废 水 重金属处理，尤其是对生物处理含 放射性 核素锶废水具有重要的实际意义。，下面是一种放线菌菌株YF-64及其应用专利的具体信息内容。
一种放线菌菌株YF-64及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种隶属于天蓝黄链霉菌Streptomyces coelicoflavus.的放线菌菌株YF-64，以及其在吸附废水中放射性核素锶的应用。
背景技术
[0003] 锶作为放射性元素的一种，近年来，被广泛用于电力、医学方面。锶同其它放射性核素一样在环境中的释放使我们生存的环境受到核污染。而这些放射性核素由于无法被生物降解，会在生物体内累积，最后通过食物链的富集作用，将危害到食物链顶层人类的身体健康。因此，放射性污染修复问题已成为全球最关注的问题之一，也是当前资源和环境领域的研究热点。
[0004] 传统处理放射性核素的方法如离子交换、还原沉淀、凝结、电渗析、膜过滤等，但这些方法在处理时存在能耗高、成本高、去除效率低、对核素离子的选择性低、会产生大量的二次有毒泥浆等缺点。近年来，微生物已经被证明对重金属具有成本低，离子选择性高，吸附率高，耗能少，金属离子可以回收，且没有二次污染等优点。因此，利用微生物处理放射性废物正日益引起人们的关注，是对现有放射性废水处理方法和核素固化方法的补充及探索，有极大应用前景。
发明内容
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] 名称：Streptomyces coelicoflavus.YF-64，以下简称为YF-64；
[0009] 保藏编号：CCTCC NO：M 2016581；
[0010] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
[0011] 保藏地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072；
[0012] 保藏时间：2016年10月20日。
[0013] 本发明通过16S rDNA序列方法对菌株YF-64进行了分类鉴定。提取此菌的DNA，扩增16S rDNA的序列。16S rDNA基因序列分析所设计的PCR扩增引物为：16F(5‘-GGA TGA GCC CGC GGC CTA-3’)和16R(5‘-CGG CCG CGG CTG CTG GCA CGT A-3’)。将其基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比，菌株YF-64与天蓝黄链霉菌Streptomyces coelicoflavus.的同源性最高。本发明已将菌株YF-64的基因序列已提交NCBI的GENBANK数据库，菌株基因序列登录号为JF901702。
[0014] 同时，本发明还结合形态学特征对菌株YF-64进行了分类鉴定。将菌株YF-64接种在培养基上，呈现的形态学特征为：菌落的颜色为黑褐色，细胞呈杆状，在培养基中不形成荚膜，不运动，无鞭毛，孢子椭圆形或球形，表面光滑，不产生可溶性色素。
[0015] 结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，本发明所述放线菌菌株YF-64与天蓝黄链霉菌Streptomyces coelicoflavus.隶属同一分支，因而将其命名为Streptomyces coelicoflavus.YF-64。
[0016] 菌株YF-64可作为经济、高效、环境友好的生物吸附材料进行放射性废物的处理。
[0017] 进一步地，菌株YF-64在处理放射性废水中的应用。
[0018] 根据试验数据，优选地，菌株YF-64能够吸附废水中放射性核素锶。本发明利用电镜、红外光谱分析等方法研究菌株YF-64吸附放射性核素锶的初步机理。数据显示，菌株YF-2+
64对锶具有较强的吸附效果，当接触时间为50min，pH值为6，Sr 初始浓度为50mg/L，摇床转速为120r/min时，该菌株的吸附效果达到最佳为44.29mg/g。红外光谱(FT-IR)结果显示，菌株YF-64对锶的吸附主要是由细胞壁上的羟基、次甲基、羰基起主要吸附作用。
64对锶具有较强的吸附效果，当接触时间为50min，pH值为6，Sr 初始浓度为50mg/L，摇床转速为120r/min时，该菌株的吸附效果达到最佳为44.29mg/g。红外光谱(FT-IR)结果显示，菌株YF-64对锶的吸附主要是由细胞壁上的羟基、次甲基、羰基起主要吸附作用。
[0019] 一些实施例中，应用菌株YF-64处理放射性废物，尤其是吸附废水中放射性核素锶，可制成一种含有菌株YF-64的吸附剂。该吸附剂可作为一种产品，或是生物吸附材料，直接用于放射性废物的处理。本发明给出该吸附剂的一种可行的制备方法：用纱布过滤收集培养好的YF-64菌株，把收集的菌丝体用去离子水洗涤3次，自然晾干，置于60℃烘箱中烘至恒重，冷却后将菌体研磨成细粉，筛分，备用。
[0020] 与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：
[0021] (1)本发明提供一种新的抗锶放线菌菌株YF-64。该菌株可作为经济、高效、环境友好的生物吸附材料进行放射性废物的处理，尤其能够吸附废水中放射性核素锶。
[0022] (2)微生物表面存在大量的活性分子和活性基团，微生物生物吸附提供了丰富的作用位点和作用方式。与常规的离子交换介质的单一作用基团相比较，微生物表面的作用基团丰富，可为不同的金属离子提供不同类型的作用基团，同时在相同质量情况下，微生物表面的活性基团的作用容量更大。近年来的文献报道已被证明微生物对重金属离子具有很强的吸附性能，这为微生物的高效吸附效率奠定了基础。而在生物吸附的报道中，大多是关于微生物吸附普通重金属，关于微生物吸附放射性核素重金属的文献较少。本发明所述菌株YF-64作为一种生物吸附材料，在放射性核素重金属吸附处理方面应用前景广阔。
[0023] (3)本发明优化了菌株YF-64对锶的吸附条件，当接触时间为50min，pH值为6，Sr2+初始浓度为50mg/L以及摇床转速为120r/min时，菌株的吸附量达到最大值，为44.29mg/g。附图说明
[0024] 图1是本发明所述放线菌菌株YF-64的扫描电镜形态图。
[0025] 图2是本发明所述放线菌菌株YF-64与相关种16S rDNA序列的系统发育树。
[0026] 图3是实施例所述吸附试验中，pH对Sr2+吸附的影响曲线。
[0027] 图4是实施例所述吸附试验中，Sr2+初始浓度对吸附的影响曲线。
[0028] 图5是实施例所述吸附试验中，吸附时间对吸附的影响曲线。
[0029] 图6是实施例所述吸附试验中，温度对吸附的影响曲线。
[0030] 图7是实施例所述吸附试验中，摇床转速对吸附的影响曲线。
[0031] 图8是本发明所述放线菌菌株YF-64吸附Sr2+前(A)后(B)的红外光谱变化对比图。
具体实施方式
[0032] 以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。
[0033] 实施例1：菌株YF-64的分离和鉴定
[0034] (一)放线菌菌株YF-64是从大亚湾核电站附近水体中分离筛选得到，具体包括如下的步骤：
[0035] (1)配制培养基
[0036] 高氏一号合成培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
[0037] 高氏一号合成培养基的配制过程：按配方称取可溶性淀粉于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解并倒入容积为1000mL的铝锅中煮沸，然后再依次按配方加入其它成分并溶化，待加入的所有培养基组分完全溶解后，补充蒸馏水到1000mL，调节pH为7.2，分装于250mL三角瓶中，121℃灭菌30min，备用。
[0038] (2)驯化培养
[0039] 将新鲜培养至对数期的放线菌菌株YF-64制成孢子悬浮液，取1mL孢子悬浮液涂布到一定浓度含锶的固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察是否有菌落长出，如有菌落生长，则再吸取1mL孢子悬浮液接种到更高锶浓度的新鲜固体培养基中，继续培养，观察菌落生长情况,确定YF-64菌株对锶离子的最低抑制浓度。
[0040] (3)分离纯化
[0041] 准确吸取1mL水样加入到装有99mL无菌水的三角瓶中，即成浓度为0.1mg/L的水样稀释液，另用1mL无菌吸管吸取上述水样稀释液1mL移入到装有9mL的无菌试管中，充分摇匀，让菌液浓度为0.01mg/L的稀释液，依次类推，采取逐步稀释法获得1×10-2，1×10-3和1×10-4三个稀释浓度。然后将溶化好的培养基倒入平板并冷却到45-50℃，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置于28℃的恒温培养箱中培养，并观察菌落的生长情况。
[0042] (二)采用16S rDNA基因测序法对放线菌菌株YF-64进行分类鉴定。
[0043] 16S rDNA基因PCR扩增引物为：16F(5‘-GGA TGA GCC CGC GGC CTA-3’)和16R(5‘-CGG CCG CGG CTG CTG GCA CGT A-3’)。
[0044] 扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行32个循环，72℃延伸3min。
[0045] 基因扩增产物纯化后经上海生工测序，将所得序列与GENBANK中已有的16S rDNA序列进行BLAST对比分析，用MEGA5.2进行多重序列比对，采用Kimura-2模型建NJ(Neighbor-joining)系统进化树。
[0046] 对YF-64菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增，得到一条1441bp的条带，将其基因序列与NCBI数据库中的相关菌株序列进行BLAST对比。结果显示，该菌株与天蓝黄链霉菌Streptomyces coelicoflavus.隶属同一分支，因而将其命名为Streptomyces coelicoflavus.YF-64，并与相关种的16S rDNA序列构建系统发育树(见图2所示)，序列已提交NCBI的GENBANK数据库，YF-64菌株基因序列登录号为JF901702。
[0047] (三)放线菌YF-64菌株的形态鉴定特征如下：
[0049] 如图1所示，菌落的颜色为黑褐色，细胞呈杆状，在培养基中不形成荚膜，不运动，无鞭毛，孢子椭圆形或球形，表面光滑，不产生可溶性色素。
[0050] 实施例2：菌株YF-64处理放射性废物的性能及作用机理
[0051] 为了进一步明确菌株YF-64对放射性废物的吸附特性和初步机理，本实施例以锶为研究对象，于不同的环境条件下研究微生物菌株对锶的吸附特性，利用电镜、红外光谱分析等方法研究菌株吸附放射性核素锶的初步机理。
[0052] (一)YF-64菌株吸附剂的制备
[0053] 用8层纱布过滤收集培养好的YF-64菌株，把收集的菌丝体用去离子水洗涤3次，自然晾干，置于60℃烘箱中烘至恒重，冷却后将菌体研磨成细粉，筛分，备用。
[0054] (二)吸附试验方法及结果
[0055] 取40mL不同质量浓度的锶标准溶液置于100mL的锥形瓶中，用0.1mol/L HNO3或NaOH将锶溶液的pH(2-9)调至一系列值，锶初始浓度10-100mg/L，接触时间1-120min，温度20-40℃，摇床转速30-180r/min，每组试验加入一定量的YF-64菌株吸附剂，然后置于摇床中，在不同温度，不同的吸附时间后，测定菌株对锶的吸附效果。
[0056] (1)pH对Sr2+吸附的影响
[0057] 由图3可见，pH值是影响YF-64菌株吸附重金属锶的重要因素之一。在pH较低时，吸附剂表面会被很多H+离子包围，从而增强了吸附剂和锶表面的吸引力，其次也有可能当液相pH较低时，吸附剂的表面细胞被质子化，增大了吸附剂和Sr2+表面的吸附力。在本实施例中，当pH为6时，吸附量达到最大，为41.27mg/g，此时将pH升高至7或更高时，溶液中出现少量沉淀，随着pH不断增加，吸附剂整个表面逐渐呈现负电性，吸附率降低。由此可以推断，在碱性环境中，Sr2+和OH-发生反应生成沉淀，影响了菌株对Sr2+的吸附。
[0058] (2)Sr2+初始浓度对吸附的影响
[0059] Sr2+在不同初始浓度下的吸附效果是不同的，如图4所示。初始浓度小于30ppm，吸附率随着锶初始浓度的增大而增大，这是因为菌株表面活性位点的总数多于金属离子占据的活性位点的数量，被占据的位点越多，吸附效果越好。浓度在50mg/L左右时，吸附效果达到最好为42.08mg/g，而随着吸附的进行，吸附活性位点不断被占据，故对于一定量的吸附剂来说，尽管随着重金属离子浓度的增加，在达到饱和状态前总吸附量会有所增加，但其吸附量会下降。所以，YF-64菌株吸附Sr2+的最佳初始浓度为50mg/L。
[0060] (3)吸附时间对吸附的影响
[0061] 如图5所示，吸附时间小于50min时，细菌对锶的吸附量随着接触时间的延长呈递增的趋势。在吸附时间为50min左右时吸附效果为44.29mg/g，之后随着接触时间的增加，菌株对锶的吸附效果没有明显变化，吸附率基本保持稳定。有可能是吸附达到一定程度后，吸附和解吸附的达到动态平衡，菌株不再对Sr2+进行吸附。有研究认为，微生物对重金属离子的吸附可以分成二个阶段：第一阶段是快速吸附阶段，通常在几十分钟内便达可到最终吸附量的70％左右；第二个阶段是慢速吸附阶段，在这一阶段常常需要几个小时才能达到最终吸附量。所以综合经济效益考虑，锶的最佳吸附时间为50min。
[0062] (4)温度对吸附的影响
[0063] 由图6可以看出，YF-64菌株在不同温度时的吸附率不同，20℃时，吸附量是42.03mg/g。上升到30℃时达到最大值42.16mg/g，随着温度的上升，吸附量又下降。但是随着温度变化吸附量的变化不是特别明显，所以，温度对吸附效果的影响不大。
[0064] (5)摇床转速对吸附的影响
[0065] 锶在不同摇床转速下的吸附效果是不同的，由图7可以知，转速从30r/min增加到120r/min的过程中锶的吸附量随转速的加快逐渐增大；当摇床转速为120r/min时，锶的吸附量达到最大，为42.68mg/g。之后随着转速的上升，吸附效果下降。转速从30r/min增加到
120r/min的过程中锶吸附量随转速的加快逐渐增大，这是可能是因为振荡器速度增加，菌株运转速度加快，提高了菌株与锶离子的接触概率，使菌株分散性提高进而增大了比表面积。但当摇床转速大于120r/min时，虽然运转速度加快了，但大部分菌株旋转聚拢在烧杯中央，与烧杯内侧溶液接触机会减少，减少了菌株对锶离子的吸附，导致吸附量降低。也有可能是由于溶液中的菌体细胞壁在外界巨大离心力的作用下，细胞发生损伤或破坏，从而导致Sr2+与菌体的结合力下降。另外，当吸附达到一定程度后，会有吸附和解吸附的动态平衡，过高的转速反而会加快解吸附速度，平衡偏向解吸，造成整个体系的吸附速率下降。所以菌株对金属锶的吸附实验中，摇床转速设定120r/min最合理。
120r/min的过程中锶吸附量随转速的加快逐渐增大，这是可能是因为振荡器速度增加，菌株运转速度加快，提高了菌株与锶离子的接触概率，使菌株分散性提高进而增大了比表面积。但当摇床转速大于120r/min时，虽然运转速度加快了，但大部分菌株旋转聚拢在烧杯中央，与烧杯内侧溶液接触机会减少，减少了菌株对锶离子的吸附，导致吸附量降低。也有可能是由于溶液中的菌体细胞壁在外界巨大离心力的作用下，细胞发生损伤或破坏，从而导致Sr2+与菌体的结合力下降。另外，当吸附达到一定程度后，会有吸附和解吸附的动态平衡，过高的转速反而会加快解吸附速度，平衡偏向解吸，造成整个体系的吸附速率下降。所以菌株对金属锶的吸附实验中，摇床转速设定120r/min最合理。
[0066] (三)YF-64菌株红外图谱分析
[0067] 红外图谱(FT-IR)表征：取适量干燥的菌株粉末与KBr一起研磨、压片，然后在TENSOR 27型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司)上在400-4000cm－1范围内扫描，扫描结果见图8。
[0068] 由图8可以看出，YF-64菌株吸附重金属前后图谱发生明显的变化，在3500cm-1附近，吸附前特征峰是3343.19，吸附后特征峰变成3416.93，这可能是由于细胞壁上的羟基(-OH)吸附了Sr2+所致。在2900cm-1附近吸附前特征峰是2837.62，吸附后特征峰变成2858.69，这可能是由于细胞壁细胞壁上次甲基(≡CH)对吸附所做的贡献。在1750cm-1附近，吸附前后特征峰发生了明显的变化峰值由1636.50变为1652.29，这可能是细胞壁上的羰基(-C＝O)吸附Sr2+的结果。综上所述，该菌株对锶吸附所做贡献的官能团主要是羟基、次甲基、羰基。
[0069] 综上，本发明获得一种可高效吸附放射性废物的YF-64菌株，以及其生物学纯培养物。将其应用于处理含放射性核素锶的核工业废水，可以解决现有技术处理放射性核素的能耗高、成本高、去除效率低、对核素离子的选择性低、会产生大量的二次有毒泥浆等诸多缺陷。本发明的YF-64菌株是一种抗锶放线菌，这对于生物处理含放射性核素锶废水具有重要的实际意义。下一步，可借助分子生物技术和基因工程技术，找出YF-64菌株抗性基因，构建基因工程菌，对含低浓度的重金属实际废水开展应用研究，并确定相关工程应用参数。
[0070] 上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
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