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用于免疫抗分枝杆菌的组合物

阅读：1018发布：2020-07-26

专利汇可以提供用于免疫抗分枝杆菌的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于产生宿主T细胞免疫反应的方法，该方法包括施用包含非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗，所述病毒载体表达分枝杆菌抗原 85A基因的翻译产物。还提供了载体疫苗及其用途。还提供了使用腺病毒载体诱导针对抗原的CD8和CD4记忆T细胞反应的方法，所述腺病毒载体表达抗原或其免疫原性片段。，下面是用于免疫抗分枝杆菌的组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种在人类患者中诱导针对至少一种抗原的T细胞免疫反应的方法，该方法包括给所述患者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性组合物是载体疫苗。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞免疫反应是CCR7+反应。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述非复制或复制受损的病毒载体选自：痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、甲病毒属、黄病毒属和流感病毒组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非复制的病毒载体是MVA。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述非复制的病毒载体是腺病毒载体。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述病毒载体表达带有PK羧基端标签的Ag85A。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述病毒载体表达带有TPA前导序列的Ag85A。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述病毒载体表达带有截短的羧基端的Ag85A。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述病毒载体表达SEQ ID NO：5的翻译产物。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述病毒载体进一步表达来自分枝杆菌的至少一种附加抗原基因的翻译产物。
12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述免疫原性组合物与至少一种附加抗原和/或抗微生物剂一起施用。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种附加抗原和/或抗微生物剂同时、分开或顺序施用。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述反应是抗原特异性免疫反应。
15.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述反应是治疗性的或预防性的。
16.免疫原性组合物在制备用于通过在患者中诱导T细胞免疫反应而治疗或预防所述患者分枝杆菌疾病的药剂中的用途，所述免疫原性组合物包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。
17.免疫原性组合物在制备用于通过在患者中诱导T细胞免疫反应而治疗或预防所述患者分枝杆菌疾病和至少一种其他疾病的药剂中的用途，所述免疫原性组合物包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体和至少一种附加抗原基因的翻译产物。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述免疫原性组合物进一步诱导针对衍生所述病毒载体的病毒的T细胞免疫反应。
19.包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的免疫原性组合物在制备用于通过诱导T细胞免疫反应而治疗或预防患者至少一种疾病的药剂中的用途，其中所述药剂与至少一种附加抗原一起施用。
20.抗原在制备用于通过诱导T细胞免疫反应而治疗患者疾病的药剂中的用途，其中所述药剂与包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的免疫原性组合物一起施用。
21.根据权利要求1至15任一项所述的方法或者权利要求16至20任一项所述的用途，其中所述T细胞反应保护性抵抗疾病，所述疾病选自：结核病、麻风病、鸟分枝杆菌感染、非结核分枝杆菌感染、布鲁利溃疡、牛分枝杆菌感染或疾病、天花、猴痘、副结核分枝杆菌感染、炎性肠病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌症和膀胱癌组成的组。
22.根据权利要求1至15任一项所述的方法或者权利要求16至20任一项所述的用途，其中所述患者选自：儿童，患有HIV感染或AIDS的患者，免疫妥协的患者，或经历过器官移植的患者组成的组。
23.根据权利要求1至15任一项所述的方法或者权利要求16至20任一项所述的用途，其中所述患者之前已经暴露于分枝杆菌。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述患者之前已经暴露于结核分枝杆菌。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述患者潜伏感染了所述分枝杆菌。
26.根据权利要求1至15任一项所述的方法或者权利要求16至20任一项所述的用途，其中所述患者已经使用BCG预处理。
27.一种载体疫苗，其包含表达核苷酸序列SEQ ID NO：4的翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。
28.根据权利要求27所述的载体疫苗，其中所述病毒载体表达另外包括PK羧基端标签的核苷酸序列SEQ ID NO：4的翻译产物。
29.根据权利要求27或28所述的载体疫苗，其中所述病毒载体表达另外包括TPA前导序列的核苷酸序列SEQ ID NO：4的翻译产物。
30.根据权利要求29所述的载体疫苗，其中所述病毒载体表达核苷酸序列SEQ ID NO：
5的翻译产物。
31.根据权利要求27至30任一项所述的载体疫苗，其中所述非复制或复制受损的病毒载体选自：痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、甲病毒属、黄病毒属和流感病毒组成的组。
32.根据权利要求31所述的载体疫苗，其中所述非复制的病毒载体是MVA。
33.根据权利要求31所述的载体疫苗，其中所述非复制的病毒载体是腺病毒载体。
34.根据权利要求27至33任一项所述的载体疫苗，其中所述病毒载体还表达来自分枝杆菌的至少一种附加抗原基因的翻译产物。
35.一种诱导针对抗原的CD 8和CD4记忆T细胞反应的方法，其使用表达抗原或其免疫原性片段的腺病毒载体。
36.表达抗原或其免疫原性片段的腺病毒载体在制备用于诱导针对所述抗原的CD 8和CD4记忆T细胞反应的药剂中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述药剂用于治疗或预防分枝杆菌疾病。
38.根据权利要求35所述的方法或根据权利要求36或37所述的用途，其中所述抗原是Ag85A。

说明书全文

用于免疫抗分枝杆菌的组合物

[0001] 本发明涉及一种用于产生宿主T细胞免疫反应的方法。该方法包括施用载体疫苗的步骤，所述载体疫苗包含非复制或复制受损的病毒载体，所述病毒载体表达分枝杆菌抗原85A基因(在本文还称为“Ag85A”基因)的翻译产物。

[0002] 本文引用的所有公布、专利和专利申请通过引用全部结合入本文。

[0003] 发明背景

[0004] 结核病是由呼吸病原体结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)引起的，每年导致2百万人死亡，主要在发展中世界(http://www.who.int/gtb/
publications/globrep01/index.html)。唯一得到许可的抗结核分枝杆菌的疫苗，即卡介苗(BCG)(Calmette，A.，C.Guerin.(1924)Ann.Inst.Pasteur.38：371)，是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的减毒株，其在发展中国家通常作为单次剂量皮内施用于新生儿。许多研究的综述表明，BCG免疫保护性抵抗儿童脑膜结核和系统形式的疾病。然而，针对全球主要的结核病死亡原因——成人肺部疾病的保护效力是可变的(范围为0-80％)
(Colditz，G.A.等，(1994).JAMA 271：698)，并随时间而减弱(Sterne，J.A.等，(1998)Int.J.Tuberc.Lung Dis.2：200)。变化的基础是不确定的。即使如此，每年全球有80％的婴儿接受BCG(http://www.who.int/inf-fs/en/fact 104.html)。

[0005] 结核分枝杆菌是一种细胞内病原体，对抗其的保护效力与以下因素有关：保持强烈的细胞介导的对感染的反应，所述反应涉及CD4+和CD8+T细胞；和与Th1-型细胞因子(特别是IFN-γ)反应的能力(Flynn，J.L.，J.Chan.(2001)Annu.Rev.Immunol.19：93)。BCG免疫诱导分泌IFN-γ的T细胞，主要是CD4+T细胞表型，其与结核分枝杆菌蛋白交叉反应(Launois P等，(1994)Infection and Immunity 62(9)：3679-87)。近期研究表明，胃肠外给药的BCG未能诱导可能是保护性抵抗肺部疾病的关键的肺粘膜T细胞免疫反应。

[0006] 因此，需要开发其他的抵抗分枝杆菌疾病的疫苗。

发明内容

[0007] 令人惊讶的是，目前已经发现：表达分枝杆菌抗原85A(Ag85A)的病毒载体在作为免疫原性组合物施用时，可以诱导人类患者的T细胞免疫反应。因此，本发明提供了一种在人类患者中诱导针对分枝杆菌抗原的T细胞免疫反应的方法，该方法包括为患者施用免疫原性组合物的步骤，所述组合物包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。优选地，所述免疫原性组合物是载体疫苗。该新型疫苗方法显著提高了所述T细胞免疫反应的强度和持续时间。优选地，所述T细胞反应是记忆T细胞反应。

[0008] 85A抗原(Ag85A)(登记号CAA17868和BX842584)是Ag 85复合体的成员。Ag 85复合体是由结核分枝杆菌、BCG和许多其他种类的分枝杆菌分泌的蛋白质家族，
包括Ag85A、Ag85B和Ag85C(Harth，G.等，(1996)Infect.Immun.64：3038-3047)。抗原
85A(Ag85A)在所有分枝杆菌种类之中是高度保守的，并且在动物和人类研究中是免疫显性的。Ag 85A(Ag85A)由fbpA基因编码。来自结核分枝杆菌的85A抗原(Ag85A)在本文列于SEQID NO 1和SEQ ID NO 2)。

[0009] 在结核疫苗研究中，诱导加强的T细胞反应的近期策略已经利用了使用质粒、细菌或病毒载体的重组DNA技术和重组蛋白质来表达结核分枝杆菌抗原。已经显示，在结核分枝杆菌攻击后，使用表达Ag85A的MVA载体加强的Ag85A DNA对小鼠的免疫提供了相当于BCG的保护程度(McShane，H.等，(2002).Infect.Immun.70：1623-1626)。然而，单独使用重组MVA载体单次或反复免疫所产生的免疫反应是弱的。

[0010] 对于针对分枝杆菌疾病(例如结核病)的长期保护，认为重要的是保持可持续刺激保护性免疫数十年的“记忆T细胞”。

[0011] 记忆免疫反应经典地归因于长寿的抗原特异性T淋巴细胞的再活化，所述T淋巴细胞直接产生于分化的效应T细胞，并保持一致的休眠状态。认为效应T细胞和记忆T细胞分布至机体的所有组织，特别是病原体可能再次相遇的上皮表面(例如，皮肤和消化道)。

[0012] 记忆T细胞已经显示为异质的，并包括至少两种具有不同迁移能力和效应功能的亚型(Reinhardt，R.L.等，(2001)Nature.410，101-105)。第一亚型细胞类似于初次应答中产生的效应细胞，因为其缺乏淋巴结-归巢受体L-选择蛋白和CCR7，并表达用于迁移入发炎组织的受体。当与抗原再次相遇后，这些“效应记忆T细胞”(TEM)可以快速产生IFN-γ或IL-4，或释放预先存储的穿孔蛋白。第二亚型细胞表达L-选择蛋白和CCR7，并缺乏直接的效应功能。这些“中央记忆T细胞”(TCM)具有低的活化阈值，并且在次级淋巴样器官中再次刺激后，增殖并分化为效应细胞(Iezzi，G.等，(2001).J.Exp.Med.193，987-994)。

[0013] 本发明的发明人已经发现，当单独用于BCG首次健康志愿受试者时，复制受损的表达Ag 85A(Ag85A)的病毒载体(在这种情况下，示例为“MVA85A”)可以诱导高水平的抗原特异性分泌干扰素γ的记忆T细胞-效应记忆T细胞和中心记忆T细胞两者。

[0014] 在过去的10年，已经建立了用于检测和定量T细胞反应的新的免疫测定法。本发明的发明人利用干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT测定法作为使用MVA85A的临床实验的主要的免疫读数，因为IFN-γ从抗原特异性T细胞的分泌是保护性对抗结核分支杆菌的最佳的可利用的相关因素。而且，ELISPOT测定法是非常可重现且灵敏的定量分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞数目的方法。

[0015] 本发明的发明人利用了两种ELISPOT测定法：体外(新鲜)ELISPOT测定，其中使用抗原培养外周血液单核细胞(PBMC)18小时，以测定CCR7-循环效应T细胞的水平；和培养的ELISPOT测定，其中使用抗原培养PBMC 10至14天，以检测CCR7+中央记忆T细胞的水平(Godkin等，JI，2002)。

[0016] 本发明的发明人已经发现，用MVA85A的免疫诱导特异性针对抗原85A(Ag85A)的强烈的中央记忆T细胞反应，在免疫3周后，当循环效应几乎不可检测到T细胞反应时，依然可检测到抗原85A。

[0017] 这首次证明：可以通过施用表达分枝杆菌抗原的免疫原性组合物而显著提高患者的长期中央记忆T细胞群。

[0018] 如本文使用的，术语“记忆T细胞”意于包括T细胞的两个亚型——CCR7-(效应记忆T细胞)和CCR7+(中央记忆T细胞)。该定义还包括II类限制的CD4记忆T细胞和I类限制的CD8记忆T细胞。优选地，由本发明载体疫苗诱导的记忆T细胞的特征为CCR7+的细胞表面表达。这些细胞在本文被称为中央记忆T细胞。

[0019] 优选地，由本发明免疫原性组合物诱导的记忆T细胞反应是保护性T细胞反应。可以通过免疫测定IFN-γ分泌，优选抗原特异性T细胞的IFN-γ分泌，来检测保护性免疫反应。优选地，所述记忆T细胞反应是长期的，并持续至少1、2、5、10、15、20、25或更多年。最优选地，所述保护性免疫反应是终生的。

[0020] 优选地，在病毒载体中表达Ag85A基因。优选地，在非复制或复制受损的病毒载体中表达Ag85A基因。

[0021] 术语“载体疫苗”是本领域公知的。在根据本发明的方法中使用的载体是非复制或复制受损的病毒载体。如本文使用的术语“非复制的”或“复制受损的”意思是在多数正常人类细胞中不能复制至任何显著的程度。非复制或复制受损的病毒可以天然(即，其可以作为这样的病毒从自然界分离)或人工(例如，通过体外培养或通过基因操作，例如删除对复制关键的基因)变成。一般存在一种或几种可以培养所述病毒的细胞类型，例如用于经修饰的Ankara病毒(MVA)的CEF细胞。通常，所述病毒载体应该能够刺激T细胞反应。

[0022] 可在这里使用的病毒载体的实例是牛痘(vaccinia)病毒载体，例如MVA或NYVAC。优选的病毒载体是牛痘株MVA或从MVA衍生的毒株。牛痘载体的替代物包括其他痘病毒
(poxvirus)载体，包括禽痘(avipox)载体，例如鸡痘(fowlpox)或金丝雀痘(canarypox)载体。特别适合作为禽痘载体的是：已知为ALVAC(可作为Kanapox商购获得)的金丝雀痘株，和从ALVAC衍生的毒株，和已知为FP9的鸡痘株。其他替代物是甲病毒属载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、黄病毒属载体、逆转录病毒载体和流感病毒载体。

[0023] 例如，所述载体可以是非人类腺病毒载体。已经令人惊讶地发现，腺病毒载体的使用除了诱导非常强的CD4记忆T细胞反应外，还诱导了非常强的CD 8记忆T细胞反应。同一疫苗诱导CD8和CD4两种记忆T细胞反应，可能在预防和治疗分枝杆菌疾病中都是有益的。因此，本申请的范围内还包括：使用腺病毒载体诱导针对抗原的CD8和CD4记忆T细胞反应的方法，所述腺病毒载体表达所述抗原或其免疫原性片段。由所述腺病毒载体表达的抗原优选为上述分枝杆菌抗原，最优选为Ag85A，但可选地，可以是任何其他适当抗原。

[0024] 本发明范围内还包括：表达抗原或其免疫原性片段的腺病毒载体在制备用于诱导针对所述抗原的CD 8和CD4记忆T细胞反应的药剂中的用途。优选地，本发明提供了表达分枝杆菌抗原或其免疫原性片段的腺病毒载体在制备用于治疗或预防分枝杆菌疾病的药剂中的用途。所述抗原优选为上述分枝杆菌抗原，最优选为Ag85A，但可选地，可以是任何其他适当抗原。

[0025] 优选的是，所述病毒载体不能在人类患者中导致严重的感染。

[0026] 一般通过两种方法检测病毒的复制：1)DNA合成和2)病毒滴度(viral titre)。更准确地说，如本文使用的并当用于痘病毒时，术语“非复制或复制受损的”表示满足下述标准的任一或两者的病毒：

[0027] 1)与牛痘病毒Copenhagen株相比，表现出在MRC-5细胞(人类细胞系)中的DNA合成减少1log(10倍)；

[0028] 2)与牛痘病毒Copenhagen株相比，表现出在HELA细胞(人类细胞系)中的病毒滴度减少2log。

[0029] 落入该定义的痘病毒的实例为MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在该定义之外的病毒是减毒的牛痘株M7。

[0030] 本发明还提供了免疫原性组合物在制备用于治疗或预防人类患者分枝杆菌疾病的药剂中的用途，所述免疫原性组合物包含非复制或复制受损的病毒载体，该病毒载体表达分枝杆菌Ag85A基因的翻译产物。优选地，所述免疫原性组合物是载体疫苗。所述免疫原性组合物和载体疫苗通过在所述患者中诱导T细胞免疫反应而起作用。

[0031] 根据本发明的疫苗可以是预防性的(即，防止感染)、暴露后的(即，在感染后但在疾病前治疗)或治疗性的(即，治疗疾病)，但通常是预防性或暴露后的。

[0032] 可以通过本发明的载体疫苗治疗或预防的分枝杆菌疾病包括：结核病、麻风病、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)感染、非结核分枝杆菌感染、布鲁利(Buruli)溃疡、牛分枝杆菌(Mycobacterium bows)感染或疾病、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)感染或相关疾病。其他疾病(即，非分枝杆菌疾病)包括炎性肠病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌症、膀胱癌、天花和猴痘。

[0033] 可以使用专门的病毒载体构建体来帮助所述载体疫苗的制备和利用。本文描述的所有载体构建体形成了本发明的方面。包含这些病毒构建体的载体疫苗也作为本发明的方面被涵盖。

[0034] 例如，一种或多种抗原基因可以在所述基因的羧基端或氨基端被截短。这可以具有促进克隆和构建所述载体疫苗的作用，并且可选地或另外，可以导致效力提高。用于截短的方法将是本领域技术人员已知的。实现这种截短的最简单的方法是使用各种公知的基因工程技术，以选择性删除所述抗原基因任一端的编码核酸序列，然后将所需的编码序列插入所述病毒载体。例如，分别使用3′和/或5′核酸外切酶策略选择性地侵蚀所述编码核酸的3′和/或5′端，生成所述候选蛋白的截短。优选地，野生型基因序列被截短，这样所表达的抗原相对于母抗原被截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。最优选地，抗原基因是相对于野生型Ag85A抗原在羧基端被截短了
15个氨基酸的Ag85A(SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4的表达产物)。

[0035] 适用于本发明的抗原还包括所述母抗原的片段，条件是那些片段具有与母抗原共同的抗原决定簇或表位，或者与母抗原是免疫可识别的。编码这些片段的多核苷酸也适用于本发明的免疫原性组合物和载体疫苗。

[0036] 如本文使用的，术语“片段”指多肽，该多肽的氨基酸序列与衍生该多肽的母抗原或其一个功能等同物的氨基酸序列部分但非全部相同。所述片段应该包括至少n个来自所述序列的连续氨基酸，并且根据特定的序列，n优选为7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)。小的片段可以形成抗原决定簇。

[0037] 本发明的抗原基因还可以编码所述母抗原的变异体或功能等同物。这种核酸分子可以是天然存在的变异体，例如天然存在的等位基因变异体，或者所述分子可以是未知天然存在的变异体。所述核酸分子的这种非天然存在的变异体可以通过诱变技术制备，包括应用于核酸分子、细胞或有机体的那些技术。

[0038] 在这点上，所述变异体是通过核苷酸置换、缺失或插入而不同于前述抗原基因序列的变异体。所述置换、缺失或插入可以涉及一个或多个核苷酸。所述变异体可以在编码区或非编码区或同时两者中变更。在编码区中的变更可以生成保守或非保守的氨基酸置换、缺失或插入。

[0039] 可选地，或除了使用基因平截以外，编码所述抗原的基因可以包括编码标签多肽的核酸，这样所述标签多肽在翻译后共价连接至所述抗原。优选地，所述标签多肽选自：PK标签、FLAG标签、MYC标签、多组氨酸标签或任何可以被单克隆抗体检测的标签组成的组。其他实例将对本领域技术人员而言是清楚的。如果被使用，所述PK标签优选地具有Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp序列。这种类型的标签可以有助于检测抗原表达和表达所述抗原的克隆，并可选地或另外，可以导致效力的提高。

[0040] 可以定位编码所述标签多肽的核酸，这样，在翻译后，所述标签位于所表达的抗原的羧基端或氨基端，或者可以在所表达的抗原的内部。优选地，所述标签位于所表达抗原的羧基端。编码连接子序列的核苷酸可以插入编码所述标签多肽的核酸与编码所表达的抗原的核酸之间。优选地，当被表达时，所述连接子序列包含氨基酸Gly-Ser-Ile。更优选地，氨基酸Gly-Ser-Ile插入抗原序列氨基端和所表达的抗原的标签之间。最优选地，所表达的抗原是Ag85a(Ag85A)，且PK标签位于Ag85a(Ag85A)基因的羧基端。

[0041] 编码抗原的基因还可以包括前导序列。所述前导序列可以影响初级转录物加工为mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。优选地，所述前导序列提高所述抗原的表达和/或免疫原性。提高的免疫原性可以通过例如培养和体外ELISPOT测定法测定。提高的表达水平可以通过例如使用单克隆抗体检测所产生的蛋白质的量来测定。优选地，当与未使用所述前导序列表达的抗原相比较时，表达和/或免疫原性被提高了2倍、3倍或更多。适当的前导序列的实例是t-PA(组织纤溶酶原激活物)(Malin A.S.等，(2000)Microbes Infect.2000 Nov；2(14)：1677-85)。

[0042] 优选地，所述病毒载体构建体包括与TPA前导序列融合的羧基端截短了的Ag85A序列。而在进一步优选的实施方案中，本发明的病毒载体表达与TPA前导序列和与PK标签序列融合的羧基端截短的Ag85A序列。优选地，所述前导序列与所述抗原的氨基端融合，且所述标签序列融合至所述蛋白质的内部或羧基端。在特别优选的实施方案中，所述病毒载体的构建体包括编码羧基端截短了15个氨基酸的Ag85a(Ag85A)的多核苷酸，所述Ag85a融合至TPA序列并带有Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp序列的羧基端PK标签，其中氨基酸残基Gly-Ser-Ile存在于所述Ag85A序列和所述PK标签之间(SEQ ID NO：5)。优选地，病毒载体的表达产物具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

[0043] 已经发现，本发明的发明人注意到的保护性T细胞的作用在之前已经暴露于分枝杆菌抗原的人类患者中特别有效。异源初始-加强(prime-boost)免疫策略在动物和人类中诱导了比使用相同疫苗的同源性加强更高水平的效应T细胞反应(Schneider，J.等，(1998)Nat.Med.4，397-402，McShane，H.等，(2001)Infect.Immun.69，681-686)。

[0044] 对BCG的效力在(新生接种的)个体年龄到达10至15岁时逐渐消失的潜在机制还了解甚少。一个可能的假设是，BCG产生的免疫性已经消失，而所述个体变得等同于首次用于实验的宿主，其可以使用设计成诱导初次免疫的新候选疫苗进行免疫。尽管使用BCG重复免疫没有表现出进一步提高对抗TB的保护(参考Rodrigues L等，Lancet 2005)，
但BCG结合入异源初次-加强方案将维持BCG的保护效应。使用表达抗原85A(Ag85A)
的病毒载体加强的BCG在几种动物模型中的免疫原性和保护效力之前已经有记载
(Goonetilleke，N.P.等，(2003)J.Immunol.171，1602-1609；Williams A等，Infection and Immunity(73(6)：3814-6)，但没有记载保护性记忆T细胞反应的诱导。

[0045] 因此，本发明还提供了一种用于提高人类患者中T细胞免疫反应的方法，其包括联合载体疫苗为患者施用至少一种分枝杆菌抗原的步骤，所述载体疫苗包含表达分枝杆菌85a(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。优选地，所述T细胞免疫反应是记忆T细胞免疫反应。

[0046] 本发明还提供了：(a)至少一种分枝杆菌抗原和(b)包含表达分枝杆菌85a(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗，在制备用于施用至患者以诱导T细胞免疫反应的药剂中的用途。

[0047] 可以同时、顺序或分开施用包含表达分枝杆菌85a(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗和分枝杆菌抗原。例如，可以在施用所述载体疫苗之前，施用所述分枝杆菌抗原以对患者进行预免疫，或者在施用所述载体疫苗之后，施用所述分枝杆菌抗原以加强患者对所述载体疫苗的免疫反应。

[0048] 另外，本发明还提供了一种在人类患者中诱导T细胞免疫反应的方法，其包括给人类患者施用免疫原性组合物的步骤，所述免疫原性组合物包括表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体，其中所述患者已经预先暴露于至少一种分枝杆菌抗原。优选地，所述T细胞免疫反应是记忆T细胞免疫反应。

[0049] 本发明还提供了包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防人类患者中分枝杆菌疾病的药剂中的用途，所述患者已经预先暴露于分支杆菌抗原。

[0050] 分枝杆菌抗原可以来自结核分枝杆菌和/或可以来自一种或多种其他分枝杆菌，例如鸟胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M.marinum)和/或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)。当患者已经预先暴露于仅一种抗原时，所述抗原可以是赋予针对分枝杆菌感染的保护性免疫反应的抗原。在本发明的一个实施方案中，预先暴露于患者的抗原不是Ag85A。

[0051] 可选地或另外，患者可以预先暴露于一种或多种分枝杆菌本身。例如，患者预先暴露于至少一种分枝杆菌抗原可以包括预先暴露于结核分枝杆菌。可选地或另外，患者预先暴露于至少一种分枝杆菌抗原可以包括预先暴露于环境分枝杆菌，例如鸟胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M.marinum)和/或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)。优选地，患者潜伏感染所述分枝杆菌。例如，患者可以预先暴露于结核分枝杆菌并潜伏感染结核。当所述药剂用于治疗潜伏感染了所述分枝杆菌的患者时，所述治疗优选根除所述分枝杆菌感染。

[0052] 可选地或另外，预先暴露可以包括使用BCG的新生期免疫或预免疫。本发明的发明人已经发现，在先前使用BCG免疫和然后接受加强剂量的本发明载体疫苗的志愿者中，诱导了显著较高水平的抗原特异性的分泌干扰素γ的T细胞，并且在免疫后24周，所述水平比施用单独BCG免疫的受免疫者中高5-30倍。

[0053] 因此，本发明的该方面提供了一种在人类患者中诱导T细胞免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：使所述患者暴露于至少一种分枝杆菌抗原，和通过施用包括免疫原性组合物的加强组合物加强所述免疫反应，所述免疫原性组合物包含表达分枝杆菌85a(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。

[0054] 本发明的该方面还涉及一种用于在人类患者中产生T细胞免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：

[0055] i)使所述患者暴露于至少一种分枝杆菌抗原；

[0056] ii)给所述患者施用至少一次剂量的包括载体疫苗的加强组合物，所述载体疫苗包含表达分枝杆菌85a(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。

[0057] 在本发明的一个实施方案中，其中所述患者在步骤i)中仅暴露于一种分枝杆菌抗原，所述抗原是赋予保护性免疫反应的抗原，但不是Ag85A。

[0058] 步骤i)可以在任何年龄的患者中进行，例如，在新生期、婴儿期、青春期或成人期过程中。优选地，所述患者在新生期暴露于所述至少一种分枝杆菌抗原。

[0059] 免疫原性组合物的施用可以发生在预先暴露于至少一种分枝杆菌抗原之后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多周或者0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35或40或更多年。优选地，当步骤i)在患者处于婴儿期时进行时，则步骤ii)在婴儿期或青春期进行。

[0060] 当步骤ii)包括给所述患者施用超过一次剂量的加强组合物时，所述超过一次的剂量可以以短时间周期或长时间周期施用。例如，所述加强组合物剂量可以以小时、天、周、月或年的周期施用。例如，第二次加强剂量可以在下述时间施用：在第一次加强剂量之后0.5小时和24小时之间，在第一次加强剂量之后1天和7天之间，在第一次加强剂量之后1周和1个月之间，在第一次加强剂量之后的1个月和6个月之间，在第一次加强剂量之后的
6个月和1年之间，或者在第一次加强剂量之后的1至2年之间、2至5年之间、6至10年之间或超过10年。加上适当的修正(mutatis mutandis)，这些时间间隔优选还应用于任何随后剂量之间的周期。

[0061] 在本发明的第二方面中，除了诱导的抗85a(Ag85A)抗原的免疫反应以外，所述病毒载体刺激载体特异性的T细胞反应。根据本发明的该方面，本发明的载体疫苗的施用促进了抗病毒的T细胞免疫反应，所述病毒载体从所述病毒衍生。例如，在本发明的载体疫苗中使用MVA载体促进抗牛痘病毒的T细胞免疫反应。优选地，该T细胞反应是保护性的T细胞反应。该类型的作用在之前已经被报道并且是明显有利的，因为所述载体疫苗在以下两个方面具有双重作用：首先在保护性抵抗分枝杆菌疾病中，和第二在保护性抵抗所述载体相关病毒介导的疾病中。在MVA载体的情况中，这样的疾病是天花。

[0062] 可以通过本发明载体疫苗治疗或预防的病毒衍生疾病对于本领域技术人员是清楚的；实例包括天花、猴痘和播散性牛痘感染。

[0063] 因此，本发明的该方面提供了一种在人类患者中诱导抗分枝杆菌抗原和病毒的T细胞免疫反应的方法，包括给所述人类患者施用包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的免疫原性组合物。优选地，所述T细胞免疫反应是记忆T细胞反应。

[0064] 本发明的该方面还提供了：包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的免疫原性组合物，在制备用于在人类患者中诱导抗分枝杆菌抗原和病毒的T细胞免疫反应的药剂中的用途。

[0065] 本发明的疫苗递送免疫有效量的至少一种抗原至患者。对于“免疫有效量”，其意思是该量以单次剂量或作为一系列剂量的部分对个体的施用，对于治疗或预防是有效的。该量根据所述待治疗个体的健康和身体状况、年龄、所述个体免疫系统的能力、希望保护的程度、所述疫苗的组成、治疗医生对医疗情境的评价和其他相关因素而变化。预期所述量将处于可以通过常规试验测定的相对宽的范围内。

[0066] 在本发明的第三个方面，所述病毒载体可进一步表达一种或多种附加抗原基因的翻译产物，所述抗原基因可用以诱导针对这类附加抗原的抗原特异性免疫反应。所述免疫反应可以是CD8+、CD4+和/或抗体反应。优选地，所述一种或多种附加抗原来源于结核分枝杆菌、疟原虫(Plasmodium sp)、流感病毒、HIV、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、细胞巨化病毒(Cytomegalovirus)、人乳头瘤病毒(Human papilloma virus)、疟疾、利什曼寄生虫(leishmania parasites)，或优选地，任何分枝杆菌亚种(mycobacteria spp)。优选地，所述一种或多种附加抗原基因编码的抗原选自：来自任何分枝杆菌的抗原85家族的抗原或任何由分枝杆菌亚种表达的抗原组成的组；更优选地，一种或多种潜伏抗原，例如16kDa抗原或肝素结合血细胞凝集素(haemagglutinin)(HBHA)或ESAT6或称为72F的融合蛋白。

[0067] 还预期，所述附加抗原可以是内源衍生的，这样所诱导的免疫反应定向抵抗肿瘤。适合本发明使用的内源衍生抗原是：人类热激蛋白，和肿瘤相关抗原，例如CEA、PSA、Muc-1、Her2neu。

[0068] 所述病毒载体可以被设计为表达作为表位串(epitope string)的Ag85A基因和一种或多种附加抗原基因。有利地，一串多个表位中的表位连接在一起而没有间插序列，这样避免不必要的核酸和/或氨基酸物质。所述表位串的生成可优选通过使用重组DNA构建体来实现，所述重组DNA构建体编码所述表位串的氨基酸序列，且编码Ag85A的DNA与编码所述附加抗原的DNA在同一阅读框。或者，Ag85A和所述附加抗原可以作为分离的多肽被表达。

[0069] 本发明的该方面还提供了：包含表达分枝杆菌Ag85A基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗，在制备通过在所述患者中诱导T细胞免疫反应用于治疗或预防人类患者中分枝杆菌疾病和至少一种其他疾病的药剂中的用途。

[0070] 根据本发明的该方面，所述载体疫苗可用以通过在人类患者中诱导T细胞免疫反应来保护性抵抗分枝杆菌疾病和一种或多种选自HIV、疟疾和天花组成的组的疾病，所述T细胞免疫反应优选记忆T细胞免疫反应。

[0071] 尽管本发明的载体疫苗可单独使用，但其也可以与其他免疫或治疗方案结合用于治疗或预防其他疾病。因此，除提供上述载体疫苗之外，本发明还提供了一种包含本发明载体疫苗和一种或多种衍生于致病因子的其他抗原或表位的组合物。

[0072] 适用于本发明的组合物的抗原和表位可以是细菌或病毒来源的。适当的抗原可以进一步被分类为蛋白质抗原、糖类抗原或糖轭合物抗原。本发明的组合物可以包括一种或多种其他抗原或表位。实例为：

[0073] -不同的分枝杆菌抗原或表位。

[0074] -HIV抗原或表位；。

[0075] -疟原虫抗原或表位。

[0076] -疟疾抗原或表位。

[0077] -来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原。

[0078] -来自肺炎链球菌(例如，来自PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133)的蛋白质抗原。

[0079] -来自甲型肝炎病毒(例如灭活病毒)的抗原或表位。

[0080] -来自乙型肝炎病毒(例如表面抗原和/或核心抗原)的抗原或表位。

[0081] -来自丙型肝炎病毒的抗原或表位。

[0082] -来自b型流感嗜血杆菌的糖抗原。

[0083] -脊髓灰质炎病毒抗原或表位(例如IPV中)。

[0084] -白喉疫苗或其组成性表位或抗原或类毒素。

[0085] -破伤风疫苗或其组成性表位或抗原或类毒素。

[0086] -麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原或表位。

[0087] -流感抗原或表位，例如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。所述流感抗原可以选自广泛流行的毒株，例如禽流感，例如H5N1株。

[0088] -来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原或表位。

[0089] -癌抗原或表位。

[0090] 当使用糖抗原时，其优选与载体轭合，以提高免疫原性。当必要时，毒性蛋白抗原可以通过化学和/或遗传方法脱毒。

[0091] 糖抗原优选为轭合物形式。用于轭合物的优选载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素。当为白喉类毒素时，白喉毒素的CRM 197突变体是特别优选的载体。其他适当的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)外膜蛋白、合成肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、人工蛋白质，所述人工蛋白质包括多种来自各种病原体衍生抗原的人类CD4+T细胞表位，例如N19蛋白、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、铁吸收蛋白质、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B，等。

[0092] 所述组合物中的其他抗原通常每种以至少1μg/ml的浓度存在。一般而言，任何给定抗原的浓度足以引发针对该抗原的免疫反应。

[0093] 作为在所述混合物中使用其他蛋白质抗原的替代，可以使用编码所述抗原的核酸。因此，所述混合物的蛋白质组分可以由编码所述蛋白质的核酸(优选DNA，例如，以质粒形式)所取代。类似地，本发明的组合物可以包含模拟糖抗原的蛋白质，例如模拟表位或抗独特型抗体。

[0094] 另外，本发明还提供了包含本发明载体疫苗和一种或多种抗微生物化合物的组合物。适用于本发明的组合物的抗微生物剂的实例是抗结核的化疗剂，例如利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺(pyrizinamide)等。

[0095] 因此，本发明提供了一种在人类患者中提高针对至少一种抗原的T细胞免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：结合至少一种其他抗原和/或抗微生物剂，给所述患者施用包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗。

[0096] 本发明还提供了：(a)包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗和(b)至少一种其他抗原和/或微生物，在制备用于施用至人类患者以诱导T细胞免疫反应的药剂中的用途。

[0097] 可以同时、顺序或分开施用包括表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗和其他抗原和/或抗微生物剂。例如，可以在施用所述抗原/抗微生物剂之前施用所述载体疫苗至以对患者进行预免疫，或施用所述抗原之后，施用所述载体疫苗以加强患者对所述抗原的免疫反应。所述载体疫苗和抗原/抗微生物剂优选混合施用。

[0098] 本发明还提供了至少一种抗原和/或抗微生物剂在制备用于诱导患者T细胞免疫反应的药剂中的用途，其中所述药剂与载体疫苗一起施用，所述载体疫苗包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体。类似地，本发明提供了包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗在制备用于诱导患者T细胞免疫反应的药剂中的用途，其中所述药剂与至少一种其他抗原和/或抗微生物剂一起施用。

[0099] 本发明还提供了至少一种抗原和/或抗微生物剂在制备用于诱导患者T细胞免疫反应的药剂中的用途，其中所述患者已经用包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗预处理。本发明还提供了包含表达分枝杆菌Ag85A(Ag85A)基因翻译产物的非复制或复制受损的病毒载体的载体疫苗在制备用于诱导患者T细胞免疫反应的药剂中的用途，其中所述患者已经用至少一种抗原和/或抗微生物剂预处理。

[0100] 如上所述，本发明可用以诱导或提高多种免疫反应。特别地，本发明的目的是确定免疫抵抗涉及分枝杆菌的疾病的有效方法。所述疾病包括汉森氏病、结核病、骨髓炎、克隆氏病、麻风病、淋巴腺炎、约尼氏病。

[0101] 本发明的上述方面适用于多种不同的患者，包括例如：儿童；患有HIV、AIDS的患者，免疫妥协/免疫抑制的患者，或经历过器官移植、骨髓移植的患者，或患有遗传免疫缺陷的患者。当所述疫苗用于预防用途时，所述患者可以是儿童(例如新生儿或1-5岁的儿童)、年长的儿童或青少年；当所述疫苗用于治疗用途时，所述患者优选为成年人。预期用于儿童的疫苗也可以施用至成年人，例如以评价安全性、剂量、免疫原性等。

[0102] 本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含(1)本发明的免疫原性组合物和(2)药学上可接受的载体。

[0103] 本发明提供了一种制备药物的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备本发明的载体疫苗；和(ii)将所述免疫原性组合物与一种或多种药学上可接受的载体混合。

[0104] 载体(2)可以是本身不诱导生成对接受所述组合物的患者有害的抗体并且其施用没有异常毒性的任何物质。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。这样的载体是本领域普通技术人员公知的。药学上可接受载体可包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。这类载体中还可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。还可以存在稳定剂(例如海藻糖)或允许室温下水溶性糖玻璃形成的物质。后者包括使用混合的可溶性玻璃稳定技术，以微球形式悬浮于全氟碳液体中。脂质体也是适当的载体。药物载体的全面讨论可获自：Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy.第20版，ISBN：0683306472。

[0105] 本发明的药物组合物还可预防性应用于例如下述情况：希望与微生物接触时和要防止建立感染时。例如，可在外科手术之前施用所述组合物。

[0106] 所述药物组合物优选是无菌的。其优选是无热原的。其优选是缓冲的，例如介于pH 6和pH 8之间，通常约pH 7。优选地，所述组合物基本是与人类等渗的。

[0107] 本发明的组合物可通过多种不同的途径施用。某些途径对于某些组合物是更有利的，因为导致生成更有效的反应，或者因为较少可能诱导副作用，或者因为更容易给药。

[0108] 例如，本发明使用的组合物可以通过任何几种途径施用，包括但不限于：经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮或经皮肤应用(transdermal or transcutaneous application)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠方式。
所述组合物可制备用于鼻内给药，作为鼻腔喷雾、滴鼻剂、凝胶或粉末，注射剂(液体溶液或悬浮剂)；也可制备成在适合于在注射前溶解于或悬浮于液体载体中的固体形式。

[0109] 所述组合物的直接给药一般将通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射完成，或者递送至组织的细胞间隙。剂量治疗可以是单次剂量方案或多剂量方案。

[0110] 现在将通过参考下述附图以举例方式更详细描述本发明的各方面和实施方案：

[0111] 附图简述

[0112] 图1：各免疫组中免疫后的平均IFN-γELISPOT反应：单独BCG；单独MVA85A；BCG预免疫-MVA85A加强。(a)各组中免疫的适当时间(周)；(b)结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)反应；(c)纯化的抗原85(Ag85A)蛋白反应；(d)累加的池肽反应；(e)对于三种受测蛋白的每一种，使用Mann-Whitney统计值比较各疫苗组在各时间点的反应。表明了统计学上的显著对照；(f)在BCG免疫的个体中MVA加强之后的T细胞表位展示。所有单个肽的
反应被CD4+T细胞清除所消除；

[0113] 图2：免疫之前，对于单独MVA85A研究中的4名志愿者，筛查针对结核分枝杆菌PPD、鸟分枝杆菌PPD和重组抗原85A(Ag85A)的血液培养的ELISPOT反应。通过代码
TXXXXXX识别每个志愿者，其中前3个X相应于试验号，后3个X相应于志愿者号，例如
T002022意思为：T002是试验号，022是志愿者号；

[0114] 图3：5名志愿者(每个通过代码TXXXX识别，其中XXXX是四位数，第1位相应于试验号，第2、3和4位相应于志愿者号，例如T2003意思为：T2是试验号，而003是志愿者号(T2与上述图2中的T002相同))在单独MVA85A免疫给药3周后，针对多池Ag85A肽(使用大写字母标记)的培养的(标记为“培养”)和体外ELISPOT反应。免疫后的反应非常
高，并高于免疫前的反应。志愿者之前没有使用BCG免疫；

[0115] 图4：随访在第1周接受免疫的MVA-85A免疫的健康志愿者中针对MVA-Lac-z的T细胞反应，所述MVA-Lac-z用作体外ELISPOT测定中的抗原。志愿者之前没有使用BCG免疫；

[0116] 图5(a)：在潜伏感染结核分枝杆菌的受试者中单独使用MVA85A免疫后对PPD、重组抗原85A(Ag85A)和累加抗原85A(Ag85A)肽池的平均Elispot反应；

[0117] 图5(b)：在BCG预免疫的受试者(T005，即实验5；参见实施例1)和潜伏感染结核分枝杆菌的受试者(T007，即实验7)中MVA85A诱导的累加抗原85A(Ag85A)池肽反应的比较；

[0118] 图5(c)：在BCG预免疫的受试者(T005)和潜伏感染结核分枝杆菌的受试者(T007)中MVA85A诱导的重组抗原85A(Ag85A)反应的比较；

[0119] 图6(a)：在预免疫(BCG)和加强(MVA85A)之间长(超过10年)间隔的受试者组免疫后至少1年的MVA85A诱导的免疫反应的持久性；

[0120] 图6(b)：在预免疫(BCG)和加强(MVA85A)之间短(一个月)间隔的受试者组免疫后至少1年的MVA85A诱导的免疫反应的持久性；

[0121] 图7(a)：BCG和MVA85A免疫之间的间隔与MVA85A后1周针对抗原85A(Ag85A)累加肽池的T细胞反应之间相关性的缺乏；

[0122] 图7(b)：BCG和MVA85A免疫之间的间隔与MVA85A后24周针对抗原85A(Ag85A)累加肽池的T细胞反应之间相关性的缺乏；

[0123] 图8(a)显示了免疫后IFN-γ的平均水平；

[0124] 图8(b)显示了攻击后IFN-γ的平均水平；

[0125] 图9(a)显示了BCG预免疫的英国志愿者中针对MVA85A的体外IFN-γElispot反应；和

[0126] 图9(b)显示了BCG预免疫的刚比亚志愿者中针对MVA85A的体外IFN-γElispot反应。
实施例

[0127] 实施例1

[0128] MVA85A疫苗

[0129] 之前已经描述了MVA85A的构建(McShane，H.等，(2002)Infect.Immun.70，1623-1626)。临床级的MVA85由Impfstoffwerke Dessau-Tornau生产，达到良好操作规范标准。对于临床试验中使用MVA85A，药物和保健产品监管署(Medicines and Healthcare products Regulatory Agency，London)颁发了医师和牙医豁免证书(Doctors and
Dentists Exemption Certificate)。

[0130] 临床实验

[0131] 在Oxfordshire Research Ethics Committee批准的协议下招募志愿者用于免疫研究，并且只有在获得书面知情同意之后才可以使志愿者加入。包括的年龄范围是18-55，并且所有受试志愿者在筛查中对HIV、HBV和HCV血清反应阴性。在免疫之前进行常规的实验室血液学和生物化学检查，且所有值均在正常范围之内。随访全部志愿者6个月，并在规律时间点采取血样。接受了MVA85A免疫的那些志愿者完成日志卡，记录了免疫后7天的局部和全身副作用以及体温。

[0132] 免疫

[0133] 首先的两项研究在BCG预免疫的健康志愿者中进行，所述BCG预免疫的志愿者使用Heaf试验确定。Heaf试验包括将结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)置于皮肤上，然后使用喷枪生成多个刺伤。在72小时在刺伤部位超过4个丘疹的为阳性反应。阳性皮试表明活性结核感染或之前的BCG免疫。阴性(0级)Heaf试验(相当于结核菌素皮试为0mm)的志愿者使用BCG(使用BCG Glaxo株单次免疫，皮内注射100μl，n＝11)或MVA85A(皮内注
7
射5×10pfu，相隔3周2次免疫，n＝14)免疫。在第三项研究中，招募了之前已经用BCG
免疫的志愿者(n＝17)。BCG免疫和MVA85A免疫之间的平均时间为18年(范围为0.5-38
年)。Heaf试验强度不超过II级(相当于结核菌素皮试＜15mm)的志愿者加入该研究，并
7
使用单次剂量的5×10pfu MVA85A皮内注入BCG免疫的对侧手臂的三角肌上的皮肤。总
计，31名健康志愿者使用MVA85A免疫。14名首次接触BCG的志愿者中有11名接受了2次
免疫，相隔3周进行。其他3名志愿者接受单次免疫。全部17名BCG预免疫的志愿者接受了单次MVA85A免疫。所有志愿者完成了6个月的随访期，且在任何这些研究中没有严重或剧烈的不良事件。

[0134] 免疫原性的测量

[0135] 用以确定疫苗免疫原性的主要免疫测量是体外IFN-γELISPOT测定法。其针对在下述时间点采取的血样进行：在结核菌素皮试之前的筛查时，和然后在免疫后的1、4、12和24周。这些测量针对新鲜的PBMC进行，使用结核菌素PPD(20μg/ml，SSI)、纯化的抗原85(Ag85A)复合体(10μg/ml)和7个池的9-10条15-mer肽，所述肽有10个氨基酸重叠
(各肽在ELISPOT孔中的终浓度为10μg/ml)。简言之，300,000PBMC/孔的100μl R10(RPMI加10％胎儿小牛血清)直接铺板于存在抗原的ELISPOT板(MAIP S4510，Millipore)，并培养18小时。所有测定中使用链激酶(250U/ml)/链道酶(12.5U/ml)和植物血细胞凝集素
(10μg/ml)作为阳性对照。测定进行两次，结果取平均。

[0136] 表位作图

[0137] 根据免疫后的首次样品或随后样品测试针对单个肽的反应。对单个肽的反应进行磁珠清除(Dynal)。通过与轭合亚铁珠的抗CD4和CD8的单克隆抗体一起培养30分钟来进行CD4+和CD8+T细胞清除，所述珠与细胞的比例为5∶1，所述培养使用M-450(Dynal，Oslo，Norway)于200μl R10中在冰上培养。使用磁体(Dynal)去除抗体包裹的细胞。根据未清除的、CD4+清除的和CD8+T细胞清除的组来分析样品。细胞清除通过FACS扫描证实，并通常对于CD8+T细胞＞90％，对CD4+T细胞＞97％(数据未显示)。

[0138] 免疫原性的分析

[0139] ELISPOT数据的分析是通过从带有抗原或肽池和细胞的孔中斑点的平均计数扣除介质中平均数目的斑点和单独对照孔的细胞。忽略小于5斑点/孔的计数。如果所述计数是阴性对照孔的至少两倍并且比阴性对照孔多至少5个斑点，则认为该孔是阳性的。对于肽池孔，累加各志愿者在各时间点的所有肽池的结果。例如，当有7个肽池时，每个含有
9-10个肽，每个池测试两次。计算每个池的两次测试的平均值，然后减去阴性对照孔的平均值，以生成该池的结果。然后将7个单个池的结果加在一起。这将可能对于对任何10-mer重叠区反应的T细胞计数两次，所述重叠区出现于具有相邻肽的两个池中。

[0140] 数据分析

[0141] 基于对数转化的数据，使用筛查时的基线结果作为协变量进行重复测量的变量分析，以比较各组。然后使用Mann-Whitney检验用于组间的所有比较，使用Wilcoxon检验用于筛查和BCG预免疫-MVA85A加强组的24周样品之间的配对比较。

[0142] 培养的ELISPOT方法

[0143] 对于培养的ELISPOT，使用20μg/ml的结核分支杆菌PPD(“PPD-T”)、鸟分枝杆6
菌PPD(“PPD-A”)或10μg/ml重组抗原85A(Ag85A)在24孔板中刺激1×10 冷藏保存的
PBMC。经过+37℃、5％CO2大气下的3天培养期之后，去除500μl的细胞培养物上清液，并由R10中5IU/ml的Lymphocult-T(Biotest，Dreieich，Germany)取代。这在第7天重复。
在第9天，细胞经三次洗涤，于+37℃、5％CO2大气下R10中静置过夜。在第10天，细胞经
4
洗涤并悬浮于2ml的R10中，将50μl经培养的细胞(2.5×10 最初铺板的细胞)转移至
ELISPOT板的复孔，并用PPD-T(20μg/ml)、PPD-A(20μg/ml)和Ag85A(10μg/ml)刺激18小时。然后如之前所描述的培养ELISPOT板。

[0144] 结果

[0145] 使用MVA85A的免疫是安全并良好耐受的(表1)。比较了使用单独BCG、单独MVA85A和BCG预免疫-MVA85A加强免疫所诱导的抗原特异性T细胞反应的动力学和强度。
在测定中使用PPD-T、抗原85(Ag85A)蛋白或来自抗原85(Ag85A)的重叠肽作为抗原，全部三种免疫方案都诱导了显著的免疫反应(表2，图1)。在PPD-T(F＝3.624；P＝0.037)、抗原85(Ag85A)(F＝16.605；P＜0.001)和累加的池抗原85A(Ag85A)肽组(F＝39.982；
P＜0.001)中存在显著的疫苗主要作用。使用BCG的免疫诱导了中等水平的抗原特异性
IFN-γ分泌T细胞，其在免疫后4周达到峰值(表2，图1b-d)。在BCG免疫后，针对池抗原
85A(Ag85A)肽的反应是显著弱的(图1d)。11名志愿者中只有4名志愿者在体外ELISPOT
测定中对任何7肽池反应。这些肽池反应可全部归因于肽12、13、27和28，并完全由CD4+T细胞清除所消除。

[0146] 表1：使用MVA85A免疫后诉求的不良事件

[0147] 在首次接触BCG和BCG预免疫的组之间，所报道的不良事件的频率和严重度没有差异。

[0148]

[0149] a所有全身症状在7天内消退

[0150] b范围37.7-38.1℃；全部在24小时内自发消退

[0151] 在首次接触BCG的志愿者中，在13/14个志愿者中，使用MVA85A单次免疫诱导了高水平的抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞，其在免疫后7天达到峰值(表2，图1b-c)。经过4周，该反应已经降至仅在基线之上的水平。在第3周使用MVA85A第二次免疫，没有发现加强作用。一个志愿者在用MVA85A免疫后没有生成插入特异性T细胞，然而，虽然其没有牛痘免疫既往史，但该志愿者确实生成了针对的MVA载体的特异性T细胞反应(数据未显示)。通过进行使用MVA-lac-Z抗原的体外ELISPOT测定来进一步考察MVA85A免疫的志愿者中对MVA-lac-Z的反应。测定方法如上“免疫原性测量”中所讨论的。MVA85A免疫的健康志愿者表现了在免疫后持续达24周的强烈的抗MVAT细胞反应。

[0152] 与BCG免疫相比，在所有13/14反应志愿者中，MVA85A免疫诱导了强烈的针对几个肽池的反应(表2，图1d)。观察到对跨越抗原85A(Ag85A)全长的大范围的肽的反应。这些个体肽反应都完全被CD4+T细胞清除所消除(数据未显示)。

[0153] 在BCG预免疫-MVA85A加强组的16/17志愿者中，免疫后1周观察到抗原特异性T细胞的显著增加(表2，图1)。BCG预免疫-MVA85A加强组在免疫后1周的峰值反应显
著高于单独BCG或MVA85A组(图1b-e)。这些反应以比单独BCG或MVA85A免疫后显著更
高的水平维持至少24周(图1e)。如预期的，之前已经用BCG免疫的志愿者在筛查时的基线反应高于首次接触BCG的组。然而，在BCG预免疫-MVA85A加强组中使用MVA85A免疫
后24周的反应显著高于该组关于PPD(Wilcoxon z＝-3.010，P＝0.003)、抗原85(Ag85A)(Wilcoxon z＝-3.516，P＜0.001)和累加的池肽(Wilcoxon z＝-3.408，P＝0.001)的
基线计数。

[0154] 单独MVA85A组(未显示)和BCG预免疫-MVA85A加强组(图1f)中观察到的肽反应的宽度非常相似。然而，BCG预免疫-MVA85A加强组中的反应强度显著更高(图1e)。使用来自抗原85A(Ag85A)的全部66个肽测定了BCG预免疫-MVA85A加强组中12名志愿者的
PBMC。这些肽的几个被超过50％的受试者识别(图1f)，说明了这些肽由不同的HLA II类分子的泛宿主识别，如之前所报道的(Launois，P.等，(1994)Infect.Immun.62，3679-3687)。

[0155] 表2.各免疫组在各时间点对PPD、抗原85(Ag85A)和累加的池肽的ELISPOT反应的算术平均值(SE)和中值(IQR)

[0156]

[0157] 在单独MVA85A组中观察到的T细胞反应强度比迄今使用的其他重组MVA强约10倍(McConkey，SJ.等，“Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans”，Nat.Med.，
9，729-735(2003))；Mwau，M. 等，“A human immunodeficiency virus 1(HIV-1)clade A vaccine in clinical trials：stimulation of HIV-specific T-cell responses by DNA and recombinant modified vaccinia virus Ankara(MVA)vaccines in humans”，J.Gen.Virol.，85，911-919(2004))。表达来自热带疟原虫(P.falciparum)的抗原的重组MVA在
6
免疫后7天诱导了90 SFC/10 PBMC的平均累加的肽反应(McConkey，SJ.等，(2003)Nat.
6
Med.9，729-735)。相比之下，在MVA85A免疫后7天观察到对1365 SFC/10 PBMC 7的累加肽的平均反应(表2)。对此的一个解释是这些志愿者具有一些预先存在的抗分枝杆菌免疫性，其经由MVA85A的免疫而被加强。我们使用了培养的而非体外ELISPOT测定法，来进一步对其考察。已经显示培养的ELISPOT测定法测量中央记忆型T细胞而非由体外ELISPOT测量的活化效应T细胞(Reece，W.H.等，(2004)Nat.Med.10，406-410，Godkin，AJ.等，(2002)J.Immunol.169，2210-2214)。

[0158] 针对来自单独MVA85A组的4名志愿者的预免疫筛查PBMC进行培养的IFN-γELISPOT测定。细胞用结核分枝杆菌PPD、鸟分枝杆菌PPD和重组抗原85A(Ag85A)进行培养。全部4名志愿者对鸟分枝杆菌PPD反应，2/4对结核分枝杆菌PPD反应，而2/4对重组抗原85A(Ag85A)反应(图2)。根据筛查体外ELISPOT，这些志愿者没有一个对结核分枝杆菌PPD或纯化的抗原85(Ag85A)具有任何基线反应。

[0159] 为进一步考察MVA85A免疫后的记忆T细胞反应的诱导，对免疫后3周的PBMC进行体外和培养的ELISPOT测定。细胞使用结核分枝杆菌PPD、鸟分枝杆菌PPD和重组
抗原85A(Ag85A)进行培养。在第3周的体外反应是非常低或检测不到的，然而，根据培养的ELISPOT，在全部5名受试志愿者中存在强烈的反应，这表明经由特异性针对抗原
85A(Ag85A)的中央记忆T细胞的免疫的诱导(图3)。

[0160] 实施例2

[0161] 潜伏感染结核分枝杆菌的受试者的安全性和免疫原性数据

[0162] 使用MVA85A对9名潜伏感染结核分枝杆菌(M.tb)的健康成人进行免疫。在12个月的时期内，以免疫后的规律的时间间隔测量每名受试者中的血浆炎性标志物。在免疫前和免疫后10周，在每名受试者中进行肺部高分辨率CT扫描。进行这些测试以检测肺炎的任何亚临床病征。图5a显示了从所述9名潜伏感染的志愿者获得的体外Elispot的结
果。

[0163] 该组中MVA85A的安全性与在实施例1中描述的先期试验中所观察到的相同。没有检测到局部或全身副作用的增加，也没有检测到任何肺炎病征。炎性标志物在免疫后没有改变，并且通过免疫后CT扫描没有检测到肺炎。

[0164] 作为比较，17名在0.5至37年前已经接受过BCG注射的健康成人使用MVA85A免疫进行加强。实施例1描述了结果。在潜伏感染组(试验7，“T007”)中观察到的免疫后免疫反应的强度类似于在BCG预免疫组(试验5，“T005”)中观察到的免疫反应。结果显示于图5b和5c。

[0165] 该数据是显著的，因为鉴于遍及发展中国家的潜伏感染的流行，重要的是：任何新型的TB疫苗在潜伏感染的受试者中是安全的。另外，加强的免疫原性支持该疫苗作为暴露后疫苗施用至潜伏感染的人的应用，目的为消除这种潜伏感染。

[0166] 免疫反应的持续时间

[0167] BCG预免疫的志愿者在MVA85A加强后的体外ELISPOT反应在免疫后持续至少1年，且预免疫(BCG)和加强(MVA85A)之间既有短间隔(1个月)也有长间隔(超过10年)。

[0168] 图6中显示了在BCG后超过10年使用MVA85A免疫的12名志愿者以及在BCG后1个月使用MVA85A免疫的10名志愿者的长期随访数据。来自两组志愿者的数据显示，免疫后1年时的免疫反应的持久性与免疫后6个月时观察到的持久性处于相同的强度。

[0169] 疫苗诱导的免疫反应的持久性说明记忆反应的诱导。除非已经诱导了记忆反应，否则在使用非复制的疫苗免疫一年后预期不会看到持久的疫苗诱导的反应。

[0170] 预免疫-加强间隔与免疫反应水平之间的相关性

[0171] 图3中显示的数据表明，在MVA85A加强免疫后看到的BCG诱导的免疫反应的加强不依赖于BCG预免疫和MVA85A加强之间的间隔。短(1个月)和长(超过10年)的加强间隔观察到相等的加强。

[0172] 预免疫(BCG)和加强(MVA85A)免疫的间隔与峰(1周)或平高线(6个月)MVA85A诱导的免疫反应之间没有相关性(图7)。

[0173] 因此，在BCG免疫后不久(例如，在发展中国家的婴儿期)或者在更后的时间点(例如，在青春期)，加强分枝杆菌免疫是同样可行的。既在婴儿期加强又在青春期加强是效力试验的可能选择，并且是加强TB疫苗的潜在适应症。

[0174] BCG预免疫-MYA85A加强在猕猴中的免疫原性和保护效力

[0175] 在免疫原性和攻击实验中，使用以下物质对猕猴(6/组)进行免疫：i)单独BCG，ii)BCG并然后在9周后用MVA85A加强，或者iii)盐水(对照组)。所有动物在BCG免疫(或者给对照组盐水免疫)后18周经气管内攻击，然后在安乐死之前被跟随16周。免疫原性结果显示于图8中。

[0176] 图8a显示了该攻击实验中的全部3个组免疫后的IFN-γ平均水平(如3天淋巴细胞刺激试验所测量的)。而在BCG组和BCG预免疫-MVA85A组中，对PPD反应中的IFN-γ水平似乎是相当的，而对Ag85A的反应在BCG预免疫-MVA85A加强组中明显较高。因此，存在单独BCG组(组i)中没有观察到的MVA85A免疫(组ii)后Ag85A特异性IFN-γ分泌
的显著升高(图8a)。

[0177] 图8b显示了该攻击实验中全部3组攻击后的IFN-γ平均水平(如3天淋巴细胞刺激试验所测量的)。在使用结核分枝杆菌攻击后，BCG-MVA85A组(组ii)比单独BCG组
(组i)具有显著较高的Ag85A特异性反应。同时，与盐水组相比较，BCG组和BCG-MVA85A组中的ESAT6/CFP10反应(早期分泌的抗原靶蛋白/培养物滤出液蛋白10)较低，所述ESAT6/CFP10反应是结核分支杆菌特异性免疫反应(强度与细菌免疫量有关)。这两组之间的PPD反应是相当的。ESAT6/CFP10结果是重要的(最底下的小图)，因为这些抗原是TB特异性的，并且针对这些抗原的免疫反应的水平与细菌免疫量相关(即，细菌免疫量越高(盐水组)，则对ESAT6和CFP10的免疫反应越高)。与盐水组相比，BCG组和BCG-MVA85A组中较低水平的ESAT6/CFP10反应意味着疫苗的保护效力。

[0178] 在尸检时，在BCG-MVA85A组中观察到比单独BCG组中少很多的病理改变。这两组中细菌免疫量的减少为：BCG-MVA85A组，0.97；单独BCG组，0.42。

[0179] 猕猴是良好的人类疾病模型，尽管动物的数目小，但这一充满前景的保护效力的提高表明，预期在人类中具有相似的效力结果。

[0180] 南非成人中II期研究的安全性和免疫原性数据

[0181] 已经在南非的西开普开始了II期安全性和免疫原性研究。该试验是在成人中进行，且目标是24名受试者。该研究排除了潜伏感染的受试者。目前，已经对12名受试者进行了免疫。根据其免疫后1周的Elispot测定，全部12名受试者具有显著的MVA85A诱导的免疫反应。

[0182] 目前的安全性特征与在英国和冈比亚研究中观察到的安全性特征相同。图1和图9a显示了英国研究的结果，图9b显示了冈比亚研究的结果。

[0183] 总计，在冈比亚对11名BCG首次接触志愿者和10名BCG预免疫志愿者进行了免疫。BCG首次接触组的免疫原性结果(图9b)类似于在英国的BCG预免疫组的免疫原性结
果(图1b、1c、1d)，这是因为其在随访期间保持在基线之上。这可能反映了较大程度的经由处于基线的环境分枝杆菌的预免疫，还反映了正在暴露于维持所述反应的环境分枝杆菌。

[0184] 在冈比亚的BCG首次接触组和BCG预处理组之间没有显著差异，其如上解释为该组中较大程度的环境预处理。相反，在英国，BCG首次接触组的免疫原性结果在随访过程中返回至基线(图9a和图1b、1c和1d)，而BCG预处理组在随访期间保持在基线之上(图1b、1c和1d)。

[0185] 贯穿BCG文献，在不同国家和洲有许多保护效力广泛差异性的实例。在英国、西非和南非，MVA85A一致的安全性和免疫原性特征是非常显著的。

[0186] 小鼠中表达抗原85A(Ag85A)的腺病毒的免疫原性

[0187] 表达抗原85A(Ag85A)的重组腺病毒(人类株5，删除了E1和E3)已显示在小鼠中单独施用时诱导了强烈的免疫反应(CD4反应c 800斑/百万脾细胞；CD8反应c 1200斑/百万脾细胞)。当施用至之前已经接受过BCG的小鼠时，该表达抗原85A(Ag85A)的腺病毒刺激了甚至更强的反应(CD4反应c 1400斑/百万脾细胞；CD8反应c 2500斑/百万脾细
胞)。因此，值得注意地，显示该腺病毒载体除了诱导非常强的CD4 T细胞反应外，还诱导非常强的CD8 T细胞反应，并且经由相同疫苗对这些反应的诱导可能在预防和治疗分枝杆菌疾病中都有益处。之前，腺病毒载体已经被视为诱导CD8 T细胞反应的良好方法，但在这里，表明CD4和CD8反应都被强有力地诱导了。该数据表明腺病毒载体可以是BCG预免疫的T细胞反应的强有力加强剂。

[0188] 以上只是通过举例的方式描述了本发明。应该理解，可以在不背离本发明的范围的情况下，作出细节的修改。

[0189] AG85A特异序列

[0190] SEQ ID NO：1(AG85A多肽序列)

[0191] MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMG

[0192] RDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSD

[0193] WYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQF

[0194] VYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNT

[0195] RVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYW

[0196] GAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA

[0197] SEQ ID NO：2(AG85A核苷酸序列)

[0198] atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtg

[0199] gtcggggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacg

[0200] gcgaccgcgggggcattttcccggccgggcttgccggtggagtacctgcaggtgccg

[0201] tcgccgtcgatgggccgtgacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcg

[0202] cccgccctgtacctgctcgacggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggac

[0203] atcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccg

[0204] gtgggtggccagtcaagcttctactccgactggtaccagcccgcctgcggcaaggcc

[0205] ggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgaccagcgagctgccggggtggctg

[0206] caggccaacaggcacgtcaagcccaccggaagcgccgtcgtcggtctttcgatggct

[0207] gcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttcgtctacgcggga

[0208] gcgatgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtcccaccctgatcggcctg

[0209] gcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgaaggaggac

[0210] ccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtcgggaagctgatcgccaacaac

[0211] acccgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaac

[0212] ctgccggccaagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaacatcaagttccaagac

[0213] gcctacaacgccggtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccggacagcggtacg

[0214] cacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgg

[0215] gcactgggtgccacgcccaacaccgggcccgcgccccagggcgcctag

[0216] SEQ ID NO：3(15氨基酸AG85A平截多肽序列)

[0217] MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMG

[0218] RDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSD

[0219] WYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQF

[0220] VYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNT

[0221] RVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYW

[0222] GAQLNAMKPDLQR

[0223] SEQ ID NO：4(15氨基酸AG85A平截核苷酸序列)

[0224] atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcgg

[0225] ggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacggcgaccgcgg

[0226] gggcattttcccggccgggcttgccggtggagtgcctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggc

[0227] cgtgacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcgcccgccctgtacctgctcga

[0228] cggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggacatcaacaccccggcgttcgagtggt

[0229] acgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccggtgggtggccagtcaagcttctactccgac

[0230] tggtaccagcccgcctgcggcaaggccggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgac

[0231] cagcgagctgccggggtggctgcaggccaacaggcacgtcaagcccaccggaagcgccgtcg

[0232] tcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttc

[0233] gtctacgcgggagcgatgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtcccaccctgat

[0234] cggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgaaggagg

[0235] acccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtcgggaagctgatcgccaacaacacc

[0236] cgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaacctgccggc

[0237] caagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaacatcaagttccaagacgcctacaacgccg

[0238] gtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccggacagcggtacgcacagctgggagtactgg

[0239] ggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgg

[0240] SEQ ID NO：51176核苷酸序列的插入片段如下(上例中表达的序列，下划线的Ag85A编码序列)：

[0241] tctgtacgggcccgtacggtaccgagctcggatctgcgcgccgccaccATGGATGCA

[0242] ATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCC

[0243] AGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAGGATCTATGCAGCTTGTTGACAGGGTT

[0244] CGTGGCGCCGTCACGGGTATGTCGCGTCGACTCGTGGTCGGGGCCGTCGGCGCGGCC

[0245] CTAGTGTCGGGTCTGGTCGGCGCCGTCGGTGGCACGGCGACCGCGGGGGCATTTTCC

[0246] CGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGAC

[0247] ATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC

[0248] GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAG

[0249] TGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTC

[0250] TACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGG

[0251] GAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAG

[0252] CCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTG

[0253] GCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGAC

[0254] CCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGC

[0255] TACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGAC

[0256] CCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGC

[0257] GGCAACGGCAAGCTGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAG

[0258] GGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGC

[0259] CACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGC

[0260] GCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGT

[0261] GGATCCATTCCAAACCCTTTGCTGGGATTGGACtgactgcagatatccatcacactg

[0262] SEQ ID NO：6

[0263] MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGSMQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAV

[0264] GAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALY

[0265] LLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQT

[0266] YKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSG

[0267] LLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQNDPLLNVGKLIANNTRVWV

[0268] YCGNGKLSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEY

[0269] WGAQLNAMKPDLQRGSIPNPLLGLD

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一种智能车载无线充电装置	2020-05-11	764
具有罕见词处理的神经机器翻译系统	2020-05-11	222
一种面向小语种语言的神经机器翻译方法	2020-05-16	631
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