同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法专利检索-溶剂溶剂类专利检索查询-专利查询网

同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法

阅读：2发布：2020-09-24

专利汇可以提供同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，属于黄曲霉毒素含量的超高效液相色谱检测领域。本发明同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱法进行定性定量测定。本发明方法使肉鸡肝脏、肾脏或鸡肉中的黄曲霉毒素B1和M1得到充分提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高、快速等优点，能够应用于检测动物可食用组织中的黄曲霉毒素残留。，下面是同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1，得到提取液；
(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定；
步骤(1)所述提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的黄曲霉毒素B1和M1包括：将待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织粉碎，加入提取溶剂，经超声处理后，摇床震荡，然后加入无水硫酸钠，离心，取上清；
所述提取溶剂为二氯甲烷；所述摇床震荡的时间为60min；所述摇床震荡的转速为
400r/min；
按照g/ml计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：提取溶剂＝1：10；
步骤(2)中所述的净化包括：取提取液10ml，50℃水浴条件下氮气吹干，加入2ml甲醇溶解残渣，加入pH7.4 PBS溶液13mL，通过AFM1免疫亲和柱，流速1-2滴/秒，10ml纯水冲洗免疫亲和柱，压入空气排出柱内残余水分，加入1ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液；
步骤(2)中所述的衍生包括：将洗脱液经氮气吹干，加入三氟乙酸、正己烷，水浴衍生，然后氮气吹干，定容；所述定容用的溶液为10％-100％甲醇水溶液或10％-100％乙腈溶液；
步骤(3)所述超高效液相色谱的条件包括：色谱柱为WatersAcquity UPLC BEH C18，规格为50mm×2.1mm×1.7μm；流速0.2mL/min；进样量为10μL；按照体积比计，流动相为乙腈：
水＝20：80；柱温25℃；激发波长365nm，发射波长435nm。
2.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，所述超声的时间为10min；
超声的功率为60Hz。
3.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，按照质量比计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：无水硫酸钠＝1：1。
4.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，所述定容用的溶液为10％甲醇水溶液。
5.按照权利要求1所述的超高效液相色谱方法，其特征在于，步骤(3)定性定量测定包括：根据待检测黄曲霉毒素与黄曲霉毒素标准品的保留时间一致，确定为目标黄曲霉毒素；
根据黄曲霉毒素标准品浓度与色谱峰面积做线性回归，得到线性回归方程；将待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中黄曲霉毒素的峰面积带入线性回归方程，计算目标黄曲霉毒素的相应浓度。

说明书全文

同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的

超高效液相色谱方法

技术领域

[0001] 本发明涉及肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1含量的检测方法，尤其涉及同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉组织中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，属于黄曲霉毒素含量的超高效液相色谱检测领域。

背景技术

[0002] 黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFT)，是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的次生代谢产物，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，尤其是黄曲霉毒素B1为强污染物质，其分布范围广，主要产生和存在于发霉变质的粮食谷物或其生产制品中。动物食用了含有黄曲霉毒素B1(AFB1)的饲料后，在体内经羟基化代谢会产生黄曲霉毒素M1(AFM1)，二者均具有极强的毒性，能引起人类特别是儿童、各种饲养动物的中毒，还能致癌、致畸、致突变，即使每千克物质中含有几十微克的量仍有很大的毒性，二者均会残留于动物的肝、肾、肌肉等人类可食用部分，对人类、家禽、家畜的健康造成了极大的威胁。

[0003] 超高效液相色谱方法(UPLC)是分离科学中的一个全新类别，它借助高效液相色谱法(HPLC)的理论和原理，涵盖了小颗粒填料，非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量，灵敏度和色谱峰容量。与传统的HPLC相比，UPLC的灵敏度及分离度均提高了数倍甚至数十倍，且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本，是一种比HPLC更快速、更高效、更灵敏的残留检测方法。因此，建立一种准确、灵敏、高效的超高效液相色谱法检测肉鸡可食用组织中的黄曲霉毒素残留，对保证畜禽产品的安全和维护人类的健康均具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1(AFB1)和黄曲霉毒素M1(AFM1)含量的超高效液相色谱方法，该方法使AFB1和AFM1得到充分的提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高等优点。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

[0006] 本发明首先公开了一种同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中AFB1和AFM1含量的超高效液相色谱方法，包括以下步骤：(1)提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1，得到提取液；(2)将提取液进行净化、衍生；(3)采用超高效液相色谱进行定性定量测定。

[0007] 步骤(1)所述提取待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织中的AFB1和AFM1包括：将待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织粉碎，加入提取溶剂，经超声处理后，摇床震荡，然后加入无水硫酸钠，离心，取上清。其中，所述提取溶剂选自二氯甲烷、70％-100％甲醇溶液或84％乙腈溶液(体积百分比)中的任意一种，优选为二氯甲烷；进一步优选的，按照g/ml计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织：提取溶剂＝1：10。所述超声的时间为10min；
超声的功率为60Hz；所述摇床震荡的时间为30-90min，优选为60min；所述摇床震荡的转速为400r/min。按照质量比计，所述待检测肉鸡的肝脏、肾脏和/或鸡肉组织：无水硫酸钠＝1：
1。

[0008] 步骤(2)所述净化包括：将提取液通过黄曲霉毒素免疫亲和柱，收集洗脱液；其中所述黄曲霉毒素免疫亲和柱选自AFM1免疫亲和柱或AFB1免疫亲和柱中的任意一种，优选为AFM1免疫亲和柱。具体的净化步骤包括：取提取液10ml，50℃水浴条件下氮气吹干，加入2ml甲醇溶解残渣，加入pH7.4 PBS溶液13mL，通过AFM1免疫亲和柱，流速1-2滴/秒，10ml纯水冲洗免疫亲和柱，压入空气排出柱内残余水分，加入1ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液。

[0009] 步骤(2)所述衍生的方法为三氟乙酸柱前衍生法(参见文献“高效液相色谱法对肉鸡组织样品中黄曲霉毒素B1残留量的测定”，《黑龙江畜牧兽医》科技版，2015年10月(上)281-287.)；衍生后的产物经氮气吹干、定容，用于上样。具体的包括：将洗脱液经氮气吹干，加入三氟乙酸、正己烷，水浴衍生，然后氮气吹干，定容；进一步具体的，收集用1ml甲醇洗脱的全部洗脱液，50℃水浴条件下氮气吹干，加入100μl三氟乙酸、200μl正己烷，40℃水浴衍生15min，50℃水浴条件下氮气吹干。所述定容用的溶液为10％-100％甲醇水溶液或10％-
100％乙腈溶液，优选为10％甲醇水溶液(体积百分比)。

[0010] 步骤(3)所述超高效液相色谱的条件包括：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18，规格为50mm×2.1mm×1.7μm；流速0.1-0.3mL/min；进样量为10μL；流动相为乙腈：水；柱温20-30℃；激发波长365nm，发射波长435nm；运行时间4min。按照体积比计，所述流动相为乙腈：水＝15-30：70-85，即乙腈和水的比例为15：85、20：80、25：75或30：70；优选的，所述流动相为乙腈：水＝20：80；所述柱温优选为25℃；所述流速优选为0.2mL/min。

[0011] 步骤(3)定性定量测定包括：根据待检测黄曲霉毒素与黄曲霉毒素标准品的保留时间一致，确定为目标黄曲霉毒素。根据黄曲霉毒素标准品浓度与色谱峰面积做线性回归，得到线性回归方程；将待检测肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中黄曲霉毒素的峰面积带入相应的线性回归方程，计算目标黄曲霉毒素的相应浓度。

[0012] 提取用有机溶剂对于肉鸡的肝脏、肾脏或鸡肉组织中的AFB1和AFM1的充分提取分离具有重要影响。根据黄曲霉毒素的性质，一般提取用有机溶剂主要有甲醇、二氯甲烷和乙腈。本发明对三种有机溶剂对黄曲霉毒素的提取效果进行了比较，其中80％甲醇与84％乙腈为提取饲料中黄曲霉毒素的常用溶剂，但用于提取肝脏、肾脏或肌肉等组织中黄曲霉毒素的回收率显著低于二氯甲烷。而且，二氯甲烷为提取溶剂时AFB1和AFM1的加标回收率显著高于不同浓度的甲醇溶液。因此，本发明选择二氯甲烷为组织中AFB1和AFM1的提取溶剂。

[0013] 震荡提取时间对加标回收率也存在显著影响。在30-90min范围内，当震荡提取时间为60min时，AFB1和AFM1的加标回收率均极显著高于震荡提取30-50min；继续延长震荡时间至70-90min，AFB1和AFM1的加标回收率与震荡60min差异不显著。因此，本发明优选震荡提取时间为60min。

[0014] 本发明对净化提取液用的免疫亲和柱进行了考察。黄曲霉毒素M1的免疫亲和柱对AFM1和AFB1的回收率均很高，而AFB1免疫亲和柱不能吸附AFM1。因此本发明选择AFM1免疫亲和柱。定容用溶液的优化结果表明，有机相选择甲醇且比例在10％时，色谱峰峰型好，溶剂峰对AFM1峰型干扰小，峰面积大。

[0015] 本发明对色谱条件包括流动相、流速、柱温以及检测波长进行了优化。流动相优化结果表明，流动相乙腈：水为20：80条件下AFB1和AFM1峰面积显著大于其它比例流动相。流速优化结果表明，流速为0.2ml/min时AFB1和AFM1峰面积显著大于流速为0.1或0.3ml/min(P<0.01)，且峰型好，色谱峰能得到较好的分离；而流速为0.1ml/min时出峰时间晚，且峰型低平；流速为0.3ml/min时，出峰时间过早，与溶剂峰分离不彻底。柱温优化结果表明，在柱温为25℃时分离效果好，峰型好，峰面积大，与其他处理比较差异显著(P<0.01)。本发明综合AFB1、AFM1最大吸收波长，选择435nm作为最终发射波长，365nm作为最终激发波长。

[0016] 本发明方法适用于检测肉鸡的肝脏、肾脏或肌肉任意一种或多种中的AFB1和AFM1含量。

[0017] 应用本发明方法检测肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中黄曲霉毒素B1的平均回收率分别为82.32％～85.56％、85.34％～88.45％和84.88％～89.73％；精密度分别在1.47％～
4.45％、1.12％～3.54％和2.01％～4.17％。肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中黄曲霉毒素M1的平均回收率分别为92.17％～95.03％、94.12％～97.21％和95.32％～98.54％；精密度分别为
1.83％～3.46％、1.47％～3.81％和1.96％～3.97％。黄曲霉毒素B1检测限为0.008ng/mL，定量限为0.02ng/mL；黄曲霉毒素M1检测限为0.003ng/mL，定量限为0.01ng/mL。

[0018] 应用本发明同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，在黄曲霉毒素B1亚慢性中毒肉鸡的肝脏、肾脏和鸡肉组织中均检测到AFB1和AFM1的残留。

[0019] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

[0020] 本发明同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，实现AFB1和AFM1的充分提取分离，具有准确度好、重现性稳定、灵敏度高、快速等优点。与目前饲料或粮食中黄曲霉毒素的残留检测方法相比，本发明方法的灵敏度高，回收率高，更加方便、快速。本发明为肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中AFB1和AFM1的定性、定量及快速检测提供了一种简便、灵敏、准确的方法，在黄曲霉毒素代谢研究、残留检验和食品质量安全监测等方面均具有极其重要的应用价值。附图说明

[0021] 图1为AFB1和AFM1标准品色谱图；

[0022] 图2为肝脏添加AFB1和AFM1色谱图；

[0023] 图3为肾脏添加AFB1和AFM1色谱图；

[0024] 图4为肌肉添加AFB1和AFM1色谱图；

[0025] 图5为不同震荡时间AFB1和AFM1回收率比较。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

[0027] 实施例1肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法检测

[0028] 1、实验方法

[0029] 1.1 试剂的配制

[0030] PBS溶液配制：精确称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H2O 2.9g溶于约800mL去离子水中，调pH7.4，定容至1000mL，4℃冰箱保存。

[0031] 黄曲霉毒素B1标准品的配制：取Sigma-Aldrich的1mg 包装AFB1标准品一份，用色谱级甲醇于棕色容量瓶中溶解并定容到10ml，即100μg/ml的标准储备液，-20℃冰箱中备用。

[0032] 黄曲霉毒素M1标准品的配制：取Sigma-Aldrich、浓度为0.5μg/ml AFM1标准溶液1ml，用色谱级乙腈于棕色容量瓶中定容到10ml，即0.05μg/ml的标准储备液，-20℃冰箱中备用。

[0033] 两种标准溶液在使用前分别用相应溶剂稀释到所需浓度，-4℃冰箱中备用。

[0034] 1.2实验器材准备

[0035] 1)超高效液相色谱仪Acquity UPLC(美国Waters公司)

[0036] 2)荧光检测器(FLD，美国Waters公司)

[0037] 3)EMPOWER 3色谱工作站

[0038] 4)黄曲霉毒素免疫亲和柱(北京华安麦科公司AFM1免疫亲和柱和美国VICAM公司AFB1免疫亲和柱)

[0039] 5)0.2μm有机滤膜(美国Waters公司)

[0040] 6)泵流操作架(安捷伦公司)

[0041] 7)MP2002型电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)

[0042] 8)高速旋转粉碎机(德国Fritsch公司)

[0043] 9)N-EVAPTM112氮吹仪(美国Organomation Associates公司)

[0044] 10)pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)

[0045] 11)MS3型漩涡振荡器(IKA公司)

[0046] 12)SHZ-C型水浴恒温振荡器(上海浦东物理光学仪器厂)

[0047] 1.3色谱条件

[0048] 色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18，规格为50mm×2.1mm×1.7μm；流速0.2mL/min；进样量为10μL；流动相为乙腈:水(2:8)；柱温25℃；激发波长365nm，发射波长
435nm；运行时间4min。

[0049] 1.4标准曲线的绘制

[0050] 两种黄曲霉毒素标准溶液分别用相应溶剂稀释为6个系列标准工作液(表1)，将相对应的黄曲霉毒素标准品浓度y和黄曲霉毒素的色谱峰面积x做线性回归，得到相应的回归方程和相关系数；同时考察黄曲霉毒素标准品的保留时间及其变异系数。

[0051] 表1黄曲霉毒素B1与M1标准品系列浓度

[0052]

[0053] 1.5回收率和精密度实验

[0054] 回收率试验：准确称取未接触AFB1(对照组)的肉鸡肝脏、肾脏和肌肉2.00g，分别加入不同浓度的黄曲霉毒素标准品溶液，制成低、中、高三种不同含量的添加浓度(表2)，按组织样本的处理方法操作(1.7)。每一浓度重复处理并进样5次，每次取10μL进样分析，根据获得相应的峰面积计算加标回收率。

[0055] 表2空白组织中高、中、低三种黄曲霉毒素的浓度

[0056]

[0057] 精密度试验：准确称取对照组肉鸡肝脏、肾脏和肌肉2.00g，分别加入上述低、中、高3个浓度的黄曲霉毒素标准品溶液，按组织样本的处理方法操作(1.7)，每次取10μL进样分析，每一浓度重复处理并进样5次，计算日内变异系数；连续测定5天，计算日间变异系数。

[0058] 1.6灵敏度的测定

[0059] 逐步稀释各种黄曲霉毒素标准品的贮备液，用EMPOWER 3 软件建立处理方法来计算信噪比，依据信噪比(S/N)等于3时，确定检测限(LOD)，依据信噪比(S/N)等于10时，确定定量限(LOQ)。

[0060] 1.7肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的检测

[0061] 样品准备：取连续染毒黄曲霉毒素B1 28天的亚慢性中毒肉鸡(模型组)，心脏采血处死后，取出全部肝脏、肾脏以及双腿和胸肌部分肌肉。

[0062] 样品提取：将组织剪碎置组织捣碎机中，粉碎后，称取样品2±0.02g，加入20ml二氯甲烷，60Hz超声10min后，400r/min摇床震荡60min，加入无水硫酸钠2g，离心(10000r/min，5min)，取上清10ml，50℃水浴条件下氮气吹干，加入2ml甲醇溶解残渣，加入pH7.4 PBS溶液13mL，通过AFM1免疫亲和柱，流速1-2滴/秒，10ml纯水冲洗免疫亲和柱，压入空气排出柱内残余水分，加入1ml甲醇洗脱，收集全部洗脱液，50℃水浴条件下氮气吹干，加入100μl三氟乙酸、200μl正己烷，40℃水浴衍生15min，50℃水浴条件下氮气吹干，10％甲醇水溶液定容1mL，上样。

[0063] 根据待检测黄曲霉毒素与黄曲霉毒素标准品的保留时间一致，确定为目标黄曲霉毒素。根据黄曲霉毒素标准品浓度与色谱峰面积做线性回归，得到线性回归方程，根据肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中黄曲霉毒素的峰面积带到相应的线性回归方程进行定量。

[0064] 2、实验结果

[0065] 2.1黄曲霉毒素的线性方程

[0066] 黄曲霉毒素标准品的色谱图见图1；黄曲霉毒素的线性方程见表3。

[0067] 表3黄曲霉毒素B1.M1的线性方程

[0068]

[0069] 2.2黄曲霉毒素的保留时间及其变异系数

[0070] 黄曲霉毒素标准品的保留时间及其变异系数见表4。

[0071] 表4黄曲霉毒素B1.M1的保留时间及其变异系数

[0072]

[0073] 2.3回收率和精密度

[0074] 根据表5-10结果，肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中黄曲霉毒素B1的平均回收率分别为82.32％～85.56％、85.34％～88.45％和84.88％～89.73％；精密度分别在1.47％～
4.45％、1.12％～3.54％和2.01％～4.17％。肉鸡肝脏、肾脏及肌肉中黄曲霉毒素M1的平均回收率分别为92.17％～95.03％、94.12％～97.21％和95.32％～98.54％；精密度分别为
1.83％～3.46％、1.47％～3.81％和1.96％～3.97％。

[0075] 肝脏添加黄曲霉毒素色谱图见图2；肾脏添加黄曲霉毒素色谱图见图3；肌肉添加黄曲霉毒素色谱图见图4。

[0076] 表5肝脏中黄曲霉毒素B1.M1回收率

[0077]

[0078] 表6肾脏中黄曲霉毒素B1.M1回收率

[0079]

[0080] 表7肌肉中黄曲霉毒素B1.M1回收率

[0081]

[0082] 表8肝脏中黄曲霉毒素B1.M1精密度

[0083]

[0084] 表9肾脏中黄曲霉毒素B1.M1精密度

[0085]

[0086] 表10肌肉中黄曲霉毒素B1.M1精密度

[0087]

[0088] 2.4检测限与定量限

[0089] 黄曲霉毒素B1检测限在0.008ng/mL，定量限在0.02ng/mL；黄曲霉毒素M1检测限在0.003ng/mL，定量限在0.01ng/mL(表11)。

[0090] 表11黄曲霉毒素B1.M1的检测限和定量限

[0091]

[0092] 2.5肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的检测

[0093] 应用同时检测肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1含量的超高效液相色谱方法，检测黄曲霉毒素B1亚慢性中毒肉鸡肝脏、肾脏和鸡肉中黄曲霉毒素B1和M1的含量。

[0094] 在正常对照组中，三种组织中均未检测到两种黄曲霉毒素的残留，而在黄曲霉毒素B1亚慢性中毒组中，三种组织中均检测到两种黄曲霉毒素的残留(表12)。

[0095] 表12 AFB1和AFM1的含量

[0096]

[0097] 实验例1条件优化实验

[0098] 1、提取方式的优化

[0099] (1)提取用有机溶剂的优化

[0100] 取空白组织，样品加标量AFB1为0.02μg/kg，AFM1为0.01μg/kg，分别用二氯甲烷、70％甲醇溶液、80％甲醇溶液、90％甲醇溶液、纯甲醇溶液和84％乙腈溶液(体积百分比)提取，其他提取参数及超高效液相色谱检测参数同实施例1。根据加标回收率分析，当提取溶剂为二氯甲烷时AFB1和AFM1的加标回收率均显著高于其他提取溶剂(表13)。

[0101] 表13有机溶剂对AFB1和AFM1回收率(％)的影响

[0102]

[0103] 注：同种黄曲霉毒素在不同提取溶剂提取时回收率与二氯甲烷提取回收率相比，大写字母A代表P<0.05，小写字母a代表P<0.01。

[0104] 根据黄曲霉毒素的性质，一般提取用的有机溶剂主要有甲醇、二氯甲烷和乙腈。本发明对三种有机溶剂对黄曲霉毒素的提取效果进行了比较，其中80％甲醇与84％乙腈为提取饲料中黄曲霉毒素的常用溶剂，但用于提取肝脏、肾脏、肌肉等组织中黄曲霉毒素的回收率显著低于二氯甲烷。因此，本发明选择提取效果好、回收率高的二氯甲烷作为鸡肉组织中AFB1和AFM1的提取溶剂。

[0105] (2)震荡提取时间的优化

[0106] 样品加标量AFB1为0.02μg/kg，AFM1为0.01μg/kg，提取溶剂为二氯甲烷，震荡提取时间分别为30min、50min、60min、70min、90min，摇床震荡的转速为400r/min(其他提取参数及超高效液相色谱检测参数同实施例1)，探讨震荡时间对加标回收率的影响。

[0107] 由表14及图5可知，震荡30min和50min的提取回收率显著或极显著低于60min，震荡70min或90min的提取回收率与震荡60min差异不显著。因此，本发明优选震荡提取时间为60min。

[0108] 表14震荡时间对AFB1和AFM1回收率(％)的影响

[0109]

[0110] 注:同种黄曲霉毒素在不同震荡时间下的回收率分别与震荡60min组的回收率相比，大写字母不同代表P<0.05，小写字母不同代表P<0.01。

[0111] (3)免疫亲和柱的考察

[0112] 将黄曲霉毒素标准品通过AFM1免疫亲和柱或AFB1免疫亲和柱，比较亲和柱的种类对回收率的影响。结果表明，黄曲霉毒素M1的免疫亲和柱对AFM1和AFB1的回收率均很高，而AFB1免疫亲和柱不能吸附AFM1(表15)。因此，优选AFM1免疫亲和柱。

[0113] 表15不同免疫亲和柱对AFB1和AFM1回收率(％)的影响

[0114]

[0115] (4)定容用溶液

[0116] 考察分别用甲醇水溶液体积百分比分别为10％，20％，50％，70％，100％；乙腈水溶液比例为10％，20％，50％，70％，100％(体积百分比)；溶解定容最后的吹干样品，分析不同定容用溶液对进样后样品色谱分离效果的影响(超高效液相色谱检测参数同实施例1)。

[0117] 结果表明，有机相选择甲醇，且比例在10％时，色谱峰峰型好，溶剂峰对AFM1峰型干扰小，峰面积大。因此优选10％甲醇水溶液定容。

[0118] 2、色谱条件优化

[0119] (1)流动相优化

[0120] 流速0.2ml/min，进样量10μl，柱温25℃；标准品浓度AFB1为0.02ng/ml，AFM1为0.01ng/ml；分析流动相乙腈和水体积比分别为15:85、20:80、25:75和30:70对AFB1和AFM1峰面积的影响(其他超高效液相色谱检测参数同实施例1)。

[0121] 结果表明，乙腈:水为20:80流动相条件下的峰面积显著大于其他流动相条件下的峰面积(表16)。因此，本发明流动相优选乙腈:水为20:80。

[0122] 表16流动相乙腈和水比例对AFB1和AFM1峰面积的影响

[0123]

[0124] 注:同种黄曲霉毒素在不同流动相条件下的峰面积分别与20+80(乙腈+水)组的峰面积相比，大写字母A代表P<0.05，小写字母a代表P<0.01。

[0125] (2)流速优化

[0126] 进样量10μl，柱温25℃，流动相乙腈：水为20：80；标准品浓度AFB1为0.02ng/ml，AFM1为0.01ng/ml；分析流速分别为0.1、0.2和0.3ml/min时对峰面积的影响(其他超高效液相色谱检测参数同实施例1)。

[0127] 表17流速对AFB1和AFM1峰面积的影响

[0128]

[0129] 注:同种黄曲霉毒素在不同流速条件下的峰面积分别与0.2ml/min组的峰面积相比，大写字母A代表P<0.05，小写字母a代表P<0.01。

[0130] 结果表明，在流速为0.1ml/min时出峰时间晚，且峰型低平；在流速为0.3ml/min时，出峰时间过早，与溶剂峰分离不彻底；流速为0.2ml/min时峰型好，峰面积与其他处理比较差异显著(P<0.01)(表17)，色谱峰能得到较好的分离。因此，本发明优选流速为0.2ml/min。

[0131] (3)柱温优化

[0132] 进样量10μl，流动相乙腈：水为20：80，流速0.2ml/min；标准品浓度AFB1为0.02ng/ml，AFM1为0.01ng/ml；分析柱温分别为20、25、30℃对峰面积的影响(其他超高效液相色谱检测参数同实施例1)。

[0133] 表18柱温对AFB1和AFM1峰面积的影响

[0134]

[0135] 注:同种黄曲霉毒素在不同柱温条件下的峰面积分别与25℃组的峰面积相比，大写字母A代表P<0.05，小写字母a代表P<0.01。

[0136] 结果表明，在柱温为25℃时，分离效果好，峰型好，峰面积大，与其他处理比较差异显著(P<0.01)(表18)。因此优选柱温为25℃。

[0137] (4)检测波长的考察

[0138] 激发波长定为360nm，对发射波长在390～400nm扫描，综合AFB1，AFM1最大吸收波长，选择435nm作为最终发射波长。

[0139] 发射波长定为435nm，对激发波长在300～400nm扫描，综合AFB1，AFM1最大吸收波长，选择365nm作为最终激发波长。

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