多核酸扩增反应用具
阅读：318发布：2024-02-27
专利汇可以提供多核酸扩增反应用具专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且实施方式的多核酸扩增反应用具具备支持体和多个种类的引物组。支持体以支持液相的反应场的方式构成。多个种类的引物组，按每个种类能够游离地固定于在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的所述支持体的至少1个面的彼此独立的多个固定化区域。多个种类的引物组以扩增与其分别对应的目标序列的方式构成。，下面是多核酸扩增反应用具专利的具体信息内容。
1.多核酸扩增反应用具，具备：以支持液相的反应场的方式构成的支持体；彼此独立地配置于在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的所述支持体的至少1个面的多个引物固定化区域；和按每个种类能够游离地固定于所述多个引物固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。
2.根据权利要求1所述的多核酸扩增反应用具，所述支持体具有容器形态或流路形态。
3.根据权利要求1所述的多核酸扩增反应用具，进一步具备能够游离地固定于所述引物固定化区域的增稠剂。
4.根据权利要求1所述的多核酸扩增反应用具，进一步具备安装于所述支持体的、与支持体一起构成维持反应液的室的覆盖体。
5.根据权利要求1所述的多核酸扩增反应用具，所述支持体由基板形成。
6.根据权利要求5所述的多核酸扩增反应用具，是核酸检出用器件，其中，所述支持体在其第1面具备沟部，
所述沟部具备用于核酸样品进行反应的流路型室，
所述流路型室的剖面积，大于所述沟部中除了所述流路型室以外部分的剖面积。
7.根据权利要求5所述的多核酸扩增反应用具，进一步具备：
在所述支持体上形成的核酸检出用的传感器部；在所述支持体上形成的、与所述传感器连接的配线；和在所述支持体上形成的保护膜，
所述多核酸扩增反应用具是在用于所述传感器部与核酸样品反应的室内进行核酸扩增反应，然后通过所述传感器部进行核酸扩增产物的检出的核酸检出器件，所述保护膜具备在所述基板上的所述核酸样品的接液区域使包含一部分所述基板的下层部露出的1个以上的开口。
8.根据权利要求7所述的多核酸扩增反应用具，所述传感器部是电极。
9.根据权利要求8所述的多核酸扩增反应用具，所述保护膜在所述接液区域覆盖所述配线。
10.根据权利要求7所述的多核酸扩增反应用具，所述保护膜是选自聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚1,1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅和金属氧化物中的至少1种。
11.根据权利要求7所述的多核酸扩增反应用具，所述保护膜包含酚醛清漆树脂、环氧树脂、聚烯烃树脂和硅树脂。
12.根据权利要求1所记载的多核酸扩增反应用具，所述支持体由第1板形成，所述第
1板由硬质材料构成，
所述多核酸扩增反应用具进一步具备：由软质材料一体构成的流路包装、和由硬质材料构成的第2板，
所述流路包装具备：核酸反应流路；贮存核酸样品的第1注射器；贮存核酸反应中使用的试剂液的第2注射器；贮存从所述核酸反应流路流出的液体的第3注射器；连接所述第1注射器和所述第2注射器以及所述核酸反应流路的第1流路；和连接所述核酸反应流路和所述第3注射器的第2流路，
所述多核酸扩增反应用具是所述第1板与所述流路包装的第1面相对、所述第2板与所述第1面的相反侧的第2面相对并与所述第1板一起密封所述流路包装的核酸反应盒。
13.多核酸扩增反应载体，具备：基体；彼此独立地配置于所述基体的至少1个面的多个引物固定化区域；和按每个种类能够游离地固定化于所述多个引物固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。
14.多核酸扩增方法，具备：在支持体的至少1个面的彼此独立的多个固定化区域，将用于分别扩增多个种类的目标核酸的多个种类的引物组，按每个种类能够游离地进行固定的步骤，所述支持体是以支持液相的1个反应场的方式构成的，所述至少1个面是在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的面；
对所述支持体添加用于进行核酸扩增的反应液而形成1个反应场的步骤；
在所述1个反应场中对于所述多个种类的目标核酸分别进行扩增反应的步骤。
多核酸扩增反应用具
技术领域
[0001] 本发明涉及多核酸扩增反应用具。
背景技术
[0002] 现在，随着基因检查技术的进展，在临床现场、犯罪搜查等各种场面实施基因检查。在这些基因检查中，大多要通过检出多个对象基因、将它们的结果综合才能有用。例如，在临床现场进行病原菌特定等。这时，判定基于患者的症状而怀疑感染的多个种类的微生物、或各微生物的类型。由此进行诊断。在犯罪搜查现场进行例如个人特定等。这时，对于所有人在其基因组上具有的多个基因座中的重复序列，特定重复的次数。由特定的多个基因座中的重复数综合地特定个人。由此可以以高准确率特定个人。这样，检出多个对象基因的技术变得非常重要。
[0003] 到目前为止，在检出多个对象基因时，首先在特定的反应容器内进行样品核酸的扩增。然后，进一步在检出用的反应装置内对于所得的扩增产物进行检出。
[0004] 扩增主要在接下来的多个或1个反应容器内进行。在多个反应容器内进行扩增时，分别准备用于扩增各个对象基因的反应容器。在1个反应容器内进行扩增时，用于检出全部对象基因的试剂被收纳于1个反应容器中而进行多核酸扩增反应。应被检出的核酸的检出一般通过将扩增产物供于DNA芯片、电泳等来进行。
发明内容
[0005] 发明要解决的课题
[0006] 本发明要解决的课题是提供能够彼此独立地同时扩增多个种类的目标序列的多核酸扩增反应用具。
[0007] 用于解决课题的方法
[0008] 实施方式的多核酸扩增反应用具具备支持体和多个种类的引物组。支持体以支持液相的反应场的方式构成。多个种类的引物组，按每个种类能够游离地固定于在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的所述支持体的至少1个面的彼此独立的多个固定化区域。多个种类的引物组以扩增与其分别对应的目标序列的方式构成。附图说明
[0009] 图1是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0010] 图2是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0011] 图3是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0012] 图4是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0013] 图5是显示使用实施方式的检出方法的图解。
[0014] 图6是模拟地显示检出由实施方式所得的扩增产物时得到的结果的图。
[0015] 图7是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0016] 图8是显示多核酸扩增反应用具的1例的图。
[0017] 图9是显示多核酸扩增检出反应用具的1例的图。
[0018] 图10是显示多核酸扩增检出反应用具的1例的图。
[0019] 图11是显示芯片原料的1例的图。
[0020] 图12是显示多核酸扩增检出反应用具的1例的图。
[0021] 图13是显示多核酸扩增检出反应用具的1例的图。
[0022] 图14是显示多核酸扩增检出反应用具的1例的图。
[0023] 图15是显示多核酸反应用具的1例的图。
[0024] 图16是显示由多核酸反应用具所得的实验结果的图。
[0025] 图17是核酸检出用器件的概略图。
[0026] 图18是核酸检出用器件的概略图。
[0027] 图19是核酸检出用器件的概略图。
[0028] 图20是核酸检出用器件的概略图。
[0029] 图21是支持体的概略图。
[0030] 图22是核酸检出用器件的概略图。
[0031] 图23是核酸检出用器件的概略图。
[0032] 图24是显示核酸扩增反应的结果的图。
[0033] 图25是核酸检出用器件的概略图。
[0034] 图26是核酸检出用器件的概略图。
[0035] 图27是核酸检出用器件的概略图。
[0036] 图28是核酸检出用器件的概略图。
[0037] 图29是核酸检出用器件的概略图。
[0038] 图30是核酸检出用器件的概略图和显示核酸扩增反应的结果的图。
[0039] 图31是显示核酸检出用器件的制成步骤的图。
[0040] 图32是显示核酸检出用器件的概略构成的剖面图。
[0041] 图33是显示核酸检出用器件的概略构成的图。
[0042] 图34是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0043] 图35是显示核酸检出用器件内藏盒的概略构成的图。
[0044] 图36是显示核酸检出用器件与反应部规定用部件的对向配置的图。
[0045] 图37是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0046] 图38是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0047] 图39是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0048] 图40是显示核酸扩增反应的结果的图。
[0049] 图41是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0051] 图43是核酸检出用器件的表面的反应区域附近的放大图。
[0052] 图44显示由各电极得到的结果的图。
[0053] 图45是显示核酸反应用具的平面图。
[0054] 图46是显示核酸反应用具的透视图。
[0055] 图47是显示核酸反应用具的透视图。
[0056] 图48是显示核酸反应用具的透视图。
[0057] 图49是显示核酸反应用具的透视图。
[0058] 图50是显示芯片原料的图。
[0059] 图51是显示阵列型引物探针芯片的图。
[0060] 图52是显示阵列型引物探针芯片的图。
[0061] 图53是显示阵列型引物探针芯片的图。
[0062] 图54是显示核酸检出盒的概略构成的分解立体图。
[0063] 图55是显示核酸检出盒的概略构成的立体图。
[0064] 图56是显示核酸检出装置的概略构成的立体图。
具体实施方式
[0065] 以下，对于本发明的实施的方式进行详细说明。
[0066] 1.定义
[0067] “多核酸扩增”是指将应被扩增的多个种类的目标序列同时扩增。“扩增”是指使用引物组将模板核酸连续地复制的工序。能够使用的扩增法只要是使用引物组扩增目标核酸的方法即可，不限于这些，例如，包含PCR扩增、LAMP扩增、RT-LAMP扩增、SMAP扩增和ICAN扩增等。
[0068] “目标序列”是指要通过引物组进行扩增的序列，也包含使用的引物所结合的区域。
[0069] “目标核酸”是至少包含目标序列的序列，是被使用的引物组作为模板使用的核酸，也称为“模板核酸”。
[0070] “引物组”是为了扩增1种目标核酸而所需的引物的集合体。例如，在PCR扩增用的引物组的情况下，1种引物组包含用于扩增1种目标核酸的1种正向引物和1种反向引物即可。另外例如，在LAMP扩增用的引物组的情况下，1种引物组至少包含用于扩增1种目标核酸的FIP引物、BIP引物即可，根据需要还可以包含F3引物、B3引物、LP引物、即LF引物和/或LB引物。
[0071] “目的序列”是指应被该阵列型引物探针芯片检出的序列。应被检出的目的核酸包含“目的序列”。将由目的序列组成的核酸称为“目的序列链”。目的序列链与包含其互补序列的探针核酸杂交，通过检出该杂交的有无或量，来检出或测定目的核酸的有无或量。
[0073] “样品”只要是包含应被核酸反应用具扩增和/或检出的核酸的物质即可。样品不限于这些，可以是例如，血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、组织、活组织检查、口腔内粘膜、培养细胞、喀痰等，或通过任何其本身公知的手段从所述的任一或其混合物中作为核酸成分提取出的物质。
[0074] 2.多核酸扩增反应用具
[0075] ＜第1实施方式＞
[0076] (1)多核酸扩增反应用具
[0077] 参照图1(a)和(b)来说明多核酸扩增反应用具的1例。该多核酸反应用具是用于多扩增多个种类的目标核酸的多核酸扩增反应用具的例子。
[0078] 图1(a)是多核酸扩增反应用具的1例的立体图。图1(a)所记载的多核酸扩增反应用具1具有容器形状的支持体2。支持体2的内侧底面配置彼此独立的多个固定化区域3。图1(b)是将固定化区域3的部分放大而得的模式图。如其中所示，在1个固定化区域
3固定1个种类的引物组4。在多个固定化区域3各自按每个种类而分别固定多种引物组
4。多种引物组4根据需要可以彼此不同，也可以一部分是彼此不同的序列，或者也可以一部分是彼此相同的序列。
3固定1个种类的引物组4。在多个固定化区域3各自按每个种类而分别固定多种引物组
4。多种引物组4根据需要可以彼此不同，也可以一部分是彼此不同的序列，或者也可以一部分是彼此相同的序列。
[0079] 引物组4为了分别扩增作为目的的多种目标核酸而准备多个种类。自爱1个固定化区域3固定用于扩增特定的1种目标核酸的1种引物组4。例如，在PCR扩增用的反应用具的情况下，1个固定化区域包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的正向引物和反向引物分别多条。另外，在LAMP扩增用的反应用具的情况下，1个固定化区域包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的FIP引物、BIP引物、根据需要的F3引物、B3引物、和LP引物分别多条。
[0080] 引物组4以与用于提供反应场的液相接触而游离的方式、以能够游离的状态固定于固定化区域3。引物组4向固定化区域3的固定化，例如，可以通过将包含1组引物组的溶液滴加于1个固定化区域3中，然后使其干燥来实现。进而，同样地，对于其他固定化区域3，将分别包含所期望的引物组4的溶液滴加和干燥，将所期望的数的多种引物组固定于支持体2即可。由此，在独立配置于支持体2的1个面的全部固定化区域3固定引物组4。然而，引物组4向固定化区域3的固定化只要以与用于提供反应场的液相接触而能够游离的状态固定即可。因此，还可以使用能够进行这样的固定化的其本身公知的任何固定化法。
在滴加包含引物组的溶液的方法的情况下，包含引物组的溶液可以是例如，水、缓冲液或有机溶剂等。
在滴加包含引物组的溶液的方法的情况下，包含引物组的溶液可以是例如，水、缓冲液或有机溶剂等。
[0081] 配置于支持体2的多个固定化区域3彼此独立地配置即可。独立地配置是指，以不妨碍反应场中对于每个引物组开始和/或进行的扩增的间隔配置。例如，相邻的固定化区域3可以彼此相接而配置，也可以隔开微小的距离而配置在彼此附近，或者，可以隔开与通常使用的所谓DNA芯片等检出装置中所固定化的探针同样的距离而彼此配置。例如，相邻的固定化区域3的之间的距离可以为0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0082] 该引物的长度虽然不限于此，但可以为约5个碱基以上、约6个碱基以上、约7个碱基以上、约8个碱基以上、约9个碱基以上、约10个碱基以上、约15个碱基以上、约20个碱基以上、约25个碱基以上、约30个碱基以上、约35个碱基以上、约40个碱基以上、约45个碱基以上或约55个碱基以上，也可以为约80个碱基以下、约75个碱基以下、约70个碱基以下、约65个碱基以下、约60个碱基以下、约55个碱基以下、约50个碱基以下、约45个碱基以下、约40个碱基以下、约35个碱基以下、约30个碱基以下、约25个碱基以下、约20个碱基以下、约25个碱基以下或约20个碱基以下，还可以是将这些下限上限的任一者组合而得的范围。例如，优选的碱基长度的例子可以是约10个碱基～约60个碱基、约13～40个碱基、约10～30个碱基等。另外，同时固定于1个支持体的引物的长度可以全部引物相同，也可以全部引物不同，可以一部分引物为相同的长度，也可以一部分引物为不同的长度。另外，也可以每个引物组不同。另外，可以固定于1个区域的引物组按每个种类而为不同的长度，也可以固定于1个区域的引物组全部为相同的长度。
[0083] 用于提供反应场的液相只要是在固定的引物游离之后，能够使用它们进行扩增反应的液相即可，例如，可以是所期望扩增所需的反应液。
[0084] 容器形态的支持体可以是例如，管、孔、室、流路、杯和盘以及具备多个上述构造的板、例如多孔板等。另外支持体的材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。另外，容器形态的支持体还可以利用能够商业购买的任何容器。
[0085] 图1中显示了固定化区域3配置于支持体2的内侧底面的例子，但不限于此，可以配置于支持体22的内侧侧面的至少一部分，也可以配置于内侧底面和内侧侧面、顶棚面的任一者或全部。
[0086] (2)使用了多核酸扩增反应用具的核酸的扩增反应
[0087] 图2是显示使用了与第1实施方式同样的多核酸扩增反应用具21的核酸扩增反应的样子的图。图2(a)是反应前的多核酸扩增反应用具21。配置于支持体22的内侧底面的多个固定化区域23中分别固定了多种引物组24。在多核酸扩增反应用具21中添加反应液26，将收容了该反应液26的状态示于图2(b)。
[0088] 反应液26含有所期望的扩增反应所需要的成分即可。虽然不限于这些，可以含有例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂。
[0089] 如图2(b)所示，在添加了反应液26之后的多核酸扩增反应用具中，如图2(c)所模式地显示那样，固定于内侧底面的引物游离而缓缓地扩散。将游离和扩散的区域模式地用区域27表示。游离、扩散的引物与存在于其附近的模板核酸、聚合酶和底物等扩增所需的其他成分相遇，从而扩增反应开始。按每个种类独立地多个固定化的引物组，可以按其每个种类而独立地对于模板核酸开始和进行扩增反应。由此，使用了多个种类的引物组的对于多种模板序列的扩增，独立且同时地实现。这里，“反应场”理论上是指由能够在其中进行扩增反应的反应液26所规定的区域，即反应液所存在的区域。另外，将反应场中实际在其中开始并进行扩增反应的区域称为“反应区域”。假设实际上扩增反应仅在区域27内进行的情况下，区域27被理解为反应区域。
[0090] 反应液26只要是在固定的引物组游离之后，能够进行引物组与目标核酸之间的扩增反应的液相即可。对固定化了引物的反应场(最初被空气填满)，在扩增反应开始前机械地或人工地通过某些手法注入该反应液即可。
[0091] 在上述的例子中，显示了仅引物组被固定化于支持体的例子。然而，不限于此，在引物组按每个种类而被固定于各固定化区域的条件下，也可以将扩增所需的其他成分，例如聚合酶、逆转录酶等酶、底物、底物和/或缓冲剂等与引物一起固定于支持体。此时，使要固定的物质与引物一起包含在所期望的液体介质中，与上述的方法同样地通过滴加和干燥等来固定即可。在这样的多核酸扩增反应用具中进行扩增反应时，根据被固定的成分而选择在其中添加的反应液的组成即可。
[0092] ＜第2实施方式＞
[0093] 参照图3来说明多核酸扩增反应用具的另外1例。
[0094] 图3是显示多核酸扩增反应用具另外1例的平面图。图3所记载的多核酸扩增反应用具31是使用基板作为支持体32的例子。在支持体32的1个面配置彼此独立的多个固定化区域33。固定化区域33中与图1同样地，在1个固定化区域33固定1个种类的引物组34。在多个固定化区域33各自按每个种类而分别固定多种引物组34。1个固定化区域33所含的引物组34的构成与第1实施方式同样地，包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的不同种类的引物。
[0095] 使用第2实施方式的扩增，通过至少对支持体32固定化了引物组34的区域装载反应液来形成反应场即可。
[0096] 固定化区域33还可以配置于在支持体32表面预先形成的凹部面、或由凹部或凸部形成的流路的内壁。
[0097] 使用基板作为支持体时，其材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。另外，引物34向支持体的固定化与第1实施方式同样地进行即可。
[0098] 进而另外，还可以将第2实施方式的多核酸扩增反应用具配置于能够维持该用具的容器内，通过在该容器内添加反应液来形成反应场。另外此时，可以在支持体32的两面固定引物组34。由此，可以对本多核酸扩增反应用具固定更多种类的引物组，从而可以扩增更多的目标序列。在这一侧面，多核酸扩增反应用具只要是至少在1表面独立地固定了多种引物组的支持体，就可以是任何形状的支持体。此时的支持体的材质和引物的固定化法可以与第1实施方式和第2实施方式同样。这样的多核酸扩增反应用具可以作为具备基体和在其至少1个表面的彼此独立的固定化区域按每个种类而可以游离地固定的多个种类的引物组的多核酸扩增反应载体使用。此时，基体的大小和形状可以由实施者任意选择。例如，可以是板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形态。
[0099] ＜第3实施方式＞
[0100] 参照图4说明多核酸扩增反应用具的另外1例。图4所示的多核酸扩增反应用具41是使用具有流路的支持体的例子。图4(a)是平面图，图4(b)是沿线m-m’切割而得的剖面图。
[0101] 多核酸扩增反应用具41具备：在配置于在支持体42的内部形成的流路44的内侧底面的、彼此独立的多个固定化区域43，按每个种类能够游离地固定的多种引物。
[0102] 支持体42具有基体42a和覆盖体42b。覆盖体42b具有用于规定流路的凹部。固定化区域43配置于面向流路44的内侧的基体42a表面。基体42a与覆盖体42b以能够维持收纳于内部的液体的方式密合。该密合可以通过例如固定和/或接合等其本身公知的手段来实现，或者，也可以一体化，还可以在一体化了的状态下形成支持体42。
[0103] 该多核酸扩增反应用具41例如使用第1基板42a和第2基板42b来制造。首先，在第1基板42a的预先确定的固定化区域43按每个种类能够游离地固定多种引物组44。该固定化可以通过与第1实施方式同样的方法来进行。另一方面，在第2基板42b上与所需的流路形状对应地形成凹部45。凹部45的形成可以根据使用的基板的材质通过其本身公知的方法来进行。另外，固定化区域43的配置以包含在由形成于第2基板42b的凹部45所形成的流路内的方式确定。接着，将第1基板42a和第2基板42b一体化。此时，以第2基板42b的凹部45面向第1基板42a侧的方式一体化。另外，可以在第2基板42b的凹部
45的一部分设置贯通孔(未图示)。该贯通孔可以作为反应液等向流路的出入口利用。
45的一部分设置贯通孔(未图示)。该贯通孔可以作为反应液等向流路的出入口利用。
[0104] 第1基板42a的材质和第2基板42b的材质可以相同，也可以不同。另外，第1基板42a和第2基板42b的材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。
[0105] 在本实施方式中，显示了在具有流路46的支持体42的流路的内侧底面固定引物组的例子，但流路的配置和形状不限于此。固定化引物组的面可以是构成流路的任何面，引物组可以固定于构成流路的全部面，也可以固定于多个面。
[0106] 或者，对预先形成凹部45或沟而形成了流路的第1基板42a，可以通过在其流路的一部分壁面独立地固定多种引物组，然后，用硅胶加盖，从而制造图4的多核酸扩增反应用具。
[0107] ＜第4实施方式＞
[0108] 多核酸扩增和检出
[0109] 如图5所示，多核酸扩增反应用具51可以具备作为支持体的管52、独立地固定于管52的内面的多种引物组(未图示)。在这样的管型的多核酸扩增反应用具51中也可以扩增多个种类的目标核酸。然后，可以将所得的扩增产物加入到固定了多种不同的核酸探针56的DNA芯片55等装置中进行检出。这样实施方式中示例的多核酸扩增反应用具，可以使检出用样品的调制比现有更简便，并且可以独立地进行多个扩增。
[0110] ＜第5实施方式＞
[0111] 多核酸扩增法
[0112] 作为另外的实施方式，还提供以下多核酸扩增反应方法，该多核酸扩增反应方法包括：对由特定的容器、管、盘或形成了流路的基板等形成的支持体的至少1个内侧表面，能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的工序。
[0113] 这样的多核酸扩增反应方法例如可以具备以下步骤：对所期望的支持体的至少1个表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的步骤；以多个种类的引物组包含在1个反应场的方式添加包含扩增所需的试剂的反应液的步骤，所述扩增所需的试剂例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；通过将固定了该引物的支持体加热或冷却来进行温度调节等、调节适合扩增反应的反应环境的步骤；和由此进行多核酸扩增反应的步骤。
[0114] 具体的扩增反应可以根据扩增反应的种类而利用其本身公知的技术来进行。
[0115] 进而，作为另外的实施方式，还提供以下多核酸扩增反应，该多核酸扩增反应包括：对微珠、板小片或棒等基体的表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的工序。
[0116] 这样的多核酸扩增反应方法例如可以具备以下步骤：对所要求的基体的至少1个表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的步骤；将基体配置于包含扩增所需的试剂的反应液内的步骤，所述扩增所需的试剂例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；通过将反应液加热或冷却来进行温度调节等、调节适合扩增反应的反应环境的步骤；和由此进行多核酸扩增反应的步骤。
[0117] 对于通过这样的多核酸扩增而扩增目标核酸，然后用DNA芯片进行扩增产物的检出时的结果进行说明。
[0118] 图6(a-1)是显示在添加于反应容器61内的反应液62中，使用多个种类的引物组、即第1引物组(A)63a和第2引物组(B)63b，分别扩增目标序列的样子的图。图(a-1)的反应体系64不是这里公开的该多核酸扩增反应用具，而是现有的一般反应体系。即，对反应容器61的任何面均不固定任何引物组，在直接在反应液中混合的状态下进行扩增反应。
[0119] 图6(b-1)显示具有与上述的第2实施方式同样的构成的多核酸扩增反应用具21。多核酸扩增反应用具21具备容器22、和配置于其内侧底部的第1引物固定化区域23a和第
2引物固定化区域23b。在第1引物固定化区域23a能够游离地固定第1引物组(A)24a。
在第2引物固定化区域23b能够游离地固定第2引物组(B)24b。
2引物固定化区域23b。在第1引物固定化区域23a能够游离地固定第1引物组(A)24a。
在第2引物固定化区域23b能够游离地固定第2引物组(B)24b。
[0120] 利用图6(a-1)的反应体系的扩增，由于引物组(A)63a与引物组(B)63b之间的扩增效率、扩增特异性等不同，因而所得的扩增量产生差异。通过这样的扩增所得的结果的1例示于图6(a-2)。例如，在想要检出基因表达量时，这样的一般方法中不能反映真正的表达量。
[0121] 在图6(a-2)所示的作为另外实施方式的1例的多核酸扩增反应用具21的情况下，利用能够游离地固定于容器22第1引物(A)24a和第2引物(B)24b的扩增，彼此独立地对于目的的目标核酸进行。因此，在第1引物(A)24a和第2引物(B)24b各自的模板核酸以等量存在于反应场中的情况下，可以得到如图6(b-2)所示那样的相同的大小的检出信号。
[0122] 通过作为1例在上述的实施方式中显示多核酸扩增反应用具，可以在不受由不同的序列产生的干扰的条件下将多个种类的目标序列独立地同时进行。现有技术中，将多个种类的引物在1个容器内使用而进行多元扩增时，存在反应效率发生偏倚、种类的数有限这样的问题。即，有时在不同种类的引物之间发生必要的酶和/或dNTP的竞争。另外，有时根据目标序列的序列和/或引物的序列而反应特异性和/或反应效率出现差异。此时，就会产生根据引物种类不同而扩增反应开始点不同、仅对于一部分引物组的扩增开始并进行、或者对于一部分引物组的扩增不能充分实现等问题。这样的现有问题也通过本说明书中公开的实施方式而被解决。
[0123] 即，如果使用以实施方式为例显示的多核酸扩增反应用具进行扩增反应，则仅在固定的扩增试剂附近进行扩增反应，因而虽然是在同一容器中和/或同一溶液中，但扩增反应不彼此干扰，可以独立地进行各种目标的扩增反应。另外，还可以在个别反应某种程度进行之后进一步补加不同的引物组，还可以将第1实施方式所示的容器形态的多核酸扩增反应用具与上述的多核酸扩增反应载体组合使用。
[0124] ＜实施例1＞
[0125] 以下，记载可以进行10种LAMP多扩增的多扩增用容器的实施例。
[0126] (1)多扩增用容器的制作
[0127] 使用的引物的碱基序列示于表1-1和表1-2。
[0128] 表1-1引物组一览
[0129]
[0130] (表1-1的继续)
[0131]
[0132] 对于各引物组，通过在玻璃基板表面点样包含FIP：40pmol、BIP：40pmol、F3：40pmol、B3：5pmol、LP：20pmol的TE溶液0.6uL，在室温放置10分钟，从而将引物干燥固定。
在干燥固定了引物的基板上放置预先形成了流路的硅胶，从而制造在流路内点样了引物的多扩增用容器(图4)。
在干燥固定了引物的基板上放置预先形成了流路的硅胶，从而制造在流路内点样了引物的多扩增用容器(图4)。
[0133] (2)多扩增用容器用LAMP反应液的制作和LAMP反应
[0134] 将多扩增用容器用LAMP反应液的组成示于表2。
[0135] 表2 多扩增容器用LAMP溶液组成
[0136] (uL)
[0137]反应混合物 14.0
Bst DNA聚合酶 4.0
DW 22.0
模板1号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板2号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板3号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板4号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板5号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板6号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板7号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板8号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板9号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板10号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
总计 50.0
Bst DNA聚合酶 4.0
DW 22.0
模板1号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板2号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板3号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板4号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板5号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板6号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板7号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板8号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板9号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
模板10号(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
总计 50.0
[0138] 将该反应液所含的模板1～10号的碱基序列示于表3-1、表3-2、表3-3、表3-4、表3-5、表3-6、表3-7、表3-8、表3-9和表3-10。
[0139] 表3-1
[0140] 模板1号
[0141] GTTCTGTATACTGCCCCTCTCCCAGCGGTTCCATGGTAACCTCTGATTCC
[0142] CAGTTATTTAATAAGCCTTATTGGCTACATAAGGCCCAGGGCCACAACAA
[0143] TGGTATATGTTGGCATAATCAATTATTTCTTACTGTTGTGGACACTACCC
[0144] GTAGTACCAACTTTACATTATCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTA
[0145] CATATGATCCTTCTAAGTTTAAGGAATATACCAGGCACGTGGAGGAGTAT
[0146] GATTTACAATTTATATTTCAACTGTGTACTGTCACATTAACAACTGATGTT
[0147] ATGTC
[0148] 表3-2
[0149] 模板2号
[0150] GTTGAGGTGGGCAGAGGACAGCCCCTTGGTGTTGGCCTTAGTGGTCAT
[0151] CCCTTATTTAATAAATATGATGACACAGAAAATTCACGCATAGCAAATGG
[0152] CAATGCACAACAAGATGTTAGAGATAACACATCTGTTGACAACAAACAGA
[0153] CTCAGTTATGTATAATAGGCTGTGCTCCACCTATTGGGGAACACTGGGG
[0154] TATTGGCACTACATGCAA
[0155] 表3-3
[0156] 模板3号
[0157] GCCACTGTACAAAGCAGTGCTTTTTTTCCTACTCCTAGTGGTTCTATGGT
[0158] AACCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCGTACTGGTTACAACGTGCGC
[0159] AGGGCCACAATAATGGCATATGTTGGGGCAATCAGTTGTTTGTCACAGTT
[0160] GTGGATACCACTCGTAGCACTAACATGACTTTATGTGCTGAGGTTAAAAA
[0161] GGAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAAGGAATACCTTCGTCATGGCG
[0162] AGGAATTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTGTGCAAAATTACATTAACAG
[0163] CTGATGTTATGACATACATTCA
[0164] 表3-4
[0165] 模板4号
[0166] CTGCAGATGTATATGGAGACAGTATGTTCTTTTGTTTACGTAGGGAACAG
[0167] TTATTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGGGGGCATGGTAGGGGACACTA
[0168] TACCTACTGAATTGTATATTAAGGGCACTGACATACGTGACAGTCCTAGT
[0169] AGTTATGTATATGCCCCCTCGCCTAGTGGGTCTATGGTATCCTCAGACTC
[0170] CCAGTTATTTAAC
[0171] 表3-5
[0172] 模板5号
[0173] CAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAA
[0174] ATATTCAATAAACCTTATTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGG
[0175] CATTTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCA
[0176] GTACAAATATGTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACTACATATA
[0177] AAAATACTAACTTTAAGGAGTACCTACGACATGGGGAGGAATATGATTTA
[0178] CAGTTTATTTTTCAACTGTGCAAAATAACCTTAACTGCAGACGTTATGAC
[0179] 表3-6
[0180] 模板6号
[0181] TGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTG
[0182] TTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGT
[0183] TTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTA
[0184] CCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATAT
[0185] GATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTT
[0186] GCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTC
[0187] CTATATTC
[0188] 表3-7
[0189] 模板7号
[0190] CCTATAGGTGAACATTGGGGAAAAGGCACACCTTGTAATGCTAACCAGG
[0191] TAAAAGCAGGAGAATGTCCTCCTTTGGAGTTACTAAACACTGTACTACAA
[0192] GACGGGGACATGGTAGACACAGGATTTGGTGCAATGGATTTTACTACAT
[0193] TACAAGCTAATAAAAGTGATGTTCCCCTAGATATATGCAGTTCCATTTGC
[0194] AAATATCC
[0195] 表3-8
[0196] 模板8号
[0197] GTATATGTTGCTACGCCTAGTGGGTCTATGATTACGTCTGAGGCACAGTT
[0198] ATTTAATAAACCTTATTGGTTGCAACGTGCCCAAGGCCATAATAATGGCA
[0199] TTTGCTGGGGTAATCAATTATTTGTTACTGTAGTAGATACTACTAGAAGTA
[0200] CTAACATGACTATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATGATGCA
[0201] CGAAAAATTAATCAGTACCTTAGACATGTGGAGGAATATGAATTACAATT
[0202] TGTTTTTCAATTATGCAAAATTACTTTGTCTGCAGAGGTTATGGC
[0203] 表3-9
[0204] 模板9号
[0205] GACGTGAGCAGATGTTTGTTAGACACTTTTTTAATAGGGCTGGAAAACTT
[0206] GGCGAGGCTGTCCCGGATGACCTTTATATTAAAGGGTCCGGTAATACTG
[0207] CAGTTATCCAAAGTAGTGCATTTTTTCCAACTCCTAGTGGCTCTATAGTTA
[0208] CCTCAGAATCACAATTATTTAATAAGCCTTATTGGCTACAGCGTGCACAA
[0209] GGTCATAACAAT
[0210] 表3-10
[0211] 模板10号
[0212] A GGGCTGAGGG TTTGAAGTCCAACTCCTAAG CCAGTGCCAG
[0213] AAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGG
[0214] AGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCA
[0215] GGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGACAACTGTGTTCA
[0216] 在多扩增容器的流路中注入多扩增用容器用LAMP反应液50uL，以玻璃面与设定为63℃的加热板相接的方式，装载在加热板的上，进行1小时LAMP反应。
[0217] (3)PCR管用LAMP反应液的制作和LAMP反应
[0218] PCR管用LAMP反应液的组成示于表4。将该反应液放置于设定为63℃的恒温装置中，进行1小时LAMP反应。
[0219] 表4 PCR管用LAMP溶液组成
[0220] (μL)
[0221]
[0222] (4)LAMP扩增产物检出用DNA芯片的制作
[0223] 合成表5所示的探针(3’末端SH标记合成寡聚物)。
[0224] 表5 探针DNA一览
[0225]
[0226] 探针1号是用于检出从引物组1号得到的LAMP扩增产物的探针，同样地探针2～10号是分别用于检出从引物组2～10号得到的LAMP扩增产物的探针。通过将包含各探针
3uM的溶液100nL点样于电极上，进行干燥固定，来制作DNA芯片。DNA芯片、和DNA芯片测定装置使用SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008中记载的装置。
3uM的溶液100nL点样于电极上，进行干燥固定，来制作DNA芯片。DNA芯片、和DNA芯片测定装置使用SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008中记载的装置。
[0227] (5)LAMP扩增产物的检出
[0228] 通过DNA芯片检出用多扩增用容器扩增出的LAMP扩增产物、用PCR管扩增出的LAMP扩增产物，确认了用各扩增容器、管所扩增出的扩增产物。
[0229] 表6 DNA芯片检出结果
[0230]
[0231] 将其结果示于表6。使用PCR管的情况下，10种中仅3种为阳性，其他7种为阴性。另一方面，使用多扩增用容器的情况下，10种全部为阳性，显示可以进行10种多扩增反应。
在PCR管内，同一溶液中包含引物组1～10号和模板1～10号，在其中进行LAMP扩增反应。认为10种引物组中几个种类的LAMP扩增反应一开始，则酶(Bst DNA聚合酶)等被该反应消耗，其他种类的LAMP扩增反应效率低下。另一方面，在多扩增用容器中，虽然同一溶液中包含引物组1～10号和模板1～10号，在其中进行LAMP扩增反应，但通过点样引物，在流路中的各点样位置开始LAMP扩增反应，期待由各种引物引起的扩增反应独立地进行。
在PCR管内，同一溶液中包含引物组1～10号和模板1～10号，在其中进行LAMP扩增反应。认为10种引物组中几个种类的LAMP扩增反应一开始，则酶(Bst DNA聚合酶)等被该反应消耗，其他种类的LAMP扩增反应效率低下。另一方面，在多扩增用容器中，虽然同一溶液中包含引物组1～10号和模板1～10号，在其中进行LAMP扩增反应，但通过点样引物，在流路中的各点样位置开始LAMP扩增反应，期待由各种引物引起的扩增反应独立地进行。
[0232] 3.增稠剂的使用
[0233] ＜第6实施方式＞
[0234] 使用多核酸反应用具进行反应时，反应液中可以存在增稠剂。如果反应液中含有增稠剂，则固定化的引物在游离之后也停留于局部的扩散。增稠剂优选为不抑制扩增反应的物质。关于增稠剂的详细在后述。
[0235] 另外，为了更有效地实现扩增反应，控制反应液向反应场的添加速度的手段也是有效的。例如，流过引物固定化位置上的反应液的流速优选为1mm/秒以上，进一步优选为10mm/秒以上。由此，固定化的引物组的游离受到影响，因此可以实现引物组的更局部的扩散。然而，流过引物固定化位置上的反应液的流速可以根据由规定反应场的支持体和其他部件构成的反应部的形状和大小而取任意的值。
[0236] 使用上述的第1实施方式进行多扩增反应时，通过使所使用的反应液包含增稠剂，可以更高效地实现多扩增反应。
[0237] 使反应液包含增稠剂的方法，可以在反应液本身中添加增稠剂，或者，在将引物组固定于支持体时，通过使用于固定引物组的溶液包含增稠剂，从而与应使用的引物组一起在引物固定化区域固定增稠剂。或者，可以在固定引物之后，通过在引物固定化区域进一步覆盖增稠剂来固定。进而另外，也可以是贴合膜状的增稠剂等的手段，不特别限定。
[0238] 通过使反应液包含增稠剂，从而可以降低固定的引物组向反应液游离的速度、即溶出速度。由此，引物组可以更长时间地停留在局部。其结果可以在不受每种所固定的引物组的不同反应效率左右的条件下更有效地实现利用多种引物组的多扩增。
[0239] 增稠剂优选是其特性粘度大于引物的物质，并且优选是不抑制核酸扩增反应的物质。增稠剂的例子包含：来源于树液的增稠剂，例如扁桃胶、榄香树脂、达玛树脂、阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、阿拉伯半乳聚糖、达瓦树胶和桃树脂等；来源于豆类等的种子的增稠剂，例如亚麻籽胶、瓜尔胶酶分解物、酸豆籽胶、决明子胶、车前籽胶、塔拉胶、槐豆胶即刺槐豆胶、沙蒿籽胶、三刺胶、瓜尔胶和田菁胶等；来源于海藻的增稠剂，例如海藻酸、囊藻提取物、红藻胶和卡拉胶等；来源于果实类、叶和地下茎等的增稠剂，例如芦荟提取物、木立芦荟提取物、果胶、秋葵提取物和黄蜀葵等；来源于微生物的增稠剂，例如气单胞菌胶、肠细菌胶、纳豆芽孢杆菌胶、黑酵母培养液、可得然胶、普鲁兰多糖、维氏固氮菌胶、黄原酸胶、拟大茎点菌(Macrophomopsis)胶、维纶胶(welan gum)、结冷胶、鼠李聚糖胶、Erwinia Mitsuenshisugamu胶、菌核胶、果聚糖、Enterobacter Simmanas胶和葡聚糖；以及其他增粘稳定剂，例如酵母细胞膜、壳多糖、低聚氨基葡萄糖、微小纤维状纤维素、壳聚糖、微晶纤维素和氨基葡萄糖等。进而，增稠剂可以是一般作为饮食物添加物使用的例如琼脂、大豆多糖类、椰果、淀粉、魔芋根提取物、明胶等。优选为琼脂糖等琼脂和/或明胶、聚乙二醇等，但不限于这些。
[0240] 将增稠剂添加到反应液中时，可以在制作反应液时对用于制作反应液的溶剂直接溶解增稠剂。或者，首先准备在溶剂中溶解增稠剂而制作的增稠剂溶液。通过另外将反应所需的其他成分溶解于溶剂来制作反应液。可以将所得的增稠剂溶液与反应液混合。溶剂可以是水、盐水和缓冲液等。
[0241] 在固定引物组的溶液中添加增稠剂时，增稠剂的浓度优选为在室温(25℃)为液体、且能滴加到反应场中的状态。增稠剂的浓度例如为终浓度30％～0.01％左右的范围即可。例如琼脂糖的情况下，为终浓度10％～0.01％的范围即可，进一步优选5％～0.05％的范围，更优选以3％～0.1％的范围混合。在引物固定区域固定增稠剂时可以是同样的。
[0242] 另外，在反应液中添加增稠剂时，增稠剂的浓度优选在室温(25℃)为液体。增稠剂的浓度例如为终浓度30％～0.01％左右的范围即可。例如琼脂糖的情况下，为终浓度10％～0.01％的范围即可，进一步更优选以5％～0.1％的范围混合。
[0243] 现有方法中，在准备用于扩增各个对象基因的反应容器的方法的情况下，随着对象基因数的增加，而所需的反应容器的数、和/或检查时的工作量增加。另外，将用于检出全部的对象基因的试剂加入到1个反应容器中时，由于扩增反应效率发生偏倚等原因，对象基因数有限。另外，现有的多扩增的情况下，多个种类的引物组溶出而扩散时，有可能由于引物彼此之间的非特异结合而扩增效率低下、或仅特性好的引物组优先扩增，从而产生扩增反应的灵敏度低下、扩增种类限制等。这样的问题也通过本实施方式而被解决。
[0244] ＜第7实施方式＞
[0245] 上述显示了使反应液含有增稠剂的例子，但也可以反应液不含增稠剂、而至少在固定引物组的区域固定增稠剂。第7实施方式在以下记述固定增稠剂的例子。
[0246] 将增稠剂固定于支持体上时，可以在引物组的固定之前，也可以与引物组的固定同时，也可以在固定引物组之后。优选增稠剂在与引物组的固定同时或在引物组的固定之后固定于支持体。
[0247] 在与引物组的固定同时将增稠剂固定于支持体时，可以对溶解了引物组的溶液溶解增稠剂。或者，可以首先将增稠剂溶解于溶剂而准备增稠剂溶液，与另外调制的引物组固定用的溶液混合。将所得的包含引物组和增稠剂的溶液通过滴加和干燥等固定即可。
[0248] 在引物组固定化之前或之后固定增稠剂溶液时，在将含增稠剂的溶液滴加、喷射、印刷、用刷毛涂布，或在增稠剂溶液浸渍支持体之后，通过干燥等而在包含引物固定化区域的支持体表面固定即可。
[0249] 增稠剂溶液、或包含引物组和增稠剂的溶液的干燥方法，可以使用加热块、加热板和孵育器等，通过在室温以上的温度加热来进行热干燥。或者，可以在常温放置而进行自然干燥。或者，可以进行真空干燥和/或冻结干燥。例如在使用琼脂糖时，优选进行热干燥，干燥后的状态为膜状。
[0250] 固定中使用的增稠剂溶液中的增稠剂的浓度，只要固定时的状态为在室温(25℃)为液体、且能滴加到支持体上的状态即可。固定增稠剂时的增稠剂的浓度例如，为终浓度30％～0.01％左右的范围即可。例如在琼脂糖的情况下，为终浓度10％～0.01％的范围即可，进一步优选为5％～0.05％的范围，更优选以3％～0.1％的范围混合。
[0251] 进而，固定中使用的增稠剂溶液中可以含有引物组，除了引物组以外，也可以含有扩增反应所需的其他物质。
[0252] 通过增稠剂的使用，解决了多扩增反应中的灵敏度低下、扩增种类的限制等。
[0253] ＜第8实施方式＞
[0254] 参照图7来说明多核酸扩增反应用具的另外1例。
[0255] 图7是显示多核酸扩增反应用具的另外1例的平面图。图7所记载的多核酸扩增反应用具71是使用基板作为支持体72的例子。在支持体72的1个面配置彼此独立的多个固定化区域73。固定化区域73中与图1同样地，在1个固定化区域73固定1个种类的引物组74。在多个固定化区域73各自按每个种类而分别固定多种引物组34。1个固定化区域73所含的引物组74的构成与第1实施方式同样地，包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的不同种类的引物。进而，在固定化区域73以覆盖引物组74的方式通过涂布而固定了增稠剂75。
[0256] 使用第25实施方式的扩增，通过至少对支持体72的固定化了引物组74的区域装载反应液来形成反应场即可。
[0257] 固定化区域73可以配置于在支持体72表面预先形成的凹部面、或由凹部形成的流路的内壁。
[0258] 在使用基板作为支持体时，其材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。另外，引物向支持体的固定化与第11的实施方式同样地进行即可。
[0259] 进而另外，可以将第25实施方式的多核酸扩增反应用具配置于能够维持该用具的容器内，通过在容器内添加反应液来形成反应场。另外此时，可以在支持体72的两面固定引物组74。进而，可以以覆盖引物组74的方式通过涂布来固定增稠剂75。由此，可以对本多核酸扩增反应用具固定更多种类的引物组，从而可以扩增更多的目标序列。在这一侧面，多核酸扩增反应用具只要是至少在1表面独立地固定了多种引物组的支持体，则可以是任何形状的支持体。此时的支持体的材质和引物的固定化法可以与第1实施方式和第2实施方式等同样。这样的多核酸扩增反应用具71可以作为具备基体和在其至少1个表面的彼此独立的固定化区域按每个种类能够游离地固定的多个种类的引物组的多核酸扩增反应载体使用。此时，基体的大小和形状可以由实施者任意选择。例如，可以是板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形状。
[0260] 增稠剂的固定可以与引物组同时，也可以在引物组的固定化之前。另外，也可以不进行增稠剂的固定，而在反应时使反应液含有增稠剂。
[0261] ＜第9实施方式＞
[0262] (1)多核酸扩增反应用具
[0263] 参照图8来说明多核酸扩增反应用具的另外1例。图8所示的多核酸扩增反应用具81是使用具有流路的支持体的例子。图8(a)是平面图，图8(b)是沿线m-m’切割而得的剖面图。
[0264] 多核酸扩增反应用具81，具备在配置于在支持体82的内部形成的流路87的内侧底面的彼此独立的多个固定化区域83，按每个种类能够游离地固定的多种引物84。
[0265] 支持体82具有基体82a和覆盖体82b。覆盖体82b具有规定流路的凹部86。引物固定化区域83配置于与流路84的内部相接的基体82a表面。
[0266] 该多核酸扩增反应用具81例如使用第1基板和第2基板来制造。首先，在第1基板的预先确定的固定化区域83能够游离地固定多种引物组84与增稠剂的混合物。引物组84按每个种类而固定。该固定化可以如上所述地进行。另一方面，在第2基板与所期望的流路87形状对应地形成凹部86。凹部86的形成可以根据所使用的基板的材质通过其本身公知的方法来进行。另外，固定化区域83的配置以包含在由形成于第2基板的凹部86所形成的流路87内的方式确定。接着，将第1基板和第2基板一体化。通过一体化，由凹部
86的内壁与第1基板的第2基板侧的面形成流路形状的反应部。此时，以第2基板的凹部
86面向第1基板侧的方式一体化。另外，可以在第2基板的凹部86的一部分设置贯通孔(未图示)。该贯通孔可以作为反应液等向流路87的出入口利用。
86的内壁与第1基板的第2基板侧的面形成流路形状的反应部。此时，以第2基板的凹部
86面向第1基板侧的方式一体化。另外，可以在第2基板的凹部86的一部分设置贯通孔(未图示)。该贯通孔可以作为反应液等向流路87的出入口利用。
[0267] 第1基板的材质和第2基板的材质可以相同也可以不同。另外，第1基板和第2基板的材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。
[0268] 本实施方式中显示了在具有流路87的支持体82的流路87的内侧底面固定了引物组84的例子，但流路87的配置和形状不限于此。另外，固定化探针组的面可以是规定流路87的任何面，也可以在规定流路87的全部面固定探针组，另外也可以在多个面固定。
[0269] 或者，可以在预先通过凹部或凸部或形成沟而形成了流路87的第1基板上，对配置于该流路87的一部分壁面的引物固定化区域83，独立地固定多种引物组84。然后，可以安装硅胶等盖体，从而制造多核酸扩增反应用具。
[0270] 所使用的引物的长度等可以如上所述。
[0271] ＜第10实施方式＞
[0272] (1)多核酸扩增检出反应用具
[0273] 多核酸反应用具可以作为多核酸扩增检出反应用具提供。多核酸扩增检出反应用具除了如上所述的第1实施方式～第9实施方式之外，还具备探针固定化区域和固定于其中的探针核酸。接着说明多核酸扩增检出反应用具的例子。
[0274] 参照图9(a)、(b)和(c)来说明多核酸扩增检出反应用具的1例。
[0275] 图9(a)是多核酸扩增检出反应用具91的1例的立体图。图9(a)所记载的多核酸扩增检出反应用具91具有容器形状的支持体92。在支持体92的内侧底面93配置彼此独立的多个引物固定化区域94。与多个引物固定化区域94接近地、另外与各个引物区域对应地配置多个探针固定化区域95。
[0276] 图9(c)是将引物固定化区域94放大而得的模式图。如其中所示，在1个引物固定化区域94固定1个种类的引物组96。在多个引物固定化区域94各自按每个种类而分别固定多种引物组96。
[0277] 为了分别扩增目的的多种目标核酸而准备多个种类的引物组96。在1个引物固定化区域94固定用于扩增特定的1种目标核酸的1种引物组96。例如，在PCR扩增用的反应用具的情况下，在1个引物固定化区域94包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的正向引物和反向引物分别多条。另外，在LAMP扩增用的反应用具的情况下，在1个引物固定化区域94包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的FIP引物、BIP引物、根据需要的F3引物、B3引物、和LP引物分别多条。
[0278] 引物组96以与用于提供反应场的液相接触而游离的方式、以能够游离的状态固定于引物固定化区域94。引物组96向引物固定化区域94的固定化，例如，可以通过将包含1组引物组的溶液滴加于1个引物固定化区域94，然后干燥来实现。进而，同样地，对于其他引物固定化区域94，将包含分别所期望的引物组96的溶液滴加和干燥，将所期望的数的多种引物组96固定于支持体92即可。由此，在独立地配置于支持体92的1个面的全部的固定化区域94固定引物组96。然而，引物组96向固定化区域94的固定化，只要以与用于提供反应场的液相接触而能够游离的状态固定即可。因此，可以使用能够进行这样的固定化的其本身公知的任何固定化法。在滴加包含引物组的溶液的方法的情况下，包含引物组的溶液可以是例如水、缓冲液或有机溶剂等。
[0279] 配置于支持体92的多个引物固定化区域94彼此独立地配置即可。独立地配置是指，以不妨碍反应场中对于每个引物组开始和/或进行的扩增的间隔配置。例如，相邻的引物固定化区域94可以彼此相接而配置，也可以隔开微小的距离而配置在彼此附近，或者，可以隔开与通常使用的所谓DNA芯片等检出装置中所固定化的探针核酸同样的距离而彼此配置。
[0280] 例如，相邻的引物固定化区域94的之间的距离可以为0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0281] 用于提供反应场的液相只要是在固定的引物游离之后，能够使用这些引物进行扩增反应的液相即可，例如，可以是所期望的扩增所需的反应液。
[0282] 容器形态的支持体92可以是例如管、孔、室、流路、杯和盘以及具备多个上述构造的板、例如多孔板等。另外支持体92的材质只要是其本身不参与反应的材质即可，只要是能够在其中进行扩增反应的材质即可。可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。另外，容器形态的支持体92可以利用能够商业购买的任何容器。
[0283] 图9显示了引物固定化区域94配置于支持体92的内侧底面93的例子，但不限于此，可以配置于支持体92的内侧侧面的至少一部分，也可以配置于底面和内侧侧面、由覆盖体所规定的顶棚面的任一者、或全部。
[0284] 图9(b)是与引物固定化区域94接近地配置的探针固定化区域95的放大图。在探针固定化区域95固定包含应被检出的所期望的序列的互补序列的探针核酸97多个。
[0285] 应被检出的所期望的序列可以是目的序列。探针固定化区域95以探针核酸97与目的序列链的杂交信号在多个探针固定化区域95之间独立地被检出的方式配置。
[0286] 探针核酸97向探针固定化区域95的固定，可以利用其本身公知的在所谓DNA芯片中对基板表面固定探针核酸97的一般的任何技术。可以在固定探针核酸97之后固定引物组96，也可以在固定引物组96之后固定探针核酸97，也可以将引物组96的固定和探针核酸97的固定同时进行。
[0287] 例如，相邻的探针固定化区域95的之间的距离可以为0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0288] 另外例如，探针固定化区域95与引物固定化区域94的之间的距离可以为0μm～0.1μm、0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0289] 例如，在探针固定化区域95与引物固定化区域94的之间的距离为0μm的情况下，可以理解为探针固定化区域95与引物固定化区域94位于支持体92表面的相同的位置。另外，可以探针固定化区域95包含在引物固定化区域94中，也可以引物固定化区域94包含在探针固定化区域95中。
[0290] (2)使用了多核酸扩增检出反应用具的核酸的扩增检出方法
[0291] 图10是显示使用与第10实施方式同样的多核酸扩增检出反应用具91进行的核酸扩增反应后的反应场的样子的模式图。图10(a-1)和(b-1)是反应前的多核酸扩增检出反应用具91。在支持体92的内侧底面93配置多个引物固定化区域94。在多个引物固定化区域94的附近配置探针固定化区域95。在多个引物固定化区域94分别固定了多种引物组96。对应于各个引物固定化区域94，在配置于各自的附近的探针固定化区域95按所期望的每个种类而固定了多种探针核酸97。
[0292] 在多核酸扩增检出反应用具91中添加反应液98，将收容了该反应液的状态示于图10(b-2)和(b-2)。
[0293] 反应液98含有所期望的扩增反应所需的成分和增稠剂即可。虽然不限于这些，但可以含有例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂。
[0294] 增稠剂以同样的浓度含有与第6实施方式同样种类的物质即可。
[0295] 样品向反应场的添加，可以通过在多核酸扩增检出反应用具91中添加反应液98之前在反应液98中预先添加来进行，也可以在将反应液98添加到多核酸扩增检出反应用具91中之后进行，也可以通过在多核酸扩增检出反应用具91中添加反应液98之前将样品添加到多核酸扩增检出反应用具91中来进行。
[0296] 如图10(a-2)和(b-2)所示，在添加了反应液98之后的多核酸扩增检出反应用具91中，如图10(a-3)和(b-3)中模式地显示的那样，固定于支持体92的内侧的底面93的引物组96游离，缓缓地扩散。将游离和扩散的区域用区域99模式地显示。游离、扩散的引物组96与存在于其附近的模板核酸、聚合酶和底物等扩增所需的其他成分相遇，从而扩增反应开始。按每个种类而独立地多个固定的引物组96，可以按其每个种类而独立地对于模板核酸开始和进行扩增反应。由此，使用了多个种类的引物组96的对于多种模板序列的扩增，独立且同时地实现。这里，“反应场”理论上是指由能够在其中进行扩增反应的反应液
98所规定的区域，即反应液所存在的区域。另外，将反应场中实际在其中开始并进行扩增反应的区域称为“反应区域”。假设实际上扩增反应仅在区域99内进行的情况下，区域99被理解为反应区域。图10(a-3)的图是由全部的固定于引物固定化区域94的引物组96发生了扩增反应时的模式图。图10(b-3)是固定的引物组96仅在被固定于底面93的全部的引物固定化区域94的中的一部分、图10(b-3)中为3个区域发生了扩增时的模式图。
98所规定的区域，即反应液所存在的区域。另外，将反应场中实际在其中开始并进行扩增反应的区域称为“反应区域”。假设实际上扩增反应仅在区域99内进行的情况下，区域99被理解为反应区域。图10(a-3)的图是由全部的固定于引物固定化区域94的引物组96发生了扩增反应时的模式图。图10(b-3)是固定的引物组96仅在被固定于底面93的全部的引物固定化区域94的中的一部分、图10(b-3)中为3个区域发生了扩增时的模式图。
[0297] 在区域99扩增出的扩增产物中存在包含目的序列的核酸的情况下，探针固定化区域95与该核酸杂交。固定于探针固定化区域95的探针核酸97以仅与对应的引物固定化区域94中的扩增产物杂交的方式被固定。即，以固定于1个探针固定化区域95的探针核酸97仅与对应的引物固定化区域94中的扩增产物杂交的方式，维持距离地配置各个探针固定化区域95和引物固定化区域94。
[0298] 探针核酸97与目的序列链的杂交的检出，可以通过其本身公知的杂交信号的检出手段来进行。例如，可以预先对引物组96付与荧光物质，也可以对脱氧核苷三磷酸等底物付与荧光物质。以来自这些荧光物质的荧光强度为指标来确定杂交的有无和量。或者，可以通过电化学的手段了来检出杂交信号。
[0299] 杂交的检出可以在多核酸扩增检出反应用具91内部的洗涤后实行，也可以不洗涤地实行。在通过电化学的手段检出的情况下，可以使用嵌入剂来检出杂交信号。此时，例如，可以预先使反应液98中含有嵌入剂，也可以在杂交反应开始前、杂交反应中、杂交反应后添加。这些情况下，均可以在多核酸扩增检出反应用具91内部的洗涤后进行检出，也可以不进行洗涤地进行检出。杂交反应的开始、反应中、反应后的判定可以根据引物、探针核酸和模板核酸的序列、反应温度等反应条件来进行，也可以通过预实验来确定。
[0300] 引物的长度可以如上所述。
[0301] 探针核酸的长度例如，可以为3个碱基～10个碱基、10个碱基～20个碱基、20个碱基～30个碱基、30个碱基～40个碱基、40个碱基～50个碱基、50个碱基～60个碱基，优选为10个碱基～50个碱基。探针核酸包含应被检出的目的序列的互补序列。探针核酸除了目的序列的互补序列之外可以含有另外的序列，例如间隔物序列等。
[0302] 目标序列的长度例如，可以为10个碱基～100个碱基、100个碱基～200个碱基、碱基200～300个碱基、300个碱基～400个碱基，优选为100个碱基～300个碱基。
[0303] 目的序列的长度例如，可以为3个碱基～10个碱基、10个碱基～20个碱基、20个碱基～30个碱基、30个碱基～40个碱基、40个碱基～50个碱基、50个碱基～60个碱基，优选为10个碱基～50个碱基。
[0304] 固定于1个引物固定化区域94的引物组96的种类，可以是用于扩增1种目标核酸的1个种类，为了分别扩增2种以上的目标核酸也可以是多个种类。
[0305] 固定于1个探针固定化区域95的探针核酸97群的种类，可以是用于与1种目的序列的1个种类，为了分别扩增2种以上的目标核酸也可以是多个种类。另外，也可以是目的序列的部分共同、进而包含其他与目的序列不同的序列的探针核酸。
[0306] 配置于1个阵列型多核酸扩增检出反应用具91的引物固定化区域94的数的下限可以为1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、50以上、75以上、100以上、125以上、150以上、175以上、200以上、300以上、400以上、500以上、1000以上、1500以上、2000以上，上限可以为10000以下、5000以下、2500以下、2000以下、1500以下、1000以下、500以下、250以下、200以下、150以下，也可以是将这些上限下限的任一者组合而得的范围。
[0307] 配置于1个多核酸扩增检出反应用具91的引物固定化区域94和探针固定化区域95的数可以相同也可以不同。即，可以以与全部的引物固定化区域94对应的方式配置相同数的探针固定化区域95，也可以引物固定化区域94的数多于探针固定化区域95的数，也可以引物固定化区域94的数少于探针固定化区域95的数。另外，可以含有用于确认扩增反应状态、或用于确认杂交反应的状态的阳性对照和/或阴性对照。这样的阳性对照和/或阴性对照可以基于引物组96和/或探针核酸设计。
[0308] 在上述的例子中，显示了仅引物组96固定化于支持体92的例子。然而，不限于此，在引物组96按每个种类而固定于各固定化区域的条件下，可以将扩增所需的其他成分、例如聚合酶、逆转录酶等酶、底物、底物和/或缓冲剂等与引物组96一起固定于支持体92。此时，使要固定的物质与引物组96一起包含在所期望的液体介质中，与上述的方法同样地通过滴加和干燥等来固定即可。在这样的多核酸扩增检出反应用具91中进行扩增反应时，根据被固定的成分而选择在其中添加的反应液的组成即可。
[0309] 另外，在上述的例子中，显示了将增稠剂添加在反应液中的例子，但也可以在反应液不包含增稠剂的条件下，固定于支持体92。固定可以如上所述进行。
[0310] 支持体92不限于容器形状，如上所述，可以是板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形状，基体的大小和形状可以由实施者任意选择。另外，优选如第3实施方式那样，使用具有流路的基板来构成支持体92。
[0311] ＜第11实施方式＞
[0312] 参照图11～图14来说明第11的实施方式的多核酸扩增检出反应用具。
[0313] (1)芯片原料
[0314] 首先，对于通过电化学检出来检出杂交信号的多核酸扩增检出反应用具的芯片原料的构成和制造方法的1例，使用图11(a)和(b)进行说明。图11(a)是芯片原料111的平面图，图11(b)是图11(a)的芯片原料111沿线B-B的剖面图。
[0315] 芯片原料111具备在矩形的基板112上沿其长度方向配置的例如4个电极113a～113d。各电极113a～113d具有第1金属薄膜图案114和第2金属薄膜图案115依次叠层而得的结构。另外，各电极113a～113d具有大矩形部116和小矩形部117以细线117连接而得的形状。绝缘膜118覆盖在包含各电极113a～113d的基板112上。圆形窗119开口于与大矩形部116对应的绝缘膜118部分。矩形窗120开口于与小矩形部117对应的绝缘膜118部分。电极113a的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第1作用极121a发挥功能。电极113b的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第2作用极121b发挥功能。电极113c的从圆形窗119露出的大矩形部116作为对电极122发挥功能。电极113d的从圆形窗119露出的大矩形部116作为参考电极123发挥功能。另外，电极113a～113d的从矩形窗120露出的小矩形部117作为探测器接触部发挥功能。
[0316] 这样的芯片原料111可以通过如下的方法制作。
[0317] 首先，在基板112上通过例如溅射法或真空蒸着法依次堆积第1金属薄膜和第2金属薄膜。接下来将这些金属薄膜例如以抗蚀剂图案作为掩模依次选择性地进行蚀刻，沿基板112的长度方向形成依次叠层了第1金属薄膜图案114和第2金属薄膜图案115的、例如4个电极113a～113d。这些电极113a～113d具有大矩形部116与小矩形部117通过细线117连接而成的形状。
[0318] 接下来，在包含电极113a～113d的基板112上，通过例如溅射法或CVD法来堆积绝缘膜118。接下来，将各电极113a～113d的与大矩形部116对应的绝缘膜118部分和与小矩形部117对应的绝缘膜118部分，以抗蚀剂图案作为掩模，选择性地进行蚀刻，在与大矩形部116对应的绝缘膜118部分开口圆形窗119，并在与小矩形部117对应的绝缘膜118部分开口矩形窗120。由此制作前述的芯片原料111。
[0319] 基板112由例如像パイレックス(注册商标)玻璃那样的玻璃或树脂制作。
[0320] 第1金属薄膜作为用于使第2金属薄膜与基板112密合的基底金属膜发挥作用，例如，由Ti制作。第2金属薄膜例如由Au制作。
[0322] 绝缘膜118可列举例如，硅氧化膜那样的金属氧化膜、硅氮化膜那样的金属氮化膜。
[0324] (2)多核酸扩增检出反应用具
[0325] 接着，参照图12(a)和图12(b)来说明在上述(1)中制造的芯片原料111上固定引物组和探针核酸而得的多核酸扩增检出反应用具的构成和制造方法的1例。图12(a)是多核酸扩增检出反应用具的平面图，图12(b)是图12(a)的多核酸扩增检出反应用具的沿线B-B的剖面图。
[0326] 将在芯片原料111上形成的电极113a的第1作用极121a作为第1探针固定化区域201a，在该第1探针固定化区域201a固定包含第1目的序列的互补序列的第1探针核酸202a。固定的第1探针核酸202a将其多条作为1种探针核酸群而被固定。同样地，将电极
113b的第2作用极121b作为第2探针固定化区域，在该第2探针固定化区域固定包含与第
1目的序列不同的第2目的序列的互补序列的第2探针核酸202b。
113b的第2作用极121b作为第2探针固定化区域，在该第2探针固定化区域固定包含与第
1目的序列不同的第2目的序列的互补序列的第2探针核酸202b。
[0327] 将探针核酸202a和202b固定于探针固定化区域的方法的例子，包含对于具备金电极的芯片原料111，在3’末端将硫醇基导入第1探针核酸202a的方法等。
[0328] 接下来，在第1作用极121a的附近配置第1引物固定化区域203a，在第2作用极121b的附近配置第2引物固定化区域203b。在该第1引物固定化区域203a上能够游离地固定第1引物组204a和增稠剂205，在第2引物固定化区域203b上能够游离地固定第2引物组204b和增稠剂205。由此制作多核酸扩增检出反应用具。
[0329] 第1引物组204a具有以扩增第1目标序列的方式设计的序列，第2引物固定化区域203b具有以扩增由与第1目标序列不同的序列构成的第2目标序列的方式设计的序列。
[0330] 第1和第2引物组204a和204b分别向第1和第2引物固定化区域203a和203b的固定，可以通过使例如水、缓冲液或有机溶剂那样的液体含有引物组而滴加，然后在例如室温等的适当的温度条件下放置直至干燥的时间，例如，室温的情况下放置10分钟，从而进行。
[0331] 增稠剂的固定可以与第7实施方式同样地进行，或者，也可以不固定增稠剂，而仅使其在反应液中存在。
[0332] (3)使用时的多核酸扩增检出反应用具
[0333] 对于上述(2)中制作的多核酸扩增检出反应用具的使用方法，参照图13和图14来说明。
[0334] 图13(a)是使用时的多核酸扩增检出反应用具的平面图，图13(b)是图13(a)的多核酸扩增检出反应用具的沿线B-B的剖面图。
[0335] 在使用本实施方式的多核酸扩增检出反应用具91时，以分别形成于电极113a～113d的第1作用极121a、第2作用极121b、对电极122和参考电极123、以及第1引物固定化区域203a和第2引物固定化区域203b包含于同一反应场的方式维持反应液。为此，在多核酸扩增检出反应用具91的使用前，将覆盖体301安装在多核酸扩增检出反应用具91上，所述覆盖体301由例如硅胶那样的硅树脂和/或氟树脂等那样的树脂通过例如挤出成型、注射成型或模压成型和/或利用接合剂的接合等其本身公知的任一树脂成型法成型而得。安装了覆盖体301之后，将包含模板核酸303的反应液302添加到由多核酸扩增检出反应用具91与覆盖体301所形成的空间。
[0336] 在安装了覆盖体301的多核酸扩增检出反应用具91中，电极113a～113d的从各自的矩形窗120露出的小矩形部117露出。
[0337] 将覆盖体301安装在多核酸扩增检出反应用具91的例子包含例如，压合、利用接合剂的接合等。
[0338] 接下来，在将覆盖体301安装于多核酸扩增检出反应用具91之后，添加反应液302。
[0339] 在由多核酸扩增检出反应用具91与覆盖体301所形成的空间添加液体的方法，例如，可以在覆盖体301的一部分预先设置开口部，从该开口部添加，另外也可以使用顶端的锐利的、例如具有针那样的顶端的注入器插入覆盖体301的一部分而添加。
[0340] 反应液302可以包含：样品；增稠剂；扩增试剂，例如聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等；以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；和例如HOECHST33258那样的识别双链核酸而产生信号的嵌入剂。在应检查的样品中存在包含应被固定于特定的引物固定化区域的引物组扩增的目标序列的模板核酸的情况下，在包含该引物固定化区域和与其对应的探针固定化区域的反应场形成扩增产物。其样子模式地示于图14。
[0341] 图14(a)模式地显示反应场401中形成了扩增产物的状态。图14(a)是使用时的多核酸扩增检出反应用具的平面图，图14(b)是图14(a)的多核酸扩增检出反应用具的沿线B-B的剖面图。如上所述由于在图13中添加的样品中含有包含第2引物组204b所能够结合的序列的核酸，因此如图14(a)和图14(b)所示，第2引物组在反应场401中游离和扩散，与模板核酸相遇后进行扩增反应，由此形成扩增产物。由第2引物组204b产生的扩增产物在第2引物固定化区域203b的周围扩散，到达第2探针固定化区域201b。在到达的扩增产物包含目的序列的情况下，第2探针核酸202b与扩增产物杂交而形成双链核酸。反应液302所含的嵌入剂与该双链核酸结合而产生杂交信号。
[0342] 杂交信号例如，使探测器与电极113a～113d各自的从矩形窗120露出的小矩形部117接触，测定HOECHST33258那样的嵌入剂的电流应答，从而进行。
[0343] 通过使用利用电化学检出的阵列型引物探针芯片，从而可以更简单且短时间地扩增样品所含的目标核酸，然后进行该扩增产物所含的目的核酸的检出。
[0344] (4)目的核酸的检出方法
[0345] 作为另外的实施方式，还提供使用如上所述的多核酸扩增检出反应用具作为例子，扩增多种目标核酸，以杂交信号为指标检出目的核酸的方法。
[0346] 另外，作为另外的实施方式，还提供目的核酸的检出方法，该目的核酸的检出方法包括：对特定的容器、管、盘或形成了流路的基板等支持体的至少1个表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组工序；和/或将1种以上的探针核酸固定于探针固定化区域的工序。
[0347] 这样的目的核酸的检出方法例如可以具备以下步骤：对所期望的支持体的至少1个表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的步骤；在多个引物固定化区域的位置或其附近的探针固定化区域，以每个探针固定化区域能够独立地检出杂交信号的方式，按每个种类固定包含目的序列的互补序列的至少1种探针核酸的步骤；以多个种类的引物组包含在1个反应场的方式添加包含扩增所需的试剂的反应液的步骤，所述扩增所需的试剂例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；通过向例如反应液或阵列型引物探针芯片添加等而将样品拿进反应场的步骤；通过将固定了该引物的支持体加热或冷却来进行温度调节等、调节适合扩增反应的反应环境的步骤；由此进行多核酸扩增反应的步骤；和检出和/或测定由多核酸扩增反应生成的扩增产物与至少1种探针核酸之间的杂交的有无和/或量的步骤。另外，所述反应液可以包含增稠剂。
[0348] 具体的扩增反应可以根据扩增反应的种类利用其本身公知的技术来进行。
[0349] 具体的检出手段可以利用其本身公知的杂交信号的检出手段，例如利用荧光标记的荧光强度的检出和/或测定、或者利用嵌入剂的电流应答的检出和/或测定的方法来进行。
[0350] 进而，作为另外的实施方式，还提供目的核酸的检出方法，该目的核酸的检出方法包括：对微珠、板小片或棒等基体的表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组工序；和在多个引物固定化区域的位置或其附近的探针固定化区域以每个探针固定化区域能够独立地检出杂交信号的方式，按每个种类固定包含目的序列的互补序列的至少1种探针核酸的步骤。
[0351] 这样的目的核酸的检出方法例如具备以下步骤：对所要求的基体的至少1个表面能够游离地固定为了分别扩增多个种类的目标核酸而设计的多个种类的引物组的步骤；在多个引物固定化区域的位置或其附近的探针固定化区域以每个探针固定化区域能够独立地检出杂交信号的方式，按每个种类固定包含目的序列的互补序列的至少1种探针核酸的步骤；将基体配置于包含扩增所需的试剂的反应液内的步骤，所述扩增所需的试剂例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；通过向反应液添加而将样品拿进反应场的步骤；通过将反应液加热或冷却来进行温度调节等、调节适合扩增反应的反应环境的步骤；由此进行多核酸扩增反应的步骤；和检出和/或测定由多核酸扩增反应生成的扩增产物与至少1种探针核酸之间的杂交的有无和/或量的步骤。另外，反应液也可以包含增稠剂。
[0352] 通过作为例子在实施方式中显示的多核酸扩增检出反应用具，可以在不受由不同的序列造成的干扰的条件下，将对于多个种类的目标序列的扩增独立地同时进行。进而，可以与扩增反应同时或接着扩增反应，在与进行扩增反应的相同的反应场中，对于由扩增反应所生成的扩增产物检出和/或测定目的核酸的有无和/或量。另外，通过增稠剂的应用，可以效率良好地进行对于多个种类的目标序列并列进行的扩增反应。
[0353] 另外，代替向反应液添加增稠剂，还可以将增稠剂如上所述地固定于支持体。或者，增稠剂既可以仅在反应液中存在，也可以仅固定于支持体而提供。
[0354] 进而，为了更有效地实现扩增反应，反应液向反应场的添加，优选以注入速度25mm/秒以上的速度注入。由此，固定化的引物组的游离受到影响，因而可以实现引物组的更局部的扩散。
[0355] 在现有的技术中，在1个容器内使用多个种类的引物进行多元扩增时，反应效率发生偏倚、种类的数有限成为问题。即，有时在不同种类的引物之间发生必要的酶和/或dNTP的竞争。另外，有时根据目标序列的序列和/或引物的序列而反应特异性和/或反应效率出现差异。此时，就会产生根据引物种类不同而扩增反应开始点不同、仅对于一部分引物组的扩增开始并进行、或者对于一部分引物组的扩增不能充分实现等问题。这样的现有问题也通过本说明书中公开的实施方式而被解决
[0356] 即，如果是使用以实施方式为例显示的多核酸扩增检出反应用具进行扩增反应，则仅在固定的扩增试剂附近进行扩增反应，因而虽然是在同一容器中和/或同一溶液中，但扩增反应不彼此干扰，可以独立地进行各种目标的扩增反应，可以在这样的扩增反应的同时之后，在与进行扩增反应的相同的反应容器中检出和/或测定目的核酸的有无和/或量。另外，还可以在个别反应某种程度进行之后进一步补加不同的引物组，还可以将第1实施方式所示的容器形态的多核酸扩增检出反应用具与上述的多核酸扩增检出反应用具组合使用。
[0357] 在检出多个对象基因时，可以是准备用于扩增各个对象基因的反应容器的方法、将用于检出全部的对象基因的试剂放入1个反应容器进行多核酸扩增反应的方法的任一方法。准备用于扩增各个对象基因的反应容器的方法的情况下，随着对象基因数的增加，所需的反应容器的数、和/或检查时的工作量增加。另外，将用于检出全部的对象基因的试剂放入1个反应容器的情况下，扩增反应效率发生偏倚。通过使用增稠剂，可以防止这样的扩增反应效率发生的偏倚。
[0358] ＜实施例2＞
[0359] 实施例2-1
[0360] 使用第9实施方式评价引物的核酸状态。
[0361] 准备经荧光标记的引物组。显示与图15具有同样的构成的多核酸反应用具1121。
[0362] 将准备的引物组以终浓度200μM溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH值8.0)，1mM EDTA)中。在该溶液中以终浓度0.3％溶解琼脂糖而调制固定溶液。作为支持体1122使用玻璃基板。将该固定溶液滴加在支持体1122上的中央(图中用1123表示)、和支持体
1122的2点角落部(图中用1124和1125表示)的3点，在室温放置而干燥。使用在其一面形成了沟1126的硅胶板作为覆盖体1127。覆盖体1127的沟1126的两端分别形成贯通孔1128和1129。以支持体1122的固定了引物组和琼脂糖的区域包含在覆盖体1127的沟部1126内的方式，对支持体1122接合覆盖体1127。由此，得到多核酸反应用具。该多核酸反应用具通过覆盖体1127的沟部1126与支持体1122的面而形成了流路1130。
1122的2点角落部(图中用1124和1125表示)的3点，在室温放置而干燥。使用在其一面形成了沟1126的硅胶板作为覆盖体1127。覆盖体1127的沟1126的两端分别形成贯通孔1128和1129。以支持体1122的固定了引物组和琼脂糖的区域包含在覆盖体1127的沟部1126内的方式，对支持体1122接合覆盖体1127。由此，得到多核酸反应用具。该多核酸反应用具通过覆盖体1127的沟部1126与支持体1122的面而形成了流路1130。
[0363] 使用覆盖体1127的2个贯通孔分别作为流入口1128和排出口1129来进行。从流入口1128添加PBS。然后，以荧光强度作为指标观察引物的扩散状态。
[0364] 作为对象，准备不固定琼脂糖而仅将经荧光标记的引物组与上述同样地固定而制作的对照用多核酸反应用具。该对照用多核酸反应用具也同样地从流入口A添加TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH值8.0)，1mM EDTA)，以荧光强度为指标观察引物的核酸状态。
[0365] 将结果示于图16(a)和(b)。图16(a)是仅固定了引物的对照用多核酸反应用具所得的结果。图16(b)是固定了引物组和琼脂糖的多核酸反应用具所得的结果。
[0366] 与固定了引物组和琼脂糖的多核酸反应用具相比，对照用多核酸反应用具由于添加TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH值8.0)，1mM EDTA)而移动的距离更大。由该结果明确了，通过固定了引物组和琼脂糖的多核酸反应用具，可以实现更局部的引物的扩散。
[0367] 实施例2-2
[0368] 制作与第11实施方式同样的电化学检出用的多核酸扩增检出反应用具。
[0369] (1)芯片原料的制作
[0370] 形成如图11所示的多核酸扩增检出反应用具用的芯片原料。在パイレックス玻璃表面通过溅射形成钛和金的薄膜。然后，通过蚀刻处理在玻璃表面上形成钛和金的电极图案。进而在其上涂敷绝缘膜，通过蚀刻处理而使电极、即作用极、对电极、参考电极和探针用电极露出。将此作为用于多核酸扩增检出反应用具的芯片原料。
[0371] (2)多核酸扩增检出反应用具的制作
[0372] 在如上所述制作的芯片原料的作用极上固定化探针DNA。使用的探针DNA的碱基序列示于表7。
[0373]
[0374] 将序列号1～13所示的13种探针DNA(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)、(I)、(J)、(K)、(L)和(M)固定于如上所述制作的芯片原料。分别调制分别含有各3μM的探针DNA的探针DNA溶液。将这些溶液100nL按每个种类而点样在作用极上。在40℃干燥后，用超纯水洗涤。然后，除去残留在作用极表面的超纯水，从而制作探针DNA被固定化于芯片原料的电极的DNA芯片。
[0375] 接着如上述准备硅胶板制的覆盖体。在覆盖体的一面，在与探针固定化区域对应的位置形成了沟。
[0376] 对覆盖体的沟的内侧底面固定多种引物组。引物组固定化区域调整为与之前固定的探针DNA的位置对应的位置。
[0377] 首先，准备所使用的引物DNA。所使用的引物DNA是用于利用Loop-mediated Isothermal amplification(环介导等温扩增，LAMP)法的扩增的引物组。引物DNA的碱基序列示于表8A、8B和8C。
[0378]
[0379]
[0380]
[0381] 对于引物DNA(组A)、(组B)、(组C)、(组D)、(组E)、(组F)、(组G)、(组H)、(组I)、(组J)、(组K)、(组L)、(组M)分别准备200μM的FIP、BIP、F3、B3和LPF。对分别以0.036μL、0.036μL、0.005μL、0.005μL和0.018μL包含FIP、BIP、F3、B3、LPF的0.100μL的溶液，混合0.6％琼脂糖溶液0.100μL。将该水溶液固定于作为覆盖体的硅胶的沟部的内侧底面的引物固定化区域。
[0382] 具体地，将准备的各0.200μL的这些溶液点样于覆盖体的沟部的底部，在40℃使其干燥2分钟。点样以在将覆盖体安装于DNA芯片时，各个探针DNA处于与对应的引物组对向的位置的方式进行。以覆盖体的沟部、与固定化了探针DNA的面对向的方式，将覆盖体与上述制作的芯片原料接合。由此，得到多核酸扩增检出反应用具。在作为覆盖体的硅胶的沟部的2个端部开口2个贯通孔。
[0383] (3)LAMP反应液的制作
[0384] LAMP反应液的组成示于表9～表12。
[0385] 表9 LAMP反应液组成评价
[0386] 组成(1)
[0387]
[0388] 表10 LAMP反应液组成评价
[0389] 组成(2)
[0390]
[0391] 表11 LAMP反应液组成评价
[0392] 组成(3)
[0393]
[0394] 表12 LAMP反应液组成评价
[0395] 组成(4)
[0396]试剂 种类 总计50
反应混合物 14.00
DNA聚合酶 8.00
DW 28.00
总计 50.00
反应混合物 14.00
DNA聚合酶 8.00
DW 28.00
总计 50.00
[0397] 组成(1)～(4)中都含有Bst DNA聚合酶、反应混合物，使用与后述的模板溶液一并，以总量为50μL的方式添加蒸留水(即，DW)而得的组成。
[0398] 组成(1)包含模板A、模板C、模板E、模板G、模板I、模板K和模板M。
[0399] 模板A通过引物组A而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(A)杂交。模板C通过引物组C而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(C)杂交。模板E通过引物组E而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(E)杂交。模板G通过引物组G而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(G)杂交。模板I通过引物组I而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(I)杂交。模板K通过引物组K而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(K)杂交。模板M通过引物组M而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(M)杂交。
[0400] 组成(2)包含模板B、模板D、模板F、模板H、模板J和模板L。
[0401] 模板B通过引物组B而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(B)杂交。模板D通过引物组D而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(D)杂交。模板F通过引物组F而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(F)杂交。模板H通过引物组H而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(H)杂交。模板J通过引物组J而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(J)杂交。模板L通过引物组L而被LAMP扩增。由此生成的扩增产物与探针DNA(L)杂交。
[0402] 组成(3)包含模板A、模板B、模板C、模板D、模板E、模板F、模板G、模板H、模板I、模板J、模板K、模板L和模板M的全部。
[0403] 组成(4)不包含模板。
[0404] 模板A、模板B、模板C、模板D、模板E、模板F、模板G、模板H、模板I、模板J、模板K、模板L和模板M的碱基序列示于表13A、表13B和表13C。
[0405] 表13A
[0406]
[0407] (表13A的继续)
[0408]
[0409] (表13B的继续)
[0410]
[0411] (4)多核酸扩增检出反应用具上的LAMP扩增反应、和利用探针DNA的目的核酸的检出
[0412] 以设置于作为覆盖体的硅胶板的2个贯通孔中的一个作为流入口。以由设置于硅胶板的沟部与芯片原料的一面构成的流路作为反应部，在其中进行反应。从流入口向反应部注入LAMP反应溶液，使得反应液以流速25mm/秒通过引物固定化位置上。然后迅速在DNA自动检查装置内设置多核酸扩增检出反应用具。在DNA自动检查装置内的帕尔帖上、以64℃进行60分钟LAMP反应。
[0413] 在60分钟的LAMP反应的后，在55℃进行10分钟杂交反应，在30℃进行3分钟洗涤。然后，除去洗涤溶液，从流入口注入35.5μM的HOECHST33258溶液。
[0414] 对各探针核酸固定化作用极扫描电位，计测与由探针DNA与LAMP产物形成的双链特异性地结合的HOECHST33258分子的氧化电流。上述一系列的反应在SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008所记载的DNA自动检查装置中实施。
[0415] (5)检出结果
[0416] 检出结果示于表14。
[0417]
[0418] [LAMP反应溶液组成(1)的结果]
[0419] 添加了包含模板A、模板C、模板E、模板G、模板I、模板K、模板M的LAMP反应溶液组成(1)时的结果如下。
[0420] 得到了电流值的探针DNA是探针DNA(A)、探针DNA(C)、探针DNA(E)、探针DNA(G)、探针DNA(I)、探针DNA(K)和探针DNA(M)。对于这些探针DNA(A)、探针DNA(C)、探针DNA(E)、探针DNA(G)、探针DNA(I)、探针DNA(K)和探针DNA(M)的全部的探针得到了30nA以上的电流值。
[0421] 因此明确了，在组成(1)的LAMP反应液的情况下，由固定于硅胶的内侧底面的引物组A、引物组C、引物组E、引物组G、引物组I、引物组K和引物组M引起的LAMP反应分别局部地进行，生成的扩增产物与上述的探针DNA杂交。
[0422] 另一方面，在固定于硅胶的内侧底面的引物DNA是引物组B、引物组D、引物组F、引物组H、引物组J、引物组L的情况下，得不到电流值。
[0423] 根据这些结果，通过实施方式的多核酸扩增检出反应用具，能够检出LAMP反应溶液所含的模板A、模板C、模板E、模板G、模板I、模板K和模板M分别被对应的引物组扩增，且与对应的探针核酸杂交。
[0424] 由该结果可以判定，LAMP反应溶液中包含模板A、C、E、G、I、K和M。
[0425] [LAMP反应溶液组成(2)的结果]
[0426] 另外，添加了包含模板B、模板D、模板F、模板H、模板J和模板L的LAMP反应溶液组成(2)时的结果如下。
[0427] 通过组成(2)的反应溶液的添加，对于探针DNA(B)、探针DNA(D)、探针DNA(F)、探针DNA(H)、探针DNA(J)和探针DNA(L)的全部的探针得到了30nA以上的电流值。
[0428] 因此确认了，模板B、模板D、模板F、模板H、模板J和模板L通过固定于硅胶的底面的引物DNA，即引物组B、引物组D、引物组F、引物组H、引物组J和引物组L分别被局部对扩增，生成的扩增产物与对应的探针DNA杂交。
[0429] 另一方面，对于固定于硅胶的底面的引物DNA，引物组A、引物组C、引物组E、引物组G、引物组I、引物组K和引物组M)没有得到电流值。
[0430] 由该结果可以判定，LAMP反应溶液中包含模板B、D、F、H、J、L。
[0431] [LAMP反应溶液组成(3)的结果]
[0432] 添加了包含全部13种模板的LAMP反应溶液组成(3)时的结果如下。
[0433] 对于全部的探针DNA，得到了30nA以上的电流值。由此明确了，通过固定于硅胶的底面的13种引物DNA进行的LAMP反应分别局部地进行，生成的LAMP产物与13种探针DNA反应。
[0434] 由该结果可以判定，LAMP反应溶液中包含13种模板。
[0435] 另外，添加了不包含模板的LAMP反应溶液组成(4)时，通过固定于硅胶的底面的13种引物DNA进行LAMP扩增反应不进行，得不到电流值。
[0436] 由以上的结果显示，使用本实施例所记载的阵列型引物探针芯片，可以检出LAMP反应溶液中所含的多个种类的模板，并且识别其序列。
[0437] 实施例2-3
[0438] 除了固定混合了水而代替增稠剂的引物以外，与例2-3同样地进行试验。即，4种LAMP反应液使用与上述添加增稠剂时使用的试剂完全相同、所含的模板种类也相同的反应液。
[0439] 其结果示于表15。
[0440]
[0441] 在不包含模板的LAMP反应液(4)中，对于任一探针DNA均未检出电流值。
[0442] 另一方面，即使是添加了LAMP反应液(1)、(2)和(3)的结果，也有时得不到来源于其中所含的模板的电流值。认为这是因为，没有得到对于LAPM反应液(1)、(2)和(3)所含的模板的一部分的扩增，因而没有产生LAMP扩增的扩增产物，因此，没有产生与探针DNA的杂交。另外进而，对于得到了电流值的探针DNA的电流值，也与将增稠剂与引物组一起固定时相比，所得的电流值为较小的值。
[0443] 由这些结果启示，如果在固定化引物组时不添加增稠剂，则引物DNA的溶出范围大，很可能本来应得到的扩增反应不能实现。
[0444] 由上述的实施例2-2和2-3的结果显示以下事实。如本例所记载，通过在按照实施方式的多核酸扩增检出反应用具中与引物组的固定一起增稠剂，可以更高精度地检出LAMP反应溶液中所含的多个种类的模板，并且可以识别其序列。
[0445] 实施例2-4
[0446] 对上述的例2-2的(1)中制作的芯片原料固定增稠剂和引物组。
[0447] 记载增稠剂的调制方法。作为增稠剂，使用ナカライテスク社制“Agarose-Super LM(解链温度≤60℃)”。在琼脂糖的情况下，根据分子量、结构而具有固有的熔解温度、凝胶化温度、再熔解温度，需要根据特性而设定条件。
[0448] 将琼脂糖0.6g添加于100mL的DW中，充分混合后，在80℃过热而使其完全溶解，制作0.6％琼脂糖溶液。与引物溶液混合时，再次过热至80℃而使其完全溶解后，与引物等量混合，调制成琼脂糖浓度为终浓度0.3％。
[0449] 将如上所述调制的终浓度0.3％琼脂糖混合引物溶液滴加在支持体上。然后，在设定为40℃的加热板上加热2分钟使其干燥。干燥后的状态变成膜，在确认了完全固定化之后，与支持体一起在-20℃保管直到使用。
[0450] 4.流路形状的设计
[0451] 作为另外的实施方式，这里记载的多核酸扩增反应用具还可以作为以微细的流路进行核酸的扩增反应的反应器件，或者，作为扩增反应后检出扩增产物的核酸检出用器件和核酸检出装置提供。
[0452] 随着近年基因工程学的发展，在医疗领域，利用基因的疾病的诊断或者预防渐渐成为可能。这被称为基因诊断，通过检出成为疾病的原因的人的基因缺陷、变化而可以在疾病发病前或者极为初期的阶段进行疾病的诊断和/或预测。另外，随着人基因组解析，关于基因型与疫病的关系进行了研究，适合各个人的基因型的治疗(订制(Tailor-made)医疗)也逐渐现实化。因此，简便地进行基因的检出以及基因型的确定变得非常重要。进一步这些基因检查大多需要检出多个种类的基因而进行综合判断，因此同时且短时间地检出多个种类的对象基因是极为重要的。
[0453] 作为用于核酸的装置，能够在1个器件内将多种试剂参与的多个反应依次进行的被称为μ-TAS的器件被广泛研究开发。这些器件的特征在于，由试剂保持区域、反应区域、传感器区域等组成，并具备连接它们流路。
[0454] 将多个种类的基因同时在1个器件内检出时，考虑了为了扩增多个对象基因而准备多个分别的扩增用容器的方法、或者将全部的对象基因的扩增反应加入一个反应容器而进行多核酸扩增反应的方法的任一方法。然而，在要检出的对象基因种变多的情况下，任一方法都存在器件化变得困难这样的问题。即，在准备多个分别的扩增容器的方法中，需要大量地准备多个扩增容器，器件变得复杂；另外在进行多核酸扩增反应的方法中，存在如果对象基因数变多，则基因扩增反应发生竞争，扩增效率大幅降低这样的问题。
[0455] 作为上述问题的解决方法之一，有在1个反应场中使用多个种类的引物组使多个种类的目标核酸同时独立地(以独立的区域)进行扩增反应，独立地测定所得的各扩增产物的量，从而确定目的核酸的有无的核酸检出用器件。
[0456] 然而，如上所述的设想了在1个反应场中使用多个种类的引物组使多个种类的目标核酸同时独立地进行扩增反应的核酸检出用器件，存在例如以下那样的课题。
[0457] 课题之一是核酸检出用器件的扩增区域中的引物组的保持的困难性。引物组为了保持在核酸检出用器件的扩增区域中而将包含引物组的溶液滴加到各扩增区域。然而，该溶液在保持引物组的过程中容易移动。因此，核酸检出用器件存在不能正确地规定各扩增区域中的引物组的保持位置这样的问题。
[0458] 其他课题是引物组的流出。预先保持在扩增区域的引物组，在将包含目标核酸的溶液导入扩增区域时，可能从该保持位置流出到邻接的扩增区域。
[0459] 其他课题是由引物组和扩增产物的移动造成的扩增反应的抑制。引物组和扩增产物在扩增反应中由于溶液的流动而扩散。如果对象外的引物组和扩增产物从邻接的其他扩增区域流入，则在扩增区域，扩增反应可能被抑制。
[0460] 其他课题是由来自保护膜的溶出物造成的扩增反应的抑制。扩增反应在内包扩增产物的检出传感器的区域进行。然而，来自传感器的保护膜的溶出物可能抑制扩增反应。
[0461] 通过利用本实施方式，多核酸扩增反应用具可以解决这样的问题和课题，由此可以提供作为另外方式的、提高核酸的扩增反应的效率的多核酸扩增反应用具，例如核酸反应用器件、核酸检出用器件和核酸检出装置。
[0462] 以下参照附图对于各种实施方式进行说明。此外，对全部实施方式中共同的构成付与同一的符号，省略重复的说明。另外，各图是实施方式和用于促进其理解的模式图，其形状和/或尺寸、比例等有与实际的装置不同之处，这些可以参考以下的说明和公知的技术来适宜设计变更。
[0463] ＜第12实施方式＞
[0464] 参照图17来说明第12实施方式的核酸检出用器件3001的1例。图17(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图17(b)是沿图17(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。核酸检出用器件3001用于在1个反应场中使用多个种类的引物组3031使多个种类的目标核酸同时独立地进行扩增反应。
[0465] 核酸检出用器件3001具备支持体(第2部件)3011、覆盖体(第1部件)3012。支持体3011在与覆盖体3012相接的面具备大略平面。此外，在第12实施方式中，将按照支持体3011、覆盖体3012的顺序排列的方向称为叠层方向。覆盖体3012在与支持体3011相接的面(第1面)具备沟部3121。沟部3121设置于与支持体3011相接的面。沟部3121通过覆盖体3012、和与其相接的支持体3011而内部被密封。由覆盖体3012和支持体3011所密封的沟部3121作为各种溶液的流路发挥功能。沟部3121作为1例，是从各种溶液的入口3121a向出口3121b以曲线状蜿蜒的形状，但不特别限定。沟部3121从入口3121a向出口3121b以大略相同的宽度形成。沟部3121例如多个室(流路型室)1211以等间隔相互配置。室4211进行核酸的扩增反应，为了后述的电极(传感器)与核酸样品反应而使用。室4211以与沟部3121中的除了室4211以外的区域(部分)相比，向叠层方向凹陷的形状形成。即，以室4211的深度比沟部3121中的除了室4211以外的区域的深度深的方式形成。反过来说，沟部3121中的除了室4211以外的区域的深度比室4211的深度浅。因此，室4211的剖面积大于沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积。此外，室4211的剖面积和沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积，是基于与覆盖体3012中的设置了沟部3121的面垂直的面的剖面积。沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积优选为室4211的剖面积的例如90％以下，但不特别限定。此外，室4211与引物固定化区域3021对应。引物固定化区域3021例如在室4211的上面部(比除了室4211以外的区域向叠层方向凹陷的部分)形成。多个引物固定化区域3021彼此独立地配置于沟部3121。
[0466] 此外，支持体3011和覆盖体3012的材质可以相同也可以不同。另外，支持体3011和覆盖体3012的材质是支持体3011和覆盖体3012本身不参与扩增反应等的材质即可。支持体3011和覆盖体3012是可以在沟部3121内进行扩增反应的材质即可。支持体3011和覆盖体3012可以从例如硅、玻璃、树脂和金属等中任意选择。
[0467] 接着，对于引物固定化区域3021中的、用于扩增核酸的引物组3031的固定(保持)进行说明。室4211在流路壁面保持引物组3031。此外，引物固定化区域3021与室4211的位置对应，因而可以适宜解读成室4211。引物组3031如图17所示，以如果在室4211中的叠层方向的上面部附近(引物固定化区域3021)与用于提供反应场的液相接触则游离的状态被固定。多个室4211(引物固定化区域3021)按每个目标核酸的种类而分别固定多种引物组3031。即，多个室4211(引物固定化区域3021)保持以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。引物组3031的固定化可以如下进行：例如，以沟部3121面向铅直方向的上方的方式仅准备覆盖体3012，对1个引物固定化区域3021滴加包含引物组3031的溶液，然后使其干燥。此外，引物组3031的保持方法不限于利用干燥的方法，也可以使用其他冻结干燥等手法。
[0468] 如上所述，室4211与沟部3121中的除了室4211以外的区域相比较深地形成，因而局部地滴加于引物固定化区域3021的包含引物组3031的溶液不容易移动到除了室4211以外的区域。因此，邻接的引物固定化区域3021可以独立地保持不同的引物组3031。
[0469] 接着，对于反应液向多种引物组3031固定于分别不同的引物固定化区域3021而得的核酸检出用器件3001的添加进行说明。图18(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图18(b)是沿图18(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。图18显示在核酸检出用器件3001中添加了反应液的状态。此外，图18所示的核酸检出用器件3001除了反应液添加在沟部3121以外，与图1是同样的。
[0470] 反应液包含核酸扩增反应所需的成分即可。虽然不限于这些，但反应液还可以包含例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂。
[0471] 如图18所示，从入口3121a添加反应液后，固定于引物固定化区域3021的引物组3031开始游离、扩散。引物游离和扩散的区域，模式地在图18中用引物游离·扩散区域3022表示。
[0472] 优选将反应液导入核酸检出用器件3001时，游离、扩散的引物组3031不能容易地流出到邻接的其他引物固定化区域3021。即，引物游离·扩散区域3022优选与引物固定化区域3021(换句话说为室4211)对应。
[0473] 核酸检出用器件3001可以在反应液导入时大幅降低室4211中的固定了引物组3031的部分(与除了室4211以外的区域相比向叠层方向凹陷的部分)附近的流速。因此，核酸检出用器件3001可以防止引物组3031流出到邻接的其他引物固定化区域3021。因此，第12实施方式的核酸检出用器件3001可以使邻接的引物固定化区域3021的引物组3031分别独立。
[0474] 进而，在扩增反应中，优选某一扩增区域(与引物固定化区域3021(室4211)对应的区域)中的引物组3031和生成的扩增产物不向其他扩增区域扩散，独立地位于扩增区域内。核酸检出用器件3001，除了室4211以外的区域中的沟部3121的深度(流路剖面积)比室4211的深度(流路剖面积)浅(小)。因此，核酸检出用器件3001在扩增反应中，可以抑制某一扩增区域中的引物和生成的扩增产物向其他扩增区域扩散。因此，第12实施方式的核酸检出用器件3001可以将使用多个种类的引物组3031的对于多种模板序列的扩增独立(局部地)、且同时地高效率地实现。
[0475] 局部地得到的扩增产物的具体的检出手段，可以利用其本身公知的杂交信号的检出手段，例如利用荧光标记的荧光强度的检出和/或测定、或者利用嵌入剂检出和/或测定电流应答的方法来进行，不限定。
[0476] 接着，对于利用核酸检出用器件3001的杂交信号的检出进行说明。图19(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图19(b)是沿图19(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。此外，图19所示的核酸检出用器件3001除了支持体3011具备探针固定化区域3111以外，与图1是同样的。探针固定化区域3111在例如与引物固定化区域3021(室4211)对向的位置配置于支持体3011，但不特别限定，只要在室4211内，则可以是任何形态。探针固定化区域3111是设置了例如检出杂交信号的电极(核酸检出用的电极)的区域。即，探针固定化区域3111中的核酸检出用的电极，配置于与覆盖体3012中的与支持体3011相接的面对向、且与沟部3121(特别是引物固定化区域3021(室4211))对向的位置。
[0477] 在探针固定化区域3111固定多个包含应被检出的所期望的序列的互补序列的探针核酸。核酸检出用器件3001在引物固定化区域3021进行扩增反应后，可以继续在探针固定化区域3111获得杂交信号。
[0478] 接着，对于在图19所示的核酸检出用器件3001中导入反应液进行扩增反应的情况进行说明。图20(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图20(b)是沿图20(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。图20显示在核酸检出用器件3001中添加了反应液的状态。此外，图20所示的核酸检出用器件3001除了反应液添加在沟部3121以外，与图19是同样的。在核酸检出用器件3001中，如果导入反应液，则在模板核酸存在的情况下，通过对应的游离、扩散的引物组3031而模板核酸被扩增，生成扩增产物3032。扩增反应中生成的扩增产物3032如图20所示，局部地在室4211内生成。核酸检出用器件3001可以通过扩增产物3032与固定于探针固定化区域3111的探针反应而获得杂交信号。
[0479] ＜实施例3＞
[0480] 实施例3-1
[0481] 以下，具体地说明使用第12实施方式的核酸检出器件3001的核酸检出的例子。在本实施例3-1中，作为覆盖体3012使用硅胶制的包装3012a，在包装3012a一面的引物固定化区域3021固定引物组3031。图21是显示实施例3-1的支持体3011的1例的概略图。在实施例3-1中，作为支持体3011，使用以探针固定化区域3111为电极3111a的电化学检出用的阵列型芯片(基板)3011a，作为检出依赖于杂交的存在而生成的电流应答的传感器使用。此外，衬垫部3112a介由配线3113b而将电极3111a的杂交信号传达到核酸检出装置(未图示)。即，核酸检出装置基于来自各电极3111a的电流值来检出核酸。
[0482] (1)核酸检出用器件的准备
[0483] 1-1电化学检出用阵列型芯片的制作
[0484] 电化学检出用阵列型芯片3011a，在パイレックス(注册商标)玻璃表面通过溅射而形成钛和金的薄膜。然后，通过蚀刻处理，在玻璃表面上形成钛和金的电极图案。进而在其上涂敷绝缘膜，通过蚀刻处理而使电极3111a露出。
[0485] 接着在上述芯片原料上的各电极3111a(图21中A-E、NC(阴性对照))固定化表16所示的6种核酸探针(序列A～E、NC)。通过将包含各核酸探针的溶液滴加于各电极
3111a，然后洗涤除去多余的核酸探针，从而固定化。
3111a，然后洗涤除去多余的核酸探针，从而固定化。
[0486] 表16 DNA探针碱基序列
[0487]
[0488] 1-2固定了引物的包装3012a的制作、核酸检出用器件的组装
[0489] 首先准备作为引物组3031使用的引物DNA。所使用的引物DNA是用于利用Loop-mediated Isothermal amplification(LAMP)法进行的扩增的引物组3031。所使用的引物DNA的碱基序列示于表17。将包含引物DNA的溶液点样于与分别固定了对应的探针DNA的区域对向的包装3012a的底面，在40℃干燥2分钟。由此，得到固定了引物的包装3012a。将该包装3012a安装于阵列型芯片30111a，得到图22所示的核酸检出用器件3001。
图22(a)是实施例3-1的核酸检出用器件3001的1例的平面图。图22(b)是沿图22(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。
图22(a)是实施例3-1的核酸检出用器件3001的1例的平面图。图22(b)是沿图22(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。
[0490] 表17 DNA引物碱基序列
[0491]
[0492] (2)核酸的检出
[0493] 2-1模板溶液的准备
[0494] 如表18那样，准备基因A、B、D的3种模板与LAMP扩增用试剂混合而成的模板溶液。
[0495] 表18
[0496] 组成
[0497]
[0498] 模板溶液使用包含Bst DNA聚合酶、反应混合物，以总量为50μL的方式添加蒸留水(即，DW)而得的溶液。模板溶液如表19所示，包含：通过引物DNA(组A)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(A)杂交而被检出的模板A；通过引物DNA(组B)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(B)杂交而被检出的模板B；和通过引物DNA(组D)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(D)杂交而被检出的模板D。
[0499] 表19 模板A、B、D的DNA模板序列
[0500]
[0501] 2-2模板溶液的添加
[0502] 将2-1中准备的模板溶液在核酸检出用器件3001中添加50μL。
[0503] 2-3核酸的反应
[0504] 在以下所示的条件下将核酸检出用器件3001的流路区域加热或者冷却，进行各种反应。图23(a)是实施例3-1的核酸检出用器件3001的1例的平面图。图23(b)是沿图23(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。如图23所示，对于特定的引物，在包含应扩增的目标序列的模板包含在LAMP反应溶液中的情况下，在固定了该引物的场所局部地进行LAMP反应，生成的扩增产物3032与位于其附近的探针DNA杂交。
[0505] 核酸扩增反应：64℃、60分钟
[0506] 杂交反应：50℃、10分钟
[0507] 洗涤反应：30℃、5分钟
[0508] 电流检出用试剂(HOECHST33258)反应：25℃、3分钟。
[0509] 2-4核酸的检出
[0510] 对各探针核酸固定化作用极扫描电位，计测与由探针DNA和LAMP产物形成的双链特异性地结合的HOECHST33258分子的氧化电流。上述一系列的反应在SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008所记载的DNA自动检查装置中实施。
[0511] 结果
[0512] 所得的结果示于图24。图24是显示实施例3-1的核酸扩增反应的结果的图。添加了模板的固定化了与基因A、B、D对应的探针A、B、D的电极A、B、D中，得到了大于NC的电流值。另一方面，未添加模板的与基因C、E对应的电极C、E的电流值与NC为同程度。由此明确了，可以确实地检出模板溶液中的模板。
[0513] ＜第13实施方式＞
[0514] 对于第13实施方式参照附图进行详细说明。此外，对于与第12实施方式中所说明的构成同一的构成，付与同符号而省略说明。参照图25来说明第13实施方式的核酸检出用器件3001的1例。图25(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图25(b)是沿图25(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。核酸检出用器件3001用于在1个反应场中使用多个种类的引物组3031使多个种类的目标核酸同时独立地进行扩增反应。第
13实施方式中沟部3121的形状与第12实施方式不同。
13实施方式中沟部3121的形状与第12实施方式不同。
[0515] 沟部3121从入口3121a向出口3121b以在叠层方向大略相同的深度形成。沟部3121以规定间隔配置了多个室4211。以室4211的宽度比沟部3121中的除了室4211以外的区域的宽度更宽的形状形成。反过来说，沟部3121中的除了室4211以外的区域的宽度比室4211的宽度窄。此外，室4211与沟部3121中的除了室4211以外的区域相比宽度宽即可，可以向与叠层方向垂直的方向以圆弧状突出，也可以以角状突出。因此，室4211的剖面积大于沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积。此外，室4211的剖面积和沟部
3121中的除了室4211以外的区域的剖面积是基于与覆盖体3012中的设置了沟部3121的面垂直的面的剖面积。沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积优选为室4211的剖面积的最大值的例如90％以下，但不特别限定。此外，室4211与引物固定化区域3021对应。引物固定化区域3021在沟部3121中的叠层方向的上面部附近形成。多个引物固定化区域3021彼此独立地配置于沟部3121。
3121中的除了室4211以外的区域的剖面积是基于与覆盖体3012中的设置了沟部3121的面垂直的面的剖面积。沟部3121中的除了室4211以外的区域的剖面积优选为室4211的剖面积的最大值的例如90％以下，但不特别限定。此外，室4211与引物固定化区域3021对应。引物固定化区域3021在沟部3121中的叠层方向的上面部附近形成。多个引物固定化区域3021彼此独立地配置于沟部3121。
[0516] 如上所述，室4211与沟部3121中的除了室4211以外的区域相比宽度宽地形成，因而局部地滴加于引物固定化区域3021的包含引物组3031的溶液，不容易移动到除了室4211以外的区域。因此，邻接的引物固定化区域3021可以独立地保持不同的引物组3031。
[0517] 接着，对于反应液向多种引物组3031固定于分别不同的引物固定化区域3021而得的核酸检出用器件3001的添加进行说明。图26(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图26(b)是沿图26(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。图26显示在核酸检出用器件3001中添加了反应液的状态。此外，图26所示的核酸检出用器件3001除了反应液添加于沟部3121以外与图25是同样的。反应液可以是与第12实施方式同样的成分。
[0518] 如图26所示，从入口3121a添加反应液后，固定于引物固定化区域3021的引物组3031开始游离、扩散。引物游离和扩散的区域模式地在图26中用引物游离·扩散区域3022表示。核酸检出用器件3001，除了室4211以外的区域中的沟部3121的宽度(流路剖面积)比室4211的宽度(流路剖面积)窄(小)。因此，核酸检出用器件3001可以在扩增反应中抑制某一扩增区域中的引物和生成的扩增产物向其他扩增区域扩散。因此，第13实施方式的核酸检出用器件3001可以将使用多个种类的引物组3031的对于多种模板序列的扩增独立(局部地)、且同时地高效率地实现。
[0519] 此外，在图25、26所示的例子中，对于引物组3031固定于室4211的上面部附近的流路壁面的例子进行说明，但不限于此。图27是显示室4211(引物固定化区域3021)中的引物组3031的其他固定场所的核酸检出用器件3001的1例的平面图。引物组3031也可以固定于与叠层方向垂直的室4211的流路壁面。即，引物组3031在室4211中，设置于与除了室4211以外的沟部3121的区域相比向与叠层方向垂直的方向突出的部分。
[0520] 如图27所示，引物组3031固定于室4211的情况下，核酸检出用器件3001能够在反应液导入时大幅降低室4211中的固定了引物组3031的部分(与除了室4211以外的沟部3121的区域相比向与叠层方向垂直的方向突出的部分)附近的流速。因此，核酸检出用器件3001可以防止引物组3031流出到邻接的其他引物固定化区域3021。因此，第13实施方式的核酸检出用器件3001可以使邻接的引物固定化区域3021的引物组3031分别独立。
[0521] 此外，在图25、26、27所示的例子中，连接各室4211彼此之间的沟部3121的部分以最短距离连接的直线形状构成，但不限于此。图28是显示连接各室4211彼此之间的沟部3121的其他形状的核酸检出用器件3001的1例的平面图。图28所示的例子中，连接各室4211彼此之间的沟部3121的部分以与直线形状相比流路的距离更长的形状(例如曲线形状)构成。因此，图28所示的沟部3121与图25、26、27所示的以直线形状连接各室4211彼此之间的沟部3121的构成相比，可以提高各室4211彼此之间的独立性，可以进行效率更好的核酸扩增。此外，这里关于第13实施方式，对于连接各室4211彼此之间的沟部3121的构成进行了说明，但对于第12实施方式，通过应用如图28所示的构成，也可以获得上述的效果。
[0522] 局部地得到的扩增产物的具体的检出手段，可以利用其本身公知的杂交信号的检出手段、例如利用荧光标记的荧光强度的检出和/或测定、或者利用嵌入剂检出和/或测定电流应答的方法来进行，不限定。
[0523] 接着，对于利用核酸检出用器件3001的杂交信号的检出进行说明。图29(a)是核酸检出用器件3001的1例的平面图。图29(b)是沿图29(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。此外，图29所示的核酸检出用器件3001除了支持体3011具备探针固定化区域3111以外与图25是同样的。探针固定化区域3111虽然不特别地限定，但例如，在与室4211(引物固定化区域3021)对向的位置配置于支持体3011。探针固定化区域3111是设置检出杂交信号的电极的区域。
[0524] 探针固定化区域3111固定多个包含应被检出的所期望的序列的互补序列的探针核酸。核酸检出用器件3001在引物固定化区域3021进行扩增反应后，可以继续在探针固定化区域3111获得杂交信号。
[0525] 此外，在支持体3011特别地是利用嵌入剂的电流检出方式传感器的情况下，由于伴随扩增反应时的加热而由传感器保护膜溶出的溶出物而发生扩增抑制。然而，第13实施方式的核酸检出器件3001是除扩增·检出区域(室4211)以外的沟部3121较细(宽度较窄)的构成，因此可以减少与设置于探针固定化区域3111的传感器的接液面积，因此可以有效地抑制扩增抑制物的溶出。
[0526] 实施例3-2
[0527] 利用上述的第13实施方式的核酸检出用器件3001的核酸检出例如以下那样实施。将包含成为检查对象的核酸的反应液，用移液器等器具导入形成于核酸检出用器件3001的沟部31211。如果导入反应液，则在模板核酸存在的情况下，通过对应的游离扩散的引物组3031而模板核酸被扩增，产生扩增产物。
[0528] 图30(a)是实施例3-2的核酸检出用器件3001的1例的平面图。图30(b)是沿图20(a)中的线X-X的核酸检出用器件3001的剖面图。图30(c)是显示实施例3-2的核酸扩增反应的结果的图。图30(c)显示在图30(a)、(b)所示的核酸检出用器件3001的区域A、B和D(各室4211)中发生扩增反应，且扩增产物包含与对应的探针核酸的序列互补的目的序列的情况下得到的结果。如图30(C)所示，对于区域A、B、D得到的电流值比NC的电流值大。另一方面，对于区域C、E得到的检出信号与NC为同程度。由此明确了，可以确实地检出模板溶液中的模板。此外，检出信号在特别邻接的区域A、B也可获得。因此，第13实施方式的核酸检出用器件3001可以在没有邻接区域彼此之间的干扰的条件下，独立地进行从核酸的扩增反应到检出。如上显示，根据实施例3-2，使用第13实施方式的核酸检出用器件3001，可以将多个种类的目标核酸同时独立地进行扩增反应、直到进行检出。
[0529] 根据上述的本实施方式，可以解决核酸检出用器件的扩增区域中的引物组的保持的困难性、引物组的流出、由引物组和扩增产物的移动造成的扩增反应的抑制、由来自保护膜的溶出物造成扩增反应的抑制中的至少1个课题。因此，使用多个种类的引物组使多个种类的目标核酸同时独立地进行扩增反应的核酸检出用器件和使用了该器件的核酸检出装置，可以同时独立地实现有效的扩增反应和检出。
[0530] 此外，还可以组合第12实施方式的室4211的形状和第13实施方式的室4211的形状。
[0531] 5.保护膜的使用
[0532] 作为另外的实施方式，多核酸扩增反应用具还可以作为用于将从核酸的扩增到检出在同一器件内进行的核酸检出用器件提供。
[0533] 另外，多核酸扩增反应用具还可以作为降低核酸扩增反应的抑制的核酸检出用器件提供。
[0534] 作为进行核酸检出的器件的之一，可列举DNA芯片。DNA芯片是在基板上固定化了多种核酸探针的器件，以能够一次检出大量的核酸序列为特征。
[0535] 核酸探针的固定化区域有各种形态，但有在电极等传感器上固定化核酸探针，通过配线引出来自该传感器的检出信号，从外部检出的方法。
[0536] 这样的方式的情况下，除了传感器部分和/或与外部的接触部分以外的区域被称为保护膜(钝化膜)的膜覆盖。这是应用半导体技术的保护膜，保护膜保护所得的检出信号免受来自配线部分等的噪声、和/或污染等。
[0537] 另一方面，能够在1个器件内将多种试剂参与的多个反应依次进行的被称为μ-TAS的器件被广泛研究开发。这样的器件由试剂保持区域、反应区域、传感器区域等组成，并具备连接它们流路。应用该技术的用于检出核酸的检出装置也被开发。进行核酸检出时，需要使用多种试剂、进行多个反应。多个反应是核酸提取反应、核酸纯化反应、核酸扩增反应、核酸杂交反应、杂交的有无检出等。这些反应中，核酸扩增反应有PCR法和/或LAMP法、ICAN法等，但均具有不仅受扩增温度和/或试剂的组成较大影响，而且在混入杂质时容易发生扩增抑制这样的特征，因此反应容器的材质和/或清洁性变得非常重要。
[0538] 上述DNA芯片那样的核酸检出器件有各种构成，但如前述那样，在将多个反应在各自反应容器中进行的情况下，试剂和/或检查时间的损失大。因此，正在开发能够将核酸扩增反应和核酸杂交反应在同一反应容器内进行的核酸检出器件。
[0539] 然而，核酸扩增反应由于杂质的混入而发生扩增抑制。已经明确来自核酸检出用器件的保护膜的溶出成分强烈地抑制核酸扩增，导致灵敏度的低下。因此，核酸检出用器件要求降低来自保护膜的杂质的溶出量，提高灵敏度。
[0540] 根据实施方式，多核酸扩增反应用具被作为核酸检出器件提供时，核酸检出器件，核酸检出器件具备基板、传感器部、配线和保护部。所述传感器部是在所述基板上形成的核酸检出用。所述配线在所述基板上形成，与所述传感器连接。所述保护膜在所述基板上形成。所述核酸检出器件在用于所述传感器部与核酸样品反应的室内进行核酸扩增反应后，通过所述传感器部进行核酸扩增产物的检出。所述保护膜在所述基板上的所述核酸样品的接液区域，具备使包含一部分所述基板的下层部露出的1个以上的开口。
[0541] ＜第14实施方式＞
[0542] 图31是显示成为第14实施方式的核酸检出用器件(DNA芯片)5100的1例的制成步骤的图。核酸检出用器件5100是按照图31的(a)～(e)的顺序依次叠层各构成要素而构成的。图32是显示成为第14实施方式的核酸检出用器件5100的1例的概略构成的叠层方向的剖面图。图33是显示成为第14实施方式的核酸检出用器件5100的1例的概略构成的图。
[0543] 核酸检出用器件5100具备基板5010、传感器部5011、衬垫5012、配线5013、保护膜5014。基板5010如图32(a)所示，是薄的板状部件。基板5010由玻璃、硅、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、聚酰亚胺、ABS、金属等构成，但不特别限定。
[0544] 传感器部5011如图32(b)所示，在基板5010的表面上形成。传感器部5011是由导电性部件构成的电极。传感器部5011在基板5010的一端侧设置了多个。传感器部5011分别固定化了用于检出成为目标的核酸的各种核酸探针，从而检出成为目标的核酸。此外，1个传感器部5011由1个以上的传感器构成。
[0545] 衬垫部5012如图32(c)所示，在基板5010的表面上形成。衬垫部5012由导电性部件构成。衬垫部5012在基板5010的另一端侧多个设置。衬垫部5012是用于介由后述的配线5013将传感器部5011的检出信号传达至检出装置(未图示)的。
[0546] 配线5013如图32(d)所示，在基板5010的表面上形成。配线5013由导电性部件构成。配线5013连接传感器部5011与衬垫部5012。配线5013有时通过利用了过孔等的多层结构形成立体配线。配线5013是用于取出各传感器部5011的检出信号，送达衬垫部5012的。保护膜5014如图32(e)所示，在基板5010的表面上形成。
[0547] 保护膜5014是由有机系材料构成的保护膜。保护膜5014例如由疏水性高的材料构成。一般保护膜分类为有机系的保护膜和无机系的保护膜。无机系的保护膜已知杂质的溶出少，但为高成本。因此，第14实施方式中使用的保护膜5014是有机系的保护膜。对于基板5010的表面上的保护膜5014的形状后述。保护膜5014用于防止噪声向来自配线5013等的检出信号的混入、和/或信号向其他配线的泄漏，还保护核酸检出用器件5100免受污染等。通过上述的步骤，核酸检出用器件5100如图32所示，是各构成要素叠层而构成的。第14实施方式的核酸检出器件5100在用于传感器部5011与核酸样品反应的后述的流路型反应部(室)5201内进行核酸扩增反应后，通过传感器部5011而用于核酸扩增产物的检出。此外，在第14实施方式中，将核酸检出用器件5100沿叠层方向的保护膜5014侧的最外面称为核酸检出用器件5100的表面。
[0548] 如上所述构成的核酸检出用器件5100的表面如图31所示，主要大致分为传感器区域5020、配线区域5021、衬垫区域5022、反应区域5023。
[0549] 传感器区域5020是形成了传感器部5011的区域。配线区域5021是形成了配线5013的区域。衬垫区域5022是形成了衬垫部5012的区域。反应区域5023是进行核酸扩增反应、核酸杂交反应等的区域。
[0550] 这里，对于反应区域5023进行说明。核酸检出用器件5100如图32(b)所示，在用于核酸扩增反应、核酸杂交反应等时，以在保护膜5014上后述的反应部规定用部件5200对向的方式配置。传感器部5011和传感器部5011附近与设置在反应部规定用部件5200的后述的流路型反应部5201对向。在第14实施方式中，反应区域5023是指在核酸检出用器件5100的表面与流路型反应部5201对向的区域。因此，反应区域5023包含传感器区域5020。另外，反应区域5023包含传感器部5011附近的配线5013。此外，反应区域5023也可以是基板5010上的与用于进行核酸扩增反应的反应溶液(核酸样品)进行接液的接液区域。核酸检出用器件5100的表面的反应区域5023由流路型反应部5201的形状规定。
[0551] 接着，对于核酸检出用器件5100的表面的保护膜5014的形状进行说明。保护膜5014如图32所示，在配线区域5021，以配线5013不露出的方式覆盖配线5013。保护膜5014如图32所示，在衬垫区域5022，以各衬垫部5012与检出装置(未图示)接触的方式，并以各衬垫部5012的至少一部露出的方式，设置于基板5010上。即，保护膜5014在除了反应区域5023以外的区域，除了各衬垫部5012的至少一部分以外，覆盖核酸检出用器件5100的表面。
[0552] 接着，对于反应区域5023中的保护膜5014的形状进行说明。图34是第14实施方式的核酸检出用器件5100的表面的反应区域5023附近的放大图。保护膜5014在反应区域5023，以配线5013不露出的方式覆盖配线5013。另一方面，保护膜5014在反应区域5023，不设置于传感器部5011。保护膜5014在反应区域5023，至少在配线5013以外的部分具备使基板5010或传感器部5011露出的1个以上的开口。保护膜5014在反应区域5023，在除了必要最低限的部分以外不设置。此外，保护膜5014在基板5010上也可以设置在配线5013与基板5010的边界部分附近。
[0553] 如上所述，第14实施方式的保护膜5014在反应区域5023，具有使包含一部分基板5010的下层部(基板5010或传感器部5011)露出的1个以上的开口。此外，保护膜5014还可以以具有1个以上的开口的1张膜覆盖核酸检出用器件5100的表面的方式构成。另外，保护膜5014可以以多张膜覆盖核酸检出用器件5100的表面的方式构成，还可以是由多张膜组合形成的具备1个以上的开口的构成。如上所述的反应区域5023中的保护膜5014的构成，可以在反应区域5023内进行扩增反应时，大幅降低由从保护膜5014溶出的杂质造成的扩增抑制的影响。通常，核酸的检出包括核酸提取反应、核酸纯化反应、核酸扩增反应、核酸杂交反应、杂交的有无检出等，但第14实施方式的核酸检出用器件5100不仅核酸杂交反应，连核酸扩增反应也可以在同一反应区域5023内进行。此外，即使在反应区域5023保护膜5014也覆盖配线5013，如上所述是因为如果配线5013不被保护膜5014覆盖，则由配线5013混入噪声。
[0554] 图35是显示成为能够使用第14实施方式的核酸检出用器件5100而将从核酸扩增反应到核酸检出在同一反应容器内进行的核酸检出用器件内藏盒(送液盒)1的一例的概略构成的图。此外，图35中，为了图的简略化，省略了在基板5010形成的配线5013和保护膜5014的图示。图36是将反应部规定用部件(反应容器)5200对向配置而成的核酸检出用器件5100，从反应部规定用部件5200侧观察而得的图。此外，图36显示了各传感器部5011由2个传感器构成的例子。
[0555] 核酸检出用器件内藏盒5001如图35所示，具备上述的核酸检出用器件5100、反应部规定用部件5200、第1盒5300、第2盒5400。
[0556] 反应部规定用部件5200如图36所示，具备流路型反应部5201。流路型反应部5201是设置于与核酸检出用器件5100的表面相接的面的沟(流路)。对于流路型反应部
5201，用于将从核酸扩增反应到核酸检出在同一反应容器内进行的各种溶液，从样品注入口5201a注入、从样品出口5201b排出。流路型反应部5201以蜿蜒的流路形状设置，但不限于此。流路型反应部5201可以以直线状设置，也可以以圆形状设置，也可以以方形状设置。反应部规定用部件5200可以是平板型也可以是管型。
5201，用于将从核酸扩增反应到核酸检出在同一反应容器内进行的各种溶液，从样品注入口5201a注入、从样品出口5201b排出。流路型反应部5201以蜿蜒的流路形状设置，但不限于此。流路型反应部5201可以以直线状设置，也可以以圆形状设置，也可以以方形状设置。反应部规定用部件5200可以是平板型也可以是管型。
[0557] 此外，核酸扩增用引物可以与核酸样品混合后注入流路型反应部5201，也可以预先保持在流路型反应部5201的任一部位。后者的情况下，按每个扩增对象准备的多种引物组可以保持在流路型反应部5201的分别不同的场所，也可以全部保持在一个位置。对流路型反应部5201中的多种引物组的保持方法不限定。例如，多种引物组可以通过热和/或真空干燥等手法干燥保持，也可以以液体的状态保持。另外，多种引物组还可以冻结保持。另外，多种引物组还可以保持于膜等保持用载体。
[0558] 此外，流路型反应部5201可以通过在反应部规定用部件5020形成而规定，但不特别限定。流路型反应部5201还可以通过蚀刻基板5010等而形成。
[0559] 第1盒5300、第2盒5400是夹持核酸检出用器件5100、反应部规定用部件5200的外框。第1盒5300、第2盒5400由例如硬质材料构成。此外，核酸检出用器件内藏盒5001是由第1盒5300、第2盒5400夹入分别作为不同的构成要素的核酸检出用器件5100、反应部规定用部件5200的盒结构，但不特别限定。反应部规定用部件5200可以与第2盒5400一体地构成。核酸检出用器件内藏盒5001可以是由反应部规定用部件5200、第1盒5300、第2盒5400一体地构成的容器型，以在其中插入核酸检出用器件5100的方式构成。
[0560] 接着，作为比较例，对于与第14实施方式不同地，在反应区域，除了传感器部以外的部分(不仅包含配线，还包含基板)被有机系的保护膜覆盖的核酸检出用器件进行说明。核酸杂交反应在形成了传感器部的反应区域内进行。因此，通常在反应区域，除了传感器部以外的部分被保护膜覆盖。然而，一般已知保护膜有微量的溶出物(杂质)。通常，杂质不影响核酸杂交反应。但是，核酸扩增反应是非常纤细的反应，如果含有杂质则容易引起扩增抑制。因此，在将核酸扩增反应与核酸杂交反应在同一反应区域进行的情况下，发生由于来自在反应区域存在的保护膜的溶出物，发生上述的扩增抑制这样的问题。
[0561] 根据第14实施方式，通过在反应区域5023降低保护膜5014所占的面积，可以大幅降低来自保护膜5014的杂质的溶出量，从而可以降低核酸扩增反应的抑制。其结果是核酸检出器件5100的灵敏度提高。
[0562] ＜第15实施方式＞
[0563] 2对于第15实施方式参照附图进行详细说明。此外，对于与第14实施方式中所说明的构成同一的构成，付与同符号而省略说明。图37是第15实施方式的核酸检出用器件5100中的反应区域5023附近的放大图。第15实施方式中反应区域5023中的保护膜5014的形状与第1实施方式不同。
[0564] 保护膜5014在反应区域5023，与第14实施方式同样地，以配线5013不露出的方式覆盖配线5013。进而，保护膜5014在反应区域5023，以传感器部5011的外周部分(传感器部5011与基板5010的边界部分)不露出的方式覆盖传感器部5011的外周部分。换句话说，保护膜5014具备传感器部5011的大略中央部分露出那样的开口。即，保护膜5014在反应区域5023中，在至少配线5013和传感器部5011的外周部分以外的部分具备使基板5010或传感器部5011露出的1个以上的开口。此外，保护膜5014可以设置在基板5010上也可以设置在配线5013与基板5010的边界部分附近。
[0565] 如上所述，第15实施方式的保护膜5014在反应区域5023，具备使包含一部分基板5010的下层部(基板5010或传感器部5011)露出的1个以上的开口。
[0566] 将保护膜5014设置于传感器部5011的外周部分是由于如下的理由。来自传感器部5011的检出信号与传感器部5011的露出面积(不被保护膜5014覆盖的接液面积)成比例。因此，各传感器部5011的露出面积优选为一定。通过将在与各传感器部5011的大略中央部分对向的部分设置了开口的保护膜5014安放在基板5010上，从而各传感器部5011的面积可以严格地规定为一定。
[0567] 根据第15实施方式，可获得与第14实施方式同样的效果。进而，根据第15实施方式，各传感器部5011的露出面积(在各传感器部5011由多个传感器构成的情况下，为多个传感器的露出的面积的合计)规定为一定，因此核酸检出器件5100的灵敏度更加提高。
[0568] ＜第16实施方式＞
[0569] 对于第16实施方式参照附图进行详细说明。此外，与第14实施方式中所说明的构成同一的构成，付与同符号而省略说明。图38是第16实施方式的核酸检出用器件5100中的反应区域5023附近的放大图。第16实施方式中反应区域5023中的保护膜5014的形状与第14实施方式不同。
[0570] 保护膜5014在反应区域5023以配线5013不露出的方式覆盖配线5013。另外，保护膜5014在反应区域5023，具备在各传感器部5011之间的边界区域覆盖基板5010上的划分形状。这里，各传感器部5011之间的边界区域是指反应区域5023中的各传感器部5011之间的大略中央部分。设置于各传感器部5011之间的边界区域的保护膜5014，在反应区域5023，以划分(分割)设置于传感器部5011附近的开口(露出的基板5010)、和设置于邻接的不同的传感器部5011附近的开口(露出的基板5010)的方式，覆盖基板5010上。此外，对在各传感器部5011之间的边界区域覆盖基板5010上的保护膜5010的形状不特别限定。另一方面，保护膜5014在反应区域5023，不设置于传感器部5011。即，保护膜5014在反应区域5023，具备在至少配线5013和各传感器部5011之间的边界理区域以外的部分使基板5010或传感器部5011露出的1个以上的开口。此外，保护膜5014在基板5010上也可以设置在配线5013与基板5010的边界部分附近。此外，保护膜5014也可以与第15实施方式同样地，以覆盖传感器部5011的外周部分的方式设置。
[0571] 如上所述，第16实施方式的保护膜5014在反应区域5023，具备使包含一部分基板5010的下层部(基板5010或传感器部5011)露出的1个以上的开口。
[0572] 在各传感器部5011之间的边界区域设置保护膜5014是由于如下的理由。在各传感器部5011上分别固定化用于检出成为目标的核酸的各种核酸探针。制造时，包含各核酸探针的液体滴加于各传感器部5011上。然而，在基板5010的亲水性高的情况下，如果不在各传感器部5011之间的边界区域设置保护膜5014，则滴加于某一传感器部5011的核酸探针溶液与滴加于邻接的传感器部5011的其他核酸探针溶液相接而混合。一般有机系的保护膜亲水性低。因此，设置于各传感器部5011之间的边界区域的保护膜5014可以防止滴加于某一传感器部5011的核酸探针溶液与滴加于邻接的传感器部5011的其他核酸探针溶液相接。
[0573] 根据第16实施方式，可获得与第14实施方式或第15实施方式同样的效果。进而，根据第16实施方式，可以在核酸检出用器件5100的制造时正确且容易地进行对各传感器部5014的核酸探针的固定。
[0574] ＜第17实施方式＞
[0575] 对于第17实施方式参照附图进行详细说明。此外，与第14实施方式中所说明的构成同一的构成，付与同符号而省略说明。图39是第17实施方式的核酸检出用器件5100中的反应区域5023附近的放大图。第17实施方式中各传感器部5011之间的边界区域的保护膜5014的形状与第16实施方式不同。
[0576] 保护膜5014在反应区域5023以配线5013不露出的方式覆盖配线5013。另一方面，保护膜5014在反应区域5023不设置于传感器部5011。另外，保护膜5014在反应区域5023，与第16实施方式同样地，具备在各传感器部5011之间的边界区域覆盖基板5010上的划分形状。设置于边界区域的保护膜5014在反应区域5023，以划分(分割)为设置于传感器部5011附近的开口(露出的基板5010)、和设置于邻接的其他传感器部5011附近的开口(露出的基板5010)的方式，覆盖基板5010上。
[0577] 保护膜5014在各传感器部5011之间的边界区域，以包围传感器部5011的周围的形状设置。作为一例，保护膜5014在传感器部5011附近，对邻接的至少一方的传感器部5011侧，具备凸状的弧形状的开口。因此，传感器部5011附近露出基板5010，但进一步其周围被保护膜5014覆盖。
[0578] 即，保护膜5014在反应区域5023，具备在至少配线5013和边界理区域以外的部分使基板5010或传感器部5011露出的1个以上的开口。此外，保护膜5014在基板5010上也可以设置在配线5013与基板5010的边界部分附近。此外，保护膜5014可以与第15实施方式同样地，以覆盖传感器部5011的外周部分的方式设置。
[0579] 如上所述，第17实施方式的保护膜5014在反应区域5023，具备使包含一部分基板5010的下层部(基板5010或传感器部5011)露出的1个以上的开口。
[0580] 保护膜5014在各传感器部5011之间的边界区域以包围传感器部5011的周围的形状设置，是为了防止滴加于传感器部5011的包含核酸探针的液体变宽到必要以上。
[0581] 根据第17实施方式，可获得与第14实施方式或第15实施方式同样的效果。进而，根据第17实施方式，可以在核酸检出用器件5100的制造时正确且容易地进行对各传感器部的核酸探针的固定。
[0582] ＜实施例4＞
[0583] 实施例4-1
[0584] 在实施例4-1中，对于实际使用上述说明的第16实施方式的核酸检出用器件5100的核酸扩增反应进行说明。图41将使用了第16实施方式的核酸检出用器件5100的核酸扩增反应的结果、与使用了比较例的核酸检出用器件的核酸扩增反应的结果进行比较显示。此外，比较例的核酸检出用器件是在反应区域，传感器11以外的部分(不仅包含配线，也包含基板)被有机系的保护膜覆盖的构成。图41中横轴显示扩增时间，纵轴显示扩增核酸量。在实施例4-1中，在第16实施方式的核酸检出用器件5100和比较例的核酸检出用器件各自的反应区域注入扩增反应试剂，对注入后进行了40分钟、60分钟的扩增的时刻的扩增核酸量进行定量。在比较例的核酸检出用器件中，40分钟的扩增量低，60分钟也尚不充分。与此相对，在第16实施方式的核酸检出用器件5100中，在40分钟的时刻获得了充分量的扩增。由于在该时刻扩增饱和，因此60分钟的扩增核酸量未增加。
[0585] 由图40所示的结果明确了，第16实施方式的核酸检出用器件5100的构成大幅降低了扩增抑制。此外，对于第14、15、17的实施方式的核酸检出用器件5100也具备与第16实施方式的核酸检出用器件5100同样的构成，因此可获得上述同样的特性。
[0586] 实施例4-2
[0587] 在实施例4-2中，具体说明试剂使用了上述说明的第16实施方式的核酸检出用器件内藏盒5001的核酸检出的使用例。图41是第16实施方式的核酸检出用器件5100中的反应区域5023附近的放大图。此外，实施例4-2中如图41所示，传感器部5011由2个1组的传感器构成。核酸检出用器件5100检出按每个传感器部5011(每2个1组的传感器)不同的核酸。反应区域5023内的保护膜5014如第16实施方式所说明的那样，仅在覆盖配线5013的部分、和各传感器部5011之间的边界区域形成。反应区域5023内的其他部分，基板5010(实施例4-2中使用玻璃)露出。
[0588] (1)核酸检出用器件内藏盒5001的准备
[0589] 1-1.核酸检出用器件5100的准备
[0590] 在核酸检出用器件5100上的各电极(以后，与构成各传感器部5011的传感器对应)固定化以下的表20所示的5种核酸探针(序列A～E)。将包含各核酸探针的溶液滴加于各电极组，然后将多余的核酸探针洗涤除去，从而进行固定化。此外，下述1、2号电极组、3、4号电极组、5、6号电极组、7、8号电极组、9、10号电极组分别构成不同的传感器部5011。
[0591] 1)阴性对照用···1、2号电极
[0592] 2)基因-A检出用···3、4号电极
[0593] 3)基因-B检出用···5、6号电极
[0594] 4)基因-C检出用···7、8号电极
[0595] 5)基因-D检出用···9、10号电极。
[0596] 表20 DNA探针碱基序列
[0597]
[0598] 1-2.核酸检出用器件内藏盒5001的组装
[0599] 在所述核酸检出用器件5100的传感器部5011上安装能够形成反应区域5023的反应部规定用部件5200。在反应部规定用部件5200形成样品注入口，以反应液不漏出的方式固定于核酸检出用器件5100。在反应部规定用部件5200内预先以干燥状态保持如以下的表21所示的引物组。扩增用引物设计成利用LAMP法的扩增用的。
[0600] 表21 DNA引物碱基序列
[0601]
[0602] (2)核酸的检出
[0603] 2-1.模板溶液的准备
[0604] 如以下的表22所示，准备基因A、B、D的3种模板、与扩增用试剂混合而得的模板溶液。
[0605] 表22
[0606] 组成
[0607]
[0608] 模板溶液中使用包含Bst DNA聚合酶、反应混合物，以与后述的模板溶液合并总量为50μL的方式添加了蒸留水(即，DW)的溶液。包含：通过引物DNA(组A)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(A)杂交而被检出的模板A；通过引物DNA(组B)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(B)杂交而被检出的模板B；通过引物DNA(组D)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(D)杂交而被检出的模板D。
[0609] 模板A、B、D是具有以下的表23所示的碱基序列的合成寡聚DNA。
[0610] 表23 DNA模板序列(模板A、B、D)
[0611]
[0612] 2-2.模板溶液的添加
[0613] 将2-1中准备的模板溶液在反应区域添加50μL。
[0614] 2-3.核酸的反应
[0615] 在以下所示的条件下，将反应区域加热或者冷却，进行各种反应。
[0616] 核酸扩增反应：64℃、60分钟
[0617] 杂交反应：50℃、10分钟
[0618] 洗涤反应：30℃、5分钟
[0619] 电流检出用试剂(HOECHST33258)反应：25℃、3分钟
[0620] 2-4.核酸的检出
[0621] 对各探针核酸固定化作用极扫描电位，计测与由探针DNA和LAMP产物形成的双链特异性地结合的HOECHST33258分子的氧化电流。上述一系列的反应在SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008所记载的DNA自动检查装置中实施。
[0622] (3)结果
[0623] 图42是显示由各电极得到的结果的图。在添加了模板的固定化了与基因A、B、D对应的探针A、B、D的电极3、4、5、6、9、10，得到了大于阴性对照的电流值。另一方面，未添加模板的固定化了与基因C对应的探针C的电极7、8，形成与阴性对照同程度的电流值。由图42所示的结果明确了，通过使用第16实施方式的核酸检出用器件5100，可以确实地检出添加了模板的基因。
[0624] 实施例4-3
[0625] 在实施例4-3中，具体说明实际使用了上述说明的第17实施方式的核酸检出用器件内藏盒5001的核酸检出的使用例。图43是第17实施方式的核酸检出用器件5100中的反应区域5023附近的放大图。此外，实施例3中如图43所示，传感器部5011由2个1组的传感器构成。核酸检出用器件5100检出对每个传感器部5011(每2个1组的传感器)不同的核酸。反应区域5023内的保护膜5014如第17实施方式所说明的那样，仅在覆盖配线5013的部分、各传感器部5011之间的边界区域、构成各传感器部5011的2个传感器的外周部分形成。在反应区域5023内的其他部分，基板5010(实施例4-1中使用玻璃)露出。此外，除了核酸检出用器件5100以外，检出中使用的材料和检出条件与实施例4-1是同样的。
此外，下述1、2号电极组、3、4号电极组、5、6号电极组、7、8号电极组、9、10号电极组分别构成不同的传感器部5011。
此外，下述1、2号电极组、3、4号电极组、5、6号电极组、7、8号电极组、9、10号电极组分别构成不同的传感器部5011。
[0626] 结果
[0627] 图44是显示由各电极得到的结果的图。在添加了模板的固定化了与基因A、B、D对应的探针A、B、D的电极3、4、5、6、9、10，得到了大于阴性对照的电流值。另一方面，未添加模板的固定化了与基因C对应的探针C的电极7、8成为与阴性对照同程度的电流值。由图44所示的结果明确了，通过使用第17实施方式的核酸检出用器件5100，可以确实地检出添加了模板的基因。
[0628] 6.核酸反应的抑制的防止
[0629] 在另外的方式中，多核酸扩增反应用具还可以作为不抑制核酸反应的核酸反应用具提供。
[0630] 如上所述，检出多个对象基因的技术非常重要。然而，这样的状况下开发的核酸扩增装置和/或核酸检出装置中有的抑制核酸反应已经明显化。引物与目标核酸的反应、和探针核酸与目标核酸的反应是核酸彼此之间发生的核酸反应。需要在反应场中本来应发生的反应不被抑制地进行。
[0631] 通过利用本实施方式，多核酸扩增反应用具还可以作为不抑制核酸反应的核酸反应用具提供。例如，这样的核酸反应用具可以是核酸扩增用反应用具、核酸检出用反应用具、核酸扩增检出用反应用具。详细地，可以是阵列型探针芯片、阵列型引物芯片和阵列型引物探针芯片。
[0632] 这样的核酸反应用具在构成反应场的部件的表面形成保护膜。这里“反应场”是指在其中进行核酸反应的场。
[0633] 保护膜由选自聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚1,1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅和金属氧化物中的至少1种构成。
[0635] 保护膜可以以与构成核酸反应用具的反应场的部件的反应场相接的方式形成。保护膜的形成可以根据保护膜材料的种类利用其本身公知的技术来进行。或者保护膜为了在反应场中防止从可能抑制反应的部件游离出成为问题的物质而应用即可。此时，与反应场接触的部件的至少一部分被保护膜覆盖即可。
[0636] “引物组”是为了扩增1种目标核酸所需的引物的集合体。例如，在LAMP扩增用的引物组的情况下，1种引物组至少包含用于扩增1种目标核酸的FIP引物、BIP引物即可，根据需要还可以包含F3引物、B3引物、LP引物，即LF引物和/或LB引物。在1个反应用具中进行扩增反应的情况下，在其中进行的扩增一般为1种特定的扩增。因此，在LAMP扩增反应用的反应用具的情况下，1个反应用具所含的多个种类的引物组可以是用于扩增由彼此不同的碱基序列组成的目标序列的彼此不同的引物组。或者，1个反应用具所含的多个种类的引物组可以是具有用于扩增特定的目标序列的彼此不同的引物的组合的引物组。
[0637] 以下记载核酸反应用具的例子。分别所示的例子，记载作为核酸反应用具的阵列型探针芯片、阵列型引物芯片和阵列型引物探针芯片。
[0638] ＜第18实施方式＞
[0639] 阵列型探针芯片
[0640] 阵列型探针芯片6001的实施方式的模式图示于图45。阵列型探针芯片6001在基体6011上具备电极6012。用于取出电极6012的电信息的信号取出部6013配置于与各电极6012对应的位置。电极6012和信号取出部6013通过导线6014连接。探针核酸6015固定化于电极6012的表面。除了电极6012表面以外的基体6011的表面和导线6014的表面被保护膜6013覆盖。
[0641] 保护膜6013的形成可以对所要求的部位通过涂布来进行，或者利用图案化、掩蔽和蚀刻等技术在对全体形成保护膜之后在所要求的部位形成所要求的大小和形状的保护膜。还可以至少覆盖导线6014，防止导线6014与反应液的接触。或者，可以至少在与反应液接触的区域形成保护膜。
[0642] 基体6011可以由例如玻璃、蓝宝石、陶瓷、树脂、橡胶、弹性橡胶、SiO2、SiN或Al2O3等制造，但不限于此。优选由本身为电和化学惰性的其本身公知的任一材质构成。
[0643] 电极6012的制造通过公知的手段进行即可。虽然不特别限定，但电极可以用金、金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓和钨等金属单质和它们的合金、或者石墨、玻碳那样的碳、和它们的氧化物或化合物来制造。
[0644] 探针核酸6015向电极6012的固定化可以通过化学结合来进行，也可以通过探针核酸液的点样和干燥来进行。
[0645] 由探针核酸6015和样品核酸(未图示)杂交而生成的杂交信号通过电极6012传达，从信号取出部6013被取出。
[0646] 图45所示的阵列型探针芯片基体具备10个电极6012，但不限于此，配置于1个基体的电极的数可以任意变更。另外电极的配置图案也不限于图中所示的，本领域技术人员可以根据需要适宜设计变更。基体6011上根据需要还可以设置参考电极和对电极。
[0647] 基体6022可以是管、孔、室、流路、杯和盘以及具备它们中多种构造的板例如多孔板、板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形状。
[0648] 基体6022是具有容器形状的形状，例如，管、孔、室、流路、杯和盘以及具备它们中多种构造的板，例如在多孔板的情况下，在容器内部收纳反应液而形成反应场。进而，阵列型探针芯片还可以具备盖体。盖体以覆盖容器形状或板形状的基体6022的至少固定化了探针核酸6015的区域的方式构成即可。盖体可以是板状。板状的盖体的一部分可以形成沟等凹部。可以在盖体的凹部与基体6022之间的空间形成反应场。
[0649] 在基体6022是板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形状的情况下，可以通过将它们浸渍在包含反应液的另外容器内部而形成反应场，可以通过在配置于基体6022的固定化了探针核酸的区域装载反应液而形成反应场。
[0650] ＜第19实施方式＞
[0651] 阵列型引物芯片
[0652] 参照图46(a)、(b)和(c)来说明阵列型引物芯片的1例。
[0653] 图46(a)是阵列型引物芯片的1例的立体图。图46(a)所记载的阵列型引物芯片6021具备在其内壁形成了保护膜6020的容器6022。在形成了保护膜6020的基体6022的内侧底面6023配置彼此独立的多个固定化区域6024。图46(b)是将固定化区域6024的部分放大而得的模式图。如其中所示，在1个固定化区域6024固定1个种类的引物组6025。
在多个固定化区域6024各自按每1组分别固定多种引物组6025。
在多个固定化区域6024各自按每1组分别固定多种引物组6025。
[0654] 引物组6025根据要扩增的目标核酸的种类准备多个种类。在1个固定化区域6024固定用于扩增特定的1种目标核酸的1种引物组6025。例如，为了PCR扩增，1种引物组包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的正向引物和反向引物。另外，为了LAMP扩增，1种引物组包含为了扩增1种特定的目标核酸所需的FIP引物、BIP引物、根据需要的F3引物、B3引物、和LP引物。
[0655] 引物组6025以与用于提供反应场的液相接触而游离的方式、以能够游离的状态固定于固定化区域6024。引物组6025向固定化区域6024的固定化例如，可以将包含1组引物组的溶液滴加于1个固定化区域6024，然后使其干燥来实现。进而，同样地，对于其他固定化区域6024，将分别包含所期望的引物组6025的溶液滴加和干燥，将所期望的数的多种引物组固定于基体6022即可。由此，在独立地配置于基体6022的1个面的全部的固定化区域6024固定引物组6025。然而，引物组6025向固定化区域6024的固定化，只要以与用于提供反应场的液相接触而能够游离的状态固定即可。因此，可以使用能够进行这样的固定化的其本身公知的任何固定化法。在滴加包含引物组的溶液的方法的情况下，包含引物组的溶液可以是例如水、缓冲液或有机溶剂等。
[0656] 配置于基体6022的多个固定化区域6024彼此独立地配置即可。独立地配置，是指以不妨碍反应场中对于每个引物组开始和/或进行的扩增的间隔配置。例如，相邻的固定化区域6024可以彼此相接而配置，也可以隔开微小的距离而配置在彼此附近，或者，与通常使用的所谓DNA芯片等的检出装置中所固定化的引物组隔开同样的距离而彼此配置。
[0657] 例如，相邻的固定化区域6024的之间的距离可以为0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0658] 用于提供反应场的液相只要是可以在固定的引物组游离之后，使用它们进行扩增反应的液相即可，例如，可以是所期望的扩增所需的反应液。
[0659] 图46(a)和(b)所示核酸反应用具是基体6022为容器形状的例子。容器形状的基体6022是例如管、孔、室、流路、杯和盘以及具备多个上述构造的板、例如多孔板等。另外基体的材质可以是任何材质。基体6022也可以使用与上述的阵列型探针芯片同样的基体材料。另外，基体6022也可以是板形状。进而，阵列型引物芯片上还可以具备盖体。盖体以覆盖容器形状或板形状的基体6022的至少固定化了引物6025的区域的方式构成即可。盖体可以是板状。也可以在板状的盖体的一部分形成沟等凹部。可以在盖体的凹部与基体
6022之间的空间形成反应场。
6022之间的空间形成反应场。
[0660] 核酸反应用具另外，还可以在配置于如图46(c)所示的板状的基体6022的至少1个面6023的引物固定化区域6024固定引物组6025。此时，反应场通过对至少基体6022的固定化了引物组6025的区域装载反应液而形成即可。此时，可以在基体6022的面6023形成凹部和/或凸部，或者还可以通过这些凹部和/或凸部形成流路。引物固定化区域6024和引物组6025可以配置在基体6022的凹部内，也可以配置在由多个凸部围成的区域。另外，基体6022还可以通过配置于包含反应容器的容器内来形成反应场。此时，基体6022可以是板状、球状、棒状和包含它们的一部分的形状。
[0661] 保护膜的形成也可以利用其本身公知的任何技术。
[0662] 在图46(a)和(b)中，显示了固定化区域6024仅配置于基体6022的内侧底面的例子，但不限于此。配置于基体6022的内侧的至少一部分即可，也可以配置于内侧底面和内侧侧面、由盖体形成的顶棚面的任一面或全部。
[0663] 图47是显示使用了上述的阵列型引物芯片6031的核酸扩增反应的样子的图。图47(a)是反应前的阵列型引物芯片6031。在配置于内面形成了保护膜的基体6032的内侧底面的多个固定化区域6033分别固定多种引物组6034。在阵列型引物芯片6031中添加反应液6036，将收容了反应液的状态示于图47(b)。
[0664] 反应液6036包含所期望的扩增反应所需的成分即可。虽然不限于这些，但可以包含例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂。
[0665] 如图47(b)所示，在添加了反应液6036后的阵列型引物芯片6031中，如图47(c)所模式地显示的那样，固定于形成了保护膜的内侧底面的引物组游离而缓缓地扩散。将游离和扩散的区域模式地用区域6035表示。游离、扩散的引物组与存在于其附近的模板核酸、聚合酶和底物等扩增所需的其他成分相遇，扩增反应开始。按每个种类而独立地多个固定化的引物组，可以按其每个种类而独立地对于模板核酸开始和进行扩增反应。由此，使用了多个种类的引物组的对于多种模板序列的扩增，独立且同时地实现。这里，“反应场”理论上是指由能够在其中进行扩增反应的反应液6036所规定的区域，即反应液所存在的区域。另外，将反应场中实际在其中开始并进行扩增反应的区域称为“反应区域”。假设实际上扩增反应仅在区域6035内进行的情况下，区域6035被理解为反应区域。
[0666] 在在上述的例子中，显示了仅将引物组固定化于基体的例子。然而，不限于此，在引物组按每个种类而固定于各固定化区域的条件下，还可以将扩增所需的其他成分，例如聚合酶、逆转录酶等酶、底物、底物和/或缓冲剂等与引物一起固定于基体。此时，使要固定的物质与引物一起包含在所期望的液体介质中，与上述的方法同样地通过滴加和干燥等来固定即可。这样的阵列型引物芯片中进行扩增反应时，根据被固定的成分而选择在其中添加的反应液的组成即可。
[0667] ＜第20实施方式＞
[0668] 阵列型引物探针芯片
[0669] 将另外的实施方式的例子示于图48。该实施方式包含上述的基体、固定于基体的至少1面的探针核酸、和能够游离地固定化的引物。该实施方式也可以称为阵列型引物探针芯片。阵列型引物探针芯片是在1个基体上具备探针核酸和引物的核酸反应用具。关于基体的构成，可以与上述的阵列型探针芯片和阵列型引物芯片同样。
[0670] 图48(a)是阵列型引物探针芯片的1例的立体图。图48(a)所记载的阵列型引物探针芯片6041具备容器形状的基体6042。在基体6042的内壁形成保护膜6043。在基体6042的内侧底面6044的保护膜6043上配置彼此独立的多个引物固定化区域6045。与多个引物固定化区域6045接近地，另外与各个引物固定化区域对应地配置多个探针固定化区域6046。
[0671] 图48(b)是将引物固定化区域6045放大而得的模式图。如其中所示，在1个引物固定化区域6045固定1个种类的引物组6047。多个引物固定化区域6045各自按照每组分别固定多种引物组6047。
[0672] 引物组6047与上述的阵列型引物芯片同样地固定即可。
[0673] 图48(c)是与引物固定化区域6045接近地配置的探针固定化区域6046的放大图。在探针固定化区域6046固定化包含应被检出的所期望的序列的互补序列的探针核酸6048多个。
[0674] 应被检出的所期望的序列可以是探针核酸的互补序列。探针固定化区域6046以探针核酸6048与其目的序列的杂交信号在多个探针固定化区域6046之间独立地被检出的方式配置。
[0675] 探针核酸6048向探针固定化区域6046的固定，也可以利用其本身公知的在所谓DNA芯片中对基板表面固定探针核酸的一般的任何技术。可以在探针核酸6048的固定化之后固定引物组6047，也可以在固定引物组6047之后固定化探针核酸6048。另外，也可以将引物组6047的固定与探针核酸6048的固定化同时进行。
[0676] 例如，相邻的探针固定化区域6046的之间的距离可以为0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0677] 另外例如，探针固定化区域6046与引物固定化区域6045的之间的距离可以为0μm～0.1μm、0.1μm～1μm、1μm～10μm、10μm～100μm、100μm～1mm、1mm～10mm、或其以上，优选为100μm～10mm。
[0678] 例如，在探针固定化区域6046与引物固定化区域6045的之间的距离为0μm的情况下，可以理解为探针固定化区域6046与引物固定化区域6045位于基体表面的相同的位置。另外，可以探针固定化区域6046包含在引物固定化区域6045中，也可以引物固定化区域6045包含在探针固定化区域6046中。
[0679] 图49是显示使用该阵列型引物探针芯片6041进行的核酸扩增反应后的反应场的样子的模式图。图49(a-1)和(b-1)是反应前的阵列型引物探针芯片6041。在基体6042的内壁形成了保护膜6043。在配置于基体6042的内侧底面6044的保护膜6043上的多个引物固定化区域6045分别固定多种引物组6047。与各个引物固定化区域6045对应地，在各自的附近配置探针固定化区域6046。在探针固定化区域6046，按每个种类而固定化多种探针核酸6048。
[0680] 在阵列型引物探针芯片6041中添加反应液6050，将收容了该反应液的状态示于图49(a-2)和(b-2)。
[0681] 反应液6050可以包含所期望的扩增反应所需的成分。虽然不限于这些，但可以含有例如，聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等、以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂。
[0682] 样品向反应场的添加，可以通过在阵列型引物探针芯片6041中添加反应液6050以前在反应液6050中预先添加，也可以在将反应液6050添加到阵列型引物探针芯片6041后进行，也可以通过在向阵列型引物探针芯片6041添加反应液6050以前将样品添加到阵列型引物探针芯片6041中来进行。
[0683] 如图49(a-2)和(b-2)所示，在添加了反应液6050后的阵列型引物探针芯片6041中，如图49(a-3)和(b-3)中模式地显示的那样，固定于底面6044的保护膜6043上的引物组6047游离而缓缓地扩散。将游离和扩散的区域模式地用区域6051表示。游离、扩散的引物与存在于其附近的模板核酸、聚合酶和底物等扩增所需的其他成分相遇，扩增反应开始。按每个种类而独立地多个固定的引物组，可以按其每个种类而独立地对于模板核酸开始和进行扩增反应。由此，使用了多个种类的引物组的对于多种模板序列的扩增，独立且同时地实现。这里，“反应场”理论上是指由能够在其中进行扩增反应的反应液6050所规定的区域，即反应液所存在的区域。另外，将反应场中实际在其中开始并进行扩增反应的区域称为“反应区域”。假设实际上扩增反应仅在区域6051内进行的情况下，区域6051被理解为反应区域。图49(a-3)的图是通过固定于全部的引物固定化区域6045的引物组而发生了扩增反应时的模式图。图49(b-3)是通过固定的引物组，形成于底部6044的保护膜6043上的全部的引物固定化区域6045中的一部分发生了扩增，图49(b-3)中是仅3个区域发生了扩增时的模式图。
[0684] 在区域6051中扩增而得的扩增产物中存在包含目的序列的核酸的情况下，探针固定化区域6046与该核酸杂交。固定于探针固定化区域6046的探针核酸6048以仅与对应的引物固定化区域6045中的扩增产物杂交的方式被固定。即，以固定于1个探针固定化区域6046的探针核酸6048仅与对应的引物固定化区域6045中的扩增产物杂交的方式，维持距离地配置各个探针固定化区域6046和引物固定化区域6045。
[0685] 探针核酸6048与其目的序列的杂交的检出可以通过其本身公知的杂交信号的检出手段来进行。例如，可以预先对引物付与荧光物质，也可以对脱氧核苷三磷酸等底物付与荧光物质。也可以以来自这些荧光物质的荧光强度为指标确定杂交的有无和量。或者，还可以通过电化学的手段来检出杂交信号。
[0686] 杂交的检出可以在阵列型引物探针芯片6041内部的洗涤后实行，也可以不进行洗涤而实行。在通过电化学手段检出的情况下，可以使用嵌入剂来检出杂交信号。此时，例如，可以预先使反应液6050中含有嵌入剂，也可以在杂交反应开始前、杂交反应中、杂交反应后添加。这些情况下，均可以在阵列型引物探针芯片6041内部的洗涤后进行检出，也可以不进行洗涤而实行检出。杂交反应的开始、反应中、反应后的判定可以根据引物、探针核酸和模板核酸的序列、反应温度等反应条件来进行，也可以通过预实验来确定。
[0687] 该引物的长度虽然不限于此，但可以为约5个碱基以上、约6个碱基以上、约7个碱基以上、约8个碱基以上、约9个碱基以上、约10个碱基以上、约15个碱基以上、约20个碱基以上、约25个碱基以上、约30个碱基以上、约35个碱基以上、约40个碱基以上、约45个碱基以上或约55个碱基以上，约80个碱基以下、约75个碱基以下、约70个碱基以下、约65个碱基以下、约60个碱基以下、约55个碱基以下、约50个碱基以下、约45个碱基以下、约40个碱基以下、约35个碱基以下、约30个碱基以下、约25个碱基以下、约20个碱基以下、约25个碱基以下或约20个碱基以下，也可以是将这些下限上限的任一者组合而得的范围。例如，优选的碱基长度的例子可以为约10个碱基～约60个碱基、约13～40个碱基、约10～30个碱基等。另外，同时固定于1个固定化区域的引物的长度可以全部的引物相同，也可以全部的引物不同，也可以一部分引物为相同的长度，也可以一部分引物为不同的长度。另外，也可以每个引物组不同。另外，可以固定于1个固定化区域的引物组按每个种类而为不同的长度，也可以固定于1个固定化区域的引物组全部为相同的长度。
[0688] 探针核酸的长度例如，可以为3个碱基～10个碱基、10个碱基～20个碱基、20个碱基～30个碱基、30个碱基～40个碱基、40个碱基～50个碱基、50个碱基～60个碱基，优选为10个碱基～50个碱基。探针核酸包含应被检出的目的序列的互补序列。探针核酸除了目的序列的互补序列之外还可以含有其他的序列，例如间隔物序列等。
[0689] 目标序列的长度例如，可以为10个碱基～100个碱基、100个碱基～200个碱基、碱基200～300个碱基、300个碱基～400个碱基、优选为100个碱基～300个碱基。
[0690] 目的序列的长度例如，可以为3个碱基～10个碱基、10个碱基～20个碱基、20个碱基～30个碱基、30个碱基～40个碱基、40个碱基～50个碱基、50个碱基～60个碱基、优选为10个碱基～50个碱基。
[0691] 固定于1个引物固定化区域的引物组的种类可以是用于扩增1种目标核酸的1个种类，为了分别扩增2种以上的目标核酸也可以是多个种类。
[0692] 固定于1个探针固定化区域的探针核酸群的种类可以是用于与1种目的序列杂交的一个种类，为了分别扩增2种以上的目标核酸也可以是多个种类。另外，也可以是目的序列的部分共同、进而包含其他与目的序列不同的序列的探针核酸。
[0693] 配置于1个阵列型引物探针芯片的引物固定化区域的数的下限可以为1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、50以上、75以上、100以上、125以上、150以上、175以上、200以上、300以上、400以上、500以上、1000以上、1500以上、2000以上，上限可以为10000以下、5000以下、2500以下、2000以下、1500以下、1000以下、500以下、250以下、200以下、150以下，也可以是将这些上限下限的任一者组合而得的范围。
[0694] 配置于1个阵列型引物探针芯片的引物固定化区域和探针固定化区域的数可以相同也可以不同。即，可以以与全部的引物固定化区域对应的方式配置相同数的探针固定化区域，也可以引物固定化区域的数多于探针固定化区域的数，也可以引物固定化区域的数少于探针固定化区域的数。另外，还可以包含用于确认扩增反应状态、或用于确认杂交反应的状态的阳性对照和/或阴性对照。这样的阳性对照和/或阴性对照也可以对于引物组和/或探针核酸分别设置。
[0695] 在上述的例子中，显示了仅将引物组固定化于基体的例子。然而，不限于此，在引物组按每个种类而固定化于各固定化区域的条件下，还可以将扩增所需的其他成分，例如聚合酶、逆转录酶等的酶、底物、底物和/或缓冲剂等与引物一起固定于基体。此时，使要固定的物质与引物一起包含在所期望的液体介质中，与上述的方法同样地通过滴加和干燥等来固定即可。在这样的阵列型引物探针芯片中进行扩增反应时，根据被固定的成分而选择在其中添加的反应液的组成即可。
[0696] ＜第21实施方式＞
[0697] 参照图50～图53来说明第21实施方式的阵列型引物探针芯片。
[0698] (1)芯片原料
[0699] 首先，对于通过电化学检出来检出杂交信号的阵列型引物探针芯片的芯片原料的构成和制造方法的1例，使用图50(a)和(b)进行说明。图50(a)是芯片原料的平面图，图50(b)是图50(a)的芯片原料的沿线B-B的剖面图。
[0700] 芯片原料111具有在矩形的基板112上沿其长度方向配置的例如4个电极113a～113d。各电极113a～113d具有依次叠层了第1金属薄膜图案114和第2金属薄膜图案
115的结构。另外，各电极113a～113d具有大矩形部116与小矩形部117通过细线117连接而成的形状。绝缘性的保护膜6118覆盖于包含各电极113a～113d的基板112上。圆形窗119开口于与大矩形部116对应的绝缘性的保护膜6118部分。矩形窗120开口于与小矩形部117对应的绝缘性的保护膜6118部分。电极113a的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第1作用极121a发挥功能。电极113b的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第2作用极121b发挥功能。电极113c的从圆形窗119露出的大矩形部作为对电极122发挥功能。电极113d的从圆形窗119露出的大矩形部作为参考电极123发挥功能。另外，电极113a～113d的从矩形窗120露出的小矩形部117作为探测器接触部发挥功能。
115的结构。另外，各电极113a～113d具有大矩形部116与小矩形部117通过细线117连接而成的形状。绝缘性的保护膜6118覆盖于包含各电极113a～113d的基板112上。圆形窗119开口于与大矩形部116对应的绝缘性的保护膜6118部分。矩形窗120开口于与小矩形部117对应的绝缘性的保护膜6118部分。电极113a的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第1作用极121a发挥功能。电极113b的从圆形窗119露出的大矩形部116作为第2作用极121b发挥功能。电极113c的从圆形窗119露出的大矩形部作为对电极122发挥功能。电极113d的从圆形窗119露出的大矩形部作为参考电极123发挥功能。另外，电极113a～113d的从矩形窗120露出的小矩形部117作为探测器接触部发挥功能。
[0701] 这样的芯片原料可以通过如下的方法来制作。
[0702] 首先，在基板112上将第1金属薄膜和第2金属薄膜通过例如溅射法或真空蒸着法来依次堆积。接下来将这些金属薄膜以例如抗蚀剂图案作为掩模，依次选择性地进行蚀刻，沿着基板112的长度方向形成依次叠层了第1金属薄膜图案114和第2金属薄膜图案115的例如4个电极113a～113d。这些电极113a～113d具有大矩形部116与小矩形部
117通过细线117连接而成的形状。
117通过细线117连接而成的形状。
[0703] 接下来，在包含电极113a～113d的基板112上，通过例如溅射法或CVD法来堆积保护膜6118。接下来，对与各电极113a～113d的大矩形部116对应的保护膜6118部分和与小矩形部117对应的保护膜6118部分，以抗蚀剂图案作为掩模，选择性地进行蚀刻，在与大矩形部116对应的绝缘性的保护膜6118部分开口圆形窗119，并且在与小矩形部117对应的绝缘性的保护膜6118部分开口矩形窗120。由此制作前述的芯片原料111。
[0704] 基板112由例如パイレックス(注册商标)玻璃那样的玻璃或树脂制作。
[0705] 第1金属薄膜作为用于使第2金属薄膜与基板112密合的基底金属膜发挥作用，由例如Ti制作。第2金属薄膜由例如Au制作。
[0706] 将第1和第2金属薄膜图案化时的蚀刻的例子，包含使用蚀刻气体的等离子体蚀刻或反应性离子蚀刻。
[0707] 绝缘性的保护膜6118从聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚1,1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅和金属氧化物中选择即可。还可以是例如，硅氧化膜那样的金属氧化膜、硅氮化膜那样的金属氮化膜。
[0708] 将绝缘性的保护膜6118图案化时的蚀刻的例子，包含使用蚀刻气体的等离子体蚀刻或反应性离子蚀刻。
[0709] (2)阵列型引物探针芯片
[0710] 接着，参照图51(a)和图51(b)来说明在上述(1)中制造的芯片原料111固定了引物组和探针核酸而得的阵列型引物探针芯片的构成和制造方法的1例。图51(a)是阵列型引物探针芯片的平面图，图51(b)是图51(a)的阵列型引物探针芯片的沿线B-B的剖面图。
[0711] 将形成于芯片原料111上的电极113a的第1作用极121a作为第1探针固定化区域201a，在该第1探针固定化区域201a固定包含第1目的序列的互补序列的第1探针核酸202a。固定的第1探针核酸202a将其多条作为1种探针核酸群而被固定。同样地，将电极
113b的第2作用极121b作为第2探针固定化区域，在该第2探针固定化区域固定包含与第
1目的序列不同的第2目的序列的互补序列的第2探针核酸202b。
113b的第2作用极121b作为第2探针固定化区域，在该第2探针固定化区域固定包含与第
1目的序列不同的第2目的序列的互补序列的第2探针核酸202b。
[0712] 将探针核酸202a和202b固定于探针固定化区域的方法的例子，包含对于具备金电极的芯片原料111，在3’末端将硫醇基导入第1探针核酸202a的方法等。
[0713] 接下来，在第1作用极121a的附近配置第1引物固定化区域203a，在第2作用极121b的附近配置第2引物固定化区域203b。在该第1引物固定化区域203a上固定第1引物组204a，在第2引物固定化区域203b上固定第2引物组204b。由此制作阵列型引物探针芯片。
[0714] 第1引物组204a具有以扩增第1目标序列的方式设计的序列，第2引物固定化区域203b具有以扩增由与第1目标序列不同的序列组成的第2目标序列的方式设计的序列。
[0715] 将第1和第2引物组204a和204b分别向第1和第2引物固定化区域203a和203b的固定如下进行：使例如水、缓冲液或有机溶剂那样的液体中包含引物组而滴加，然后在例如室温等的适当的温度条件下放置直至干燥的时间，例如室温的情况下放置10分钟。
[0716] (3)使用时的阵列型引物探针芯片
[0717] 对于上述(2)中制作的阵列型引物探针芯片的使用方法，参照图52和图53进行说明。
[0718] 图52(a)是使用时的阵列型引物探针芯片的平面图，图52(b)是图52(a)的阵列型引物探针芯片的沿线B-B的剖面图。
[0719] 在使用本实施方式的阵列型引物探针芯片91的情况下，以分别形成于电极113a～113d的第1作用极121a、第2作用极121b、对电极122和参考电极123、以及第1引物固定化区域203a和第2引物固定化区域203b包含在同一反应场的方式维持反应液。
为此，在阵列型引物探针芯片91的使用之前将覆盖体301安装在阵列型引物探针芯片91上，所述覆盖体301将例如硅胶那样的硅树脂和/或氟树脂等那样的树脂通过例如挤出成型、注射成型或模压成型和/或利用接合剂的接合等其本身公知的任一树脂成型法进行成型而得。安装了覆盖体301之后，将包含模板核酸303的反应液302添加在由阵列型引物探针芯片91和覆盖体301所形成的空间中。
为此，在阵列型引物探针芯片91的使用之前将覆盖体301安装在阵列型引物探针芯片91上，所述覆盖体301将例如硅胶那样的硅树脂和/或氟树脂等那样的树脂通过例如挤出成型、注射成型或模压成型和/或利用接合剂的接合等其本身公知的任一树脂成型法进行成型而得。安装了覆盖体301之后，将包含模板核酸303的反应液302添加在由阵列型引物探针芯片91和覆盖体301所形成的空间中。
[0720] 在安装了覆盖体301的阵列型引物探针芯片91中，电极113a～113d各自的从矩形窗120露出的小矩形部117露出。
[0721] 将覆盖体301安装于阵列型引物探针芯片91的例子，包含例如压合、利用接合剂的接合等。
[0722] 接下来，在将覆盖体301安装于阵列型引物探针芯片91之后添加反应液302。
[0723] 在由阵列型引物探针芯片91和覆盖体301所形成的空间中添加液体的方法，例如，可以在覆盖体301的一部分预先设置开口部，从该开口部添加，另外也可以使用具有顶端锐利的、例如针那样的顶端的注入器插入覆盖体301的一部分而添加。
[0724] 反应液302包含：样品；扩增试剂，例如聚合酶等酶、以引物为起点形成新的多核苷酸链时所需的脱氧核苷三磷酸等底物、同时进行逆转录时的逆转录酶和其所需的底物等；以及用于维持适当的扩增环境的盐类等缓冲剂；和例如HOECHST33258那样的识别双链核酸而产生信号的嵌入剂。在应检查的样品中存在包含应被固定于特定的引物固定化区域的引物组扩增的目标序列的模板核酸的情况下，在包含该引物固定化区域和与其对应的探针固定化区域的反应场中形成扩增产物。其样子模式地示于图53。
[0725] 图53(a)模式地显示在反应场302中形成了扩增产物的状态。图53(a)是使用时的阵列型引物探针芯片的平面图，图53(b)是图53(a)的阵列型引物探针芯片的沿线B-B的剖面图。如上所述，在图52中添加的样品中，包含含有第2引物组204b所能够结合的序列的核酸，因此如图53(a)和图53(b)所示，在反应场302中，第2引物组游离和扩散，与模板核酸相遇后进行扩增反应，由此形成扩增产物。由第2引物组204b产生的扩增产物向第2引物固定化区域203b的周围扩散，到达第2探针固定化区域201b。在到达的扩增产物包含目的序列的情况下，第2探针核酸202b与扩增产物杂交而形成双链核酸。对该双链核酸，反应液302所含的嵌入剂结合而产生杂交信号。
[0726] 杂交信号，例如，使探测器与电极113a～113d各自的从矩形窗120露出的小矩形部117接触，测定HOECHST33258那样的嵌入剂的电流应答，从而进行。
[0727] 通过使用利用电化学检出的阵列型引物探针芯片，可以更简单且短时间地在扩增样品所含的目标核酸之后，进行该扩增产物所含的目的核酸的检出。
[0728] ＜第22实施方式＞
[0729] 检出方法
[0730] 在使用阵列型探针芯片和阵列型引物探针芯片进行核酸的检出的情况下，可以如下进行。
[0731] (a)电流检出方式
[0732] 对电化学地检出双链核酸的方法进行说明。该方法中，使用特异性地识别双链核酸的双链识别体。双链识别体的例子包含例如，HOECHST33258、吖啶橙、喹吖因、道诺霉素、金属嵌入剂、双吖啶等双嵌入剂、三嵌入剂、多嵌入剂等，但不限于这些。进而，还可以将这些物质用电化学活性的金属络合物，例如二茂铁、紫精等修饰。
[0733] 双链识别体的浓度根据其种类不同而不同，一般在1ng/mL～1mg/mL的范围使用。此时，在离子强度0.001～5的范围使用pH值5～10的范围的缓冲液即可。
[0734] 杂交反应中或反应后，在反应溶液中添加双链识别体。在通过杂交而生成了双链核酸的情况下，双链识别体与其结合。于是，施加例如双链识别体进行电化反应的电位以上的电位，可以测定来源于双链识别体的反应电流值。此时，电位可以定速施加，或者脉冲施加，或者施加定电位。测定的时可以使用例如恒电位仪、数字万用表、和函数发生器等装置控制电流、电压。优选使用例如日本特开平10-146183号公报所记载的公知的电化学检出手段。
[0735] (b)荧光检出法
[0736] 对于通过荧光来检出双链核酸的方法进行说明。对于引物组所含的至少1个引物，预先用荧光活性的物质进行标记。或者，使用用荧光活性的物质进行了标记的2次探针核酸进行检出。或者，还可以使用多种标记。荧光活性的物质虽然不限于这些，但包含FITC、Cy3、Cy5、或者罗丹明等荧光色素。荧光物质使用例如荧光检出器来检出。根据标记种类使用适宜的检出装置，检出被标记的检出序列或2次探针核酸。
[0737] ＜实施例5＞
[0738] 例5-1
[0739] 为了研究保护膜对核酸反应的影响，在不固定化引物而具有流路作为反应场的扩增用芯片中进行扩增反应。然后，通过阵列型探针芯片进行检出。
[0740] (1)芯片原料的制作
[0741] 使用晶片大小的パイレックス玻璃作为板状的基体(即，基板)。在表面用旋涂器涂布保护膜材料。作为保护膜材料，使用负型抗蚀剂(环氧)、正型抗蚀剂(酚醛清漆、聚烯烃)、不含感光剂的材料(酚醛清漆)。
[0742] 涂布各材料后，将基板夹入干燥烘箱，在150℃实施预烘，使膜干燥。
[0743] 接下来，在负型光致抗蚀剂材料的情况下，用密合型曝光机以400mJ进行曝光后，进行显影处理。在正型抗蚀剂材料的情况下，不进行曝光处理而仅进行显影处理。对于除了光致抗蚀剂以外的材料，不进行曝光、显影处理。
[0744] 用干燥烘箱在160℃进行后烘，使膜完全硬化。硬化后，进行化学干蚀刻(Chemical dry etching，CDE)处理2分钟，形成芯片原料。
[0745] (2)扩增用芯片
[0746] 将预先形成了流路的硅胶安装于所述芯片原料上。将此作为扩增用芯片。
[0747] (3)LAMP反应液的制作和LAMP反应
[0748] 使用的引物的碱基序列示于表24。
[0749] 表24 LAMP引物序列
[0750]
[0751] LAMP反应液的组成示于表25。
[0752] 表25 LAMP反应液的组成
[0753]试剂名 体积(μl)
反应混合物 14
80μM FIP 1
80μM BIP 1
10μM F3 1
10μM B3 1
40μM环引物＊ 1
Bst DNA聚合酶 2
模板(1×106拷贝/μl) 2
DW 27
总计 50
反应混合物 14
80μM FIP 1
80μM BIP 1
10μM F3 1
10μM B3 1
40μM环引物＊ 1
Bst DNA聚合酶 2
模板(1×106拷贝/μl) 2
DW 27
总计 50
[0754] 将LAMP反应液中使用的反应混合物的组成示于表26。
[0755] 表26 反应混合物组成表
[0756]浓度 制造商
Tris-HCI(pH8.8) 56mM Bio Vision Inc
KCI 28mM アソビオソ(株)
MgSO4 22mM (株)シグマ
(NH4)SO4 28mM HAMPTON RESEARCH Corp.
Tween20 0.20％ 和光純薬工業(株)
甜菜碱 2.2M S社
dNTPs 3.9mM each プロメガ(株)
Tris-HCI(pH8.8) 56mM Bio Vision Inc
KCI 28mM アソビオソ(株)
MgSO4 22mM (株)シグマ
(NH4)SO4 28mM HAMPTON RESEARCH Corp.
Tween20 0.20％ 和光純薬工業(株)
甜菜碱 2.2M S社
dNTPs 3.9mM each プロメガ(株)
[0757] LAMP反应液所含的模板的碱基序列示于表27。
[0758] 表27 模板碱基序列
[0759]
[0760] 在扩增用芯片的流路中注入LAMP反应液50uL，安装到帕尔帖温度设置为63℃的Genelyzer内，进行1小时LAMP反应。
[0761]
[0762] (4)阵列型探针芯片
[0763] 阵列型引物探针芯片用的芯片原料的概略图示于图50。在パイレツクス玻璃表面通过溅射而形成钛和金的薄膜。然后，通过蚀刻处理，在玻璃表面上形成钛和金的电极。进而在其上涂敷绝缘膜，通过蚀刻处理而在绝缘膜开口圆形窗和矩形窗，使作用极、对电极、参考电极和探测器接触部露出。以此作为阵列型引物探针芯片用的芯片原料。
[0764] (5)阵列型探针芯片的制作
[0765] 合成表28所示的探针核酸(3’末端SH标记合成寡聚物)。
[0766] 表28
[0767]探针名 序列(5’→3’) 序列号
35-1-34 TTTGGTGCAATGGATTTTACTACATTACAAGCTA 229
35-1-34 TTTGGTGCAATGGATTTTACTACATTACAAGCTA 229
[0768] 调制包含探针DNA各3μM的探针DNA溶液，将该溶液100nL在作用极上点样。在40℃干燥，用超纯水洗涤后，除去残留在作用极表面的超纯水，在芯片原料的作用极固定探针DNA。
[0769] 关于DNA芯片和DNA芯片测定装置的详细，请参照以下的文献(SICE Journal of Control，Measurement，and System Integration，Vol.1，No.3，pp.266-270，2008)。
[0770]
[0771] 为了试验各保护膜对扩增反应的影响，通过阵列型探针芯片检出在扩增用芯片中扩增的LAMP扩增产物。
[0772] 其结果示于表29。
[0773] 表29
[0774]
[0775] 如表29所示，在使用酚醛清漆树脂(含有萘醌系感光剂)作为保护膜的情况下，杂交信号为阴性。在使用酚醛清漆树脂、环氧树脂、聚烯烃树脂和硅树脂作为保护膜的情况下，杂交信号为阳性。
[0776] 因此，明确了酚醛清漆树脂(含有萘醌系感光剂)影响扩增反应等核酸反应。另一方面，明确了酚醛清漆树脂、环氧树脂、聚烯烃树脂和硅树脂影响扩增反应等核酸反应的可能性低。
[0777] 酚醛清漆树脂(含有萘醌系感光剂)是作为正型抗蚀剂一般在以进行核酸反应为目的的器件的制造中使用的1例。明确了这样的材料在这次试验中影响核酸反应。在用于进行核酸反应的器件中，需要避免使用影响核酸反应的材料。
[0778] 由上述的结果显示，酚醛清漆树脂、环氧树脂、聚烯烃树脂和硅树脂是在以进行核酸反应为目的的器件中优选使用的材料。
[0779] ＜例5-2＞
[0780] 以下记载制作并使用包含固定化于引物固定化区域的引物组、和作为固定化于引物固定化区域的附近的探针固定化区域的探针核酸的探针DNA的电化学检出用的阵列型引物探针芯片的例子。探针固定化区域由电极形成，作为用于检出依赖于杂交的存在而生成的电流应答的传感器使用。
[0781] (1)芯片原料的制作
[0782] 阵列型引物探针芯片用的芯片原料的概略图示于图50。在パイレックス玻璃表面通过溅射而形成钛和金的薄膜。然后，通过蚀刻处理，在玻璃表面上形成钛和金的电极。进而在其上涂敷绝缘膜，通过蚀刻处理而在绝缘膜开口圆形窗和矩形窗，使作用极、对电极、参考电极和探测器接触部露出。以此作为阵列型引物探针芯片用的芯片原料。
[0783] (2)阵列型引物探针芯片的制作
[0784] 首先，将探针DNA固定着作用极上。使用的探针DNA的碱基序列示于表30。
[0785] 表30 探针DNA一览
[0786]
[0787] 在3’末端修饰硫醇基
[0788] 调制分别包含探针DNA(A)和探针DNA(B)各3μM的探针DNA溶液，将该溶液100nL点样在作用极上。以40℃干燥，用超纯水洗涤后，除去残留在作用极表面的超纯水，在芯片原料的作用极固定探针DNA。
[0789] 接着，作为引物组准备所使用的引物DNA。所使用的引物DNA是用于Loop-mediated Isothermal amplification(环介导等温扩增，LAMP)法的扩增的引物组。
使用的引物DNA的碱基序列示于表31。
使用的引物DNA的碱基序列示于表31。
[0790] 表31 引物组一览
[0791]
[0792] 对于引物DNA(组A)，分别准备200μM的FIP、BIP、F3、B3、LPF，使用分别包含0.1μL、0.1μL、0.0125μL、0.00125μL和0.05μL的0.275μL的溶液，固定于作为对应的探针DNA(A)的附近的引物固定化区域的作用极上。具体地，将准备的各0.275μL的这些溶液，点样于分别固定了探针DNA(A)的对应的附近的作用极，以63℃干燥5分钟。由此，得到阵列型引物探针芯片。
[0793] (3)LAMP反应液的制作
[0794] LAMP反应液的组成示于表32。
[0795] 表32 LAMP溶液组成
[0796] 组成(1) (uL)
[0797]
[0798] 组成(2) (uL)
[0799]反应混合物 14.0
Bst DNA聚合酶 2.0
DW 34.0
总计 50.0
Bst DNA聚合酶 2.0
DW 34.0
总计 50.0
[0800] 组成(2) (uL)
[0801]反应混合物 14.0
Bst DNA聚合酶 2.0
DW 33.0
模板A(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
总计 50.0
Bst DNA聚合酶 2.0
DW 33.0
模板A(1.0E+03拷贝/uL) 1.0
总计 50.0
[0802] 组成(4) (uL)
[0803]
[0804] 组成(1)～(4)使用共同地包含Bst DNA聚合酶、反应混合物，以与后述的模板溶液一起总量为50μL的方式添加蒸留水(即，DW)而得的组成。组成(1)包含通过引物DNA(组B)而发生LAMP法的扩增反应，且与探针DNA(B)杂交而被检出的模板B。组成(2)不包含模板，组成(3)包含通过引物DNA(组A)而发生LAMP法的扩增反应、且与探针DNA(A)杂交而被检出的模板A。组成(1)使用包含模板A和模板B两者的组成。模板A和B是具有表33所示的碱基序列的合成寡聚DNA。
[0805]
[0806] (4)阵列型引物探针芯片上的LAMP扩增反应、和利用探针DNA的目的核酸的检出[0807] 如图52概略显示的那样，将以包含作为探针固定化区域的电极和引物DNA固定化区域的方式、作为用于形成反应容器的覆盖体而成型的硅胶，安装于阵列型引物探针芯片上，从预先设置于硅胶的孔向反应容器内注入LAMP反应溶液后，盖上盖。将此设置于设定为63℃的板上，进行60分钟LAMP反应。如图53概略显示的那样，对于特定的引物，在LAMP反应溶液中包含该引物可以结合、且应被该引物扩增的目标序列的模板的情况下，在固定了该引物的场所局部地进行LAMP反应。生成的LAMP产物与位于附近的探针DNA杂交。
[0808] 在60分钟的LAMP反应后，在45℃进行10分钟杂交反应，在45℃进行10分钟洗涤。然后，除去洗涤溶液，注入75μM的HOECHST33258溶液。对各探针核酸固定化作用极扫描电位，计测与由探针DNA和LAMP产物形成的双链特异性地结合的HOECHST33258分子的氧化电流。上述一系列的反应在以下的文献所记载的DNA自动检查装置中实施(SICE Journal of Control,Measurement,and System Integration,Vol.1,No.3,pp.266-270,2008)。
[0809] (5)检出结果
[0810] 检出结果示于表34。
[0811] 表34 DNA芯片检出结果
[0812]
[0813] 单位:nA
[0814] 在添加包含模板B的LAMP反应溶液组成(1)的情况下，由固定于作用极2的附近的引物DNA(组B)引起的LAMP反应进行，生成的LAMP产物与探针DNA(B)，其结果获得了70nA的电流值。
[0815] 另一方面，对于固定于作用极2的附近的引物DNA(组A)，LAMP反应不，得不到电流值。
[0816] 由这2个数值可以判定，LAMP反应溶液中包含模板B。
[0817] 另外，在添加了不包含模板的LAMP反应溶液组成(2)的情况下，由固定于作用极1和2各自的附近的引物DNA(组A)、引物DNA(组B)引起的LAMP扩增反应不进行，得不到电流值。
[0818] 由以上的结果显示，使用本实施例所记载的阵列型引物探针芯片，可以检出LAMP反应溶液中所含的模板，并识别其序列。
[0819] 7.适合全自动处理的器件
[0820] 作为另外的实施方式，提供适合将接着前处理工序的目标核酸的检出全自动地处理的核酸检出盒和核酸检出装置。
[0821] 到目前为止作为检出核酸的系统，已知分别利用核酸提取装置、核酸扩增装置、杂交装置、核酸检出装置、数据分析装置等各装置的系统。在这样的系统中，除了在这些装置实现的以外的样品的调整或者装置之间的样品的移动需要人手。
[0822] 在核酸扩增中，存在即使在扩增前的样品中极微量地混入其他核酸，该核酸也大量扩增，从而引起误检的问题。还已知核酸分子在干燥状态下也稳定，有时吸附于各种物质，进而在空气中浮游。因此为了防止误检，进行核酸提取的场所需要不带入扩增后的样品等的严格的管理体制。
[0823] 近年来，还开发了将从核酸提取、扩增、从杂交、检出到数据分析的工序自动进行的全自动核酸检出装置。但是，现存的全自动核酸检出装置并未对所述的检出对象外的核酸分子的混入采取确实的对策，另外大型的较多，因此成为面向研究用途的装置。另外，通过采用密封结构而对策的装置也在发售，但由于盒等的部件点数多、且结构复杂，因此难以小型化，由于这些消耗品昂贵，因此检出费用庞大。
[0824] 在一般的全自动核酸检出中采用密封结构的情况下，具备用于装填核酸样品及各试剂液的多个容器、对各个容器形成流路的各个阀来进行控制，盒等的部件点数多，结构复杂，因此盒昂贵。另外，对于核酸检出装置，也适应盒的结构而需要复杂的控制，因此结构复杂，难以小型化且昂贵。
[0825] 通过另外的实施方式，提供将从核酸扩增到目标核酸的检出一贯地自动处理的小型密封型的核酸检出盒和核酸检出装置。
[0826] ＜第23实施方式＞
[0827] 图54是显示成为本实施方式的核酸检出(核酸提取)盒7022的一例的概略构成的分解立体图。核酸检出盒7022主要具备流路包装7001、上板7002、下板7003的3个部件。图55是显示成为图54所示的流路包装7001、上板7002、下板7003组合而得的核酸检出盒7022的一例的概略构成的立体图。图55(a)是从核酸检出盒7022的表面侧观察而得的立体图。此外，在本实施方式中，将沿流路包装7001、上板7002、下板7003的叠层方向的上板7002的外面作为核酸检出盒7022的表面。图55(b)是从核酸检出盒7022的背面侧观察而得的立体图。此外，在本实施方式中，将流路包装7001、上板7002、下板7003的叠层方向中的下板7003的外面作为核酸检出盒7022的背面。
[0828] 流路包装7001具备样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006、流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009、废液注射器7010。流路包装7001是具备表面(第1面)和表面的相反侧的背面(第2面)的薄型的板状。流路包装7001是样本注射器
7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006、流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009、废液注射器7010作为其一个部件而一体构成(一体成型)的。因此，流路包装7001可以削减部件点数。流路包装7001由例如硅氧烷、弹性橡胶等软质材料构成。此外，弹性橡胶是比硅氧烷密的材质，因此可以进一步防止液体的蒸发。
7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006、流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009、废液注射器7010作为其一个部件而一体构成(一体成型)的。因此，流路包装7001可以削减部件点数。流路包装7001由例如硅氧烷、弹性橡胶等软质材料构成。此外，弹性橡胶是比硅氧烷密的材质，因此可以进一步防止液体的蒸发。
[0829] 样本注射器7004是表面具备用于装填(注入)液体的样本(也称为成为检出对象的核酸、样本样品、核酸样品)的开口部、背面具备能够容易地变形的薄膜部的容器形状。因此，样本注射器7004可以通过从外部向薄膜部侧的加压而容易地变形、压扁。另一方面，样本注射器7004通过例如压扁的状态而装填液体，从而薄膜部侧膨胀。样本注射器7004可以贮存样本。
[0830] 洗涤注射器7005是表面具备用于装填洗涤液的开口部、背面具备能够容易地变形的薄膜部的容器形状。因此，洗涤注射器7005与样本注射器7004同样地，可以通过从外部向薄膜部侧的加压而容易地变形、压扁。另一方面，洗涤注射器7005通过例如压扁的状态而装填液体，从而薄膜部侧膨胀。洗涤注射器7005可以贮存用于杂交后的洗涤的洗涤液。
[0831] 嵌入剂注射器7006，洗涤注射器7005是表面具有用于装填电流检出时的氧化还原反应用的液体的嵌入剂(核酸检出中使用试剂液)的开口部、背面具备能够容易地变形的薄膜部的容器形状。因此，嵌入剂注射器7006与样本注射器7004同样地，可以通过从外部向薄膜部侧的加压而容易地变形、压扁。另一方面，嵌入剂注射器7006通过例如压扁的状态而装填液体，从而薄膜部侧膨胀。嵌入剂注射器7006可以贮存嵌入剂。
[0832] 流路7007连接样本注射器7004、洗涤注射器7005和嵌入剂注射器7006以及核酸检出流路7008。此外，流路7007进一步具备独立地分枝的流路7071、7072、7073。流路7007介由流路7071、7072、7073，而与样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006连接。另外，流路7007也与核酸检出流路7008连接。因此，流路7007是用于将样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006中贮存的液体送入(流入)核酸检出流路7008的流路。另外，在样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006各自与流路7007的连接部分别设置逆止阀7011a、7011b、7011c。逆止阀7011a、7011b、7011c分别具备防止液体从流路7007流入样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006的功能。进而，逆止阀7011a、7011b、7011c还分别具备防止除了从样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006的送液时以外的各液体的意外流出的功能。
[0833] 核酸检出流路7008例如，是设置在流路包装7001的背面的沟。核酸检出流路7008，液体的流入侧与流路7007连接，流出侧与废液流路7009连接。核酸检出流路7008是用于处理核酸提取、核酸扩增、杂交、到核酸检出的流路(区域)。
[0834] 废液流路7009连接核酸检出流路7008和废液注射器7010。废液流路7009是用于将从核酸检出流路7008流出的液体(废液)送入废液注射器7010的流路。
[0835] 废液注射器7010以流路包装7001的背面具备能够容易地变形的薄膜部的袋状构成。因此，废液注射器7010可以通过从外部向薄膜部侧的加压而容易地变形、压扁。废液注射器7010在通常时(废液流入之前)以薄膜预先被折叠、压扁(收缩)的状态构成。废液注射器7010在废液流入时，薄膜侧从压扁的状态开始膨胀。因此，废液注射器7010可以贮存从核酸检出流路7008流出的液体。
[0836] 根据上述的流路包装7001的构成，样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006经由流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009而与废液注射器7010连接。
[0837] 上板7002具备注入口7012a、7012b、7012c、核酸检出口7014、位置确定孔7015。上板7002由塑料、玻璃、金属等硬质材料构成。上板7002是薄型形状。上板7002与上述流路包装7001的表面相对(对向)，与流路包装7001的表面密合。即，上板7002用于密封(封闭)流路包装7001。
[0838] 注入口7012a、7012b、7012c分别设置于与样本注射器7004(其开口部)、洗涤注射器7005(其开口部)、嵌入剂注射器7006(其开口部)相对的位置。注入口7012a、7012b、7012c分别是在组装核酸检出盒7022后用于在样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006中装填液体的开口。注入口7012a、7012b、7012c在液体被装填到样本注射器
7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006之后，使用封盖7013封住。
7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006之后，使用封盖7013封住。
[0839] 核酸检出口7014在核酸检出盒7022的组装之后，不与流路包装7001相对地，设置于与在下板7003设置的基板7020a相对的位置。基板7020a与后述的核酸检出部7020连接，用于将由核酸检出部7020所检出的信号传达到后述的核酸检出基板7024。核酸检出口7014是用于在核酸检出时插入核酸检出基板7024的开口。
[0840] 位置确定孔7015如后述那样，是用于核酸检出盒7022的位置确定(位置调整)的开口。
[0841] 下板7003具备样本送液孔7016、洗涤送液孔7017、嵌入剂送液孔7018、废液用凹部7019、核酸检出部7020、温调孔7021。下板7003与上板7002同样地，由塑料、玻璃、金属等硬质材料构成。下板7003与上述流路包装7001的背面相对，与流路包装7001的背面密合。即，下板7003是薄型形状。下板7003用于与上板7002一起密封流路包装7001。
[0842] 样本送液孔7016在下板7003中设置于与样本注射器7004相对的位置。样本送液孔7016是确保即使在样本注射器7004中样本已满的情况下，也不妨碍样本注射器7004向下板7003侧膨胀的开口。因此，如图55所示，在核酸检出盒7022的背面侧，样本注射器7004的底部(薄膜部侧)通过样本送液孔7016而从下板7003内露出。
[0843] 洗涤送液孔7017在下板7003中设置在与洗涤注射器7005相对的位置。洗涤送液孔7017是确保即使在洗涤注射器7005中样本贮存已满的情况下，也不妨碍洗涤注射器7005向下板7003侧膨胀的开口。因此，如图55所示，在核酸检出盒7022的背面侧，洗涤注射器7005的底部(薄膜部侧)通过洗涤送液孔7017而从下板7003内露出。
[0844] 嵌入剂送液孔7018在下板7003中设置在与嵌入剂注射器7006相对的位置。嵌入剂送液孔7018是确保即使在嵌入剂注射器7006中样本贮存已满的情况下，也不妨碍嵌入剂注射器7006向下板7003侧膨胀的开口。因此，如图55所示，在核酸检出盒7022的背面侧，嵌入剂注射器7006的底部(薄膜侧)通过嵌入剂送液孔7018而从下板7003内露出。
[0845] 废液用凹部7019在与流路包装7001的表面相对的下板7003的面，设置在与废液注射器7010相对的位置。废液用凹部7019是确保即使在废液注射器7010中废液贮存已满的情况下，也不妨碍废液注射器7010向下板7003侧膨胀的凹部(间隙)。
[0846] 核酸检出部7020在与流路包装7001的背面相对的下板7003的面，设置在与核酸检出流路7009相对的位置。核酸检出部7020检出处理成为目标的核酸。核酸检出部7020是固定化了核酸探针的传感器区域。
[0847] 温调孔7021在与核酸检出盒7022的背面对应的面，设置在与核酸检出部7020相对的位置。即，核酸检出部7020通过温调孔7021而从下板7003内露出。温调孔7021是用于在核酸检出时对核酸检出部7020直接进行高精度的加热冷却的开口。
[0848] 如上所述，流路包装7001、上板7002、下板7003的3个部件以通过上板7002、下板7003夹持流路包装7001的形式组合。流路包装7001通过上板7002、下板7003而被加压，从而保持密封性。即，核酸检出盒7022是确保了流路包装7001的密封性的密封用器。核酸检出盒7022通过流路包装7001的密封性而能够防止核酸向外露出。此外，上板7002、下板7003的接合可以采用例如接合、溶接、上螺丝等各种方法，不限定。
[0849] 图56是显示成为使用本实施方式的核酸检出盒7022的核酸检出装置7100的一例的概略构成的立体图。此外，在本实施方式中，将核酸检出盒7022和核酸检出装置7100作为各自构成进行说明，但核酸检出装置7100可以包含核酸检出盒7022。
[0850] 核酸检出装置7100具备盒架7023、核酸检出基板7024、位置确定销7025、核酸检出基板前后机构7026、加热冷却装置7027、加热冷却装置前后机构7028、样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031、杆前后机构(移动机构)7032、弹簧7033a、7033b、7033c。
[0851] 盒架7023设置在核酸检出装置7100的中央附近。盒架7023保持核酸检出盒7022。盒架7023例如是能够插拔核酸检出盒7022的槽。
[0852] 核酸检出基板7024设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与核酸检出口7014相对的位置。核酸检出基板7024是对核酸检出口7014可以插拔的大小。核酸检出基板7024是用于通过获得由核酸检出部7020检出的信号而进行核酸检出，判定目标的核酸的有无的基板。
[0853] 位置确定销7025设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与位置确定孔7015相对的位置。位置确定销7025相对于核酸检出装置7100确定核酸检出盒7022的位置。
[0854] 核酸检出基板前后机构7026搭载核酸检出基板7024、位置确定销7025。核酸检出基板前后机构7026将核酸检出基板7024、位置确定销7025作为一体而可以同时向前后方向移动。此外，在本实施方式中，将相对于核酸检出盒7022(或盒架7023)靠近的方向、或远离的方向作为前后方向。核酸检出基板前后机构7026对核酸检出盒7022的背面嵌入核酸检出基板7024和位置确定销7025。核酸检出基板7024通过核酸检出口7014而与下板7003的基板接触。位置确定销7025通过插入位置确定孔7015而相对于核酸检出装置7100确定核酸检出盒7022的位置。
[0855] 加热冷却装置7027设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与温调孔7021相对的位置。加热冷却装置7027是对温调孔7021可以插拔的大小。加热冷却装置7027将核酸检出部7020(与其相对的核酸检出流路7008)控制在最适的温度。
[0856] 加热冷却装置前后机构7028搭载加热冷却装置7027。即，加热冷却装置7027和加热冷却装置前后机构7028夹住盒架7023而设置在核酸检出基板前后机构7026的相反侧。加热冷却装置前后机构7028使加热冷却装置7027可以向前后方向移动。核酸检出基板前后机构7026对核酸检出盒7022的背面嵌入加热冷却装置7027。加热冷却装置7027通过嵌入温调孔7021中而与核酸检出部7020接触。
[0857] 样本送液杆7029设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与样本送液孔7016相对的位置。样本送液杆7029具备介由样本送液孔7016而对样本注射器7004的薄膜部加压，将样本注射器7004内的样本送入流路7007的功能。样本送液杆7029在与核酸检出盒7022相对的顶端部分具备与前后方向垂直的面。样本送液杆7029的顶端部分的面为与样本送液孔7016的形状大略相同的形状。样本送液杆7029的顶端部分的前后方向的宽度与在核酸检出盒7022的表面背面方向从核酸检出盒7022背面到样本注射器7004的开口部(与其接触的上板7002的面)的距离大略相同。因此，样本送液杆7029可以将样本注射器
7004的薄膜部完全压扁，从而可以将样本注射器7004内的样本全部送入流路7007。
7004的薄膜部完全压扁，从而可以将样本注射器7004内的样本全部送入流路7007。
[0858] 洗涤送液杆7030设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与洗涤送液孔7017相对的位置。洗涤送液杆7030具备介由洗涤送液孔7017而对洗涤注射器7005的薄膜部加压，将洗涤注射器7005内的样本送入流路7007的功能。洗涤送液杆7030在与核酸检出盒7022相对的顶端部分具备与前后方向垂直的面。洗涤送液杆7030的顶端部分的面是与洗涤送液孔7017的形状大略相同的形状。洗涤送液杆7030的顶端部分的前后方向的宽度与在核酸检出盒7022的表面背面方向从核酸检出盒7022背面到洗涤注射器7005的开口部(与其接触的上板7002的面)的距离大略相同。因此，洗涤送液杆7030可以将洗涤注射器
7005的薄膜部完全压扁，从而可以将洗涤注射器7005内的样本全部送入流路7007。
7005的薄膜部完全压扁，从而可以将洗涤注射器7005内的样本全部送入流路7007。
[0859] 嵌入剂送液杆7031设置在核酸检出盒7022插入盒架7023时与嵌入剂送液孔7018相对的位置。嵌入剂送液杆7031具备介由嵌入剂送液孔7018而对嵌入剂注射器7006的薄膜部加压，将嵌入剂注射器7006内的样本送入流路7007的功能。嵌入剂送液杆7031在与核酸检出盒7022相对的顶端部分具备与前后方向垂直的面。嵌入剂送液杆7031的顶端部分的面为与洗涤送液孔7017的形状大略相同的形状。嵌入剂送液杆7031的顶端部分的前后方向中的宽度，与在核酸检出盒7022的表面背面方向从核酸检出盒7022背面到嵌入剂注射器7006的开口部(与其接触的上板7002的面)的距离大略相同。因此，嵌入剂送液杆7031可以将嵌入剂注射器7006的薄膜部完全压扁，从而可以将嵌入剂注射器7006内的嵌入剂全部送入流路7007。
[0860] 杆前后机构7032搭载样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031。即，样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031、杆前后机构7032夹着盒架7023而设置在核酸检出基板前后机构7026的相反侧。杆前后机构7032可以将样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031作为一体而同时地相对于核酸检出盒7022向前后方向移动。杆前后机构7032将样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆703推到核酸检出盒7022的背面。样本送液杆7029通过样本送液孔7016而与样本注射器7004的薄膜部接触，进行加压。同样地，洗涤送液杆7030通过洗涤送液孔7017而与洗涤注射器7005的薄膜部接触，进行加压。嵌入剂送液杆7031通过嵌入剂送液孔7018而与嵌入剂注射器7006的薄膜部接触，进行加压。
[0861] 这里，关于杆前后机构7032中的样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031的搭载位置关系进行说明。关于样本送液杆7029、洗涤送液杆7030的搭载位置关系如下。在样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031的任一者与核酸检出盒7022相接之前，样本送液杆7029的顶端部分比洗涤送液杆7030的顶端部分在前后方向离核酸检出盒7022近规定的距离地设置。这里规定距离例如为样本送液杆7029的顶端部分的宽度以上的距离。即，样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031向核酸检出盒7022移动时，在样本送液杆7029将样本注射器7004的薄膜部完全压扁、将样本注射器7004内的样本全部送入流路7007之前，洗涤送液杆7030不会开始与洗涤注射器7005的薄膜部接触而将洗涤注射器7005内的洗涤剂送入流路7007。
[0862] 关于洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031的搭载位置关系如下。相同条件下，洗涤送液杆7030的顶端部分比嵌入剂送液杆7031的顶端部分在前后方向离核酸检出盒7022近规定的距离地设置。这里规定距离例如为洗涤送液杆7030的顶端部分的宽度以上的距离。即，样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031向核酸检出盒7022移动时，在洗涤送液杆7030将洗涤注射器7005的薄膜部完全压扁、将洗涤注射器7005内的洗涤剂全部送入流路7007之前，嵌入剂送液杆7031不会开始与嵌入剂注射器7006的薄膜部接触而将嵌入剂注射器7006内的嵌入剂送入流路7007。
[0863] 根据上述的关系，关于样本送液杆7029、嵌入剂送液杆7031的搭载位置关系也如下。相同条件下，样本送液杆7029的顶端部分比嵌入剂送液杆7031的顶端部分在前后方向离核酸检出盒7022近规定的距离地设置。
[0864] 弹簧7033a、7033b、7033c分别设置在样本送液杆7029、洗涤送液杆7030和嵌入剂送液杆7031以及杆前后机构7032之间。弹簧7033a、7033b、7033c具备能够沿前后方向(杆前后机构7032的移动方向)伸缩的弹性。
[0865] 弹簧7033a、7033b、7033c分别通过样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031与核酸检出盒7022的接触而向前后方向收缩。此外，可以使用其他弹性体来代替弹簧7033。另外，也可以使用通过样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂送液杆7031与核酸检出盒7022的接触而向前后方向收缩的机械构成来代替弹簧7033a、7033b、7033c。
[0866] 接着，对于本实施方式的核酸检出盒7022、核酸检出装置7100的使用步骤(方法)和使用它们的核酸检出的步骤的一例进行说明。此外，下述所说明的步骤是一例，可以适宜替换。
[0867] 首先，对于核酸检出盒7022的准备步骤的一例进行说明。如图55所示，介由注入口7012a、7012b、7012c分别在密封的核酸检出盒7022的样本注射器7004中装填样本，在洗涤注射器7005中装填洗涤液，在嵌入剂注射器7006中装填嵌入剂。注入口7012使用封盖7013封上。核酸检出盒7022以设置了样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006的部分为上侧，以上板7002与核酸检出基板7024相对的方式插入盒架7023。
[0868] 接着，对于核酸检出盒7022插入了盒架7023的核酸检出装置7100的使用步骤的一例进行说明。
[0869] 首先，使核酸检出基板前后机构7026工作。核酸检出基板前后机构7026使核酸检出基板7024、位置确定销7025向着核酸检出盒7022前进。核酸检出基板前后机构7026使核酸检出基板7024移动至检出位置(下板7003的与基板7020a接触的位置)。与此同时，核酸检出基板前后机构7026使位置确定销7025移动至核酸检出盒7022的位置确定孔7015而插入。通过位置确定销7025插入位置确定孔7015而确定核酸检出盒7022相对于核酸检出装置7100的位置。
[0870] 接着，使加热冷却装置前后机构7028工作。加热冷却装置前后机构7028使加热冷却装置7027向着核酸检出盒7022前进。加热冷却装置前后机构7028通过温调孔7021而移动至使加热冷却装置7027与核酸检出部7020接触的位置。
[0871] 接着，使杆前后机构7032工作。杆前后机构7032使样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂杆7031向着核酸检出盒7022前进。杆前后机构7032通过样本送液孔7016而将样本送液杆7029推到样本注射器7004。样本注射器7004如上所述为薄膜结构且容易变形。因此，样本通过样本送液杆7029的加压而经由流路7007被送出到核酸检出流路
7008。杆前后机构7032使样本送液杆7029前进，直到将样本注射器7004完全压扁而将全部的样本送入流路7007。此外，洗涤送液杆7030的顶端部分、嵌入剂送液杆7031的顶端部分通过如上述所述的与样本送液杆7029的顶端部分的位置关系，而与洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006分别相接。
7008。杆前后机构7032使样本送液杆7029前进，直到将样本注射器7004完全压扁而将全部的样本送入流路7007。此外，洗涤送液杆7030的顶端部分、嵌入剂送液杆7031的顶端部分通过如上述所述的与样本送液杆7029的顶端部分的位置关系，而与洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006分别相接。
[0872] 此时，核酸检出流路7008内的空气被样本挤出，经由废液流路7009而流入废液注射器7010。废液注射器7010通过流入的空气而内部压力上升，稍微膨胀。废液注射器7010通过膨胀而确保用于废液流入的容量。此外，样本注射器7004的容量与充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009的量为大略相同的量。因此，从样本注射器7004送出到流路7007的全部的样本充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009，但不会流出到废液注射器7010。
[0873] 接着，使加热冷却装置前后机构7028工作。加热冷却装置前后机构7028使加热冷却装置7027向着核酸检出盒7022前进。加热冷却装置前后机构7028介由温调孔7021而使加热冷却装置7027与核酸检出部7020接触。接着，使加热冷却装置7027工作而加热样本。核酸检出流路7008的内壁预先固定有扩增用引物，因此通过加热而引物向样本内溶出。在核酸检出流路7008中进行核酸扩增的同时，进行向固定化于核酸检出部7020的探针电极的杂交。
[0874] 接着，再次使杆前后机构7032工作。杆前后机构7032使样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂杆7031向着核酸检出盒7022前进。杆前后机构7032通过洗涤送液孔7017而将洗涤送液杆7030推到洗涤注射器7005。此外，样本送液杆7029如上所述，以通过弹簧7033a而自由伸缩的方式构成。因此，即使杆前后机构7032使样本送液杆7029进一步向核酸检出盒7022侧，样本送液杆7029也由于弹簧7033收缩，而不会破坏核酸检出盒7022。
[0875] 另外，洗涤注射器7005如上所述，为薄膜结构且容易变形。因此，洗涤液通过洗涤送液杆7030的加压而经由流路7007被送出到核酸检出流路7008。洗涤液洗涤核酸检出流路7008。杆前后机构7032使洗涤送液杆7030前进，直至将洗涤注射器7005完全压扁而将全部的样本送入流路7007。此外，嵌入剂送液杆7031的顶端部分通过如上述所述的与洗涤送液杆7030的顶端部分的位置关系，而不与嵌入剂注射器7006相接。
[0876] 此外，洗涤注射器7005的容量与充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009的量为大略相同的量。因此，从洗涤注射器7005送出到流路7007的全部的洗涤液将充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009的样本挤出到废液注射器7010，代替地充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009。即，核酸检出流路7008内的样本通过废液流路7009而全部流入废液注射器7010。此外，洗涤液充满流路7007、核酸检出流路
7008、废液流路7009，但不会流出到废液注射器7010。废液注射器7010由于容易膨胀，因而由于流入的样本而进一步膨胀。
7008、废液流路7009，但不会流出到废液注射器7010。废液注射器7010由于容易膨胀，因而由于流入的样本而进一步膨胀。
[0877] 接着，再次使杆前后机构7032工作。杆前后机构7032使样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂杆7031向着核酸检出盒7022前进。杆前后机构7032通过嵌入剂送液孔7018而将嵌入剂送液杆7031推到嵌入剂注射器7006。此外，洗涤送液杆7030如上所述，以通过弹簧707033b而自由伸缩的方式构成。因此，即使杆前后机构7032使洗涤送液杆7030再次进一步向核酸检出盒7022侧移动，洗涤送液杆7030也由于弹簧707033b收缩，而不会破坏核酸检出盒7022。
[0878] 另外，嵌入剂注射器7006如上所述，为薄膜结构且容易变形。因此，嵌入剂通过嵌入剂送液杆7031的加压而经由流路7007被送入核酸检出流路7008。在核酸检出流路7008内，通过嵌入剂而进行核酸检出反应。杆前后机构7032使嵌入剂送液杆7031前进，直至将嵌入剂注射器7006完全压扁而将全部的样本送入流路7007。
[0879] 此外，嵌入剂注射器7006的容量与充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009的量为大略相同的量。因此，从嵌入剂注射器7006送出到流路7007的全部的嵌入剂，将充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009的洗涤液挤出到废液注射器7010，代替地充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009。即，核酸检出流路7008内的洗涤液通过废液流路7009而全部流入废液注射器7010。此外，嵌入剂充满流路7007、核酸检出流路7008、废液流路7009，但不会流出到废液注射器7010。废液注射器7010容易膨胀，因而由于流入的洗涤液而进一步膨胀。
[0880] 如上所述，杆前后机构7032通过并设的样本送液杆7029、洗涤送液杆7030、嵌入剂杆7031而以此压扁样本注射器7004、洗涤注射器7005、嵌入剂注射器7006，从而依次向核酸检出流路7008送液。从核酸检出流路7008排出的废液通过压力上升而废液用注射器7010自然膨胀，从而被送液至废液用注射器7010。
[0881] 此外，自不待言，进行上述的一系列的核酸扩增到核酸检出反应的工作时，使用加热冷却装置7027将核酸检出部7020控制为最适的温度。核酸检出反应结束后，使用核酸检出基板7024进行核酸检出，判定目标核酸的有无。
[0882] 此外，在本实施方式中，对于弹簧707033c设置在嵌入剂送液杆7031与杆前后机构7032之间的例子进行了说明，但也可以不设置弹簧707033c。这是因为，杆前后机构7032在嵌入剂送液杆7031将嵌入剂注射器7006内的嵌入剂全部送入流路7007中之后，不会进一步向核酸检出盒7022侧移动。另外，在本实施方式中，对于核酸检出盒7022具备洗涤注射器7005的例子进行了说明，但核酸检出盒7022也可以不具备洗涤注射器7005。这是因为，洗涤液用于提高目标核酸的检出精度，对从核酸扩增到核酸检出反应的处理不是必须的。此时，核酸检出盒7022不必要具备逆止阀7011b、注入口707012b、洗涤送液孔7017，核酸检出装置7100不必要具备洗涤送液杆7030、弹簧707033c。
[0883] 根据本实施方式，可以以极简易的构成、通过廉价的小型密封型的核酸检出盒7022和使用该检出盒的核酸检出装置7100，将从核酸扩增到目标核酸的检出一贯地自动处理。
[0884] 对于本发明的几个实施方式进行说明，但这些实施方式是作为例子提示，并不限定发明的范围。这些新的实施方式可以通过其他各种方式实施，在不脱离发明的要旨的范围内，可以进行各种省略、替换、变更。这些实施方式和/或其变形包含在发明的范围和/或要旨中，同时也包含在权利要求书所记载的发明和与其均等的范围中。
[0885] 还包含如下的实施方式。
[0886] [1]多核酸扩增反应用具，具备：以支持液相的反应场的方式构成的支持体；和按每个种类能够游离地固定于在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的所述支持体的至少1个面的彼此独立的多个固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。
[0887] [2]根据上述[1]所述的多核酸扩增反应用具，所述支持体具有容器形态或流路形态。
[0888] [3]多核酸扩增反应载体，具备：基体；和按每个种类能够游离地固定化于所述基体的至少1个表面的彼此独立的多个固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。
[0889] [4]多核酸扩增方法，具备：在支持体的至少1个面的彼此独立的多个固定化区域，将用于分别扩增多个种类的目标核酸的多个种类的引物组，按每个种类能够游离地进行固定的步骤，所述支持体是以支持液相的1个反应场的方式构成的，所述至少1个面是在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的面；
[0890] 对所述支持体添加用于进行核酸扩增的反应液而形成1个反应场的步骤；
[0891] 和在所述1个反应场中对于所述多个种类的目标核酸分别进行扩增反应的步骤。
[0892] [5]多核酸反应用具，具备：以支持液相的反应场的方式构成的支持体；独立地配置于在由所述液相形成所述反应场时与所述反应场相接的所述支持体的至少1个面的多个引物固定化区域；按每个种类能够游离地独立地固定于所述多个引物固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组；能够游离地固定于所述引物固定化区域的增稠剂。
[0893] [6]根据上述[5]所述的多核酸扩增反应用具，进一步具备安装在所述支持体的支持所述反应场的面的覆盖体，该多核酸反应用具中，所述覆盖体具有在与所述支持体的至少包含全部的引物固定化区域的区域对应的部分形成的沟部、和在所述沟部的一端和另一端分别开口的贯通孔，通过所述覆盖体的所述沟部和所述支持体的支持所述反应部的面而形成反应部。
[0894] [7]根据上述[1]或[2]所述的多核酸反应用具，进一步具备：配置于所述多个引物固定化区域的附近的多个探针固定化区域、和固定化于所述多个探针固定化区域的多种探针核酸。
[0895] [8]根据上述[5]～[7]的任一项所述的多核酸反应用具，所述增稠剂是琼脂或明胶。
[0896] [9]根据[1]～[8]的任一项所述的多核酸反应用具，所述增稠剂以覆盖所述引物的方式被固定。
[0897] [10]根据上述[5]～[9]的任一项所述的多核酸反应用具，所述增稠剂与所述引物一起被固定于所述引物固定化区域。
[0898] [11]多核酸反应载体，具备：支持体；按每个种类能够游离地固定化于所述支持体的至少1个表面的彼此独立的多个引物固定化区域的、以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组；和在所述引物固定化区域能够游离地固定化的增稠剂。
[0899] [12]根据上述[11]所述的多核酸反应载体，进一步具备：配置于所述多个引物固定化区域的附近的多个探针固定化区域；和固定化于所述多个探针固定化区域的多种探针核酸。
[0900] [13]根据[11]或[12]所述的多核酸反应载体，所述增稠剂是琼脂或明胶。
[0901] [14]根据上述[11]～[13]的任一项所述的多核酸反应载体，所述增稠剂以覆盖所述引物的方式被固定化。
[0902] [15]根据上述[11]～[13]的任一项所述的多核酸反应载体，所述增稠剂与所述引物一起被固定化于所述引物固定化区域。
[0903] [16]多核酸反应用具，具备：板状的支持体；固定于所述支持体的1个面的、在所述支持体侧的面开口沿轴方向延伸的沟部的覆盖体；由所述覆盖体的所述沟部和所述支持体的所述1个面构成的流路；开口于所述流路的一端的第1贯通孔；开口于所述流路的另一端的第2贯通孔；分别能够游离地固定于所述流路内壁的引物固定化区域的多种引物组；和能够游离地固定于所述引物固定化区域的增稠剂，
[0904] 该多核酸扩增反应用具中，所述多种引物组按每个种类而独立地固定于引物固定化区域，1种引物组包含用于扩增1种目标核酸的多种引物。
[0905] [17]根据上述[16]所述的多核酸反应用具，进一步具备：配置于所述多个引物固定化区域的附近的多个探针固定化区域、和固定化于所述多个探针固定化区域的多种探针核酸。
[0906] [17]多核酸反应方法，具备以下(a)、(b)和(c)的步骤，
[0907] (a)准备多核酸反应用具的步骤，所述多核酸反应用具具备：板状的支持体；固定于所述支持体的1个面的、在所述支持体侧的面开口沿轴方向延伸的沟部的覆盖体；由所述覆盖体的沟部和所述支持体的所述1个面构成的流路；开口于所述流路的一端的第1贯通孔；开口于所述流路的另一端的第2贯通孔；彼此独立地配置于所述流路内壁的多个引物固定化区域；分别能够游离地固定于所述多个引物固定化区域的多种引物组；和能够游离地固定于所述引物固定化区域的增稠剂，
[0908] 这里，所述多种引物组按每个种类而独立地独立地固定于引物固定化区域，1种引物组包含用于扩增1种目标核酸的多种引物，
[0909] (b)从所述第1开口部对所述流路添加包含目标核酸的反应液的步骤，
[0910] (c)扩增所述目标核酸的步骤。
[0911] [19]多核酸反应方法，具备以下(a)、(b)和(c)的步骤，
[0912] (a)准备多核酸反应用具的步骤，所述多核酸反应用具具备：板状的支持体；固定于所述支持体的1个面的、在所述支持体侧的面开口沿轴方向延伸的沟部的覆盖体；由所述覆盖体的沟部和所述支持体面的所述1个面构成的流路；开口于所述流路的一端的第1贯通孔；开口于所述流路的另一端的第2贯通孔；彼此独立地配置于所述流路内壁的多个引物固定化区域；和分别能够游离地固定于所述多个引物固定化区域的多种引物组，[0913] 这里，所述多种引物组按每个种类而独立地固定于引物固定化区域，1种引物组包含用于扩增1种目标核酸的多种引物，
[0914] (b)从所述第1开口部对所述流路添加包含目标核酸和增稠剂的反应液的步骤，[0915] (c)扩增所述目标核酸的步骤。
[0916] [20]根据上述[18]或[19]所述的多核酸反应方法，进一步具备(e)检出所述(c)中得到的扩增产物与所述探针核酸的杂交信号的步骤，
[0917] 并且所述多核酸反应用具进一步具备：配置于所述多个引物固定化区域各自的附近的多个探针固定化区域、和固定化于所述多个探针固定化区域的探针核酸。
[0918] [21]根据上述[18]～[20]所述的多核酸反应方法，在将所述引物组固定化于所述引物固定化区域之后，将所述增稠剂固定于所述引物固定化区域。
[0919] [22]根据上述[18]～[21]所述的多核酸反应方法，对所述引物固定化区域固定化所述引物组与所述增稠剂的混合物。
[0920] [23]根据上述[18]～[22]的任一项所述的多核酸反应方法，所述反应液的添加通过10mm/秒以上的流速来进行。
[0921] [24]核酸检出用器件，具备在第1面具有沟部的第1部件，
[0922] 所述沟部具备用于核酸样品反应的流路型室，
[0923] 所述流路型室的剖面积，大于所述沟部中的除了所述流路型室以外部分的剖面积。
[0924] [25]根据上述[24]所述的核酸检出用器件，所述流路型室的深度，深于所述沟部中的所述流路型室以外的区域的深度。
[0925] [26]根据上述[24]所述的核酸检出用器件，所述流路型室的宽度，宽于所述沟部中的所述流路型室以外的区域的宽度。
[0926] [27]根据上述[24]所述的核酸检出用器件，所述流路型室的剖面积和除了所述流路型室以外的所述沟部的剖面积，是基于与所述第1面垂直的面的剖面积。
[0927] [28]根据上述[24]所述的核酸检出用器件，多个所述流路型室，保持以分别扩增多个种类的目标序列的方式构成的多个种类的引物组。
[0928] [29]根据上述[24]所述的核酸检出用器件，所述流路型室在壁面保持所述引物组。
[0929] [30]根据上述[24]～[29]的任一项所述的核酸检出用器件，具备与所述第1部件的所述第1面对向的第2部件，所述第2部件在与所述沟部对向的位置具备核酸检出用的电极。
[0930] [31]使用上述[24]～[30]的任一项所述的核酸检出用器件的核酸检出装置，[0931] 该核酸检出装置中，基于来自所述电极的电流值来检出核酸。
[0932] [32]核酸检出用器件，具备：基板；在所述基板上形成的核酸检出用的传感器部；在所述基板上形成的、与所述传感器连接的配线；和在所述基板上形成的保护膜，[0933] 该核酸检出用器件在用于所述传感器部与核酸样品反应的室内进行核酸扩增反应，然后通过所述传感器部进行核酸扩增产物的检出，
[0934] 在该核酸检出用器件中，所述保护膜具备在所述基板上的所述核酸样品的接液区域使包含一部分所述基板的下层部露出的1个以上的开口。
[0935] [33]根据上述[32]所述的核酸检出用器件，所述传感器部是电极。
[0936] [34]根据上述[32]所述的核酸检出用器件，所述保护膜在所述接液区域覆盖所述配线。
[0937] [35]根据上述[34]所述的核酸检出用器件，所述保护膜覆盖所述传感器部的外周部分。
[0938] [36]根据上述[32]所述的核酸检出用器件，所述保护膜以在所述接液区域划分设置于所述传感器部附近的开口、和设置于与所述传感器部邻接的其他传感器部附近的开口的方式，覆盖所述基板。
[0939] [37]根据上述[32]所述的核酸检出用器件，所述传感器部由1个以上的传感器构成。
[0940] [38]核酸反应用具，具备：基体；彼此独立地配置于所述基体的至少1个表面的多个第1电极；分别固定于所述多个第1电极上的探针核酸；与所述多个第1电极对应地多个配置的检出信号取出部；连接所述多个第1电极和与它们对应的所述检出信号取出部的导线；和覆盖所述导线表面和所述基体的所述至少1个表面的露出部分的保护膜，[0941] 所述保护膜是选自聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚1,1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅和金属氧化物中的至少1种。
[0942] [39]根据上述[38]所述的核酸反应用具，进而具备：配置于所述基体的所述至少1个表面的与所述多个第1电极相同的位置或其附近的多个引物固定化区域；和能够游离地按每个种类而固定于所述引物固定化区域的多种引物组。
[0943] [40]根据上述[38]或[39]所述的核酸反应用具，所述基体是板状形体。
[0944] [41]根据上述[40]所述的核酸反应用具，所述第2电极彼此独立地配置与所述基体的所述至少1个表面的与配置了所述第1电极的区域不同的区域。
[0945] [42]根据上述[38]～[40]的任一项所述的核酸反应用具，进一步具备：以覆盖包含所述探针核酸固定化区域和所述引物固定化区域的区域的方式，安装于所述基体的覆盖体。
[0946] [43]核酸反应用具，具备：基体；覆盖所述基体的所述至少1个表面的露出部分的保护膜；和在所述保护膜上彼此独立地配置的多种引物组，
[0947] 所述保护膜是选自聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚1,1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯基缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯/丙烯腈共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚和聚砜、以及玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石、碳化硅和金属氧化物中的至少1种。
[0948] [44]根据上述[38]～[43]的任一项所述的核酸反应用具，所述保护膜包含酚醛清漆树脂、环氧树脂、聚烯烃树脂和硅树脂。
[0949] [45]核酸检出盒，具备：
[0950] 由软质材料一体构成的流路包装，该流路包装具备：核酸检出流路；贮存核酸样品的第1注射器；贮存核酸检出中使用的试剂液的第2注射器；贮存从所述核酸检出流路流出的液体的第3注射器；连接所述第1注射器和所述第2注射器以及所述核酸检出流路的第1流路；连接所述核酸检出流路和所述第3注射器的第2流路；
[0951] 由硬质材料构成的、与所述流路包装的第1面相对的第1板；
[0952] 由硬质材料构成的、与所述第1面的相反侧的第2面相对并与所述第1板一起密封所述流路包装的第2板。
[0953] [46]根据上述[45]所述的核酸检出盒，所述第1注射器和所述第2注射器在所述第2面具备能够容易地变形的薄膜部。
[0954] [47]根据上述[46]所述的核酸检出盒，所述下板在与所述1的注射器相对的位置具备第1开口部，在与所述第2注射器相对的位置具备第2开口部，在与所述核酸检出流路相对的位置具备对成为目标的核酸进行检出处理的核酸检出部。
[0955] [48]根据上述[47]所述的核酸检出盒，所述第1注射器的容量和所述第2注射器的容量与充满所述核酸检出流路、所述第1流路、所述第2流路的量为大略相同的量。
[0956] [49]根据上述[48]所述的核酸检出盒，所述第1流路具备：防止液体流入所述第1注射器内的第1逆止阀、和防止液体流入所述第2注射器内的第2逆止阀。
[0957] [50]使用上述[47]～[49]的任一项所述的所述核酸检出盒的核酸检出装置，该核酸检出装置具备：
[0958] 保持所述的核酸检出盒的架；
[0959] 介由所述第1开口部对所述第1注射器加压的第1杆；
[0960] 介由所述第2开口部对所述第2注射器加压的第2杆；
[0961] 以所述第1杆的顶端部分比所述第2杆的顶端部分离所述核酸检出盒近规定距离的方式搭载所述第1杆和所述第2杆，使所述第1杆和所述第2杆能够相对于所述核酸检出盒移动的移动机构。
[0962] [51]根据上述[50]所述的核酸检出装置，所述第1杆和所述第2杆以及移动机构之间具备在所述移动机构的移动方向具有弹性的弹性体。
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