技术领域
[0001] 本
发明涉及一种方法，尤其涉及一种酶法降解2,6-二羟基
苯甲酸的方法。
背景技术
[0002]
水杨酸及其衍
生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物—
苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。利用
芳香酸脱羧酶催化水杨酸衍生物的脱羧反应，具有反应条件温和、专一性高等酶反应的共同特性，可以大大降低反应的能垒，使反应更容易进行。水杨酸脱羧酶(Salicylic acid decarboxylase，Sdc)也是其中之一，该酶是2010年由Kirimura研究小组在丝孢
酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401中发现的一种可逆酶。
[0003] 除了能够催化以苯酚为底物的Kolbe-Schmitt反应生成水杨酸及其逆反应以外，水杨酸脱羧酶还可以催化2,4-二羟基苯甲酸和γ-二羟基苯甲酸脱羧生成间苯二酚，催化2,3-二羟基苯甲酸脱羧生成1,2-二羟基苯酚，催化4-
氨基水杨酸脱羧生成3-氨基苯酚等，并且可以催化它们的逆反应，能够以
碳酸氢盐作为CO2源，催化富
电子酚衍生物的羧化反应，反应可以选择性地在羟基邻位上加上羧基。通过Sdc降解白果中的有毒物质—
银杏酸，结果表明，Sdc可以在比较温和的条件下对含不同取代基的银杏酸均具有脱羧能
力，这对于含有多种不同取代基
侧链的银杏酸降解非常适合。以上研究说明，Sdc可专一性地识别酚羟基的邻位上的羧基，能够以羟基和羧基两个基团相邻的羟基苯甲酸为脱羧底物，具有较为广泛的底物适应性。但作为一个对水杨酸及其多个衍生物均具有催化脱羧能力的酶，其催化脱羧的作用机制还需要进一步的研究，比如针对底物2,6-二羟基苯甲酸，水杨酸脱羧酶发挥催化作用的最适
温度以及最适pH是多少，还需进一步研究确定。
发明内容
[0004] 为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法。
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为一号
种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；
[0007] 步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声
破碎缓冲液重悬，在
冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；
[0008] 步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定
试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；
[0009] 步骤四：Sdc活力测定：在浓度为10～60mM的2,6-二羟基苯甲
酸溶液中加入含0.1mg/mLSdc的缓冲溶液，总反应体积为1～2mL，温度25～60℃，加入强酸性溶液终止反应，反应液经9500～10500r/min离心后，经0.22μm滤
膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。
[0010] 进一步地，His-Trap亲和层析柱对Sdc纯化的步骤为：
[0011] I、启动系统：首先打开蛋白纯化系统电源，待系统稳定后，启动工作站，打开A
泵和B泵，用MilliQ水以5mL·min-1的速度冲洗系统管路至基线水平；
[0012] II、接柱子：将镍柱His-Trap FF crude与纯化系统的管路连接，注意不要带入气泡，然后用大于等于5个柱体积的MilliQ水以1mL·min-1的速度对柱子进行冲洗；
[0013] III、柱平衡：将A泵头放入结合缓冲液中，B泵头放入洗脱缓冲液中，先用大于等于5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1速度冲洗柱子，然后再用大于等于5个柱体积的结合缓冲液在同样的流速下对镍柱进行平衡；
[0014] IV、上样：用A泵将5mL粗酶液上到柱上；
[0015] V、平衡：用15个柱体积的结合缓冲液以0.5mL·min-1的速度冲洗，直到吸收曲线稳定，此时目的蛋白结合在镍柱上，而杂蛋白则被冲洗下来；
[0016] VI、洗脱：用5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1的速度进行洗脱，根据吸收曲线来收集目的蛋白；
[0017] VII、柱再生：以1mL·min-1的速度用洗脱缓冲液对柱子进行充分的冲洗，然后在同样的流速下用MilliQ水冲洗到基线稳定，最后在其中充满20％
乙醇，拆卸后将柱子封好置于4℃保存；
[0018] VIII、关闭系统：蛋白纯化系统的全部管路用MilliQ水冲洗干净后充满20％的乙醇，先关闭工作站程序，然后关闭所有设备的电源。
[0019] 进一步地，步骤四中HPLC检测产物间苯二酚的条件为：色谱柱为C18柱，以体积比2：8的甲醇-体积浓度0.1％甲酸溶液为流动相，柱温35℃，流动相流速1mL/min，检测
波长278nm。
[0020] 进一步地，步骤一中一号种子液的培养条件为：温度为35～40℃，转速为150～170rpm的条件下摇床培养11～13h；二号种子液的培养条件为：温度为35～40℃下，转速为
150～170rpm的条件下摇床培养3～5h；步骤一中培养液的诱导条件为：温度为22～28℃、转速为110～130rpm的条件下诱导17～19h；培养液的离心条件为：温度为3～5℃、转速为4800～5200rpm的条件下离心8～12min。
[0021] 进一步地，步骤二中的超声条件为：功率20～60％，工作2～5s，间歇5～8s，总超声时间为9～11min；离心分离条件为：在3～5℃、13000～15000rpm的条件下离心13～17min。
[0022] 进一步地，步骤四中的缓冲溶液为：pH4.0～5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液或pH6.0～7.0的
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
[0023] 进一步地，表达质粒为大肠杆菌表达载体pET21a-Sdc；宿主菌为E.coliBL21(DE3)大肠杆菌菌株。
[0024] 进一步地，强酸性溶液为
盐酸溶液、
硫酸溶液、
硝酸溶液中的任一种。
[0025] 本发明采用已成功构建的带有His标签的Sdc大肠杆菌表达菌株，采用此表达菌株，对Sdc进行诱导表达，收集菌体，经超声破碎、离心后，获得了突变酶的粗酶液，使用His-TRap亲和层析柱对带有His6标签的Sdc进行纯化，使用纯化后的Sdc分别在不同的温度和pH条件下与2,6-二羟基苯甲酸进行反应，采用HPLC检测对产物或反应物进行检测，计算相应酶活，确定反应的最适条件。
[0026] 本发明通过实验确定Sdc催化降解2,6-二羟基苯甲酸的最佳条件。本发明研究成果将进一步加深人们对Sdc的结构与功能关系的认识，并为Sdc的开发利用提供一定的理论支持。
附图说明
[0027] 图1为本发明在不同温度下与产物的浓度关系图。
[0028] 图2为本发明在不同pH条件下与产物的浓度关系图。
[0029] 图3为本发明产物间苯二酚的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0031] 一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，包括以下步骤：
[0032] 步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；
[0033] 步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；
[0034] 步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；
[0035] 步骤四：Sdc活力测定：在浓度为10～60mM的2,6-二羟基苯甲酸溶液中加入含0.1mg/mLSdc的缓冲溶液，总反应体积为1～2mL，温度25～60℃，加入强酸性溶液终止反应，反应液经9500～10500r/min离心后，经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。
[0036] His-Trap亲和层析柱对Sdc纯化的步骤为：
[0037] I、启动系统：首先打开蛋白纯化系统电源，待系统稳定后，启动工作站，打开A泵和B泵，用MilliQ水以5mL·min-1的速度冲洗系统管路至基线水平；
[0038] II、接柱子：将镍柱His-Trap FF crude与纯化系统的管路连接，注意不要带入气泡，然后用大于等于5个柱体积的MilliQ水以1mL·min-1的速度对柱子进行冲洗；
[0039] III、柱平衡：将A泵头放入结合缓冲液中，B泵头放入洗脱缓冲液中，先用大于等于5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1速度冲洗柱子，然后再用大于等于5个柱体积的结合缓冲液在同样的流速下对镍柱进行平衡；
[0040] IV、上样：用A泵将5mL粗酶液上到柱上；
[0041] V、平衡：用15个柱体积的结合缓冲液以0.5mL·min-1的速度冲洗，直到吸收曲线稳定，此时目的蛋白结合在镍柱上，而杂蛋白则被冲洗下来；
[0042] VI、洗脱：用5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1的速度进行洗脱，根据吸收曲线来收集目的蛋白；
[0043] VII、柱再生：以1mL·min-1的速度用洗脱缓冲液对柱子进行充分的冲洗，然后在同样的流速下用MilliQ水冲洗到基线稳定，最后在其中充满20％乙醇，拆卸后将柱子封好置于4℃保存；
[0044] VIII、关闭系统：蛋白纯化系统的全部管路用MilliQ水冲洗干净后充满20％的乙醇，先关闭工作站程序，然后关闭所有设备的电源。
[0045] 步骤四中HPLC检测产物间苯二酚的条件为：色谱柱为C18柱，以体积比2：8的甲醇-体积浓度0.1％甲酸溶液为流动相，柱温35℃，流动相流速1mL/min，检测波长278nm。
[0046] 步骤一中一号种子液的培养条件为：温度为35～40℃，转速为150～170rpm的条件下摇床培养11～13h；二号种子液的培养条件为：温度为35～40℃下，转速为150～170rpm的条件下摇床培养3～5h；步骤一中培养液的诱导条件为：温度为22～28℃、转速为110～130rpm的条件下诱导17～19h；培养液的离心条件为：温度为3～5℃、转速为4800～5200rpm的条件下离心8～12min。
[0047] 步骤二中的超声条件为：功率20～60％，工作2～5s，间歇5～8s，总超声时间为9～11min；离心分离条件为：在3～5℃、13000～15000rpm的条件下离心13～17min。
[0048] 步骤四中的缓冲溶液为：pH4.0～5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液或pH6.0～7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
[0049] 表达质粒为大肠杆菌表达载体pET21a-Sdc；宿主菌为E.coli BL21(DE3)大肠杆菌菌株。
[0050] 强酸性溶液为盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液中的任一种。
[0051] 优选的，水杨酸脱羧酶降解2,6-二羟基苯甲酸的步骤为：
[0052] 步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)大肠杆菌菌株中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg·mL-1的LB液体培养基中，37℃，160rpm的转速条件下摇床培养12h作为一号种子液；将一号种子液按1％的比例接种于新的Amp浓度为100μg·mL-1的LB液体培养基中，37℃、160rpm培养大约4h作为二号种子液，并使其OD600到达约0.6，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，诱导蛋白表达)使其终浓度为0.1mM的培养液，在25℃、120rpm的条件下诱导18h；培养液经5000rpm、4℃、离心l0min，收集菌体备用。
[0053] 步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，超声条件为：功率40％，工作3s，间歇7s，总超声时间为10min。(根据实际情况，优化超声破碎条件，使测定时间最短，减少发热量，保证酶的活性，一般10S循环一次)破碎后的细胞破碎液在4℃、14000rpm的条件下离心15min，上清即为粗酶液。粗酶液用12％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化。
[0054] His-Trap组氨酸标记亲和层析柱为一种镍离子蛋白纯化柱，对带有组氨酸标签的
蛋白质具有专一性的亲和力，含有组氨酸标签(His6·Tag)，方便进行酶的纯化，目前广泛应用于蛋白纯化。此步骤使用的所有液体均需要使用0.22μM的滤膜过滤后才能使用，以免堵塞柱子。
[0055] His-Trap亲和层析柱对Sdc纯化的步骤为：
[0056] I、启动系统：首先打开蛋白纯化系统电源，待系统稳定后，启动工作站，打开A泵和B泵，用MilliQ水(超纯水)以5mL·min-1的速度冲洗系统管路至基线水平；
[0057] II、接柱子：将镍柱His-Trap FF crude与纯化系统的管路连接，注意不要带入气泡，然后用大于等于5个柱体积的MilliQ水以1mL·min-1的速度对柱子进行冲洗；
[0058] III、柱平衡：将A泵头放入结合缓冲液中，B泵头放入洗脱缓冲液中，先用大于等于5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1速度冲洗柱子，然后再用大于等于5个柱体积的结合缓冲液在同样的流速下对镍柱进行平衡；
[0059] 其中，结合缓冲液：50mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0，使用0.22μm滤膜过滤后备用。
[0060] 洗脱缓冲液：50mM磷酸钠，500mM NaCl，400mM咪唑，pH8.0，使用0.22μm滤膜过滤后备用。
[0061] IV、上样：用A泵将约5mL粗酶液上到柱上；
[0062] V、平衡：用大约15个柱体积的结合缓冲液以0.5mL·min-1的速度冲洗，直到吸收曲线稳定，此时目的蛋白结合在镍柱上，而杂蛋白则被冲洗下来；
[0063] VI、洗脱：用大约5个柱体积的洗脱缓冲液以1mL·min-1的速度进行洗脱，根据吸收曲线来收集目的蛋白；
[0064] VII、柱再生：以1mL·min-1的速度用洗脱缓冲液对柱子进行充分的冲洗，然后在同样的流速下用MilliQ水冲洗到基线稳定，最后在其中充满20％乙醇，拆卸后将柱子封好置于4℃保存；
[0065] VIII、关闭系统：蛋白纯化系统的全部管路用MilliQ水冲洗干净后充满20％的乙醇，先关闭工作站程序，然后关闭所有设备的电源。
[0066] 步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶的浓度。
[0067] 步骤四：Sdc活力测定：pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液(浓度为0.2M)中含0.1mg/mL的Sdc，底物2,6-二羟基苯甲酸溶液浓度为30mM，总反应体积为1mL，温度40℃，反应进行1h，加入100μL 12M HCl终止反应，反应液经10000r/min离心后，经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。Sdc作为催化剂降解2,6-二羟基苯甲酸。测定产物的浓度，根据产物浓度确定水杨酸脱羧酶催化降解2,6-二羟基苯甲酸的最佳pH值以及最佳温度。
[0068] 缓冲溶液为pH4.0～5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液或pH6.0～7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。强酸性溶液为盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液中的任一种。加入强酸性溶液的目的是终止反应，pH值突然变大使Sdc失活。
[0069] HPLC检测产物间苯二酚的条件为：色谱柱为C18柱，以体积比2：8的甲醇-体积浓度0.1％甲酸溶液为流动相，柱温35℃，流动相流速1mL/min，检测波长278nm。
[0070] 分别测定在不同温度、不同pH值下，Sdc降解2,6-二羟基苯甲酸得到的产物间苯二酚的浓度。
[0071] 酶的最适pH测定：测定Sdc在pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的不同缓冲液中的降解能力。
[0072] 酶最适反应温度：测定Sdc在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃不同温度下的降解能力。
[0073] 表1为不同温度下的产物浓度
[0074]温度/℃ 25 30 35 40 45 50 55 60
间苯二酚/mM 2.5 9.0 14 30 17 16 13 5
[0075] 表2为不同pH条件下的产物浓度
[0076]pH值 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
间苯二酚/mM 2.5 13 15 30 18 12 3.0
[0077] 由表1、表2可以看出，Sdc降解2,6-二羟基苯甲酸的最适温度为40℃，最适pH为5.5，此时产物间苯二酚的浓度最大，如图1、图2所示。
[0078] 本发明分别在25～60℃的温度范围和pH4.0～7.0的条件下，测定Sdc降解2,6-二羟基苯甲酸的酶活力，确定Sdc的最适作用温度和最适作用pH，比较Sdc在不同温度、不同pH条件下的催化不同底物的的最适作用条件，为其工业化应用提供数据参考。
[0079] 上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，
本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。
