技术领域
[0001] 本
发明涉及一种测定乳酸的方法，同时本发明还涉及乳酸检测试剂盒，属于医学检验、乳酸菌
发酵食品类测定技术领域。
背景技术
[0002] 乳酸是
葡萄糖的无
氧酵解产生丙
酮酸，
丙酮酸再被还原所得，是糖代谢的中间产物，主要来源于骨骼肌、脑、
皮肤、肾髓质和红细胞。血液中乳酸浓度和这些组织产生乳酸的速度以及肝脏对乳酸的代谢速度有关，约65％的乳酸由肝脏代谢。测定
血浆中的乳酸浓度对乳酸性酸中毒有重要的诊断意义。
[0003] 在高原缺氧时，
机体血糖产生无氧酵解，生成大量的乳酸，使组织产生一系列酸中毒病症状，此时检测血液乳酸的含量，是诊断酸中毒的一个重要指标。
[0004] 剧烈运动或脱
水时血液乳酸会迅速升高，因此检测血液乳酸是监护、检测运动员训练强度的指标，作为衡量运动员抗缺氧能
力、耐疲劳训练及体力恢复等方面的重要数据。
[0005] 在病理情况下，如休克、心力衰竭、血液病和
肺功能不全时出现组织严重缺氧，导致丙酮酸还原成乳酸的酵解作用增加，促使乳酸水平升高。某些肝脏
疾病时由于肝脏对乳酸的清除率减低，可出现乳酸升高。糖尿病患者胰岛素绝对或相对不足，机体不能有效利用血糖，丙酮酸大量还原成乳酸，导致体内乳酸堆积，出现乳酸酸中毒。服用大量甲醇、
乙醇、水杨酸等，可引起血液乳酸增高。
[0006] 在食品工业中，由乳酸菌发酵的食品，需要检测乳酸的浓度，也要用到检测试剂。
[0007] 乳酸的测定有化学法、气相色谱法、电化学法、酶
电极感应法和酶催化法。化学法操作复杂，时间长，准确性差；气相色谱法准确性好，样本用量少，但需要气相色谱仪不能用于常规试验室；电化学法灵敏度高，线性范围宽，快速、简便、准确，但需要专用设备；现在酶法应用最为普遍，酶催化法灵敏度高，线性范围宽，且适用于自动化分析仪，是乳酸测定最理想的常规方法。
[0008] 根据反应原理不同，酶法可分为乳酸脱氢酶法和乳酸
氧化酶法。
[0009] 乳酸脱氢酶法：
[0010] 用340nm
波长检测还原性辅酶的生成量，计算出乳酸的含量；
[0011] 乳酸氧化酶法：
[0012]
[0013] 用波长500～600nm波长检测吸光度，求出乳酸的浓度。
[0014] 乳酸氧化酶法比乳酸脱氢酶试剂稳定，灵敏度高，重复性好，线性范围宽。
发明内容
[0015] 正常情况下，血浆中的乳酸含量很低，在0.60～0.17mmol/L，目前现有的方法学在检测低值情况下往往灵敏度低，重复性差，特别是做质控时变异系数大。本发明是在原来乳酸氧化酶法的
基础上，又增加了一个丙酮酸氧化酶，能使一分子的乳酸氧化后产生两分子的氧，增加了吸光度，起到了放大作用。这样就充分提高了灵敏度和重复性。
[0016] 本发明高灵敏的乳酸氧化酶法的反应原理：
[0017] 反应分两步进行
[0018] 第一步，先在试剂一中加入丙酮酸氧化酶和过氧化物酶，氧化分解掉血样中原有的丙酮酸及反应所产生的氧；
[0019] 第二步，加入试剂二后，乳酸氧化酶分解乳酸产生丙酮酸和过氧化氢，丙酮酸再被丙酮酸氧化酶氧化生成过氧化氢，两步反应生成两分子的过氧化氢，再进行Trinder反应，能使吸光度增加一倍，与乳酸标准液比较，求得血浆中乳酸浓度。反应式如下：
[0020]
[0021]
[0022]
[0023] 试剂结构：
[0024] 试剂一：
[0025]
[0026]
[0027] 试剂二：
[0028]
[0029] 试剂
稳定性好，线性范围宽，灵敏度高，准确度好，便于推广。
[0030] 按试剂的组成，可配成试剂一∶试剂二＝1～4︰1不同的浓度比，优选试剂一∶试剂二＝2～4︰1。样品∶试剂＝1∶80～120，优选为1︰100。
[0031] 缓冲液为
醋酸盐、甘
氨酸盐、
磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸等中的一种或两种。用量优选为20～100mmol/L。试剂一、试剂二的缓冲液pH均为6.0～8.0。
[0032]
防腐剂为叠氮化钠、ProClin-300、对羟基苯
甲酸及酯类等中的一种或多种，但是，以叠氮化钠为优选，对反应体系没有什么影响，价格也低，用量范围在2～20mmol/L。
[0033] 稳定剂为小
牛血清蛋白，氨基酸类，糖类，多元醇类等，可以单用，也可以两种或多种以上联用，首选
小牛血清蛋白。黄素腺嘌呤二核苷酸，糖类可选用甘露醇，海藻糖，多元醇可选用乙二醇，PEG6000等。
[0034] 反应体系中可适当加入
表面活性剂，能
加速反应，增加酶的稳定性，包括吐温类，聚氧乙烯醚类等非离子表面活性剂，特别优选的是吐温类，使用范围在0.5～10ml/L，最佳选用1.0～1.5ml/L。
[0035] 酶激活剂为Ca2+或Mg2+。用量在0.05～5mmol/L，应严格掌握，加多了可与H2PO4-1结合产生浑浊。
[0036]
显色剂为4-氨基安替比林，
苯酚类、苯胺类。苯酚类包括：苯酚、2，4-二氯酚、4-氯酚、对羟基
苯甲酸、三溴羟基苯甲酸、3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠等，检测波长在500～520nm；苯胺类包括：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间
甲苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐等等，很多，就不多叙述了。检测波长在540～600nm之间，灵敏度比苯酚类的高，是目前生化检测试剂中常用的。使用不同的显色剂就有相对应的波长。
附图说明
[0037] 图1为本发明检测试剂盒检测结果线性图；
[0038] 图2为本发明检测试剂盒与外购乳酸氧化酶法检测对比图。
具体实施方式
[0040] 试剂一：
[0041]
[0042] 试剂二：
[0043]
[0044] TOOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺
[0045] 试剂一︰试剂二为2︰1,两点终点法，正反应，波长：546nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为3.0︰180︰90，
温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，反应5分钟，检测吸光度。
[0046] 实施例二
[0047] 试剂一：
[0048]
[0049] 试剂二：
[0050]
[0051] 试剂一︰试剂二为3︰1,两点终点法，正反应，波长选用520nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为4.0︰270︰90，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，反应5分钟，检测吸光度。
[0052] 实施例三
[0053] 试剂一：
[0054]
[0055]
[0056] 试剂二：
[0057]
[0058] ADPS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠
[0059] 试剂一︰试剂二为4︰1,两点终点法，正反应，波长选用550nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为2.5︰200︰50，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，反应5分钟，检测吸光度。
[0060] 以实施例三为例，检测数据如下：
[0061] 检测试剂盒线性结果为
[0062]理论值mmol/L 0 2.31 4.61 9.23 18.46
实测值mmol/L 0.06 2.64 5.14 9.98 18.46
[0063] 线性方程：y＝0.9933x+0.3805，R2＝0.9982。见
说明书附图1。
[0064] 用朗道标准品(1117UN，1.62mmol/L)定标，检测朗道质控血清(1093UN，1.20～1.46～1.70mmol/L)，重复检测20次，结果如下：
[0065]
[0066] SD＝0.0176，CV＝1.19％，平均吸光度：0.3166(日立7180机)低值血清重复检测20次，结果如下：
[0067]
[0068] SD＝0.007678，CV＝3.80％，平均吸光度：0.0795(日立7180机)
[0069] 用该检测试剂盒与外购乳酸氧化酶法检测50份临床血清做对比试验，对比试验结果如下：
[0070] 50例临床样本的对比试验
[0071]
[0072] 两种方法所得的结果高度相关，r2＝0.9998。见说明书附图2。
[0073] 稳定性检测：用朗道标准品(1117UN，1.62mmol/L)定标，检测朗道质控血清(1093UN，1.20～1.46～1.70mmol/L)，每月标准品、质控品重新复溶，试剂重新开瓶进行检测一次，每次重复检测10次，求均值，共13个月。结果如下：
[0074]
[0075] 质控品定值：1.20～1.46～1.70mmol/L根据国家规定，企业制定的试剂有效期应在超期一个月内仍稳定，结果符合要求。
[0076] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
