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包含脂肪酶的洗涤剂组合物

阅读：647发布：2020-05-08

专利汇可以提供包含脂肪酶的洗涤剂组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含亲本脂肪酶的脂肪酶变体，所述脂肪酶变体具有脂肪酶活性并且包含使用SEQ ID NO:2进行编号时对应于G23S、D27N、A40、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的一个或多个替换。本发明还公开了水溶性单位剂量制品，所述水溶性单位剂量制品包括水溶性膜和包含脂肪酶变体的洗涤剂组合物。本发明还公开了使用此类组合物清洁和/或处理表面的方法。，下面是包含脂肪酶的洗涤剂组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种水溶性单位剂量制品，包括水溶性膜和液体衣物洗涤剂组合物，其中所述液体衣物洗涤剂组合物包含：亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性并且包含：(i)在对应于位置40、118、T244E和V60E的位置处的一个或多个替换；以及(ii)在对应于T231R和N233R的位置处的一个或多个替换；
以及洗涤剂助剂。
2.根据权利要求1所述的水溶性单位剂量制品，包含在对应于位置40和118，优选地对应于A40I和R118F的位置处的一个或多个替换。
3.一种水溶性单位剂量制品，包括水溶性膜和液体衣物洗涤剂组合物，其中所述液体衣物洗涤剂组合物包含：亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；以及在对应于位置T231R、N233R的位置处的一个或多个替换；以及洗涤剂助剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述脂肪酶变体包含T231R+N233R以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换。
5.根据前述权利要求1中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述变体包含对应于下列一组替换中的任一者的替换：
6.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品：
其中所述变体包含对应于E56R+T231R+N233R的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换。
7.根据权利要求1所述的水溶性单位剂量制品，其中所述变体还包含P256T。
8.根据权利要求1所述的水溶性单位剂量制品：
其中所述变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换；或者
其中所述变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换以及在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个替换。
9.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述变体包含在对应于下列一组替换中的一者的位置处的替换：
R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+D57N+R118F+T231R+N233R；
E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
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D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；
G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；
G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T。
10.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中一种或多种脂肪酶被包封在微胶囊中，其中所述微胶囊的隔膜优选地通过使分子量大于1kDa的多支化多胺交联制得。
11.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述洗涤剂组合物为液体的形式，所述液体优选地包含少于20重量％的水。
12.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述洗涤剂组合物包含选自羧甲基纤维素、疏水改性的羧甲基纤维素或它们的混合物的聚合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述非皂阴离子表面活性剂包括直链烷基苯磺酸盐、烷氧基化烷基硫酸盐或它们的混合物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品，其中所述液体衣物洗涤剂组合物包含：
a.阳离子多糖，所述阳离子多糖选自阳离子改性的羟乙基纤维素、阳离子改性的羟丙基纤维素、阳离子改性的和疏水改性的羟乙基纤维素、阳离子改性的和疏水改性的羟丙基纤维素，或它们的混合物；
b.烷氧基化的聚乙烯亚胺；
c.它们的混合物。
15.一种用于洗涤织物的方法，包括以下步骤：
a.将根据前述权利要求中任一项所述的水溶性单位剂量制品与足够的水混合以溶解所述水溶性膜并且将所述衣物洗涤剂组合物稀释以形成洗涤液体；
b.使所述洗涤液体与待洗涤的至少一件织物接触。

说明书全文

包含脂肪酶的洗涤剂组合物

[0001] 序列表的引用

[0002] 本专利申请包含计算机可读格式的序列表，其以引用方式并入。

技术领域

[0003] 本发明涉及包含脂肪酶的洗涤剂组合物和包含该洗涤剂组合物的水溶性单位剂量制品，以及制备和使用此类组合物的方法。本发明还涉及液体产品洗涤剂组合物和包含
洗涤剂组合物的水溶性单位剂量制品，其中脂肪酶变体被包封在微胶囊中。此类组合物和
制品优选为织物和家用护理产品，最优选用于衣物洗涤。

背景技术

[0004] 洗涤剂制造商一直尝试提供清洁组合物，尤其是织物和餐具清洁组合物，所述组合物提供最强力的清洁体系。脂肪酶是重要的生物催化剂，已证实脂肪酶在洗涤剂组合物
中非常有用，通过使甘油三酯水解生成脂肪酸而有助于移除油性污垢和污渍。水解后，在存在其他洗涤剂组分的情况下，水解的污垢更容易在洗涤过程中从织物表面移除。许多已知
的脂肪酶提供良好的洗涤性能，然而，它们可能也易于在洗涤期间形成产生气味的短链脂
肪酸并且/或者具有短储存稳定性。

[0005] 例如，当与洗涤剂组合物的不相容组分接触时，或者在储存期间或者在洗涤或处理步骤期间暴露于比环境温度显著更高或更低的温度时，稳定性可能特别成问题。如果稳
定性不足够强大，则这导致该组合物作为一个整体损失活性或功效，并且具体地损失酶活
性。以商品名LIPOLASETM销售的野生型疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶(同义词柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))及其变体已被商品化为洗涤剂组合物中的
活性成分，用于通过使甘油三酯水解生成脂肪酸来移除脂质污渍。然而，仍然需要包含脂肪酶的组合物，该组合物可提供良好的洗涤性能、减少的气味产生和/或改善的储存稳定性/
更长的保质期/增加的热稳定性。

发明内容

[0006] 本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性并且
包含：(i)在对应于位置40、118、T244E和V60E的位置处的一个或多个替换；以及(ii)在对应于T231R和N233R的位置处的一个或多个替换。优选地，脂肪酶变体包含在对应于位置40和
118两者的位置处的替换，更优选地在对应于A40I和R118F的位置处的一个或多个替换。

[0007] 本发明还涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含：亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换；以及洗涤剂助剂。优选地，洗涤剂组合物为液体形式，优选地包含少于20重量％的水。

[0008] 在另一个方面，本发明还涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％
的序列同一性并且包含：(i)在对应于位置23、51和56的位置处的一个或多个替换，优选地在对应于G23S、F51I,L和E56R的位置处的一个或多个替换；以及(ii)在对应于T231R和
N233R的位置处的一个或多个替换；以及优选地(iii)在对应于27、40、57、60、98、101、118、
163、220、244和256的位置处的一个或多个替换，优选地在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换。

[0009] 本发明还提供了一种包含水溶性膜和洗涤剂组合物的水溶性单位剂量制品，该洗涤剂组合物包含：如上所述的脂肪酶变体；以及洗涤剂助剂。脂肪酶变体可以液体组合物或固体组合物形式存在于水溶性单位剂量制品中。优选地，包含脂肪酶变体的洗涤剂组合物
为液体组合物。

[0010] 本发明还涉及一种制备包含脂肪酶变体的洗涤剂组合物的方法，该方法包括将洗涤剂助剂和脂肪酶变体混合以形成洗涤剂组合物的第一步骤。优选地，随后洗涤剂组合物
任选地通过将洗涤剂组合物包裹在膜(优选水溶性膜)中而形成为单位剂型。脂肪酶变体优
选地以包含少于20重量％的水的组合物形式存在于本文洗涤剂组合物中。水溶性单位剂量
制品可包括一个隔室或多于一个隔室。水溶性单位剂量制品在一个或多个隔室中，最优选
地在多隔室单位剂量洗涤剂的一个隔室中包含脂肪酶变体。

[0011] 本发明还涉及一种用于洗涤织物的方法，该方法包括以下步骤：

[0012] (i)形成包含水和本文所述的洗涤剂组合物的含水洗涤液体；

[0013] (ii)(ii)优选地在60℃或更低，或者优选地40℃以下或更低，或者优选地30℃或更低的温度下，用含水洗涤液体处理表面；以及

[0014] (iii)(iii)冲洗该表面。在一种优选的方法中，将根据本发明的水溶性单位剂量制品与足够的水混合以溶解水溶性膜，并且将衣物洗涤剂组合物稀释优选地介于300倍和
3000倍之间的倍数，从而形成含水洗涤液体。

[0015] 优选地，脂肪酶变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个替换以及在对应于T231R和N233R的位置处的
一个或优选两个替换。

[0016] 优选的变体包含在对应于F51I,L的位置处的替换。优选的变体包含在对应于E56R的位置处的替换。优选的变体包含在对应于R118F的位置处的替换。优选的变体包含在对应于F51I,L、E56R和/或R118F的位置处的一个或多个替换。优选的变体包含在对应于P256T的位置处的替换。优选的变体包含在对应于D27N的位置处的替换。优选的变体包含在对应于
G23S的位置处的替换。优选的变体包含在对应于T244E的位置处的替换。优选的变体包含在对应于A40I的位置处的替换。优选的变体包含在对应于K98I的位置处的替换。优选的变体
包含在对应于D57N的位置处的替换。优选的变体包含在对应于Y220F的位置处的替换。优选的变体包含在对应于G163S的位置处的替换。

[0017] 在一个方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含包封在微胶囊中的脂肪酶，优选脂肪酶变体。根据一个优选的方面，微胶囊的隔膜通过使分子量大于1kDa的多支化多胺交联制得。在另一个方面，洗涤剂组合物包含微胶囊组合物，该微胶囊组合物包含优选地包埋在由隔膜形成的隔室中的本发明的脂肪酶变体，所述隔膜通过使(a)分子
量大于800Da的多支化多胺和(b)分子量小于300Da的脂族或芳族胺交联制得；其中(a)/(b)
的重量比在0.1至1000的范围内。

[0018] 脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase/lipase enzyme)”、“脂解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”和“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的酶。它可具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、甾醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡-酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。就本发明的目的而言，根据实例中所述的步骤测定脂肪酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的多肽的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

[0019] 在一个方面，本发明涉及水溶性单位剂量制品，该水溶性单位剂量制品包括水溶性膜和洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含脂肪酶变体和洗涤剂助剂，包含微胶囊组合物，其中微胶囊的隔膜通过使分子量大于1kDa的多支化多胺交联制得，其中微胶囊包含本发明
的脂肪酶变体。

[0020] 等位变体：术语“等位变体”指占据相同染色体座位的基因的任何两个或更多个供选择的替代形式。等位变体天然来源于突变，并且可导致种群内的多态性。基因突变可为沉默突变(不改变编码的多肽)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

[0021] cDNA：术语“cDNA”是指可通过逆转录从自真核或原核细胞获得的成熟的、经拼接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初始RNA转录物是mRNA的前体，其在作为成熟的经拼接的mRNA出现之前，通过一系列步骤，包括拼接，被加工。

[0022] 编码序列，术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接规定变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，它起始于起始密码子诸如ATG、GTG或TTG，并终止于终止密码子诸如TAA、TAG、和TGA。所述编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或它们的组合。

[0023] 对照序列：术语“对照序列”是指编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个对照序列对于编码变体的多核苷酸可为原生的(即，出自相同基因)或外源的(即，出自不同基因)，或彼此原生或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。调控序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有助于对照序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接的特
异性限制性位点的目的，对照序列可具有接头。

[0024] 洗涤剂助剂：是指针对所期望的洗涤剂组合物的特定类型和产品形式(例如液体、颗粒、粉末、条状物、糊剂、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)所选择的任何液体、固体或气体材料。

[0025] 洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”用于提及旨在用于清洁脏污物体的洗涤过程中的混合物。该术语具体地用于提及洗涤织物和/或服装(例如“衣物洗涤剂”)。除非另外指明，否则这些可包括颗粒或粉末形式的多功能或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂状的多功能洗涤剂，尤其是所谓的重垢型液体(HDL)类型；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢型餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机洗餐具洗涤剂，包括各种供家庭和机构使用的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，以及清洁辅助剂诸如漂白添加剂和“去污棒”或预处理型。在可供选择的方面，该术语是指其它洗涤剂，诸如用于清洁盘碟、餐具等的那些洗涤剂(例如“盘碟洗涤剂”)。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。预期除了本发明所必需的变体之外，该术语还涵盖可包含任何洗涤剂助剂的洗涤剂，该洗涤剂助剂例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白体系或漂白组分、聚合物、织物调理剂、促泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、增溶剂和溶剂。洗涤剂组合物也可在洗涤步骤或在织物处理步骤中用于处理织物，例如它们可提供织物清新、织物软
化和/或着色焕新步骤。本文的洗涤剂组合物尤其被包含在水溶性单位剂量制品中。

[0026] 表达：术语“表达”包括变体的产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

[0027] 表达载体：术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至提供其表达的对照序列。

[0028] 片段：术语“片段”是指从多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有脂肪酶活性。在一个方面，片段包含SEQ ID NO:2的1至269位氨基酸的数量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％。

[0029] 高严格条件：术语“高严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃下，用2X SSC、0.2％的SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0030] 宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。

[0031] 改善的特性：术语“改善的特性”是指与变体相关联的与亲本脂肪酶相比改善的特征。此类改善的特性包括但不限于洗涤剂稳定性、存在蛋白酶的洗涤剂中的稳定性、蛋白酶稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、pH稳定性、储存条件下的稳定性和热稳定性。

[0032] 分离的：术语“分离的”是指处于非天然存在的形式或环境的物质。分离的物质的非限制性例子包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、多肽或辅因子(是或至少部分地从其天然相关联的组分去除了一种或多种或全部天然存在的组分)的任何物质；(3)相对于天然存在的物质经过人手修改的任何物质；或(4)通过增加相对于其天然相关联的其他组分的物质的量而改性的任何物质(例如，编码该物质的
基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可存在于发酵液体培养基样品中。

[0033] 低严格条件：术语“低严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在50℃下，用2X SSC、0.2％SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0034] 成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(诸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后呈其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的1至269位氨基酸。在本领域中已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

[0035] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列为SEQ ID NO:1的核苷酸1至807。

[0036] 中等严格条件：术语“中等严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在55℃下，用2X SSC、0.2％SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0037] 中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在60℃下，用2X SSC、0.2％SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0038] 突变体：术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。

[0039] 核酸构建体：术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因分离的，或者是以否则将不会天然地存在的方式经过修改以包含核酸的片段的，或者它是合成的，其包含一个或多个对照序列。

[0040] 可操作地连接：术语“可操作地连接”是指一种构型，对照序列在其中被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置上，使得对照序列指导编码序列的表达。

[0041] 亲本或亲本脂肪酶，术语“亲本”或“亲本脂肪酶”是指对其进行改变以制备本发明的酶变体的脂肪酶。亲本脂肪酶可为天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

[0042] 序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，这种相关性用参数“序列同一性”描述。

[0043] 就本发明的目的而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如在EMBOSS程序包的
Needle程序中实现(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,
Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0或更新的版本。所用的参数是，为
10的空位罚分，为0.5的空位延伸罚分，和EBLOSUM62(EMBOSS版的BLOSUM62)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

[0044] (相同残基×100)/(序列长度-序列中的总空位数)

[0045] 就本发明的目的而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定，如在EMBOSS程序包的
Needle程序中实现(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，
Rice等人，2000，见上)，优选5.0.0或更新的版本。所用的参数是10的空位罚分，0.5的空位延伸罚分，和EDNAFULL(EMBOSS版的NCBI NUC4.4)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

[0046] (相同脱氧核糖核苷酸×100)/(序列长度-序列中的总空位数)。

[0047] 稳定性：本发明的脂肪酶变体的稳定性可表示为在暴露于各种测试条件期间或之后，所述脂肪酶的残余活性或残余性能，各种测试条件诸如例如储存在洗涤剂组合物中，在不同温度下，在各种pH下，在存在不同组分诸如蛋白酶、化学品和/或氧化物质(胁迫条件)的情况下或在用于洗涤过程期间。脂肪酶变体的稳定性可相对于亲本脂肪酶例如如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶的已知活性或性能，或者另选地相对于当最初添加到任选地冷藏或冷冻
储存的洗涤剂组合物中时脂肪酶变体的已知活性或性能，或者相对于冷藏或冷冻储存(非
胁迫条件)的脂肪酶变体来测量。

[0048] 亚序列：术语“亚序列”是指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失了一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一个方面，亚序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸1至807的数量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％但小于100％。

[0049] 变体：术语“变体”是指在一个或多个(例如，若干个)位置包含改变(即替换、插入和/或缺失)的具有脂肪酶活性的多肽。替换是指占据一个位置的氨基酸被不同的氨基酸替代。缺失是指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入是指在邻近和紧接着占据一个位置
的氨基酸处添加氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的多肽的脂肪酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少
100％。

[0050] 非常高的严格条件：术语“非常高的严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在70℃下，用2X SSC、
0.2％SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0051] 非常低的严格条件：术语“非常低的严格条件”是指对于至少100个核苷酸长度的探针，按照标准Southern印迹法步骤，在42℃下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/mL经过剪切和变性的鲑鱼精DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在45℃下，用2X SSC、
0.2％SDS最后清洗载体材料三次，每次15分钟。

[0052] 野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶是指由天然存在的微生物(诸如细菌、酵母或天然存在的丝状真菌)表达的脂肪酶。

[0053] 变体设计的规则

[0054] 就本发明的目的而言，将如SEQ ID NO:2公开的多肽用于测定另一种脂肪酶中对应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2进行比对，并且基于该比
对，确定对应于SEQ ID NO:2中公开的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置数，其使用了Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如在EMBOSS程序包的Needle程序中实现(EMBOSS:The European Molecular Biology Open
Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0或更新的版本。
所用的参数是，为10的空位罚分，为0.5的空位延伸罚分，和EBLOSUM62(EMBOSS版的
BLOSUM62)取代矩阵。

[0055] 另一种脂肪酶中对应的氨基酸残基的鉴定可通过多个多肽序列的比对来确定，其使用了若干个计算机程序，包括但不限于MUSCLE(multiple sequence comparison by
log-expectation；版本3.5或更新的；Edgar，2004，Nucleic Acids Research 32：1792-
1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，Nucleic Acids Research 30:
3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research 33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics 23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology 537:39-
64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics 26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新的；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)，使用它们各自的默认参数。

[0056] 当另一种酶与SEQ ID NO:2的多肽存在分化由此使得传统的基于序列的比较未检测出它们的关系(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.295:613-615)时，可使用其他两两序列比较算法。使用利用了多肽家族的概率表现(谱)来检索数据库的检索程序能够获得
基于序列的检索中的更高灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远缘同系物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，能够实现甚至更高的
敏感性。诸如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones，
2003，Bioinformatics 19:874-881)的程序利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结
构预测、结构比对谱和溶解能)作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似
地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.313:903-919的方法能够被用于将未知结构的序列与
SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且
可以使用多种为此目的开发的工具来评估这类模型的精确性。

[0057] 对于已知结构的蛋白质，已经有数种用于检索和生成其结构性比对的工具和资源。例如，蛋白质的SCOP超家族已经过结构性比对，并且可以获取和下载那些比对。可使用多种算法诸如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins 33:88-96)或组合延伸
(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering 11:739-747)来比对两个或多个蛋白
结构，这些算法的实现可以另外用于使用感兴趣的结构来检索结构数据库以发现可能的结
构同系物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics 16:566-567)。

[0058] 在对本发明的所述变体的描述中，使用以下命名法以便于参考。使用了公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

[0059] 替换对于氨基酸替换，使用下列命名法：初始氨基酸，位置，替换后的氨基酸。相应地，在位置226处的苏氨酸用丙氨酸替换被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。用加号(“+”)分隔多个突变，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和411处分别用精氨酸(R)替换甘氨酸(G)以及用苯丙氨酸(F)替换丝氨酸(S)。

[0060] 缺失对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸，位置，*。相应地，在位置195处的甘氨酸的缺失被命名为“Gly195*”或“G195*”。用加号(“+”)分隔多个缺失，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

[0061] 插入对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。相应地，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2等等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为
“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

[0062] 在这类情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号上添加小写字母，来对插入氨基酸残基编号。如此，在上述例子中，序列将是：

[0063] 亲本：变体：195 195 195a 195b
G G-K-A

[0064] 多种改变包含多种改变的变体用加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表分别在位置170和195处用酪氨酸替换精氨酸及用谷氨酸替换甘氨酸。

[0065] 不同的改变在某一个位置处可以引入不同的改变的情况下，用逗号分开不同的改变，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”代表在位置170处用酪氨酸或谷氨酸替换精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了下列变体：

[0066] “Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

[0067] 本发明公开了包含亲本脂肪酶变体的组合物，所述变体具有脂肪酶活性，与例如来源于疏绵状嗜热丝孢菌的SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性。

[0068] 图1是根据本发明的水溶性单位剂量制品。

[0069] 图1公开了根据本发明的水溶性单位剂量制品(1)。水溶性单位剂量制品(1)包括在密封区域(4)处密封在一起的第一水溶性膜(2)和第二水溶性膜(3)。衣物洗涤剂组合物
(5)被包含在水溶性单位剂量制品(1)内。

[0070] 变体

[0071] 本发明提供了一种洗涤剂组合物和包含洗涤剂组合物的水溶性单位剂量制品，该洗涤剂组合物包含：亲本脂肪酶的变体，所述变体具有脂肪酶活性，与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0072] 优选地，脂肪酶变体与SEQ ID NO:2具有至少60％但小于100％的序列同一性，并且包含在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N,E和P256T的位置处的一个或多个替换。优选地，该变体在对应于T231R和/或N233R的位置处另外包含一个或两个替换。

[0073] 优选的变体包含在对应于G23S的位置处的替换。优选的变体包含在对应于D27N的位置处的替换。优选的变体包含在对应于A40l的位置处的替换。优选的变体包含在对应于
F51I,L的位置处的替换。优选的变体包含在对应于E56R的位置处的替换。优选的变体包含
在对应于D57N的位置处的替换。优选的变体包含在对应于V60E,K的位置处的替换。优选的
变体包含在对应于K98I的位置处的替换。优选的变体包含在对应于N101D的位置处的替换。
优选的变体包含在对应于R118F的位置处的替换。优选的变体包含在对应于G163S的位置处
的替换。优选的变体包含在对应于Y220F的位置处的替换。优选的变体包含在对应于T244E
的位置处的替换。优选的变体包含在对应于P256T的位置处的替换。

[0074] 优选的变体包含在对应于F51I,L、E56R和/或R118F的位置处的一个或多个替换。

[0075] 在优选的实施方案中，本发明的变体包含下列一组替换中的任一者：

[0076]

[0077]

[0078] 在一个实施方案中，变体包含在对应于T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0079] 在一个优选的实施方案中，变体包含对应于E56R+T231R+N233R的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、R118F、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0080] 在一个优选的实施方案中，变体包含在对应于R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0081] 在一个更优选的实施方案中，变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0082] 在一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0083] 在一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0084] 在一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0085] 在另一个更优选的实施方案中，变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0086] 在另一个更优选的实施方案中，变体包含在对应于G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于D27N、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0087] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0088] 在又一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0089] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0090] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、A40I、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0091] 在又一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、D57N、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0092] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、K98I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0093] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0094] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0095] 在另一个更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60EK、N101D、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0096] 在另一个更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60EK、
N101D、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0097] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、Y220F和+P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0098] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、
V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0099] 在另一个甚至更优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、
V60E,K、N101D和Y220F的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0100] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F、T244E和P256T的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0101] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0102] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0103] 在另一个优选的实施方案中，变体包含在对应于F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T的位置处的替换和在对应于G23S、D27N、A40I、V60E,K、N101D、G163S、Y220F和T244E的位置处的一个或多个(例如，若干个)替换。

[0104] 特别优选的实施方案包括在对应于下列一组替换中的一者的位置处包含替换的变体：

[0105] R118F+T231R+N233R+P256T；

[0106] A40I+R118F+T231R+N233R；

[0107] F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0108] F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0109] E56R+D57N+R118F+T231R+N233R；

[0110] E56R+V60K+R118F+T231R+N233R；

[0111] G23S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0112] D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0113] F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0114] E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0115] G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0116] G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0117] G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0118] D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0119] D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0120] F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0121] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0122] G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0123] G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0124] G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0125] G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0126] D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0127] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0128] A40I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0129] F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0130] D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0131] K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0132] G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0133] A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0134] A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0135] A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0136] A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0137] A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0138] F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0139] F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0140] F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0141] F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0142] D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0143] D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0144] D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0145] K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0146] K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0147] G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0148] A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0149] A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0150] A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0151] A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0152] A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0153] A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0154] A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0155] A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0156] A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0157] A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0158] F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0159] F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0160] F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0161] F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0162] F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0163] F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0164] D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0165] D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0166] D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0167] K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0168] A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0169] A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0170] A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0171] A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0172] A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0173] A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0174] A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0175] A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0176] A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0177] A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0178] F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0179] F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0180] F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0181] F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0182] D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0183] A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0184] A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

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[0187] A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

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[0339] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0340] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0341] G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0342] G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0343] G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0344] G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0345] G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0346] G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0347] G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0348] G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0349] G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0350] G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0351] G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0352] G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0353] G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0354] G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0355] G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0356] G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0357] D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0358] D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0359] D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0360] D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0361] D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0362] D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0363] D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0364] D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0365] D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0366] D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0367] F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0368] F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0369] F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0370] F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0371] K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0372] G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R；

[0373] G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0374] G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0375] G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0376] G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0377] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0378] G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0379] G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0380] G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0381] G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0382] G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0383] G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0384] G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0385] G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0386] G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0387] D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0388] D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0389] D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0390] D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0391] D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0392] F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0393] G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E；

[0394] G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T；

[0395] G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0396] G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0397] G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0398] G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0399] D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0400] G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T；

[0401] G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T。

[0402] 脂肪酶变体优选地具有与亲本脂肪酶至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。

[0403] 变体优选地具有与SEQ ID NO:2至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。

[0404] 变体可具有1-40个、1-30个、1-20个，诸如1-12个，诸如1-11个，诸如1-10个，诸如1-9个，诸如1-8个，诸如1-7个，诸如1-6个，诸如1-5个，诸如1-4个，诸如1-3个，或诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、
19个或20个替换。

[0405] 与亲本脂肪酶相比，变体可具有以下特性中的一种或多种：改善的洗涤性能、减少的气味产生、改善的储存稳定性、更长的保质期和/或增加的热稳定性。

[0406] 脂肪酶变体还可包含在一个或多个(例如，若干个)其他位置处的一个或多个另外的替换。

[0407] 氨基酸改变可为次要性质的，即保守氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失，通常为1-30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的小的接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能以利于纯化的小的延伸，诸如聚组氨酸束、抗原表位或结合结构域。

[0408] 保守取代的示例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸)的组内。通常不改变比活性的氨基酸替换是本领域已知的，并且由例如
H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York进行了描述。常见的替换有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

[0409] 作为另外一种选择，氨基酸变化具有此类性质：使所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善所述多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等等。

[0410] 多肽中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244:1081-1085)。在后一种技术中，单个丙氨酸突变被引入分子中的每一残基，并且针对脂肪酶活性测试所得的突变型分子，以鉴定
对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还可参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:
4699-4708。所述酶的活性位点或其它生物学相互作用还可通过结构的物理分析进行测定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，与推定接触位点氨基酸突变的技术一起所测定的。参见，例如，de Vos等人，1992，Science 255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，(1992)FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的同一性也可从与相关多肽的比对来推断。

[0411] 变体可由以下组成或含有SEQ ID NO:2的氨基酸的数量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

[0412] 亲本脂肪酶

[0413] 亲本脂肪酶可选自：

[0414] a)具有与SEQ ID NO:2至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％的序列同一性的多肽；

[0415] b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中等严格条件、中等-高严格条件、高严格条件或非常高的严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列或(ii)(i)
的全长互补序列杂交；

[0416] c)由多核苷酸编码的具有与SEQ ID NO:1至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽；和

[0417] d)SEQ ID NO:2的多肽的片段。

[0418] 在本发明的一个方面，亲本脂肪酶与SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，该亲本脂肪酶具有脂肪酶活性。

[0419] 在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽的差异多达40个氨基酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个氨基酸。

[0420] 在另一个方面，亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。

[0421] 在另一个方面，亲本为SEQ ID NO:2的多肽的片段，包含SEQ ID NO:2的氨基酸的数量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少
85％、至少90％或至少95％。

[0422] 在另一个实施方案中，亲本是SEQ ID NO:2的多肽的等位变体。

[0423] 在另一个方面，亲本脂肪酶由多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低的严格条件、低严格条件、中等严格条件、中等-高严格条件、高严格条件或非常高的严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补序列杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

[0424] SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或菌种的菌株的亲本的
DNA。具体地，此类探针可用于按照标准的Southern印迹法步骤与所关注的细胞的基因组
DNA或cDNA杂交，以鉴定并分离其中对应的基因。此类探针可比完整序列显著地更短，但是其长度应为至少15个，例如，至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。可使用DNA和RNA探针两者。探针通常进行标记以用于检测对应的基因(例如，用32P、
3H、35S、生物素或亲和素标记)。本发明涵盖此类探针。

[0425] 可筛选从此类其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库，以获取与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术分离来自此类其它
菌株的基因组或其它DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可被转移并固定在硝化纤维素或其
他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列杂交的克隆或DNA，将载体材料
用于Southern印迹法。

[0426] 出于本发明的目的，杂交指示在非常低至非常高的严格条件下多核苷酸与对应于下列物质的经标记核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的多肽编码序列；
(iii)其全长互补序列；或(iv)其亚序列。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段进行检测。

[0427] 在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸的数量的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸；其多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

[0428] 在另一个实施方案中，亲本由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％或100％的序列同一性。

[0429] 所述多肽可为杂交体多肽，其中一种多肽的一个区域被融合到另一种多肽的一个区域的N末端或C末端。

[0430] 亲本脂肪酶可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽被融合至本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合至本发明的多核苷酸来
制备融合多肽。用于制备融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码
序列以使它们在阅读框中，和使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。也可使
用内含肽技术构建融合多肽，该技术中融合多肽是翻译后创建的(Cooper等人，1993，EMBO J.12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science 266:776-779)。

[0431] 融合多肽还可包含两种多肽之间的切割位点。在分泌融合蛋白时，所述位点被切割，释放了两种多肽。切割位点的示例包括但不限于Martin等人，2003，
J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.76:245-
251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等人，
1995，Biotechnology 13:498-503；以及Contreras等人，1991，Biotechnology 9:378-381；
Eaton等人，1986，Biochemistry 25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology
13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure，Function，and Genetics 6:240-
248；和Stevens，2003，Drug Discovery World 4:35-48中公开的位点。

[0432] 亲本脂肪酶可获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文所用，与给定来源相关的术语“得自”是指由多核苷酸编码的亲本由该来源或者由来自该来源的多核苷酸已被插入至其中的菌株产生。在一个方面，亲本被分泌到细胞外。

[0433] 所述亲本可为细菌的脂肪酶。例如，亲本可为革兰氏阳性细菌多肽，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽胞杆菌属
(Oceanobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌属
(Streptomyces)或高温双岐菌属(Thermobifida)脂肪酶，或革兰氏阴性细菌多肽，诸如弯
曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭菌属
(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌属
(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或尿原体
(Ureaplasma)脂肪酶。

[0434] 在一个方面，亲本为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌
(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus
coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌
(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌
(Bacillus thuringiensis)脂肪酶。

[0435] 在另一个方面，亲本为似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种
(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)脂肪酶。

[0436] 在另一个方面，亲本为不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌
(Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)脂肪酶。

[0437] 在另一个方面，亲本为嗜热放线菌(Thermobifida alba)或嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(以前称为好热性放线菌(Thermomonaspora fusca))脂肪酶。

[0438] 所述亲本可为真菌脂肪酶。例如，所述亲本可为酵母脂肪酶，诸如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属
(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)脂肪酶；
或丝状真菌脂肪酶，诸如支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属
(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、出芽短梗霉(Aureobasidium)、葡萄座腔菌
(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属
(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌(Cochliobolus)、拟鬼伞属
(Coprinopsis)、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、丛赤壳属
(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、二孢菌属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、全鞭毛虫属
(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、节毛菌属(Meripilus)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属
(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属
(Penicillium)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、泼氏霉属
(Poitrasia)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢霉属(Scytalidium)、踝节菌属
(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属
(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属
(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)脂肪酶。

[0439] 在另一个方面，亲本为卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母
(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母
(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)脂肪酶。

[0440] 在另一个方面，亲本为解纤维素枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus
foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus
oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium
keratinophilum)、勒克瑙金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、奠状金孢子菌
(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌
(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢
子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢
(Fusarium cerealis)、克地镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢(Fusarium
culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、杆孢状镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium
oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、簇囊镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、毒性镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉
(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola
lanuginosa)、乳白粑齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉
(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌
(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳
(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia
australeinsis)、菲美蒂梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia
microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳
(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉
(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichoderma
longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)脂
肪酶。

[0441] 在另一个方面，亲本为疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，例如，具体地SEQ ID NO:2的脂肪酶。

[0442] 应当理解，对于前述的菌种，可用于本发明的变体涵盖完全和不完全两个阶段，以及其他分类学的等同物，例如无性型，而无论它们已知的菌种名如何。本领域的技术人员将容易地识别合适等同物的性质。

[0443] 公众能够从许多培养物保藏机构容易地取得这些种的菌株，所述保藏机构诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细
胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)、和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent
Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

[0444] 可使用上述的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然物质(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得亲本脂肪酶。用于从天然生境分离微生物和直接分离DNA的技术是本领域内为人们所熟知的。随后可通过相似地筛选另一个微生物或混合的DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来得到编码亲本的多
核苷酸。一旦已用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可利用本领域普通技术人员已知的
技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上)。

[0445] 变体的制备

[0446] 可用于本发明的变体可通过用于获得脂肪酶变体的方法制备，该方法包括：(a)在对应于G23S、D27N、A40I、F51I,L、E56R、D57N、K98I、R118F、G163S、T231R、N233R、Y220F、T244E和P256T的位置处引入替换；(b)选择具有脂肪酶活性并且与亲本脂肪酶相比具有上
文列出的期望特性中的一种的变体；以及(c)回收该变体。

[0447] 变体可以使用本领域中已知的任何诱变方法来制备，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等等。

[0448] 定点诱变是其中在编码亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

[0449] 定点诱变能在体外通过PCR完成，所述PCR涉及包含期望突变的寡核苷酸引物的使用。定点诱变也可在体外通过盒诱变进行，该盒诱变涉及限制性酶在包含编码亲本脂肪酶
的多核苷酸的质粒中的一个位点处裂解以及随后将包含突变的寡核苷酸连入多核苷酸中。
通常消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，使得质粒的粘性末端和插入序列彼此连
接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

[0450] 定点诱变也可通过本领域已知的方法在体内完成。参见例如US2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.4:285-
290；以及Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

[0451] 本发明可使用任何定点诱变步骤。有许多可利用的商品化试剂盒能够用于制备变体。

[0452] 合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码受关注的多肽。基因合成能够利用多个技术进行，诸如Tian等人(2004，Nature432:1050-1054)描述的基于多元微芯片的技术，以及在光-可编程的微流体芯片上合成和装配寡核苷酸的类似技术。

[0453] 能使用已知的诱变、重组、和/或重排方法生成并测试单个或多个氨基酸替换、缺失、和/或插入，随后进行有关的筛选程序，诸如那些由以下文献公开的程序：Reidhaar-
Olson和Sauer，1988，Science 241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry 30:10832-10837美国专利5,223,409；WO 92/
06204)和区域定点诱变(Derbyshire等人，1986，Gene 46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

[0454] 诱变/重排方法可以和高通量的、自动的筛选方法相结合，以检测宿主细胞表达的克隆的、诱变处理的多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收并使用本领域的标准方法快速测序。这些
方法允许多肽中单个氨基酸残基重要性的快速确定。

[0455] 半合成基因构建通过组合使用合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组来完成。半合成构建体的典型是通过利用合成的多核苷酸片段与PCR技术相结合
的方法。因此可从头合成限定的基因区域，而其它区域可使用位点特异性诱变引物进行扩
增，而其它区域可经过易错PCR或非易错PCR进行扩增。然后多核苷酸亚序列可以被重排。

[0456] 脂肪酶变体可通过包括下列步骤的方法制备：(a)在适于表达变体的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该变体。

[0457] 核酸构建体

[0458] 本发明还涉及核酸构建体，其包含编码本发明的变体的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个对照序列，该对照序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与对
照序列相容的条件下表达。

[0459] 可以多种方式操作所述多核苷酸以提供变体的表达。根据表达载体在其插入载体之前对所述多核苷酸的操作可为可取的和必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术
为本领域所熟知。

[0460] 对照序列可为启动子，被宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。所述启动子包含转录对照序列，其介导所述变体的表达所述启动子可为在宿主细胞中显示转录
活性的任何多核苷酸，其包括突变型、截短的和杂交体启动子，可得自对宿主细胞同源的或异源的、编码细胞外或细胞内多肽的基因。

[0461] 用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的示例为得自下列基因的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽胞杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌
cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene 69:301-315)，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子描述于Gilbert等人，“Useful
proteins from recombinant bacteria”，1980，Scientific American 242:74-94；和
Sambrook等人，1989，见上。WO99/43835中公开了串联启动子的例子。

[0462] 用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的示例是得自构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、毒性镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、毒性镰孢菌Daria(WO00/56900)、毒性镰孢菌Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II，里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译前导序列已被来自曲霉
属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译前导序列取代；非限制性示例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译前导序列已被来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构
酶基因的未翻译前导序列取代；以及它们的突变的、截短的和杂交体启动子。

[0463] 在酵母宿主中，有用的启动子得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其他对于酵母宿主细胞有用的启动子在Romanos等人，1992，Yeast 8:423-488中有所描述。

[0464] 所述对照序列还可为转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的3’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任
何终止子。

[0465] 对于细菌宿主细胞优选的终止子得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。

[0466] 对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

[0467] 对于酵母宿主细胞优选的终止子得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。对于酵母宿主细胞有用的其他终止子描
述于Romanos等人，1992，同上。

[0468] 对照序列还可为启动子下游的mRNA稳定子区和增加基因表达的基因编码序列的上游。

[0469] 合适的mRNA稳定子区的示例得自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology 177:3465-3471)。

[0470] 所述对照序列还可为前导序列，对通过宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。所述前导序列可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有
功能性的任何前导序列。

[0471] 对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。

[0472] 对于酵母宿主细胞合适的前导序列得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

[0473] 所述对照序列还可为聚腺苷酸化序列，序列可操作地连接至编码变体的序列的3’-末端，并且当被转录时被宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至被转录的mRNA的信号。
可使用在宿主细胞中有功能性的任何聚腺苷酸化序列。

[0474] 对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

[0475] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.15:5983-5990中有所描述。

[0476] 所述对照序列还可为信号肽编码区，其编码连接至变体的N-末端的信号肽并指导所述变体进入细胞的分泌途径。所述多核苷酸的编码序列的5’-末端可固有地包含信号肽
编码序列，其与编码所述变体的编码序列的片段天然地连接在翻译阅读框中。作为另外一
种选择，所述编码序列的5’-末端可包含信号肽编码序列，其对所述编码序列是外源的。在所述编码序列天然不包含信号肽编码序列的情况下，需要外源信号肽编码序列。作为另外
一种选择，外源信号肽编码序列可简单地替换天然信号肽编码序列以增强所述变体的分
泌。然而，可使用指导被表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

[0477] 对于细菌宿主细胞，有效的信号肽编码序列是得自芽孢杆菌属NCIB11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因的信号肽编码序列。另外的信号肽在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57:109-137中有所描述。

[0478] 对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因的信号肽编码序列。

[0479] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码序列描述于Romanos等人，1992，同上。

[0480] 所述对照序列还可为前肽编码序列，其编码定位在变体的N-末端的前肽。所得的多肽被称为酶原或多肽原(或有时候为酶原)。多肽原是大体失活的，并且能够通过来自多
肽原的多肽的催化或自催化裂解转变为活性多肽。前肽编码序列可得自枯草芽孢杆菌碱性
蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因。

[0481] 在信号肽和前肽序列同时存在的情况下，所述前体序列定位在紧挨变体的N-末端，并且所述信号肽序列定位在紧挨前肽序列的N-末端。

[0482] 添加调控序列还可为可取的，其调控相对于宿主细胞的生长的变体的表达。调控系统的例子是使得所述基因的表达打开或关闭响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的
存在)的那些。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，也可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其它例子是允许基因扩增的那些。在真
核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及与重
金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将可操作地连接至所述
调控序列。

[0483] 表达载体

[0484] 本专利申请也公开了重组表达载体，其包含编码可用于本发明的变体的多核苷酸、启动子，以及转录和翻译停止信号。可将各种核苷酸和对照序列结合在一起以制备重组表达载体，其可包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点插入或取代编码变体
的多核苷酸。作为另外一种选择，可通过将所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建
体插入合适的用于表达的载体来表达所述多核苷酸。在创建表达载体中，所述编码序列位
于载体中使得所述编码序列与合适的用于表达的对照序列可操作地连接。

[0485] 重组表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便的经过重组DNA步骤并可形成多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与被导入所述载体的宿主细胞的相容
性。载体可为线性或封闭的环形质粒。

[0486] 载体可为自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。所述载体可包含任何形式以确保自我复制。另选地，载体可为一种载体，当其被导入宿主细胞时被整合进基因组并连同其被整合进的染色体一起复制。此外，可使用单个载体或质粒、或同时包含被导入宿主细胞的基因组的总DNA的两个或更多个载体或质粒、或转座子。

[0487] 所述载体优选地包含一个或多个选择性标记，其允许简单选择转化的，转染的，转导等的细胞。选择性标记是一个基因，其产物提供了生物灭杀剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等等。

[0488] 细菌选择性标记的示例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性的标记诸如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、奇放线菌素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、
bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-
5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等同物。优选的用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌
(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

[0489] 所述载体优选地包含元件，其允许载体整合至宿主细胞基因组或在细胞中独立于基因组自主复制载体。

[0490] 对于整合进入宿主细胞基因组，所述载体可依赖于编码所述变体的多核苷酸的序列或载体的任何其它元件，通过同源或非同源重组整合进基因组。作为另外一种选择，所述载体可包含另外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体的精确位置整合进入宿主细
胞的基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应包含足够数量的核酸，诸如
100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与对应的靶序列具有高度的序列同一性以提高同源重组的概率。所述整合元件可为与宿主细胞基因组
中靶序列同源的任何序列。此外，所述整合元件可为非编码或可编码多核苷酸。另一方面，所述载体可通过非同源重组整合进宿主细胞的基因组。

[0491] 对于自主复制，所述载体还包含复制起点，使得所述载体在所考虑的宿主细胞中自主复制。所述复制起点可为在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语
“复制起点”或“质粒复制因子”是指使得质粒或载体在体内复制的多核苷酸。

[0492] 细菌复制起点的示例是质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，其允许在大肠杆菌中复制，以及pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点，其允许在芽孢杆菌属中复制。

[0493] 可用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

[0494] 可用于丝状真菌细胞的复制起点的示例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene 98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可按照在WO
00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

[0495] 可将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的制备。可通过将至少一个附加的拷贝的所述序列整合进宿主细胞基因组、或在细胞包含扩增拷贝的选择
性标记基因的情况下通过包含所述多核苷酸的可扩增的选择性标记来获得所述多核苷酸
拷贝数的增加，从而能通过在合适的选择性试剂的存在下培养所述细胞而选择所述多核苷
酸的附加的拷贝。

[0496] 用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的步骤是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，同上)。

[0497] 宿主细胞

[0498] 本专利申请还公开了重组宿主细胞，其包含编码本发明的变体的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个对照序列，该对照序列指导本发明的变体的制备。如前
面所述，将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞使得构建体或载体保持为染色体整
合体或作为自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编
码所述变体的基因和它的来源。

[0499] 该宿主细胞可为在变体的重组制备中有用的任何细胞，例如，原核细胞或真核细胞。

[0500] 所述原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽胞杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和尿原体属。

[0501] 细菌宿主细胞可为任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

[0502] 细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

[0503] 细菌宿主细胞还可为任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和变铅青链霉菌细胞。

[0504] 将DNA导入芽孢杆菌属细胞可通过原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56:209-
221)，电穿孔(参见，例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)，或结合(参见，例如Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169:5271-5278)实现。将DNA导入大肠杆菌细胞可通过原生质体转化(参见，例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.16:6127-6145)实现。将DNA导入链霉菌属细胞可通过原生质体转化、电穿孔(参见，例如Gong等人，2004，Folia Microbiol.
(Praha)49:399-405)、结合(参见，例如Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)或转导(参见，例如Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)实现。将DNA导入假单胞菌属细胞可通过电穿孔(参见，例如Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods64:
391-397)或结合(参见，例如Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)实现。将DNA导入链球菌属细胞可通过自然感受态(参见，例如Perry和Kuramitsu，1981，
Infect.Immun.32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如Catt和Jollick，1991，Microbios
68:189-207)、电穿孔(参见，例如Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-
3804)或结合(参见，例如Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)实现。然而，可使用本领域已知的将DNA导入宿主细胞的任何方法。

[0505] 所述宿主细胞还可为真核细胞，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

[0506] 所述宿主细胞还可为真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和缀合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有分生孢子真菌(如Hawksworth等人，在Ainsworth and Bisby’s
Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，
Cambridge，UK中定义的)。

[0507] 所述真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本文所用，“Yeast”包括产子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母
(basidiosporogenous yeast)和属于不完全菌纲(Fungi Imperfecti)(芽生菌目
(Blastomycetes))的酵母。由于未来酵母的分类可发生变化，就本发明的目的而言，应如
Biology and Activities of Yeast(Skinner、Passmore和Davenport，editors，Soc.申请Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述定义酵母。

[0508] 酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞诸如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces
lactis)、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁费酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。

[0509] 所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的真菌门和卵菌门亚门(如Hawksworth等人，1995，同上所定义的)。所述丝状真菌是特征大致在于由甲壳质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖构成的菌丝壁。营养生长是通过菌丝延长，并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母诸如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，并且碳分解代谢可为发酵的。

[0510] 丝状真菌宿主细胞可为支顶孢属、曲霉属、出芽短梗霉属、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、腐质霉属、稻瘟病菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、显革菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、侧耳菌属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、草根霉属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。

[0511] 例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黒曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红
拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢
子菌、嗜角质金孢子菌、勒克瑙金孢菌、奠状金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞菌(Coprinus cinereus)、毛云芝菌(Coriolus
hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、克地镰孢、黄色镰孢、禾谷镰孢、杆孢状镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、簇囊镰孢、拟丝孢镰孢、毒性镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉侧菌(Phlebia radiata)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes
versicolor)、哈茨木霉、康氏木霉、长柄木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

[0512] 可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法，以本身已知的方式转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适的步骤在EP238023，Yelton
等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/
Technology 6:1419-1422中有所描述。用于转化镰孢菌属菌种的合适的方法在Malardier
等人，1989，Gene 78:147-156和WO96/00787中有所描述。可使用Becker和Guarente，
Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，J.Bacteriol.153:153-163；和Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:
1920中所述的程序转化酵母。

[0513] 制备方法

[0514] 本专利申请也公开了制备本发明的脂肪酶变体的方法，该方法包括(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。

[0515] 使用本领域已知的方法在适于制备所述变体的营养培养基中培养所述宿主细胞。例如，所述细胞可以在实验室或工业发酵罐中，在合适的培养基中和在允许所述变体被表
达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、或小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批或固态发酵)进行培养。在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可购自商业供应商或可根据公布的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果所述变
体被分泌在营养培养基中，可直接从培养基中回收所述变体。如果所述变体不是分泌的，可从细胞裂解物中回收它。

[0516] 可使用本领域已知的对所述变体为特异性的方法检测所述变体。这些检测方法包括但不限于使用特异性抗体、形成酶产物或酶底物的消失。例如，可使用酶分析法测定变体的活性，诸如示例中所述的那些。

[0517] 可使用本领域中已知的方法回收所述变体。例如，可通过常规步骤，包括但不限于采集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收所述变体。

[0518] 可通过本领域中已知的多种方法，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和体积排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，Janson和Ryden编辑，VCH Publishers，New York，1989)纯化变体以获得基本上纯的变体。

[0519] 在一个可供选择的方面，不回收所述变体，而是使用表达所述变体的本发明的宿主细胞作为变体源。

[0520] 微胶囊组合物

[0521] 在本发明中，脂肪酶(优选地脂肪酶变体)任选地被包封在微胶囊中。微胶囊的隔膜优选地通过使分子量大于1kDa的多支化多胺交联制得。通过使多支化多胺交联而形成的
隔膜能够将酶与洗涤剂中的表面活性剂(尤其阴离子表面活性剂)分离，已知这些表面活性
剂对酶的稳定性有害。

[0522] 优选地，当在洗涤剂中使用包封的酶时，在洗涤剂于水中稀释时包封物能够基本上立即释放酶，如例如在衣物洗涤或盘碟洗涤应用中。优选的微胶囊在这方面具有优异的
特性，并且优选地能够在一分钟内释放整个包封的酶。

[0523] 优选的微胶囊不需要存在核聚合物即能够在水中稀释时释放酶。此外，本发明不需要酶以沉淀形式存在于微胶囊的核中，以便控制过早释放，如WO 97/24177中所述。

[0524] 当将如本文所定义的脂肪酶变体和任选的其他酶用半透膜包封在微胶囊中，并且在这些胶囊内具有比在液体洗涤剂中更高的水活度(在添加到液体洗涤剂之前)时，胶囊将
在加入到洗涤剂中时发生(部分)塌缩(水渗出)，从而留下更浓缩和更粘稠的酶包含在胶囊
内部。隔膜的塌缩还可导致渗透性降低。这可通过添加稳定剂/聚合物，尤其不可渗透通过隔膜的稳定剂/聚合物来进一步利用。塌缩和所得粘度增加将减少/阻止不利组分(例如，表面活性剂或多价螯合剂)扩散到胶囊中，从而增加酶在液体洗涤剂中的储存稳定性。液体洗涤剂中对酶敏感的组分(例如，充当酶的底物的组分)也受到保护，以免被酶降解。在洗涤期间，液体洗涤剂被水稀释，从而增加水活度。水现在将扩散到胶囊中(渗透)。胶囊将溶胀，并且隔膜将变得可透过酶，使得它们可离开胶囊，或仅仅破裂，并且以此方式释放酶。该概念在稳定酶以抵抗液体洗涤剂中的不利组分方面是非常有效的，反之也保护液体洗涤剂中的
酶敏组分不受酶影响。

[0525] 对酶敏感并可被酶降解的洗涤剂组分的示例包括(相关酶在括号中)：黄原胶(黄原胶酶)、具有酯键的聚合物(脂肪酶)、氢化蓖麻油(脂肪酶)、香料(脂肪酶)、甲酯磺酸盐表面活性剂(脂肪酶)、纤维素和纤维素衍生物(例如CMC)(纤维素酶)，以及糊精和环糊精(淀
粉酶)。

[0526] 另外，可将敏感的洗涤剂成分包封，因此其在本文所述的微胶囊中是稳定的。敏感的洗涤剂成分在储存期间易于降解。此类洗涤剂成分包括漂白化合物、漂白活化剂、香料、聚合物、助洗剂、表面活性剂等。

[0527] 一般来讲，本文所述的微胶囊可用于分离洗涤剂组合物中的不相容/敏感的组分/化合物。

[0528] 将微胶囊加入到洗涤剂组合物中可用于例如通过提供不透光效应(使用小微胶囊)或明显可见颗粒的效应(使用大微胶囊)影响洗涤剂组合物或单位剂量制品的视觉外
观。可任选地将微胶囊着色。

[0529] 微胶囊可用于在酶产品的处理和加工期间降低酶粉尘水平。

[0530] 除非另外指明，否则在整个申请书中所有百分比均以重量百分比(％w/w)表示。

[0531] 微胶囊的制备

[0532] 优选的微胶囊通常通过下列方式制备：将水滴形成为与水不可混溶的连续体(即，通常通过制备油包水乳液)并随后通过加入交联剂发生界面聚合而形成隔膜。最终固化后，可收获胶囊，并通过本领域已知的方法进一步冲洗和配制该胶囊。随后将胶囊制剂加入到
洗涤剂中。

[0533] 有效载荷、主要隔膜组分和待包封的最终附加组分存在于水相中。在连续体中存在使水滴朝向聚结稳定的组分(乳化剂、乳液稳定剂、表面活性剂等)，并且交联剂也经由连续体添加。

[0534] 乳液可通过本领域已知的任何方法制备，例如通过机械搅拌、滴落方法、隔膜乳化、微流体、超声处理等。在一些情况下，相的简单混合将自动产生乳液，这通常称为自乳化。使用导致窄粒径分布的方法是一个优点。

[0535] 随后通常直接地或更典型地通过在可溶于连续相中的溶剂中制备交联剂溶液，将交联剂加入到乳液中。乳液和交联剂或其溶液可通过本领域所用的常规方法混合，例如通
过简单混合或通过在线混合器小心控制乳液和交联剂溶液的流动。

[0536] 在一些情况下，可能需要将胶囊固化来完成隔膜形成。固化可通过将胶囊简单搅拌一段时间以允许界面聚合反应结束来实现。在其他情况下，可通过加入反应淬灭剂来停
止隔膜形成。

[0537] 可例如通过将组分反应到隔膜上以阻碍或减少洗涤剂中颗粒的絮凝来将胶囊后改性，如WO 99/01534中所述。

[0538] 所制备的胶囊可通过本领域已知的方法分离或浓缩，例如通过对胶囊分散体过滤、离心、蒸馏或滗析。

[0539] 所得胶囊可例如通过加入表面活性剂进一步配制，以赋予产品期望的特性，以用于储存、运输和稍后处理以及添加到洗涤剂中。其他微胶囊制剂包括流变改性剂、生物杀灭剂(例如Proxel)、用于调节pH的酸/碱(其也将在微胶囊内部调节)，以及用于调节水活度的水。

[0540] 胶囊形成方法可包括以下步骤：

[0541] -制备初始水和油相，

[0542] -形成油包水乳液，

[0543] -通过界面聚合形成隔膜，

[0544] -任选的后修饰，

[0545] -任选的分离和/或配制，

[0546] -加入到洗涤剂中。

[0547] 该方法可为批量方法或者连续或半连续方法。

[0548] 如本文所述，微胶囊是在其周围具有基本上均匀隔膜的小含水球体。在微胶囊内部的材料被称为核、内部相或填充物，而隔膜有时被称为壳、包衣或壁。本文所述的优选微胶囊具有介于0.5μm和2毫米之间的直径。优选地，微胶囊的平均直径在1μm至1000μm的范围内，更优选地在5μm至500μm的范围内，甚至更优选地在10μm至500μm的范围内，甚至更优选地在50μm至500μm的范围内，并且最优选地在50μm至200μm的范围内。另选地，微胶囊的直径在0.5μm至30μm的范围内；或者在1μm至25μm的范围内。聚合完成后，在油相中测量微胶囊的直径。胶囊的直径可根据周围化学环境的水活度而变化。

[0549] 如可用于本发明中的酶的微胶囊化可通过界面聚合进行，其中聚合反应中的两种反应物在界面处接触并快速反应。该方法的基础是多胺与充当交联剂的酸衍生物(通常为
酰卤)的反应。多胺优选为基本上水溶性的(当为游离碱形式时)。在适当的条件下，薄柔性隔膜在界面处快速形成。进行聚合的一种方式是使用用非水性溶剂(和乳化剂)乳化的酶和
多胺的水性溶液，并且加入包含酸衍生物的溶液。碱性试剂可存在于酶溶液中以中和在反
应期间形成的酸。在乳液滴的界面处立即形成聚合物(聚酰胺)隔膜。微胶囊的聚合物隔膜
通常具有阳离子性质，因此与具有阴离子性质的化合物结合/络合。

[0550] 微胶囊的直径由乳液滴的尺寸确定，乳液滴的尺寸例如由搅拌速率控制。

[0551] 乳液

[0552] 乳液是一种液相在第二种液相内的临时性或永久性分散体。第二液体通常被称为连续相。表面活性剂通常用于帮助乳液的形成和稳定。并非所有表面活性剂均同样地使乳
液稳定。需要选择表面活性剂的类型和量以获得最佳的乳液效用，尤其在乳液的制备和物
理稳定性，以及在稀释和进一步加工期间的稳定性方面。物理稳定性是指将乳液保持为分
散体形式。诸如聚结、聚集、吸附到容器壁、沉淀和膏化之类的过程是具有物理不稳定性的形式，应当避免。合适的表面活性剂的示例描述于WO 97/24177的第19-21页；和WO 99/
01534中。

[0553] 乳液可进一步分类为简单的乳液，其中分散的液相为简单的均质液体；或更复杂的乳液，其中分散的液相为液相或固相的异质组合，诸如双重乳液或多重乳液。例如，可形成油包水双重乳液或多重乳液，其中水相本身还包含乳化油相；这种类型的乳液可被指定
为油包水包油(o/w/o)乳液。另选地，可形成油包水乳液，其中水相包含分散的固相，其通常称为悬浮液-乳液。可描述其他更复杂的乳液。由于描述此类体系的固有困难，术语乳液用于描述简单的乳液和更复杂的乳液两者，而不必限制乳液的形式或所存在的相的类型和数
量。

[0554] 多胺

[0555] 隔膜的刚性/柔韧性和渗透性主要受多胺选择的影响。用于如本文所述的胶囊化的优选多胺包括多支化多胺。优选以伯氨基基团封端的每个支链用作隔膜网络中的连接
点，从而提供本发明的有利特性。如本文所述的多支化多胺优选地包括具有两个以上支化
点和两个以上反应性氨基基团(能够与交联剂反应，即伯氨基和仲氨基基团)的多胺。为了
制备优选的微胶囊，当制备乳液时，多支化多胺用作原料—它不是由其他原料原位形成的。
为了获得优选微胶囊的吸引性特性，多胺的多支化结构必须作为原料存在。

[0556] 支化点的数量和伯胺的数量之间存在紧密联系，因为伯胺将始终定位在支链的末端：直链胺可仅包含两个伯胺。假设在此类直链二胺中引入的每个支化点将允许在引入的
支链末端引入一个或多个伯胺。在这种情况下，我们将伯氨基基团理解为支链的一部分，即支链的端点。例如，我们认为三(2-氨基乙基)胺和1,2,3-丙三胺均为具有一个支化点的分
子。对于优选的微胶囊，多胺具有至少四个伯胺。支化点可从脂族烃链引入，如在先前所述示例中；或从不饱和碳键引入，诸如在例如3,3’-二氨基联苯胺中；或从叔氨基基团引入，诸如在N,N,N',N'-四-(2-氨基乙基)乙二胺中。

[0557] 优选地，多支化多胺不是肽或蛋白质。优选地，反应性氨基基团构成多支化多胺分子量的至少15％，诸如超过20％，或超过25％。优选地，多支化多胺的分子量为至少1kDa；更优选地，多支化多胺的分子量为至少1.3kDa。优选地，多支化多胺为聚乙烯亚胺(PEI)及其改性型式，具有两个以上支化点和两个以上反应性氨基基团；其中反应性氨基基团构成PEI分子量的至少15％，诸如超过20％，或超过25％。优选地，PEI的分子量为至少1kDa。可使用不同多支化多胺的组合来制备微胶囊。

[0558] 微胶囊的有利特性(例如，酶储存稳定性、酶渗漏降低、洗涤剂成分的通量减小)可通过添加一种或多种分子量小于1kDa的小胺来改善。小胺优选为基本上水溶性的(当为游离碱形式时)，并且可为诸如乙二胺、六亚甲基二胺、己二胺、二亚乙基四胺、亚乙基四胺、二氨基苯、哌嗪、四亚甲基戊胺或优选二亚乙基三胺(DETA)之类的材料。当制备本发明的微胶囊时，小胺可以按小胺和多支化多胺的总含量的重量计最多50％，优选最多40％、最多
30％、最多20％、最多10％或至多5％的量加入。

[0559] 优选的交联剂包括具有至少两个能够与胺反应以形成共价键的基团/位点的分子。交联剂优选为油溶性的，并且可为酸酐或酰卤的形式，优选地为酰氯的形式。例如，它可以是己二酰氯、癸二酰氯、十二烷二酰氯、邻苯二酰氯、对苯二酰氯、间苯二酰氯或三甲酰氯；但优选地，交联剂为对苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。

[0560] 在一个具体设想的实施方案中，本发明的微胶囊组合物是描述于WO2014/177709(据此以引用方式并入)中的包含本发明脂肪酶变体的组合物。同样如上所述，微胶囊还可
包含醇诸如多元醇。在优选的微胶囊中，(a)包含聚乙烯亚胺。在优选的微胶囊中，(b)包含亚乙基胺或链烷醇胺。在一个优选的实施方案中，(b)选自：乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、双(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、己二胺、二氨基苯、哌嗪和四亚乙基五胺，更优选地(b)选自：二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、双(3-氨基丙基)胺、单乙醇胺和二乙醇胺。优选地，微胶囊包含Mg2+、Ca2+或Zn2+离子的来源，诸如Mg2+、Ca2+或Zn2+的难溶性盐。优选地，使用酰氯作为交联剂，诸如间苯二甲酰氯、对苯二甲酰氯、或均苯三甲酰氯。在一个优选的实施方案中，通过界面聚合来制备隔膜。

[0561] 合适的微胶囊描述于WO 2015/1144784(据此以引用方式并入)中，该微胶囊包含如本文所述的脂肪酶变体。

[0562] 洗涤剂组合物

[0563] 优选的洗涤剂组合物是用于清洁和/或处理织物的衣物洗涤剂组合物。优选的洗涤剂组合物是液体形式。本发明具体地涉及一种包括水溶性膜和洗涤剂组合物，优选地液
体衣物洗涤剂组合物的水溶性单位剂量制品。

[0564] 水溶性单位剂量制品

[0565] 水溶性膜和液体洗涤剂组合物更详细地描述于下文中。

[0566] 水溶性单位剂量制品包括水溶性膜，其成形为使得单位剂量制品包括至少一个由水溶性膜围绕的内部隔室。单位剂量制品可包括彼此密封以限定内部隔室的第一水溶性膜
和第二水溶性膜。水溶性单位剂量制品被构造成使得洗涤剂组合物在储存期间不漏出隔
室。然而，在将水溶性单位剂量制品添加到水中时，水溶性膜溶解并使内部隔室中的内容物释放到洗涤液体中。

[0567] 隔室应当被理解为是指单位剂量制品内的密闭内部空间，其容纳洗涤剂组合物。在制造期间，第一水溶性膜可被成形为包括向其中添加洗涤剂组合物的开口隔室。然后在
靠近隔室的开口的取向上在第一膜之上覆盖第二水溶性膜。然后沿密封区域将第一膜和第
二膜密封在一起。

[0568] 单位剂量制品可包括多于一个隔室，甚至至少两个隔室，或甚至至少三个隔室。隔室可以叠加的取向布置，即一个定位在另一个的顶部上。在此类取向中，单位剂量制品将包括三个膜：顶部膜、中部膜和底部膜。另选地，隔室可以并列取向定位，即，一个紧接另一个取向。隔室可甚至以“轮胎和轮辋”布置取向，即第一隔室靠近第二隔室定位，但第一隔室至少部分地围绕第二隔室，但不完全包封第二隔室。另选地，一个隔室可被完全包封在另一个隔室内。

[0569] 在单位剂量制品包括至少两个隔室的情况下，隔室中的一个可小于另一个隔室。在单位剂量制品包括至少三个隔室的情况下，隔室中的两个可小于第三隔室，并且优选地
较小的隔室叠置在较大的隔室上。叠置的隔室优选地并列取向。

[0570] 在多隔室取向中，根据本发明的洗涤剂组合物可被包含在隔室中的至少一个中。其可例如仅包含在一个隔室中，或者可包含在两个隔室中，或甚至包含在三个隔室中。

[0571] 每个隔室可包含相同或不同的组合物。不同的组合物可以全都以相同的形式，或者它们可以以不同的形式。

[0572] 水溶性单位剂量制品可包括至少两个内部隔室，其中液体衣物洗涤剂组合物被包含在隔室中的至少一个中，优选其中单位剂量制品包括至少三个隔室，其中洗涤剂组合物
被包含在隔室中的至少一个中。

[0573] 图1公开了根据本发明的水溶性单位剂量制品(1)。水溶性单位剂量制品(1)包括在密封区域(4)处密封在一起的第一水溶性膜(2)和第二水溶性膜(3)。液体衣物洗涤剂组
合物(5)被包含在水溶性单位剂量制品(1)内。

[0574] 水溶性膜

[0575] 可用于本发明的膜是可溶于或可分散于水中的。水溶性膜优选地具有20至150微米，优选地35至125微米，甚至更优选地50至110微米，最优选地约76微米的厚度。

[0576] 优选地，如通过在本文中提出的方法测量的，使用具有20微米最大孔尺寸的玻璃过滤器之后，所述膜具有至少50％，优选地至少75％，或甚至至少95％的水溶解度：

[0577] 将5克±0.1克的膜材料加入预称重的3L烧杯中并加入2L±5ml的蒸馏水。将其在磁力搅拌器Labline(型号No.1250)或等同物以及5cm磁力搅拌器上(设定为600rpm)于30℃
下剧烈搅拌30分钟。然后，将该混合物经由具有上述指定孔尺寸(最大20微米)的折叠式定
性多孔玻璃过滤器过滤。通过任何常规方法将收集的滤液中的水分干燥，并测定剩余材料
的重量(溶解或分散的那部分)。然后，可计算出溶解度或分散度的百分比。

[0578] 优选的膜材料优选地为聚合物材料。如本领域所已知的，膜材料可通过例如将聚合物材料浇注、吹塑、挤出或吹塑挤出而获得。

[0579] 适合用作小袋材料的优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚亚烷基氧、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚羧酸和聚羧酸盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然树胶(诸如黄原胶和角叉菜胶)。更优选的聚合物选自聚丙烯酸
酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯，并且最优选地选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、以及它们的组合。优选地，小袋材料中的聚合物(例如PVA聚合物)的水平为至少60％。聚合物可具有任何重均分子量，优选地约1000至1,000,
000，更优选地约10,000至300,000，还更优选地约20,000至150,000。

[0580] 优选地，水溶性膜包含聚乙烯醇聚合物或共聚物，优选聚乙烯醇聚合物和/或聚乙烯醇共聚物的共混物，优选地选自磺化和羧化的阴离子聚乙烯醇共聚物，尤其羧化的阴离
子聚乙烯醇共聚物，最优选聚乙烯醇均聚物和羧化的阴离子聚乙烯醇共聚物的共混物。

[0581] 优选的膜表现出在冷水(其意指未加热的蒸馏水)中的良好溶解性。优选地，此类膜在24℃，甚至更优选地在10℃的温度下表现出良好的溶解性。所谓的良好溶解性，是指如上所述，在使用具有20微米最大孔尺寸的玻璃过滤器之后，由本文描述的方法测量的，该膜表现出至少50％，优选地至少75％，或甚至至少95％的水溶解度。

[0582] 优选的膜为由Monosol以贸易参考M8630、M8900、M8779、M8310供应的那些。

[0583] 膜可为不透明的、透明的或半透明的。膜可包括印刷区域。

[0584] 印刷区域可使用标准技术诸如柔性版印刷或喷墨印刷实现。

[0585] 膜可包含厌恶剂，例如苦味剂。合适的苦味剂包括但不限于柚皮甙、蔗糖八乙酸盐、盐酸奎宁、苯甲地那铵或它们的混合物。任意合适水平的厌恶剂可用于膜中。合适水平包括但不限于1ppm至5000ppm，或甚至100ppm至2500ppm，或甚至250ppm至2000rpm。

[0586] 洗涤剂组合物

[0587] 水溶性单位剂量制品包括洗涤剂组合物，优选液体衣物洗涤剂组合物。术语“液体衣物洗涤剂组合物”是指包含能够润湿和处理织物的液体的任何衣物洗涤剂组合物，并且包括但不限于液体、凝胶、糊剂、分散体等。液体组合物可包括适当细分形式的固体或气体，但液体组合物不包括整体上非流体的形式，诸如片剂或颗粒。

[0588] 不受理论的束缚，优选地将任选地包封的脂肪酶变体配制到液体衣物洗涤剂中，因为这实现更快释放到洗涤液体中。这在快速洗涤循环和冷洗涤循环中尤其有益，在这些
循环中粘在不溶解的粉末糊状相中的风险被最小化。

[0589] 液体洗涤剂组合物可用于织物手洗操作中，或者可用于自动织物机洗操作中。

[0590] 洗涤剂助剂

[0591] 洗涤剂组合物，优选液体衣物洗涤剂组合物包含洗涤剂助剂，例如选自表面活性剂、聚合物、助洗剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶、酶稳定剂、催化材料、漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成形过酸、聚合物分散剂、抗再沉积剂、增白剂、抑泡剂、美学染料、调色染料、遮光剂、香料、香料递送体系、结构剂、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、絮凝助剂、螯合剂，以及它们的混合物。

[0592] 洗涤剂助剂优选地包括表面活性剂，具体地对于清洁组合物来说表面活性剂优选地包括优选地重量比为50:1至1:10或更优选地20:1至1:2的阴离子和/或非离子表面活性
剂。

[0593] 洗涤剂组合物优选地包含按洗涤剂组合物的重量计最多50％，优选地介于5％和50％之间，更优选地介于7.5％和45％之间，甚至更优选地介于10％和40％之间，或甚至更优选地介于12％和37％之间，最优选地介于15％和30％之间的非皂阴离子表面活性剂。优
选地，非皂阴离子表面活性剂包括直链烷基苯磺酸盐、烷氧基化烷基硫酸盐或它们的混合
物。更优选地，非皂阴离子表面活性剂为直链烷基苯磺酸盐和烷氧基化烷基硫酸盐的混合
物，更优选直链烷基苯磺酸盐和乙氧基化烷基硫酸盐的混合物。

[0594] 优选地，直链烷基苯磺酸盐与烷氧基化烷基硫酸盐，更优选直链烷基苯磺酸盐与乙氧基化烷基硫酸盐的重量比为1:2至20:1，优选1.1:1至15:1，更优选1.2:1至10:1，甚至更优选1.3:1至5:1，最优选1.4:1至3:1。

[0595] 直链烷基苯磺酸盐与乙氧基化烷基硫酸盐的重量比可为1:10至20:1，优选1:7至3:1，更优选1:5至1.5:1。

[0596] 优选地，液体组合物中的总阴离子表面活性剂(即，存在于液体组合物中的所有阴离子表面活性剂):非离子表面活性剂的重量比介于5:1和23:1之间。

[0597] 优选地，非皂阴离子表面活性剂用胺中和，该胺优选地选自单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺或它们的混合物，更优选单乙醇胺。

[0598] 洗涤剂组合物优选地包含按液体衣物洗涤剂组合物的重量计介于0％和40％之间，优选地介于0.01％和30％之间，更优选地介于0.1％和20％之间，最优选地介于0.15％和15％之间的非离子表面活性剂。优选地，非离子表面活性剂选自醇烷氧基化物、羰基合成的醇烷氧基化物、格尔伯特醇烷氧基化物、烷基酚醇烷氧基化物或它们的混合物。

[0599] 优选地，洗涤剂组合物包含按液体洗涤剂组合物的重量计介于1.5％和20％之间，更优选地介于2％和15％之间，甚至更优选地介于3％和10％之间，最优选地介于4％和8％
之间的皂，优选脂肪酸盐，更优选胺中和的脂肪酸盐，其中优选地胺为链烷醇胺，更优选地选自单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺或它们的混合物，更优选地单乙醇胺。

[0600] 洗涤剂组合物优选地包含阳离子多糖，该阳离子多糖优选地选自阳离子改性的羟乙基纤维素、阳离子改性的羟丙基纤维素、阳离子和疏水改性的羟乙基纤维素、阳离子和疏水改性的羟丙基纤维素，或它们的混合物，更优选阳离子改性的羟乙基纤维素、阳离子和疏水改性的羟乙基纤维素，或它们的混合物。阳离子多糖优选地按液体衣物洗涤剂组合物的
重量计以介于0.05％和3％之间，优选地介于0.1％和2％之间，更优选地介于0.2％和1％之间，最优选地介于0.25％和0.75％之间的量存在。

[0601] 优选地，洗涤剂组合物包含烷氧基化聚乙烯亚胺，优选乙氧基化聚乙烯亚胺。优选地，液体衣物洗涤剂组合物包含按液体衣物洗涤剂组合物的重量计介于0.1％和10％之间，优选地介于0.5％和7％之间，更优选地介于1％和5％之间的乙氧基化聚乙烯亚胺。

[0602] 水溶性单位剂量制品优选地包含按单位剂量制品的重量计20％或更少，或更优选15％或更少的水，优选地包含按单位剂量制品的重量计介于0.1％和15％之间，更优选介于
1％和12.5％之间的水。

[0603] 优选地，水溶性单位剂量制品包含按液体衣物洗涤剂组合物的重量计介于10％和60％之间，优选地介于12％和50％之间，最优选地介于15％和40％之间的非水溶剂，优选地其中非水溶剂选自1,2-丙二醇、甘油、山梨醇、双丙二醇、三丙二醇或它们的混合物。

[0604] 酶—该组合物可包含一种或多种任选地包封在如本文所述的微胶囊中的提供清洁性能和/或织物护理有益效果的酶。合适的酶的示例包括但不限于：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶酸裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶，或它们的混合物。典型的组合为可包含例如与淀粉酶结合的蛋白酶和脂肪酶的酶混合
物。当存在于该组合物中时，前述附加酶可以按该组合物的重量计0.00001重量％至2重
量％、0.0001重量％至1重量％或0.001重量％至0.5重量％酶蛋白的含量存在。

[0605] 一般来讲，所选择酶的特性应当与所选择的洗涤剂相容(即最适pH、与其他酶和非酶成分相容等)，并且该酶应当以有效量存在。

[0606] 可将脂肪酶变体任选地包封在微胶囊中。此外，本发明的洗涤剂组合物还可包含一种或多种包封形式的附加酶。合适的酶的示例选自蛋白酶、淀粉酶、附加的脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶以及它们的组合。

[0607] 该组合物中的酶可包括一种或多种适于包含在衣物洗涤剂或盘碟洗涤剂中的酶(洗涤剂酶)，诸如蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、脱氧核糖核酸酶、过水解酶、氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过加氧酶和/或卤代过氧化物酶)。优选的洗涤剂酶是蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、裂解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、脱氧核糖核酸酶、过水解酶和氧化还原酶(例如漆酶、过氧化物酶、过加氧酶和/或卤代过氧化物酶)；或它们的组合。更优选的洗涤剂酶是蛋白酶
(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和甘露聚糖酶；或它们的组合。

[0608] 该组合物或微胶囊组合物可包含超过0.1％(w/w)的活性酶蛋白，具体地本发明的脂肪酶变体；优选地超过0.25％，更优选地超过0.5％，更优选地超过1％，更优选地超过
2.5％，更优选地超过5％，更优选地超过7.5％，更优选地超过10％，更优选地超过12.5％，更优选地超过15％，甚至更优选地超过20％，并且最优选地超过25％(w/w)的活性酶蛋白。

[0609] 在一个方面，优选的酶将包括纤维素酶。合适的纤维素酶包括源自细菌或真菌的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如，在US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公开的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌制得的真菌纤维素酶。

[0610] 特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的示例为在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其他示例为纤维素酶变体，诸如在WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。

[0611] 可商购获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(Novozymes A/S)、TM TM TM
Clazinase 和Puradax HA (Genencor International Inc.)以及KAC-500(B) (Kao
Corporation)。

[0612] 在一个方面，优选的酶可包括蛋白酶。合适的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源的。优选微生物来源的。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。其可为碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可例如为S1家族(诸如胰蛋白酶)或S8家族(诸如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶蛋白酶可例如为来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其它金属蛋白酶，诸如来自M5、M7或M8家族的那些。

[0613] 术语“枯草杆菌蛋白酶”是指丝氨酸蛋白酶的子组，其根据Siezen等人，Protein Engng.4(1991):719-737，和Siezen等人Protein Science 6(1997)501-523。丝氨酸蛋白酶是蛋白酶的子组，其特征在于在活性位点具有丝氨酸，其与底物形成共价加合物。枯草杆菌蛋白酶可分成6个细分类，即枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

[0614] 枯草杆菌蛋白酶的示例为来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的那些，诸如在US7262042和WO09/021867中描述的诸如迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜碱芽孢杆菌
(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B .subtilis)、解淀粉芽孢杆菌
(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus
gibsonii)，和在WO89/06279中描述的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168，以及在(WO93/18140)中描述的蛋白酶PD138。其它可用的蛋白酶可以是在WO92/175177、WO01/016285、WO02/026024和WO02/016547中描述的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的示例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的胰
蛋白酶)和WO89/06270、WO94/25583和WO05/040372中所述的镰孢属蛋白酶，以及WO05/
052161和WO05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属(Cellulomonas)的胰凝乳蛋白酶。

[0615] 另外的优选蛋白酶是(如例如WO95/23221中所述)得自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM 5483的碱性蛋白酶，以及在WO92/21760、WO95/23221、EP1921147和EP1921148中所述的它们的变体。

[0616] 金属蛋白酶的示例是在WO07/044993(Genencor Int.)中描述的中性金属蛋白酶，诸如来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的那些。

[0617] 有用的蛋白酶的示例是在WO92/19729、WO96/034946、WO98/20115、WO98/20116、WO99/011768、WO01/44452、WO03/006602、WO04/03186、WO04/041979、WO07/006305、WO11/
036263、WO11/036264中描述的变体，特别是使用BPN'编号在下列位置中的一者或多者具有替换的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、
118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、
235、236、245、248、252和274。更优选地，枯草杆菌蛋白酶变体可包含下列突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。

[0618] 合适的可商购获得的蛋白酶包括：以商品名 DuralaseTM、DurazymTM、 Ultra、 Ultra、
Ultra、
Ultra、和出
售的那些，所有均可作为或 (Novozymes A/S)出售；以商品名
Purafect
PreferenzTM、Purafect Purafect Purafect
EffectenzTM、和
(Danisco/DuPont)、AxapemTM(Gist-Brocases N.V.)、 (US5352604的图
29中所示的序列)出售的那些；以及它们的变体(Henkel AG)和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆
菌枯草杆菌蛋白酶)。

[0619] 在一个方面，优选的酶将包括淀粉酶。合适的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶，并且可以是细菌或真菌来源。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如在GB1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特殊菌
株。

[0620] 合适的淀粉酶包括具有WO95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体在WO94/02597、WO94/18314、WO97/43424和WO99/
019467的SEQ ID NO:4中有所描述，诸如在下列位置中的一者或多者具有替换的变体：15、
23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、
211、243、264、304、305、391、408和444。

[0621] 不同的合适的淀粉酶包括具有WO02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺
失并且在位置193中具有替换的那些。

[0622] 其他合适的淀粉酶是杂交体α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体，该杂交体α-淀粉酶包含来源于在WO2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉
酶的残基1-33和在WO2006/066594的SEQ ID NO:4中所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基
36-483。该杂交体α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一者或多者具有替换、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含来源于在WO2006/
066594的SEQ ID NO:6中所示的解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的
残基36-483的杂交体α-淀粉酶的最优选变体是具有以下替换的那些：

[0623] M197T；

[0624] H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或者

[0625] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

[0626] 另外的合适的淀粉酶是具有WO99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO：6的优选变体是在以下位点中的一者或多者具有替换、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。尤其优选的淀粉酶是在位置R181和G182，或位置H183和G184中具有缺失的那些。

[0627] 可使用的另外的淀粉酶是具有WO96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在下列位置中的一者或多者具有替换、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和
184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体
是在位置183和184中具有缺失以及在位置140、195、206、243、260、304和476中的一者或多者中具有替换的那些。

[0628] 可以使用的其他淀粉酶是具有WO08/153815的SEQ ID NO:2、WO01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶，或其与WO08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/
66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO01/66712中的SEQ ID NO:10的优
选变体是在下列位置中的一者或多者中具有替换、缺失或插入的那些：176、177、178、179、
190、201、207、211和264。

[0629] 另外的合适的淀粉酶是具有WO09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶，或其与SEQ ID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C-端截短和/或在下列位
置中的一者或多者中具有替换、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO：2的更优选的变体是在下列位点中的一者或多者具有替换：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E和G475K和/或在位点R180和/或S181或T182和/或G183具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下替换的那些：

[0630] N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

[0631] N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

[0632] S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或者

[0633] S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中该变体为C末端截短的并且任选地还包含在位点243的替换和/或位点180和/或位点181的缺失。

[0634] 其他合适的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQ ID
NO:12的下列位置中的一者或多者中具有替换、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314、R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有缺失D183和G184并且具有替换R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在选自M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339的一个或多个位点具有替换的变体，最优选的变体在所有这些位点上另外具有替换。

[0635] 其他示例为淀粉酶变体，诸如在WO2011/098531、WO2013/001078和WO2013/001087中所述的那些。

[0636] 可商购获得的淀粉酶为DuramylTM、TermamylTM、Termamyl UltraTM、FungamylTM、BanTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、 SupramylTM、NatalaseTM、Liquozyme X和BANTM(来自Novozymes A/S)、 AT 9000(Biozym Biotech Trading GmbH
Wehlistrasse 27b A-1200Wien Austria)和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、
Powerase、Preferenz S100、Preferenx S110、 OPTISIZE HT 和
PURASTAR (Danisco/DuPont)和 (Kao)。

[0637] 合适的附加的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括了化学改性的或蛋白质工程化的突变酶。示例包括来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)例如来自
EP258068和EP305216中所描述的疏绵状嗜热丝孢菌(先前命名为柔毛腐质霉)的脂肪酶，来
自腐质霉属例如特异腐质霉(WO96/13580)的角质酶，来自假单胞菌属菌株(这些中的一部
分现在重命名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia))例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或
类产碱假单胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋葱假单胞菌(P.Cepacia)
(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康辛假单胞菌
(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的脂肪酶，GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)，来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO10/107560)的角质酶，来自门多萨假单胞菌
(Pseudomonas mendocina)(US5,389,536)的角质酶，来自嗜热裂孢菌(WO11/084412、WO13/
033318)的脂肪酶，嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)，来自枯草芽孢杆菌(WO11/
084599)的脂肪酶，以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌
(S.pristinaespiralis)(WO12/137147)的脂肪酶。

[0638] 其他示例为脂肪酶变体，诸如EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508和WO09/109500中所述的那些。

[0639] 优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM，LipexTM；LipolexTM；Lipolase UltraTM；Lipex Evity 100L；LecitaseTM；LipoprimeTM和LipocleanTM(Novozymes A/S)、Lumafast(最初来自Genencor)和Lipomax(最初来自Gist-Brocades)以及来自Solvay的芽孢杆菌属。

[0640] 其他示例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母菌(Candida antarctica)脂肪酶A(WO10/111143)同源的酰基转移酶、来自耻垢分枝杆菌
(Mycobacterium smegmatis)(WO05/56782)的酰基转移酶、来自CE 7家族(WO09/67279)的
过水解酶，以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，尤其在来自Huntsman Textile Effects
Pte Ltd的商业产品Gentle Power Bleach中使用的S54V变体(WO10/100028)。

[0641] 在一个方面，其他优选的酶包括表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的微生物来源的内葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，包括芽孢杆菌属的成员内源的细菌多肽，其具有与US7141403
中的SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少90％、94％、97％或99％同一性的序列，以及它们的混合物。合适的内切葡聚糖酶以商品名和 (Novozymes)出售。

[0642] 其他优选的酶包括以商品名出售的果胶酸裂解酶和以商品名 (Novozymes)和 (Danisco/DuPont)出售的甘露
聚糖酶。

[0643] 可通过加入包含一种或多种酶的单个添加剂或通过加入包含所有这些酶的混合添加剂将洗涤剂酶加入洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂，即，单独添加剂或混合添加剂配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒(具体地无粉尘颗粒)、液体(具体地稳定液体)或混悬液。

[0644] 可如例如US4106991和US4661452所公开的那样制备无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的示例为聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，
PEG)，其具有1000至20000平均摩尔量；具有16个至50个亚乙基氧单元的乙氧基化的壬基
酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇包含12个至20个碳原子并且其中存在15个至80个亚乙基
氧单元；脂肪醇、脂肪酸；和脂肪酸甘油一酯和甘油二酯和甘油三酯。在GB1483591中给出了适用于流化床技术应用的成膜涂层材料的示例。例如液体酶制备可根据已建立的方法，通
过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。可根据EP238216中公开的方法制备受保护的酶。

[0645] 一般来讲，所选择酶的特性通常将与所选择的洗涤剂相容(即最适pH、与其它酶或非酶成分相容等)，并且该酶应当以有效量存在。

[0646] 聚合物

[0647] 优选地，洗涤剂助剂包括聚合物或聚合物的混合物。洗涤剂组合物可包含按重量计0-10％(诸如0.5-5％、2-5％、0.5-2％或0.2-1％)的聚合物。可使用本领域已知用于衣物洗涤剂中的任何聚合物。聚合物可用作如上所述的共助洗剂，或可提供抗再沉积、纤维保
护、去垢、染料转移抑制、油脂清洁和/或抗发泡特性。一些聚合物可具有不止一种上述特性和/或不止一种下述基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)和聚羧酸酯(诸如PAA、PAA/PMA)、聚天冬氨酸和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚
物、疏水改性的CMC(HM-CMC)和有机硅、对苯二甲酸和低聚二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)和聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示
例性聚合物包括磺化聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及二季铵乙氧基硫
酸盐。

[0648] 助洗剂的示例包括柠檬酸盐、螯合剂诸如氨基羧酸盐、氨基聚羧酸盐和膦酸盐，以及烷基或烯基琥珀酸。附加的具体示例包括2,2’,2”-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五醋酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸-N,N-二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(磺甲基)天冬氨酸
(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(磺甲基谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨二乙酸(MIDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸
(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、氨茴酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸
(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和N′-(2-羟乙基)乙二胺-N,N,N’-三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)，以及它们的组合和盐。适用于本文的膦酸盐包括1-羟乙烷-1,1-二膦酸
(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA
或DTPMP)、次氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP或NTMP)、2-膦酰基丁烷-1,2,4-三羧酸(PBTC)、六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(HDTMP)。

[0649] 该组合物还可以包含按重量计0-50％(诸如约5％至约30％)的洗涤剂共助洗剂。共助洗剂的非限制性示例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，诸如聚(丙烯酸)(PAA)或
共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)或聚天冬氨酸。

[0650] 织物调色剂

[0651] 本发明的洗涤剂组合物还可包含织物调色剂，诸如染料或颜料，它们被配制用于洗涤剂组合物中，当所述织物与包含所述洗涤组合物的洗涤液体接触时它们能沉积到织物
上，从而通过吸收/反射可见光改变所述织物的色彩。荧光增白剂发出至少一些可见光。与之相反，织物调色剂改变表面色调是因为它们吸收至少一部分可见光谱。合适的织物调色
剂包括染料和染料-粘土缀合物，并且也可包括颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下列的小分子染料：属于以下颜色索引(C.I.)分类的染
料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红，或它们的混合物，例如如WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中所述的那些(据此以引用方式并入)。洗涤剂组合物优选地包含约0.00003wt％至约0.2wt％，约
0.00008wt％至约0.05wt％，或甚至约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可包含0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物是单位剂量小袋形式时这可为尤其优
选的。合适的调色剂也公开于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

[0652] 分散剂

[0653] 本发明的洗涤剂组合物也可包含分散剂。具体地讲，粉末洗涤剂可包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中多元羧酸包含至少两个彼此相隔不超过两个碳原子的羧基基团。合适的分散剂在例如Powdered Detergents，Surfactant science系列第71卷(Marcel Dekker，Inc)中有所描述。

[0654] 染料转移抑制剂

[0655] 本发明的清洁组合物也可包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和
N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。当存在于受试组合
物中时，染料转移抑制剂可以按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％的含量存在。

[0656] 荧光增白剂

[0657] 洗涤剂组合物可优选地还包含可将正在被清洁的制品着色的附加组分，诸如荧光增白剂或光学增亮剂。其中存在增白剂的含量优选为约0.01％至约0.5％。适用于衣物洗涤剂组合物中的任何荧光增白剂可用于本发明的组合物中。最常用的荧光增白剂是属于以下
类别中的那些：二氨基芪磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和联苯基二苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪磺酸衍生物类型的示例包括以下物质的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨
基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-
基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三
嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐
和5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增
白剂是购自Ciba-Geigy AG(Basel，Switzerland)的Tinopal DMS和Tinopal CBS。Tinopal DMS为4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐。
Tinopal CBS为2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸二钠盐。还优选的荧光增白剂是可商购获
得的Parawhite KX，由Paramount Minerals and Chemicals(Mumbai，India)提供。Tinopal CBS-X为4.4'-双-(磺基苯乙烯基)-联苯基二钠盐，也称为二苯乙烯基联苯基二磺酸二钠。
其它适用于本发明的荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷基氨基香豆素。

[0658] 合适的荧光增白剂含量包括从约0.01、从0.05、从约0.1或甚至从约0.2wt％的较低含量至0.5或甚至0.75wt％的较高含量。

[0659] 去垢性聚合物

[0660] 洗涤剂组合物也可包含一种或多种去垢性聚合物，其有助于将污垢从织物(诸如棉花和基于聚酯的织物)中移除，具体地讲从基于聚酯的织物移除疏水性污垢。去垢性聚合物可例如为基于非离子或阴离子对苯二甲酸盐的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚
物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents，Surfactant science series第71卷，Marcel Dekker,Inc中的第7章。

[0661] 优选地，洗涤剂助剂包括聚酯对苯二甲酸酯。优选地，聚酯对苯二甲酸酯包含接枝有一个或多个阴离子基团的主链，更优选地，包含对苯二甲酸丙二醇酯的阴离子聚酯。

[0662] 合适的阴离子聚酯是衍生自对苯二甲酸、5-磺基间苯二甲酸或5-磺基间苯二甲酸的盐，衍生自乙二醇或聚乙二醇、丙二醇或聚丙二醇和聚亚烷基二醇单烷基醚，以及任选地衍生自另外的附加单体的那些。

[0663] 另一种类型的去垢性聚合物为两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物，该两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物包含核结构和附接到该核结构的多个烷氧基化物基团。该核结构可包含
聚亚烷基亚胺结构或聚链烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中所详细描述的(据此以引用
方式并入本文)。此外，无规接枝共聚物为合适的去垢性聚合物。合适的接枝共聚物在WO
2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中有更详细的描述(以引用方式并入本
文)。

[0664] 优选地，洗涤剂助剂包括两亲性接枝聚合物，优选地基于聚环氧烷和乙烯基酯，优选地基于作为接枝基体的水溶性聚环氧烷和通过乙烯基酯组分的聚合而形成的侧链，所述聚合物具有平均<1个接枝位点/50个亚烷基氧单元，更优选地其中接枝亚烷基氧单元与未
接枝亚烷基氧单元的摩尔比为0.002至0.05，优选0.002至0.035，更优选0.003至0.025，最优选0.004至0.02。优选的接枝聚合物具有3000至100 000的平均分子量Mw。优选的聚合物
包含按聚合物的重量计20％至70％，优选25％至60％的聚环氧烷，优选作为接枝基体的水
溶性聚环氧烷。优选地，聚环氧烷接枝基体为聚乙二醇。

[0665] 优选地，聚合物包含：30重量％至80重量％的乙烯基酯组分以及任选的丙烯酸C1-C8烷基酯，优选地其中乙烯基酯组分包括乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯或它们的混合物；更优选地70重量％至100重量％的乙酸乙烯酯和0重量％至30重量％的丙烯酸C1-C8烷基酯。

[0666] 其他去垢性聚合物为替换的多糖结构，尤其替换的纤维素结构诸如改性的纤维素衍生物，诸如EP 1867808或WO 2003/040279中所述的那些(两篇专利均据此以引用方式并
入)。适宜的纤维质聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、以及它们的混合物。适宜的纤维质聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、两性离子改性的纤维素、以及它们的混合物。适宜的纤维质聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯型羧甲基纤维素、以及它们的混合物。优选地，洗涤剂助剂包括羧甲基纤维素或其衍生物，优选地选自羧甲基纤维
素、疏水改性的羧甲基纤维素或它们的混合物，疏水改性的羧甲基纤维素是尤其优选的。

[0667] 抗再沉积剂

[0668] 本发明的洗涤剂组合物也可包含一种或多种抗再沉积剂，诸如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙烯亚胺。上文所述在“去垢性聚合物”下的基于纤维素的聚合物也可用作抗再沉积剂。

[0669] 流变改性剂

[0670] 本发明的洗涤剂组合物也可包含一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，与降粘剂不同。流变改性剂选自：非聚合结晶的、羟基功能性材料、聚合流变改性剂，所述聚合流变改性剂向液体洗涤剂组合物的含水液体基质赋予剪切致稀特性。可通过本领域已知的方
法修改和调节洗涤剂的流变特性和粘度，例如如EP 2169040中所示。

[0671] 其他合适的助剂包括但不限于抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、粘结剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填料、泡沫调节剂、水溶助长剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构增弹剂。

[0672] 制备方法

[0673] 本领域的技术人员将知道如何使用通常已知的制造技术制备本发明的水溶性单位剂量制品和液体衣物洗涤剂组合物。

[0674] 洗涤方法

[0675] 本发明的另一个方面为一种用于洗涤织物的方法，该方法包括以下步骤：

[0676] a.将根据本发明的水溶性单位剂量制品与足够的水混合以溶解水溶性膜并将衣物洗涤剂组合物稀释优选地介于300倍和3000倍之间，优选地介于300倍和800倍之间的倍
数以形成洗涤液体；

[0677] b.将洗涤液体与待洗涤的至少一件织物混合。

[0678] 酶稳定剂和/或流变改性剂

[0679] 本发明的组合物优选地包含酶稳定剂，例如多元醇、聚合物、可逆酶抑制剂、二价阳离子、酶底物、抗氧化剂等。优选的是水溶性稳定剂。

[0680] 可使用添加缓慢溶解的稳定剂的方式在胶囊内部形成局部环境，该局部环境对包封的酶/化合物更“友好”，从而改善储存期间的稳定性。

[0681] 可逆蛋白酶抑制剂的示例是硼酸、肽醛和其衍生物，以及高分子量蛋白型抑制剂(如BASI/RASI抑制剂，参见WO 2009/095425)。金属蛋白酶抑制剂的示例描述于WO 2008/
134343中。蛋白酶抑制剂在下文标题“蛋白酶抑制剂”中有更详细的描述。

[0682] 稳定聚合物可基于例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇以及它们的共聚物。稳定多元醇可为较小的分子如甘油、山梨醇、丙二醇等，但也可为较大的分子如聚乙二醇、多糖等。

[0683] 稳定二价阳离子Ca2+、Mg2+和Zn2+是本领域熟知的。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物包含Ca2+、Mg2+或Zn2+离子的来源。优选地，Ca2+、Mg2+或Zn2+离子的来源是Ca2+、Mg2+或Zn2+的难溶解(缓慢溶解)的盐。难溶解是指在20℃下纯水中的溶解度小于5g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L、0.2g/L、0.1g/L或0.05g/L。优选的Ca2+、Mg2+或Zn2+盐为碳酸钙、碳酸镁、碳酸锌、硫酸钙、亚硫酸钙、亚硫酸镁、亚硫酸锌、磷酸钙、磷酸二钙、磷酸镁、磷酸锌、柠檬酸钙、柠檬酸镁、柠檬酸锌、草酸钙、草酸镁、草酸锌、酒石酸钙、酒石酸镁或酒石酸锌。

[0684] 另外，可使用缓慢溶解的酸或碱在微胶囊内部形成对包封的酶/化合物更“友好”的局部pH。

[0685] 酶在大多数情况下通过添加它们的底物而稳定(例如，蛋白酶通过添加蛋白而稳定，淀粉酶通过添加淀粉而稳定等)。可施加抗氧化剂或还原剂(例如硫代硫酸盐、抗坏血酸盐等)以降低酶的氧化。每克洗涤剂所需这些稳定剂的净剂量比将稳定剂加入到连续洗涤
剂相中时低得多，因为它们浓缩在内部胶囊相中，并且取决于稳定剂的结构和分子量，在许多情况下不会在储存期间扩散出，或仅缓慢扩散出。尤其高分子量稳定剂(例如，高于1kDa，或高于2kDa，更优选地高于5kDa)将提供改善的净效率。因此，优选的是高分子量抑制剂、聚合物、多元醇、阳离子、酶底物和抗氧化剂。

[0686] 可通过加入“清除剂”蛋白质来保护酶。通过反应到蛋白质上的氨基酸基团(例如胺)来使酶不稳定的组分因此可与加入的清除剂或牺牲蛋白反应。优选的是具有足够大分
子量以保持在胶囊内部的清除剂蛋白。

[0687] 可任选地通过加入流变改性组分来改善酶稳定性，从而增加内部胶囊相的粘度。内部粘度增加将减慢酶去稳定剂扩散到胶囊中(和/或减慢酶稳定剂从胶囊中扩散出)并因
此延长酶的寿命。此类粘度调节剂的示例为聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、亲水性聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和PVP-乙酸乙烯酯共聚物、淀粉、透明质酸、水溶性纤维素衍生物如羧甲基纤维素、水溶性树胶(如阿拉伯树胶、刺槐豆胶、瓜耳胶或黄原胶等)，以及它们的组合或共聚物。最优选的是分子量高于1kDa，或高于2kDa，更优选地高于5kDa的非离子高分子量聚合物。优选的是非离子聚合物，因为相比于离子聚合物，它们在大多数情况下与反应性隔膜聚合物更相容。

[0688] 可通过使用高粘度水相制备胶囊，或(更复杂的)其中粘度增加首先发生在制备乳液/胶囊之后的胶囊制备过程来实现高粘度。优选的是这种“触发式”粘度增加，因为制备具有高粘度水相的乳液可能是困难的。当加入到洗涤剂中时，触发式粘度增加可原位发生，这是因为内部胶囊相具有比加入该内部胶囊相的洗涤剂更高的水活度，因此水将从胶囊扩散
出(但不是流变改性剂)，从而在加入到洗涤剂中之后增加内部相的粘度。这也可使用盐或
其他低分子量组分的扩散来利用，例如通过具有当盐浓度由于盐加入到洗涤剂中而降低时
粘度将增加的组分(例如，在初始高盐含量下沉淀但当盐浓度由于盐在添加到洗涤剂中时
扩散而降低时可溶解的聚合物)。触发粘度的另一种方法是使用粘度取决于pH的组分。对于一些界面聚合过程(例如，胺-酰基卤反应)，内部相的pH将在胶囊化期间改变，就胺-酰基卤而言，在界面聚合期间pH将降低。这可用于触发粘度的增加。许多流变改性剂如聚丙烯酸酯在特定的pH下或pH范围内表现出最大的粘度。来自Lubrizol的Carbopol 934和来自Scott-
Bader的Texipol 63-258是流变改性剂的示例，当将pH从11降低至8，或将pH从4提高至8时，其粘度显著增加。在低pH和高pH下具有不同粘度的另一种聚合物类型是部分水解的聚丙烯
酰胺。另一种可能性是使用依赖于温度的流变改性剂，因此在一个温度下制备乳液/胶囊
化，随后改变温度以增加粘度。也可利用光或超声诱导的粘度。另一种方法是使用剪切致稀流变改性剂，使得当形成乳液时在高剪切下粘度低，并且当剪切降低时粘度高。

[0689] 当包封酶时，另一种稳定技术是例如通过加入沉淀剂如盐或聚乙二醇(PEG)确保酶在储存期间沉淀在胶囊中。可例如通过添加PEG使用如上所述的相同“触发式稳定”，PEG在加入到洗涤剂中之后被扩散出来的水浓缩至酶将沉淀的程度。这样，酶可在胶囊加工期
间处于溶液状态，但当加入到洗涤剂中时沉淀。

[0690] 当制备微胶囊时酶也可以沉淀或晶体形式使用。

[0691] 以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。

[0692] 实施例

[0693] 实施例1：对硝基苯(pNP)分析

[0694] 脂肪酶的水解活性可通过使用对硝基苯酰基酯作为底物的动力学分析法来测定。

[0695] 对于每一种底物对硝基苯丁酸酯(C4)、对硝基苯己酸酯(C6)、对硝基苯癸酸酯(C10)、对硝基苯月桂酸酯(C12)和对硝基苯棕榈酸酯(C16)(所有均得自Sigma-Aldrich
Danmark A/S，Kirkebjerg Allé84，2605 目录号：C3:N-9876，C6:N-0502，C10:N-
0252，C12:N-2002，C16:N-2752)，在分析缓冲液(50mM Tris；pH 7.7；0.4％Triton X-100)中将100mM的DMSO储备溶液稀释至最终浓度1mM 25mM。

[0696] 在96孔NUNC板(目录号260836，Kamstrupvej 90，DK-4000，Roskilde)中将脂肪酶变体、亲本脂肪酶和适当的对照例如50mM Hepes；pH 8.0；10ppm Triton X-100；+/-20mM CaCl2中的LipolaseTM(SEQ ID NO:2)以下列最终蛋白质浓度加入到底物溶液中：0.01mg/
mL、5×10-3mg/mL、2.5×10-4mg/mL和1.25×10-4mg/mL。缓冲液也作为阴性对照运行。在
405nm下，在5分钟内，以10秒时间间隔在Spectra max 190(Molecular Devices GmbH，
Bismarckring 39，88400Biberach an der Riss，GERMANY)上监测对硝基苯基酰基水解所
释放的对硝基苯酚。将对变体的一种或多种底物的水解活性与亲本脂肪酶的水解活性进行
比较。

[0697] 实施例2：通过定点诱变构建变体

[0698] 定点变体由疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)(SEQ ID NO:2)构建。所述变体通过DNA片段的传统克隆制备(Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)，其使用PCR与适当设计的诱变寡核苷酸一起使用，所述诱变寡核苷酸在所得序列中引入所需的突变。

[0699] 设计了与侧接突变的期望位置的DNA序列相对应的诱变寡核苷酸，其由限定插入/缺失/替换的DNA碱基对分开，并且购自寡核苷酸供应商诸如Life Technologies。

[0700] 为了测试TLL变体，编码变体的突变DNA通过同源重组整合到感受态米曲霉菌株中，使用标准规程发酵(基于酵母提取物的培养基，3-4天，30℃)，并通过色谱法纯化。以此方式，构建和制备下表中列出的变体。

[0701] SEQ ID NO 2的变体

[0702] G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256TA40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T
G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T
D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E
G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T

[0703] 实施例3：相对洗涤性能(RP(洗涤))

[0704] 使用自动机械应力分析(AMSA)进行洗涤实验，以便评估在衣物洗涤中的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的狭槽，并且还具有一个紧压衣物洗涤样品的封盖，待洗涤的织物对着所有的狭槽开口。在洗涤期间，剧烈振荡板、测试溶液、纺织物和封盖以使测试溶液接触纺织物并以规律的定期振荡方式施加机械应力。关于进一步的描述参见WO02/
42740，尤其第23-24页的段落“特殊方法实施方案”。

[0705] 在下面指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：

[0706] 洗涤剂：3.3g/L洗涤剂B或0.8g/L洗涤剂J

[0707] 测试溶液体积：160μL

[0708] 洗涤时间：20分钟

[0709] 温度：30℃

[0710] 脂肪酶剂量：0ppm或0.35ppm

[0711] 测试材料：如WO06/125437中所述那样制备的膏状胭脂树橙染色的EMPA221棉纺织物，不同之处在于用胭脂树橙替代姜黄(胭脂树橙：A-320-WS，Chr.Hansen A/S，Boege
Alle′10-12，DK-2970，Hoersholm，Denmark&EMPA221:EMPA，Lerchenfeldstrasse 5，CH-
9014，St.Gallen，Switzerland)。

[0712] 通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5或2:1:4.5)将水硬度调节至15°dH或6°dH。

[0713]

[0714]

[0715]

[0716] 洗涤后，将纺织物在自来水中冲洗，并且使用滤纸去除纺织物中多余的水，然后立即将纺织物在100℃下干燥15分钟。

[0717] 将洗涤性能测量为所洗涤脏污纺织物的颜色变化。污垢是与胭脂树橙混合的霜膏。胭脂树橙包含着色剂降胭脂树素，其用作具有依赖于pH的颜色变化的pH指示剂。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从霜膏酰基甘油中释放，这导致pH降低，并由此导致降胭脂树素pH指
示剂颜色变化。因此，脂肪酶洗涤性能可表示为当用白光照射时从所洗涤的脏污纺织物反
射-发射的光的颜色变化程度。

[0718] 使用专业的平面扫描仪(EPSON EXPRESSION 11000XL，Atea A/S，Lautrupvang 6，2750 Ballerup，Denmark)(其用于捕获所洗涤脏污纺织物的图像)进行颜色测量。为了从扫描图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。

[0719] 将由于脂肪酶活性引起的颜色变化测量为绿光(G)的反射-发射相对于光强度值(Int)的变化，其计算为：

[0720]

[0721] 脂肪酶相对于参考脂肪酶的相对洗涤性能(RP(洗涤))计算为：

[0722] RP(洗涤)＝(G/Int(所测试脂肪酶)-G/Int(无酶))/(G/Int(参考脂肪酶)-G/Int(无酶))。

[0723] 如果脂肪酶表现优于参考脂肪酶，则认为它表现出改善的洗涤性能(RP(洗涤)>1)。在本发明的上下文中，参考酶是如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶。

[0724] 通过固相微萃取气相色谱仪测量来检测气味

[0725] 使用以下方法，通过固相微萃取气相色谱仪(SPME-GC)测量从脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸(气味)。

[0726] 如上所述那样洗涤膏状胭脂树橙染色的EMPA221棉纺织物，并且在洗涤后，使用滤纸去除纺织物中过量的水，然后将纺织物在25℃下干燥2小时。用四块经洗涤和干燥的纺织物(直径为5mm)进行每次SPME-GC测量，将其转移到气相色谱(GC)小瓶中，并且封上小瓶。将样品在30℃下温育24小时，随后加热至140℃，保持30分钟，并且在分析之前在20℃-25℃下保存至少4小时。在配备有Stabilwax-DAw/lntegra-Guard保护柱(30m，0.32mm ID和0.25微米df)和Carboxen PDMS SPME纤维(85微米)的Varian 3800GC上进行分析。在50℃下从每个
GC小瓶连续取样8分钟，其中SPME纤维在顶部空间中位于纺织物块上方，随后将取样的化合物注入到色谱柱上(进样口温度＝250℃，柱流量＝2mL氦气/分钟，柱箱温度梯度：0分钟＝
50℃，2分钟＝50℃，6分钟45秒＝240℃，11分钟45秒＝240℃。使用火焰离子化检测器(FID)进行检测，并且使用真实标准品鉴定丁酸的保留时间。

[0727] 脂肪酶的相对气味释放(RP(气味))是从脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸的量(峰面积)与从参考脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸的量(峰面积)之间的比率，这两个值均已
根据从未经脂肪酶洗涤的样本(空白)释放的丁酸的量(峰面积)得以校正。根据下式计算多
肽的相对气味性能(RP(气味))：

[0728] RP(气味)＝(气味(所测试脂肪酶)-气味(无酶))/(气味(参考脂肪酶)-气味(无酶))

[0729] 其中气味为从纺织物表面释放的测量的丁酸(峰面积)。

[0730] 有益效果风险因子(RP(洗涤)/RP(气味))

[0731] 描述洗涤性能(有益效果)与气味释放(风险)相比的有益效果风险因子(BRF)可被定义为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶的有益效果风险因子高于1，则与参考脂肪酶(SEQ ID NO:2)相比，相对于所释放的气味，脂肪酶具有更好的洗涤性能。

[0732]

[0733] 实施例4：蛋白质热去折叠分析(TSA，热转移分析法)

[0734] 使用实时PCR仪器(Applied Biosystems；Step-One-Plus)，用Sypro Orange(Invitrogen，S-6650)监测SEQ ID NO:1的变体的蛋白质热去折叠。

[0735] 在96孔白色PCR板中，将15μL样品(在100mM EPPS，0.01％Troton-X-100；pH 8.0中稀释的纯化酶)与Sypro Orange(浓度＝10X；来自供应商的储备溶液＝5000X)的水溶液混合(1:1)。

[0736] 用光学PCR密封件将板密封。将PCR仪器设定为76℃/小时的扫描速率，从25℃开始并在96℃时结束。

[0737] 使用内置LED蓝光用于激发和ROX滤波器(610nm，发射)，每隔20秒监测荧光。将Tm值计算为一阶导数的最大值(dF/dK)(Gregory等人，2009，J.Biomol.Screen.14:700)。

[0738]

[0739] 实施例5：通过定点诱变构建变体

[0740] 定点变体由疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)(SEQ ID NO:2)构建。所述变体通过DNA片段的传统克隆制备(Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)，其使用PCR与适当设计的诱变寡核苷酸一起使用，所述诱变寡核苷酸在所得序列中引入所需的突变。

[0741] 设计了与侧接突变的期望位置的DNA序列相对应的诱变寡核苷酸，其由限定插入/缺失/替换的DNA碱基对分开，并且购自寡核苷酸供应商诸如Life Technologies。为了测试TLL变体，编码变体的突变DNA通过同源重组整合到感受态米曲霉菌株中，使用标准规程发
酵(基于酵母提取物的培养基，3-4天，30℃)，并通过色谱法纯化。以此方式，构建和制备下表中列出的变体。

[0742]

[0743]

[0744] 实施例6：相对洗涤性能(RP(洗涤))

[0745] 使用自动机械应力分析(AMSA)进行洗涤实验，以便评估在衣物洗涤中的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的狭槽，并且还具有一个紧压衣物洗涤样品的封盖，待洗涤的织物对着所有的狭槽开口。在洗涤期间，剧烈振荡板、测试溶液、纺织物和封盖以使测试溶液接触纺织物并以规律的定期振荡方式施加机械应力。关于进一步的描述参见WO02/
42740，尤其是第23-24页的段落“特殊方法实施方案”。

[0746] 在下面指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：

[0747] 洗涤剂：3.3g/L洗涤剂A或0.8g/L洗涤剂B

[0748] 测试溶液体积：160μL

[0749] 洗涤时间：20分钟

[0750] 温度：30℃

[0751] 脂肪酶剂量：0ppm或0.35ppm

[0752] 测试材料：如WO 06/125437中所述那样制备的膏状胭脂树橙染色的EMPA221棉纺织物，不同之处在于用胭脂树橙替代姜黄(胭脂树橙：A-320-WS，Chr.Hansen A/S，Boege Alle′10-12，DK-2970，Hoersholm，Denmark&EMPA221:EMPA，Lerchenfeldstrasse 5，CH-
9014，St.Gallen，Switzerland)。

[0753] 通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5或2:1:4.5)将水硬度调节至15°dH或6°dH。

[0754]

[0755]

[0756] 洗涤后，将纺织物在自来水中冲洗，并且使用滤纸去除纺织物中多余的水，然后立即将纺织物在100℃下干燥15分钟。

[0757] 将洗涤性能测量为所洗涤脏污纺织物的颜色变化。污垢是与胭脂树橙混合的霜膏。胭脂树橙包含着色剂降胭脂树素，其用作具有依赖于pH的颜色变化的pH指示剂。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从霜膏酰基甘油中释放，这导致pH降低，并由此导致降胭脂树素pH指
示剂颜色变化。因此，脂肪酶洗涤性能可表示为当用白光照射时从所洗涤的脏污纺织物反
射-发射的光的颜色变化程度。

[0758] 使用专业的平面扫描仪(EPSON EXPRESSION 11000XL，Atea A/S，Lautrupvang 6，2750Ballerup，Denmark)(其用于捕获所洗涤脏污纺织物的图像)进行颜色测量。为了从扫
描图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)的值。

[0759] 将由于脂肪酶活性引起的颜色变化测量为绿光(G)的反射-发射相对于光强度值(Int)的变化，其计算为：

[0760]

[0761] 脂肪酶相对于参考脂肪酶的相对洗涤性能(RP(洗涤))计算为：

[0762] RP(洗涤)＝(G/Int(所测试脂肪酶)-G/Int(无酶))/(G/Int(参考脂肪酶)-

[0763] G/Int(无酶))。

[0764] 如果脂肪酶表现优于参考脂肪酶，则认为它表现出改善的洗涤性能(RP(洗涤)>1)。在本发明的上下文中，参考酶是如SEQ ID NO:2所示的脂肪酶。

[0765] 通过固相微萃取气相色谱仪测量来检测气味。

[0766] 使用以下方法，通过固相微萃取气相色谱仪(SPME-GC)测量从脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸(气味)。

[0767] 如上所述那样洗涤膏状胭脂树橙染色的EMPA221棉纺织物，并且在洗涤后，使用滤纸去除纺织物中过量的水，然后将纺织物在25℃下干燥2小时。用四块经洗涤和干燥的纺织物(直径为5mm)进行每次SPME-GC测量，将其转移到气相色谱(GC)小瓶中，并且封上小瓶。将样品在30℃下温育24小时，随后加热至140℃，保持30分钟，并且在分析之前在20℃-25℃下保存至少4小时。在配备有Stabilwax-DAw/lntegra-Guard保护柱(30m，0.32mm ID和0.25微米df)和Carboxen PDMS SPME纤维(85微米)的Varian 3800GC上进行分析。在50℃下从每个
GC小瓶连续取样8分钟，其中SPME纤维在顶部空间中位于纺织物块上方，随后将取样的化合物注入到色谱柱上(进样口温度＝250℃，柱流量＝2mL氦气/分钟，柱箱温度梯度：0分钟＝
50℃，2分钟＝50℃，6分钟45秒＝240℃，11分钟45秒＝240℃。使用火焰离子化检测器(FID)进行检测，并且使用真实标准品鉴定丁酸的保留时间。

[0768] 脂肪酶的相对气味释放(RP(气味))是从脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸的量(峰面积)与从参考脂肪酶洗涤过的样本释放的丁酸的量(峰面积)之间的比率，这两个值均已
根据从未经脂肪酶洗涤的样本(空白)释放的丁酸的量(峰面积)得以校正。根据下式计算相
对气味性能(RP(气味))：

[0769] RP(气味)＝(气味(所测试脂肪酶)-气味(无酶))/(气味(参考脂肪酶)-气味(无酶))

[0770] 其中气味为从纺织物表面释放的测量的丁酸(峰面积)。

[0771] 有益效果风险因子(RP(洗涤)/RP(气味))。

[0772] 描述洗涤性能(有益效果)与气味释放(风险)相比的有益效果风险因子(BRF)可被定义为RP(洗涤)/RP(气味)。如果脂肪酶的有益效果风险因子高于1，则与参考脂肪酶(SEQ ID NO:2)相比，相对于所释放的气味，脂肪酶具有更好的洗涤性能。

[0773]

[0774]

[0775] 实施例7：蛋白质热去折叠分析(TSA，热转移分析法)

[0776] 使用实时PCR仪器(Applied Biosystems；Step-One-Plus)，用Sypro Orange(Invitrogen，S-6650)监测SEQ ID NO:2的变体的蛋白质热去折叠。

[0777] 在96孔白色PCR板中，将15μL样品(在100mM EPPS，0.01％Troton-X-100；pH 8.0中稀释的纯化酶)与Sypro Orange(浓度＝10X；来自供应商的储备溶液＝5000X)的水溶液混合(1:1)。

[0778] 用光学PCR密封件将板密封。将PCR仪器设定为76℃/小时的扫描速率，从25℃开始并在96℃时结束。

[0779] 使用内置LED蓝光用于激发和ROX滤波器(610nm，发射)，每隔20秒监测荧光。将Tm值计算为一阶导数的最大值(dF/dK)(Gregory等人，2009，J.Biomol.Screen.14:700)。

[0780]

[0781] 洗涤剂实例

[0782] 实施例1-5

[0783] 单位剂量衣物洗涤剂组合物。此类单位剂量配方可包括一个或多个隔室。

[0784]

[0785] 实施例6.多隔室单位剂量组合物

[0786] 下文中提供了本发明的多隔室的单位剂量衣物洗涤剂配方。在这些实例中，单位剂量具有三个隔室，但类似的组合物能够以两个、四个或五个隔室被制得。用于包封所述隔室的膜是聚乙烯醇。

[0787]

[0788]

[0789] 多隔室配方

[0790]

[0791] 针对洗涤剂实施例1-7的原材料和说明

[0792] 具有C11-C18平均脂族碳链链长的直链烷基苯磺酸盐，

[0793] C12-18二甲基羟乙基氯化胺

[0794] AE3S是C12-15烷基乙氧基(3)硫酸盐

[0795] AE7是C12-15醇乙氧基化物，具有7的平均乙氧基化度

[0796] AE9是C12-16醇乙氧基化物，具有9的平均乙氧基化度

[0797] HSAS是如US 6,020,303和US 6,060,443所公开的具有约16-17的碳链长度的中间支化伯烷基硫酸盐

[0798] 聚丙烯酸酯MW 4500是由BASF提供的

[0799] 羧甲基纤维素为由CP Kelco(Arnhem,Netherlands)供应的 V

[0800] CHEC是阳离子改性的羟乙基纤维素聚合物。

[0801] 膦酸盐螯合剂是，例如，二亚乙基四胺五乙酸(DTPA)羟乙烷二磷酸盐(HEDP)

[0802] S-ACMC为与C.I.活性蓝19产品名AZO-CM-CELLULOSE

[0803] 去垢剂为 PF。

[0804] 丙烯酸/马来酸共聚物的分子量为70,000，丙烯酸根与马来酸根的比率为70:30

[0805] 调色染料为 Violet CT聚合物调色染料，由Milliken，Spartanburg，South Carolina，USA提供

[0806] 两亲性接枝无规接枝共聚物为聚乙酸乙烯酯接枝的环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙
烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元具有不超过1个接枝点。

[0807] 2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化物基团。

[0808] 3两亲性烷氧基化聚合物是聚乙烯亚胺(分子量＝600)，制备自被衍生为每个-NH包含24个乙氧基化物基团每–NH和每个–NH包含16个丙氧基化物基团的聚合物。

[0809] 4脂肪酶和淀粉酶以每100g洗涤剂的活性酶毫克数表示。

[0810] a Proxel GXL，1,2-苯异噻唑啉-3-酮的20％双丙二醇水溶液，由Lonza提供。

[0811] b N,N-双(羟乙基)-N,N-二甲基氯化铵脂肪酸酯。该材料的母体脂肪酸的碘值介于18和22之间。得自Evonik的材料包含有游离脂肪酸形式的杂质、N,N-双(羟乙基)-N,N-二甲基氯化铵脂肪酸酯的单酯形式的杂质、和N,N-双(羟乙基)-N-甲胺的脂肪酸酯形式的杂
质。

[0812] c 由Dow Corning提供，8％的活性

[0813] d如US 8,765,659中所述，表达为100％包封的香料油

[0814] e CDE，由BASF提供的阳离子聚合物增稠剂

[0815] f N,N-二甲基辛酰胺和N,N-二甲基癸酰胺，重量比为约55:45，商品名M-8-10，来自Stepan公司

[0816] 本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为
“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

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包含脂肪酶的洗涤剂组合物

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