一种高效抗炎性PBODN序列及其应用
阅读：698发布：2024-02-17
专利汇可以提供一种高效抗炎性PBODN序列及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 制药技术领域，具体公开了一种高效抗炎性PB ODN序列及其应用，所述序列如SEQ ID NO：1所示，该序列具有高效抗炎作用；含有该序列的制剂非常有利于控制猪 疾病 和 炎症 ，可成功实现替代或部份替代抗生素，从而降低抗生素及 疫苗 的使用量；使动物类食品更加安全，符合绿色环保的要求，有利于降低养殖动物生产企业的成本，也能提高养殖企业的养殖效率。，下面是一种高效抗炎性PBODN序列及其应用专利的具体信息内容。
1.一种高效抗炎的PB ODN序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO：1所示。
2. 根据权利要求1所述的PB ODN序列，其特征在于，所述PB ODN序列经过硫代化。
3. 含有权利要求2所述PB ODN序列的制剂。
4. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，将经硫代化后的PB ODN序列用无菌PBS溶液配制浓度为10～100µg/ml，保存于-15～-25℃。
5. 根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述PBS溶液的组成为：按照重量百分比计，0.6～1.0% NaCl、0.01～0.04% KCl、0.0124～0.0164% Na2HPO4、0.014～0.034% KH2PO4，在115～121℃下，灭菌15～25min。
6. 权利要求1所述PB ODN序列在制备治疗和/或预防猪疾病的制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述猪疾病为由猪嗜血杆菌引起的疾病。
一种高效抗炎性PB ODN序列及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 国内众多兽用抗炎性药物都主要依靠抗生素，但长期使用抗生素，会导致严重的耐药性，目前国内外众多企业已经开始限制使用多种抗生素，抗生素的滥用也极大程度限制了我国肉类食品的出口。另外一个预防兽类疾病的手段就是利用疫苗。但多种病原菌的血清型众多，疫苗交叉反应，保护效果差。因此急需一种新型安全的抗炎性制剂。
[0003] 益生菌DNA是益生菌能够抑制多种炎症反应的主要效应因素，其中存在特定的益生基序（Probiotics Motif）。益生菌DNA中益生基序的筛选与此前从大肠杆菌DNA中筛选CpG基序具有异曲同工之处。这里，我们为了区别其与哺乳动物来源的抑制性寡核苷酸（Suppressive oligodeoxynucleotide，Sup ODN），将益生菌DNA的益生基序命名为益生ODN（Probiotics oligodeoxynucleotide，PB ODN）。细菌DNA能够通过非甲基化CpG序列作用于宿主免疫系统的TLR9受体，促使B细胞增殖，诱发强烈的Th1炎性反应，增强抗原抗体反应，因此，细菌DNA早期也被应用于感染治疗。后来，Krieg等筛选出细菌DNA中的CpG序列（嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶），进而人工合成含有CpG序列的寡具脱氧核酸（CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN），并证实免疫效果远远高于细菌DNA，由此开创了CpG预防细菌感染和治疗癌症的光辉历史。
[0004] 相类似的，2000年，Pisetsky等发现哺乳动物的DNA具有免疫抑制功能。继而发现了Sup ODN序列，近来人类微卫星DNA和线粒体DNA等哺乳动物保守区域都成为了新的Sup ODN的研究位点，从此掀开了抑制性ODN研究的热潮。
[0005] 2012年，Bouladoux发现Sup基序大量存在于益生菌DNA中，而且认为此前很多有关益生菌DNA在炎症治疗方面的研究可能最终起作用的就是DNA中存在的Sup基序。认为在益生菌DNA中存在一类全新的免疫调节基序，而且具有调控炎症反应，恢复免疫微环境平衡的功能，申请人对益生菌DNA进行了大量筛选分析工作，发现其中存在类似“ACTTGG”为特征的高重复率的PB ODN基序，经过验证，确定具有明显的炎症调控能力。因此，从益生菌DNA中筛选出具有明显炎症抑制活动的特征序列，不仅可以为益生菌的开发利用研究提供更多信息，也可以控制多种病原体感染后炎症，具有可观的研究前景和价值；但是目前还没有PB ODN的相关文献及用于防治猪炎症的报道。
发明内容
[0007] 本发明是第二个目的是提供含有上述PB ODN序列的PB ODN制剂，基于所述制剂，可成功替代或部份替代抗生素，避免疫苗保护效果不全面的目的。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述PB ODN制剂的应用。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种高效抗炎的PB ODN序列，如SEQ ID NO：1所示。本发明从益生菌DNA中筛选获得了一种PB ODN序列，该序列具有高效抗炎作用。
[0010] 本发明所述PB ODN序列获得方法如下：通过对绝大部分大肠杆菌和乳酸杆菌的保守重复序列进行分析，发现“CCAAGG”和“CCAAGC”可能是两类潜在的抑制性基序，并参照Bouladoux的方法，从NCBI数据库中获得28种乳酸杆菌的基因组、27种大肠杆菌的基因组、金黄色葡萄球菌基因组、猪微卫星DNA、猪线粒体DNA和猪端粒酶DNA等近100个基因组，借助“fuzznuc”在线分析软件分析上述基序的拷贝数，再参照胡大利等（胡大利等，2007）筛选方法进行ODN活性筛选得到。
[0011] 在使用前，本发明所述PB ODN序列需经过硫代化，硫代化处理为本领域常规技术。
[0012] 本发明还提供含有上述PB ODN序列的制剂（简称为PB ODN制剂）；具体的，可以将经硫代化后的PB ODN序列用无菌PBS溶液配制浓度为10～100µg/ml，保存于-15～-25℃。
[0013] 优选地，所述PBS溶液的组成为：按照重量百分比计，0.6～1.0% NaCl、0.01～0.04% KCl、0.0124～0.0164% Na2HPO4、0.014～0.034% KH2PO4，在115～121℃下，灭菌
15～25min。
15～25min。
[0014] 具体地，所述灭菌可以采用湿热高压灭菌法，其操作可以参照本领域常规技术。
[0015] 本发明还提供所述PB ODN序列在制备治疗或预防猪疾病的制剂中的应用。
[0016] 更优选地，所述猪疾病为由猪嗜血杆菌引起的疾病。
[0017] 本发明还提供上述制剂在治疗和/或预防猪疾病中的应用，具体地，当用于治疗时，是在猪的疾病发病后，立即按每公斤猪重量皮下注射0.2～1ml PB ODN制剂，3～7天后再次给药；当用于预防时，是在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.1～0.5ml PB ODN制剂，3～7天后再次给药。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种高效抗炎的PB ODN序列及其应用，该序列具有高效抗炎作用；含有该序列的制剂非常有利于控制猪疾病和炎症，可成功替代或部份替代抗生素，从而降低抗生素及疫苗的使用量；使动物类食品更加安全，符合绿色环保的要求，有利于降低养殖动物生产企业的成本，也能提高养殖企业的养殖效率。
具体实施方式
[0019] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0020] 实施例1PB ODN的序列（SEQ ID NO：1）：5’- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，该序列均经硫代化处理（硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行）。合成后，用无菌PBS溶液配制成10µg/ml的制剂（PB ODN制剂），保存于-15℃备用。
[0021] 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0.6%的NaCl、0.01%的KCl、0.0124%的Na2HPO4、0.014%的KH2PO4溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在115℃下，灭菌20min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
[0022] 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.1ml所述PB ODN制剂，3天后再次给药。
[0023] 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0.2ml所述PB ODN制剂，3天后再次给药。
[0024] 实施例2PB ODN的序列（SEQ ID NO：1）：5’- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，该序列均经硫代化处理（硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行）。合成后，用无菌PBS溶液配制成30µg/ml的制剂（PB ODN制剂），保存于-20℃温度下备用。
[0025] 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0.7%的NaCl、0.02%的KCl、0.0134%的Na2HPO4、0.024%的KH2PO4溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在117℃下，灭菌21min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
[0026] 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.2ml所述PB ODN制剂，4天后再次给药。
[0027] 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0.3ml所述PB ODN制剂，4天后再次给药。
[0028] 实施例3PB ODN的序列（SEQ ID NO：1）：5’- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，该序列均经硫代化处理（硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行）。合成后，用无菌PBS溶液配制成50µg/ml的制剂（PB ODN制剂），保存于-22℃温度下备用。
[0029] 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0.8%的NaCl、0.03%的KCl、0.0144%的Na2HPO4、0.0245%的KH2PO4溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在118℃下，灭菌22min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
[0030] 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.3ml所述PB ODN制剂，5天后再次给药。
[0031] 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0.4ml所述PB ODN制剂，5天后再次给药。
[0032] 实施例4PB ODN的序列（SEQ ID NO：1）：5’- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3’，可采用现有基因工程或化学方法合成，该序列均经硫代化处理（硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行）。合成后，用无菌PBS溶液配制成100µg/ml的制剂（PB ODN制剂），保存于-25℃温度下备用。
[0033] 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，1.0%的NaCl、0.04%的KCl、0.0164%的Na2HPO4、0.034%的KH2PO4溶于水中；然后采用湿热高压灭菌法在121℃下，灭菌25min。湿热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
[0034] 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.5ml所述PB ODN制剂，7天后再次给药。
[0035] 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0.5ml所述PB ODN制剂，7天后再次给药。
[0036] 对比例1实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的PB ODN的部份序列，对比ODN1序列如下：5’- TCCACTGTGCTTGGACTTGG-3’。
[0037] 对比例2实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的PB ODN的部份序列，对比ODN2序列如下：5’- TCCAAGTACTAGGTGTTGG-3’。
[0038] 对比例3实验方法同实施例4，唯一不同的是，替换了所用的PB ODN的部份序——对比ODN3序列如下：5’- TCGCACTTGATGCTTGG-3’。
[0039] 实施例5 细胞学实验以16日龄猪（大白×长白）的外周血淋巴细胞（PBMC）为实验细胞，分别采用本发明实施例1～4和对比例1～3所述方法制备得到的PB ODN制剂作为防治制剂，猪嗜血杆菌作为病原菌（HPS，ATCC19417），以PBS作为空白对照，现有的市售的武汉科前副猪嗜血杆菌疫苗（HPSV）作为实验用疫苗，以兽用抗生素（安比西林）作为实验用抗生素，以对比ODN1、2、3组作为ODN效果对照，分析炎症因子IL-1β、IL-18的表达情况，结果见表1。PB ODN与HPS共培养猪PBMCs，发现能显著下调炎症因子IL-1β、IL-18的表达，而抗生素组也能下调炎症因子的表达，但不如PB ODN的效果好，对比ODN1、2、3组和疫苗对炎症因子的作用不大，上述结果说明PB ODN具备抗HPS感染的作用。
[0040] 实施例6 动物实验以16日龄猪（大白×长白）为实验对象，现有的市售的武汉科前副猪嗜血杆菌疫苗（HPSV）作为实验用疫苗，猪嗜血杆菌作为病原菌（HPS，ATCC19417），以PBS作为空白对照，分别采用本发明实施例1～4所述方法制备得到的PB ODN制剂作为防治制剂，以兽用抗生素（安比西林）作为实验用抗生素。在HPS感染前一周免疫PB ODN制剂，作为预防效果研究；在HPS感染后立即免疫PB ODN制剂，作为治疗效果研究。在免疫第14天分别观察发病率，实验结果如表2，表3所示。
[0041] 从表2～3可知，经本发明方法制备的PB ODN制剂，在预防方面效果与抗生素相当，比疫苗的效果要好。在治疗方面效果比抗生素要略好，比疫苗的效果更好。因此，PB ODN制剂完全有希望代替或部份代替传统抗生素，作为一种新型、高效、安全的制剂应用到养殖动物的防病中。
[0042] 实施例7毒性研究本实施例选用7日龄balb/c小鼠，随机分为空白对照组和将本发明实施例1～4所述方法制备得到的PB ODN制剂组，每个动物注射免疫0.5ml，（每组3个重复）。对照组饲喂采用饲养试验、动物组织解剖及外观性能等各项指标等方法。试验时间为2个月，试验结束时检测小鼠的死亡率和组织病变情况。结果显示（表4）：PB ODN处理组和对照组的动物死亡率均为零，组织解剖未发现明显病变，处理组小鼠活泼好动，说明PB ODN对BALB/C小鼠安全无毒害。
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