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一种用于磁棒进行磁珠 吸附的 试剂以及方法

阅读：937发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种用于磁棒进行磁珠吸附的试剂以及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种对生物样本直接采用磁珠进行核算的提取中，利用磁棒套对磁珠进行吸附的试剂，以及提供一种试管。本发明公开了一种利用磁棒套来吸附磁珠的试剂，该试剂包括油性物质。其中，油性物质选自于石油、硅油、植物油、动物油中的一种或者几种。本发明为样本提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。，下面是一种用于磁棒进行磁珠吸附的试剂以及方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种利用磁棒套来吸附磁珠的试剂，该试剂包括油性物质。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中，所述的油性物质选自于石油、硅油、植物油、动物油中的一种或者几种。
3.根据权利要求1所述的试剂，所述的试剂还包括核酸扩增的必要试剂。
4.根据权利要求1所述的试剂，所述的磁珠为用来吸附核酸的钠米磁珠。
5.根据权利要求1所述的试剂，所述的油性物质为不溶于水的油性物质。
6.一种利用磁棒套来吸附磁珠的方法，该方法包括：让磁棒套表面覆盖一层油性物质薄层，然后让磁珠与磁棒套接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，让磁棒套依靠磁力让磁珠吸附在磁棒套表面。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，让磁力消失，让吸附在磁棒表面的磁珠从磁棒套表面分离出来。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述的油性物质选自于石油、硅油、植物油、动物油中的一种或者几种。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述的向磁棒套表面涂覆一层油性物质的方式包括让磁棒套浸入油性物质中。
11.根据权利要求6所述的方法，其中，所述的油性物质被包括在PCR管中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的PCR管中包括RNA逆转录酶，核酸扩增试剂以及所述的油性物质，其中，所述的RNA逆转录酶和核酸扩增试剂被油性物质分隔。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的PCR管中包括内标试剂。
14.根据权利要求9所述的方法或者1所述的试剂，其中，所述的磁棒套的材质为塑料材质。
15.油性物质作为制备利用磁棒套吸附磁珠的试剂上的用途，其中，所述的油性物质为不溶解于水的物质。
16.根据权利要求15所述的用途，让油性物质涂覆在磁棒套的表面。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述的油性物质选自石油、硅油、植物油、动物油中的一种或者几种。
18.根据权利要求15所述的用途，所述的磁棒套为塑料材质。
19.根据权利要求15所述的用途，所述磁珠为纳米磁珠。

说明书全文

一种用于磁棒进行磁珠 吸附的 试剂以及方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种对生物样本直接采用磁珠进行核算的提取中，利用磁棒套对磁珠进行吸附的试剂，以及提供一种试管。

背景技术

[0002] 随着医疗领域的迅速发展，出现了越来越多以核酸为基础的生物学实验，通过对核酸的提取和检测可辅助对患者的疾病做出快速的诊断。磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，从而进行核酸分离纯化。目前磁珠法核酸提取一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主要步骤。传统的技术中，样本裂解后，加入含有磁珠的结合液，使磁珠与核酸结合，然后将含有磁性元件的磁棒套插入裂解液中，在磁场作用下，磁珠吸附于磁棒套表面，磁棒-磁棒套将磁珠转移到洗涤液中、进行洗涤，一般洗涤的次数为2次；洗涤完成后，磁棒-磁棒套将磁珠转移到洗脱液中，将附着在磁珠上的核酸洗脱下来。然后再将带有核酸的洗脱液转移到PCR反应管中，进行后续分子诊断测试，如PCR测试。

[0003] 磁珠一般是纳米级的磁珠，或者是微米级的磁珠，更多的是纳米级的磁珠，具有巨大的表面能，可以吸附核酸，例如RNA和DNA。当采用磁棒套对磁珠进行吸附的时候，是依靠磁棒套里的磁棒对磁珠的吸引力而让磁珠与提取样本的溶液(裂解液)分开，分开后，一般取出磁棒，让磁珠失去磁力的吸引而把磁珠转移到另外的试剂中，例如直接磁珠转移到核酸扩增的试剂中进行扩增，或者，让从磁棒套分离下来的磁珠进行洗涤上的核酸或者洗涤磁珠上的杂质，然后利用磁珠上的核酸进行后续的扩增或者其他用途。或者，在取出磁棒套里的磁棒之前，对吸附在磁棒套表面的磁珠进行多次洗涤，去掉杂质，然后分离磁珠上的核酸作为后续其它用途，例如扩增。

[0004] 利用磁棒套吸附磁珠，目前任然存在诸多的问题，其中之一就是，虽然磁棒套里的磁性消失后，仍然有部分磁珠依靠表面能吸附在磁棒套的表面而难易分离，这样造成核酸的损失。为了解决此问题，一般都需要提供表面光滑的磁棒套，这对于生产表面光滑的工艺和材质提出了更高的要求。特备是磁珠用量很少的时候，磁棒套表面的吸附下，有效的核酸更少，从而造成一些严峻的问题。

[0005] 这就需要对现有磁棒套吸附磁珠进行改进，减少磁棒套对磁珠的吸附。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种利用磁棒套上磁珠吸附生物物质的试剂，该试剂包括油性物质。或者，本发明提供一种涂覆在磁棒套表面的物质，该物质为油性物质，让磁棒套表面覆盖一层油性物质薄层。或者，本发明提供一种利用磁棒套来吸附磁珠的方法，该方法包括让磁棒套表面覆盖一层油性物质薄层，然后让磁珠与磁棒套接触。在一些方式中，让磁棒套依靠磁力让磁珠吸附在磁棒套表面。在一些方式中，让磁力消失，让吸附在磁棒表面的磁珠从磁棒套表面分离出来。在一些方式中，磁力消失的方式可以是移开为位于磁棒套中的磁铁。在一些方式中，通过震动让磁珠从磁棒套上分离下来。在一些优选的方式中，所述的向磁棒套表面涂覆一层油性物质的方式包括让磁棒套浸入油性物质中。所述的油性物质被包括在PCR管中。在一些方式中，从磁棒套分离的磁珠直接与扩征核酸的试剂接触，进行核酸的扩增。在一些方式中，油性物质与标准品混合，诉述的油性物质来自标准品中。

[0007] 在一些优选的方式中，这里的油性物质一般是非极性的物质，例如，石油、硅油、植物油、动物油等。例如植物油可以是，菜籽油，花生油，葵花籽油，大豆油，或者他们的混合物，矿物油例如煤油、硅油等等。这些油性物质一般不能溶解在核酸扩增的试剂溶液或者核酸提取的样品溶液中。一般，核酸扩增的试剂溶液或者核酸提取的样品溶液为水溶液。所以，油性物质是一类不溶解于水的物质，这里的“水”可以是纯净水，或者含有化学物质的水溶液，或者含有核酸提取，核酸扩增必须成分的水溶液，也可以是样本溶液或者前述任何种类的混合物。在一些方式中，这些油性物质与扩征核酸的物质混合或者扩增核酸的试剂中包括所述的油性物质。在一些方式中，扩征核酸的物质被容纳在容器中，例如PCR扩增管中。在一些方式中，扩增核酸的物质包括RNA逆转录酶，所述的核酸扩增试剂与RNA逆转录酶被油性物质分隔。所述的核酸为RNA。在一些方式中，在PCR扩增管的底部为逆转录酶，逆转录酶上是一层油性物质，在油性物质上是DNA扩增试剂。在一些方式中，PCR管的管口被密封。
在一些方式中，PCR管为两个以上的联排管，所有的PCR关口被密封。所述的密封为冠盖密封或者易撕元件密封，例如热敏胶密封。

[0008] 在一些方式中，磁棒套由塑料才来组成或者构成，或者由塑料材料注塑而成。塑料材料可以是任何塑料材料，PP，PET，其混合物。

[0009] 在一些方式中，磁珠任何可以吸附生物物质的磁珠，所谓的“磁珠”具有表面能或者处理有一些官能团，可以通过化学键来吸附核酸物质，当然，也可以吸附蛋白物质，还可以吸附其它特殊的物质，例如糖类等生物物质。凡是用磁珠吸附一些物质的都可以被用到本发明中来。在一些方式中，磁珠可以被带有磁性材料的吸引，例如磁棒、磁针、磁铁等。在一些方式中，磁珠为纳米级的磁珠，后者微米、毫米级的磁珠，更优选的是纳米级的磁珠。在一些优选的方式中，磁珠为羟基磁珠，用于吸附核酸物质。所述的核酸为DNA或者RNA。

[0010] 另一方面，本发明提供一种试管，其特征在于，该试管中包括：RNA逆转录酶或者/和内标序列；核酸扩增试剂以及油性物质，其中所述的RNA逆转录酶或者/和内标序列与核酸扩增试剂被油性物质间隔开。

[0011] 在一些方式中，RNA逆转录酶位于试管的底部，在RNA逆转录酶上覆盖一层所述的油性物质，所述的油性物质上具有核酸扩增试剂。

[0012] 在一些方式中，RNA逆转录酶和/或核酸扩增试剂为液态，油性物质为凝胶状或者固态。

[0013] 在一些方式中，核酸扩增试剂位于试管的底部，核酸扩增试剂上覆盖一层油性物质，所述的油性物质上具有RNA逆转录酶。

[0014] 在一些方式中，所述的油性物质选自于石油、硅油、植物油、动物油中的一种或者几种。

[0015] 在一些方式中，所述的试管口被密封。

[0016] 在一些方式中，所述的试管口被铝箔密封。

[0017] 在一些方式中，所述的油性物质为不溶于水的油性物质。

[0018] 在一些方式中，所述的内标序列人源序列。

[0019] 本发明的有益效果是：

[0020] 为样本提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。本发明所述方法可以机械自动化操作完成生物物质，特别是核酸物质的提取，自动转入到扩增核酸的试剂中，从一开始到最终，可以实现全自动化，而且不会对样本造成任何的损失；节约了时间以及成本。附图说明

[0021] 图1为是吸附磁珠的磁棒套的部分立体结构示意图，10代表磁棒套，2241代表整个磁棒套；

[0022] 图2为畅通磁棒套吸附磁珠的原理结构示意图；

[0023] 图3本发明改进的磁棒套吸附磁珠的原理结构图；

[0024] 图4为用于盛放核酸扩增试剂的容器，该容器里具有核酸扩增所必须的试剂；

[0025] 图5为一个具体实施例子中，用于扩增RNA的试剂的结构示意图(封装冷冻)；

[0026] 图6为一个具体实施例子中，用于扩增RNA的试剂的结构示意图(使用前的状态)[0027] 图7为一个具体实施例子中，磁棒套涂覆油性物质的过程示意图。

[0028] 图8为一个具体实施例子中，磁棒套的立体结构示意图。

[0029] 图9为本发明一个具体实施例子中(实施例子1)的实验结果图。

[0030] 图10为本发明具体实施例子中在磁棒套上涂覆有油性物质的阳性样本扩增曲线。

[0031] 图11为本发明具体实施例子中在磁棒套上涂覆有油性物质的内标的扩增曲线。

[0032] 图12为本发明具体实施例子中在磁棒套上没有涂覆有油性物质的阳性样本扩增曲线。

[0033] 图13为本发明具体实施例子中在磁棒套上没有涂覆有油性物质的内标样本扩增曲线。详细说明

[0034] 样本

[0035] 在一些实施例中，样本包括生物试样，例如从植物或动物个体获得的试样。如本文所用生物试样包括可用于检测个体中的核酸的所有临床试样，其包括但不限于细胞、组织(例如，肺、肝和肾组织)、骨髓吸出物、体液(例如，血液、血液衍生物和血液馏份(例如血清或黄层)、尿、淋巴、泪、前列腺液、脑脊液、气管吸出物、痰、脓、鼻咽吸出物、口咽吸出物、唾液)、眼拭子、颈部拭子、阴道拭子、直肠拭子、大便和大便悬浮液。其它适宜试样包括从中耳液、支气管肺泡灌洗液、气管吸出物、痰、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液获得的试样。在特定实施例中，生物试样是从动物个体获得。可获得获取所述试样的标准技术。参见(例如)施拉格(Schluger)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)176:1327-33(1992)；比格比(Bigby)等人，美国呼吸疾病评论(Am.Rev.Respir.Dis.)133:515-18(1986)；科瓦克斯(Kovacs)等人，新英格兰医学杂志(NEJM)318:589-93(1988)；和奥尼贝内(Ognibene)等人，美国呼吸疾病评论129:929-32(1984)。在一些实施例中，样本包括环境试样，例如表面试样(例如，通过擦拭或真空处理获得)、空气试样或水试样。在一些实施例中，样本包括分离的细胞，例如动物、细菌、真菌(例如，酵母)或植物细胞和/或病毒。可使用常规方法和适于所培养细胞类型的条件培养分离的细胞。

[0036] 对于样本的处理

[0037] 在一些方式中，样本一般都是采用载体进行采样，例如吸水性载体进行承载样本。承载样本可以是吸管、存贮装置、采样装置、这些采样装置吸取样本的部件可以是滤纸、棉签、等吸水性物质来吸取和承载载体。与本发明的裂解液进行接触的可以是载体，也可是从载体上洗过下来的样本混合物。例如，裂解液体先于承载样本的载体接触，从而把样本裂解和洗脱下来，然后再让裂解液体与磁珠混合，或者，让裂解液和磁珠的混合物与承载样本的载体接触，完成裂解和洗脱，然后去除掉载体和其它物质，然后仅仅保留磁珠，并不对磁珠做任何洗脱和洗涤等进一步的处理。当然，也可以提前准备好裂解液和磁珠溶液，然后再使用的时候，两种溶液混合，然后再和样本直接接触后者与承载样本的载体接触，从而完成样本的处理。

[0038] 当然，如果裂解成分和磁珠可以是干的形式存在，当与液态的样本接触后，然后对样本裂解或者进行磁珠的吸附，完成对核酸的释放和吸附。

[0039] 这里的裂解液体可以是一些离子溶液，或者离子溶液和表面活性试剂混合，这些裂解都可以造成细胞壁或者细胞膜的破坏，从而达到核酸(DNA或者RNA)的释放。当然，为了加速释放和破坏，可以采用物理加热的方法进行，例如高温加热的方式，例如60度以上的问题，温度越高，时间越短，温度越低，花费的时间越长。当然，如果裂解试剂中含有足够的破坏细胞壁或者细胞膜的成分，例如强酸、强碱、或者一些酶试剂，这些成分可以直接达到释放核酸物质的目的，可以不接触物理加热或者超声破碎的方法。物理方法一般是加热，研磨，超声破碎，化学方法一般是化学试剂成分。

[0040] 在一些优选的方式中，本发明采用少量的化学试剂配合物理方法达到核酸物质的释放和磁珠的吸附。这样可以避免杂质干扰后续的直接扩增。在另一些优选的方式中，采用化学试剂进行核酸的释放，虽然同是释放了一些非核酸物质，例如蛋白、多糖、这些物质可能干扰后学核酸的扩增，但是采用本发明的磁珠进行核酸的吸附，就算带有杂质，仍然可以进行正常的核酸扩增。

[0041] 在另一方式中，核酸为RNA。一般，RNA的扩增首先需要进行反转录过程，然后对反转录的DNA进行扩增。本发明小组发现，当释放的为RNA的时候，采用本发明小组的方法，利用磁珠直接进行RNA的吸附，然后去掉裂解液，保留磁珠，不对磁珠进行任何的洗涤或者清洗，直接进行C-NDA的反转录和扩增试剂的接触，从而完成扩增。而现有对于RNA的扩增，一般都是需要单独进行反转录，然后反转录的DNA进行浓缩进行核酸的扩增，这样的过程处理时间长，而且中间有很多单独的步骤，材料耗费大，另外步骤多，交叉污染的机会增加。另外，现有的技术对RNA的提取过程复杂，繁琐，耗材多。在一些优选的方法中，本发明利用裂解液和磁珠的混合物对RNA进行裂解，然后去掉裂解液和其它物质，仅仅保留磁珠，然后让磁珠和反转录酶和扩增试剂接触，进行扩征。采用这样的方法可以有效的进行扩增，或者扩增的结果。

[0042] 在一些优选的方式中，让裂解试剂和磁珠与样本接触后，进行高温加热处理，然后低温保持一段时间。或者，先对样本进行高温处理，然后让裂解试剂和磁珠接触，然后低温保持一段时间。可以理解，高温处理并不是必须的，当裂解试剂含有高浓度的离子浓度的时候，可以破坏细胞膜或者细胞壁，这个情况下可以不用高温处理。

[0043] 靶核酸

[0044] 这里的所谓的“靶核酸”的用途之一就是对生物进行区分，和另外的生物样本进行鉴别。例如，某一种病毒具有特有的学历诶，对太特殊的序列的扩增和检测，从而确认该特殊的病毒，而不会造成漏检和假阳性或者假阴性。也就是说，在特定实施例中，靶核酸对目标有机体具有特异性，也就是，在其它有机体中未发现靶核酸或者在与目标有机体类似的有机体中未发现靶核酸。

[0045] 靶核酸可为存于动物(例如，人类)、植物、真菌(例如，酵母)、原生动物、细菌或病毒物质中的核酸，也可以是来自以上样本中的核酸物质。例如，靶核酸可存于目标有机体的基因组中(例如，在染色体上)或存于染色体外核酸上。在一些实施例中，靶核酸是RNA，例如mRNA。靶核酸可存于细菌(例如格兰氏(Gram)阳性或格兰氏阴性细菌)中。例示性细菌种类包括不动杆菌属(Acinetobacter sp.)菌株ATCC 5459、乙酸钙不动杆菌属、绿浅气球菌(Aerococcus viridans)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、难辨梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体、弗氏柠檬酸杆菌属(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、鹑鸡肠球菌属(Enterococcus gallinarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterobacter faecalis)(例如，ATCC 29212)、埃希氏大肠杆菌(例如，ATCC 25927)、阴道加德纳氏菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(例如，ATCC 49247)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)(例如，ATCC 33495)、单核细胞增生李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)(例如，ATCC 7648)、微球菌(Micrococcus sp.)菌株ATCC 14396、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、肺炎支原体、人型支原体、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitis)(例如，ATCC 6250)、奈瑟氏淋病双球菌、尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(例如，ATCC 10145)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、沙门氏菌菌株ATCC 31194、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)(例如，ATCC 8101)、金黄色葡萄球菌(例如，ATCC 25923)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(例如，ATCC 12228)、里昂葡萄球菌
(Staphylococcus lugdunensis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、肺炎链球菌(例如，ATCC 49619)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(例如，ATCC 13813)、苍白密螺旋体(Treponema palliduma)、草绿色链球菌(Viridans group streptococci)(例如，ATCC 10556)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、蜃楼弗朗西丝氏菌(Francisella philomiragia)(GAO1-2810)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(LVSB)、假结核病耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)(PB1/+)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、0:9血清型或鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(P14-)。在一些实施例中，靶核酸存于选自以下的细菌属物质中：不动杆菌属、气球菌属(Aerococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、博德特菌(Bordetella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、衣原体(Chlamydia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、李斯忒氏菌属(Listeria)、微球菌属(Micrococcus)、动弯杆菌(Mobilincus)、莫拉菌属(Moraxella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体、奈瑟球菌、寡源杆菌属(Oligella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、红棕色单胞菌属(Porphyromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属、粘质沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属、链球菌属、密螺旋体属(Treponema)、芽胞杆菌属(Bacillus)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)或耶尔森菌属(Yersinia)。在一些实施例中，在A组链球菌或B组链球菌中发现靶核酸。

[0046] 例示性衣原体靶核酸包括在衣原体隐性质粒上发现的序列。例示性结核分枝杆菌(M.tuberculosis)靶核酸包括于IS6110(参见US 5,731,150)和/或IS1081(参见巴哈德(Bahador)等人，2005，农业生物科学研究杂志(Res.J.Agr.Biol.Sci.)，1:142-145)中发现的序列。例示性奈瑟氏淋病双球菌靶核酸包括于NGO0469(参见皮耶卡罗维奇(Piekarowicz)等人，2007，BMC微生物(BMC Microbiol.)7:66)和NGO0470中发现的序列。例示性A组链球菌靶核酸包括于Spy1258(参见刘(Liu)等人，2005，微生物研究
(Res.Microbiol)，156:564-567)、Spy0193、lytA、psaA和ply(参见US 2010/0234245)中发现的序列。例示性B组链球菌靶核酸包括于cfb基因(参见波德别尔斯基(Podbielski)等人，
1994，微生物与免疫医学杂志(Med.Microbiol.Immunol.)，183:239-256)中发现的序列。在一些实施例中，靶核酸是病毒核酸。例如，可在人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒或登革病毒中发现病毒核酸。例示性HIV靶核酸包括于Pol区域中发现的序列。在一些实施例中，靶核酸是原生动物核酸。例如，可在疟原虫属(Plasmodium spp.)、利什曼原虫属(Leishmania spp.)、冈比亚布氏锥虫(Trypanosoma brucei gambiense)、罗德西亚布氏锥虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、内阿米巴属(Entamoeba spp.)、弓形虫属(Toxoplasma spp.)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和肠形鞭毛虫(Giardia duodenalis)中发现原生动物核酸。在一些实施例中，靶核酸是哺乳动物(例如，人类)核酸。例如，可在循环肿瘤细胞、上皮细胞或成纤维细胞中发现哺乳动物核酸。在一些实施例中，靶核酸是真菌(例如，酵母)核酸。例如，可在念珠菌属(Candida spp.)(例如，白色念珠菌)中发现真菌核酸。这里的靶核酸可以是DNA上的一端序列，也是可以是RAN反转录上的一端特异的序列。

[0047] 磁珠以及对核酸的提取

[0048] 本发明所提供的磁珠可以是任何的磁珠。一般磁珠按照不同的分类，磁珠是一种纳米颗粒，在颗粒表面一般连接有化学基团，这样就形成了最终产品的磁珠。这样的磁珠可以通过商业途径进行购买，例如从厦门普睿迈格生物科技有限公司(http://www.purimagbead.com)购买。一般磁珠按照磁珠的直径的大小进行分类，另一种按照表面包裹的化学基团进行分类。按照直径的大小，可以分为平均粒径小于50钠米、60钠米、80钠米、90钠米、100钠米、150钠米、200钠米、300钠米、500钠米、600钠米、700钠米、800钠米、900钠米、1000钠米，1500钠米，2000钠米等磁珠。

[0049] 按照磁珠包裹的化学基团，按照化学基团的性质不同，可以分为羟基磁珠，羧基或者氨基磁珠，或者混合基团包裹的磁珠。一般是含有羟基聚合物包裹的磁珠或者磁珠壳层表面修饰大量硅烷醇基团(羟基)。当然，按照磁珠的形态环境进行分类，可以是单分散性磁珠，也可以是的非单分散性磁珠。

[0050] 在一些优选的方式中，羟基、羧基或者氨基之一或者任意组合来修饰磁珠表面而形成羟基磁珠、羧基磁珠或者氨基磁珠，或者任意两个组合修饰而形成的磁珠。在一些优选的方式中，磁珠为磁珠壳层表面修饰大量硅烷醇基团(羟基)的羟基磁珠或者羧基磁珠。

[0051] 使用的磁珠为粒径均一或者多分散系数＜0.2。优选的，选择呈单分散磁珠，这样具有超顺磁性，磁响应时间＜30s。所谓的粒径“均一”并不一定表示每个磁珠之前的粒径一样，而是在同一个溶液中，至少有30％的磁珠的粒径接近，或者35％的磁珠的粒径接近；40％的磁珠的粒径接近；45％的磁珠的粒径接近；50％的磁珠的粒径接近；55％的磁珠的粒径接近；60％的磁珠的粒径接近；70％的磁珠的粒径接近或75％的磁珠的粒径接近；或者
80％、85％、88％、89％、90％、95％、99％、100％的磁珠的粒径接近或则相差不大。或者，不同粒径的磁珠进行混合，例如，小于10钠米和小于50钠米的磁珠混合，或者，小于50纳米和小于100纳米的磁珠混合，或者小于50纳米和小于500纳米的磁珠混合，以及其它任意粒径纳米颗粒的磁珠混合进行核酸的吸附。

[0052] 多分散指数(polydispersity)是高分子科学中的一个重要概念，有时称分子量分布系数、非均匀指数、分散度等。最常见的定义为Mw/Mn(其中Mw、Mn分别为重均、数均分子量)该定义衡量分子量分布的宽度。有时也表示为Lw/Ln(其中Lw、Ln分别为重均、数均轮廓长度)，Dw/Dn(其中Dw、Dn分别为重均、数均粒子直径)；其中前者表示高分子轮廓长度的多分散性，后者表示高分子直径的多分散性。本发明所所说的分散系数指的是后者，主要指数均粒子直径。也是表示离子直径的均匀性关系。一般分散系数＜0.2，也可是是小于0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9，或者1，小于1.5，小于2的都可以。

[0053] 一般，对所需要提取核酸的样本进行处理，让核酸释放出来，然后让核酸与磁珠接触，从而磁珠吸附核酸物质。对样品处理的方式有很多，例如高温、化学试剂或者酶或者裂解液来裂解细胞释放核酸物质等，凡是能够释放核酸的方式都可以，在这里不进行详细的阐述。在一些优选的方式中，本发明的提供核酸提取的裂解液，该裂解液包括一种后者几种金属离子的化合物，优选的为依价金属离子，例如钾离子，钠离子，钙离子。优选的，还可以包括一种或者几种表面活性试剂。在一些优选的方式中，所述的一价金属离子的化合物包括NaCl，KCl，LiCl中的一种或者多种，表面活性试剂包括吐温和Triton-X等表面活性物质。在一些优选的方式中，一价金属离子的化合物的浓度为0.000001-3M，表面活性试剂的浓度为0.1-0.5％(质量百分比)。在一些优选的方式中，可以包括如下组分：0-2M的NaCl、0-
0.3％的Triton-X(质量百分比)和0-0.2mM的KCl；或者只是含有NaCl，KCl中的一种或者两种都含有而不含有表面活性试剂。一般，NaCl的含量要高些，可以破坏细胞膜。而KCl其调节作用，让磁珠具有最大的吸附能力和溶液里的成分的调节，微量就可以了。在一些优选的方式中，裂解液里包括磁珠颗粒和裂解试剂成分。在一些优选的方式中，当然，在这里，磁珠可以是其它体积，例如0.2-5ul，或者0.2-3ul，或者0.1-2ul(例如磁珠的浓度为10毫克每毫升)。在一些优选的方式中，或者，裂解液体除了含有上述金属离子盐之外，还包括磁珠，磁珠的质量百分比可以是0.0000001-0.1％毫克/ML之间，这里的裂解液可以不含任何盐的纯水和磁珠溶液混合。磁珠的含量及其微量，而是依靠磁珠的纳米颗粒来吸附核酸物质作为扩增的模板。在一些优选的方法中，磁珠悬浮液和裂解液混合在一起，然后添加到PCR管中，然后向PCR管中添加所需要裂解的样本，例如咽拭子，鼻拭子，痰液，脑脊液，房水等，然后对PCR管进行加热几分钟，然后在一定的温度度下(室温或者15-30度的温度下)下静止几分钟，然后从磁铁吸附住磁珠，去掉PCR管内的液体，保留磁珠，然后向PCR管中添加核酸扩增所必要的试剂，例如聚合酶、引物、探针或者其他试剂。在此过程中，不需要对磁珠进行洗脱，直接用吸附在磁珠上的核酸作为扩增的模板。在一些优选的方式中，裂解液体和磁珠悬浮液的混合物预选以混合的形式存在于PCR试管中，然后进行如上步骤的添加样本进行混合，随后加热裂解后，让磁珠和缓和液体分离，保留磁珠，不对磁珠进行任何的处理。

[0054] 当然，除了以上试剂外，还可以添加任何裂解酶，或者其它化学试剂，例如强酸，强碱试剂。在一些优选的方式中，以上的样本选在咽拭子，鼻拭子，痰液，脑脊液，房水等样本。优选的，这些咽拭子，鼻拭子样本保存于棉签上，或者采用溶液从棉签上洗脱下来的溶液中。洗脱的溶液一般是商业采集样本自带的溶液，例如友康病毒采样管中的病毒运输液，或者使用生理盐水进行洗脱。

[0055] 磁珠吸附有核酸后，例如图1，让磁棒套与磁珠接触，在磁棒套里设置有磁性元件，例如磁棒，这样，磁珠因为磁力而被吸附在磁棒套的外壁上。吸附的磁珠可以转移到另外的地方或者容器中，例如可以经过洗涤后，把磁珠转入到含有扩增试剂的容器中，例如PCR管中进行核算的扩增。

[0056] 无论如何，都需要从磁棒套上分离出磁珠，因为磁珠上吸附有目的核酸。一般，磁棒套为塑料材质注塑成型的，虽然依靠磁棒套里的磁棒让磁珠可以吸附在磁棒套的表面，但是，当磁力消失以后，并不容易从磁棒套表面分离磁珠，因为磁珠具有巨大的表面能(通常是钠米级的颗粒)，磁棒套的表面也并非理想的光滑，所以，部分磁珠通过物理作用(表面能)吸附在磁棒套表面，这样当需要分离磁珠的时候，一般，并不能完全从磁棒套上分离出所有的磁珠，就算磁棒套里的磁棒不存在的时候。例如如图2所示的原理示意图，因为现有加工工艺的限制，磁棒套表面并非绝对的光滑，而是一个粗糙的表面12，粗糙表面这是因为现有加工工艺所限制，所以，当磁珠被磁铁吸引在磁棒套表面的时候，磁珠13一方面因为磁力而吸附在磁棒套表面，另一方面，由于粗糙的表面也具有较高的自由能，而磁珠的表面能也比较高，从而，基于表面能来讲，磁珠基于表面能被吸附在磁棒套表面。固然，表面越是光滑，对于磁珠的吸附力越弱，但是对于这样一次性产品来讲，显著增加了成本。当需要从磁棒套分离磁珠时，让磁棒离开或者磁棒的磁性消失，附着在粗糙表面的磁珠并不容易自然离开磁棒套表面，因为还有表面能的存在。所以，对于这样的磁棒套吸附的磁珠，为了让其分离，往往需要高频的震动和长时间的震动，从而让其分离。本发明小组发现，就算采用长时间的高频震动，仍然有很大部分磁珠不能分离下来。例如，当把磁棒套插入到核酸扩增溶液中进行震动而进行后续的扩征。

[0057] 为了克服这样的技术缺陷，本发明小组惊讶的发现，如果在吸附磁珠之前，在磁棒套2241的任意一个磁棒套10的表面涂覆一层油性物质，可以显著降低磁珠分离的难度，而且，对于磁棒套的表面是否光滑也不做过高的要求。例如如图3所示，在粗糙的磁棒套表面12涂覆一层油性物质15，在表面形成光滑的面，这样磁珠14颗粒被磁棒14吸引的时候，附着在光滑的表面。当磁力消失以后，非常容易让磁珠从磁棒套上分离下来。油性物质有时候也是可核酸扩增所必须的一种试剂，覆盖在扩增管表面，减少水分的蒸发。经过我们发现，采用有油性表面的时候，对于磁棒套的表面不做特别的要求，只要不泄露就可以了，粗糙一些也可以使用，减轻了加工上的难度。这样不过于要求塑料材质的磁棒套表面是否光滑，显著降低了成本，另外也不需要增加分离的难度，仅仅轻微震荡就可以让磁珠从磁棒套表面分开并到溶液中。另外，当自动化处理的时候，震动的频率和时间可以显著减少或者降低，显著提高了自动化的水平。

[0058] 在磁棒套上涂覆油性物质的方式可以有很多种，例如可以配备一个容器，里面含有油性物质，例如矿物油，当需要用磁棒套去吸附磁珠的时候，让磁棒套浸入油性物质中国，然后取出，在浸入到含有磁珠的溶液中，从来通过内置的磁棒来让磁珠附着在磁棒套的表面。这样处理可以通过机器自动来完成。

[0059] 或者，为了自动化操作，让油性物质和核酸扩征的内标混合在一起。一般油性物质的比重比内标物质的比较轻，漂浮在内标品的表面，当需要用磁棒套去吸附磁珠的时候，让磁棒套浸入含有内标品的容器中，例如PCR管，从而让磁棒涂覆了一层油性物质，然后取出，在浸入到含有磁珠的溶液中，从来通过内置的磁棒来让磁珠附着在磁棒套的表面。这样处理可以通过机器自动来完成。

[0060] 在一些优选的方式中，当核酸为RNA的时候，一般需要了临时配置逆转录酶，在核酸扩增前，让逆转录酶与核酸扩征试剂混合。这就需要人工进行混合，但是为了全自动化的核酸提取和检测的实现，可以预先对逆转录酶和核酸扩征试剂进行处理，让两种试剂处于同一个容器中，例如PCR管中，但是通过油性物质间隔开，当需要进行核酸扩增的时候，让逆转录酶和核酸扩征试剂进行混合。例如图5-7所示，提供一种容器，例如图4和图5所示的PCR管，现在管的底部设置逆转录酶17，然后再逆转录酶上分装上或者铺上一层油性物质18，然后再在油性物质上设置核酸扩征试剂19。为了方便进行，油性物质可以先经过冷冻，形成粘稠的状态，这样，可以很好的封装逆转录酶，然后进行冷冻，从而让油性物质变硬，然后再在油性物质上设置核酸扩征试剂，例如液态的或者干粉的都可以。这样，让整个容器保存在低温下。可选的，用盖子封装容器的开口18。当需要使用的时候，取出容器在室温下，从而，所有的试剂溶解，油性物质由于温度的升高而为液态，则逆转录酶和核酸扩征试剂混合在一起，油性物质漂浮在扩增和逆转录酶的混合试剂上。当需要用磁棒套去吸附磁珠的时候，让磁棒套浸入含有扩增和逆转录酶的混合试剂的容器中(图7)，例如PCR管，从而让磁棒涂覆了一层油性物质，然后取出，在浸入到含有磁珠的溶液中，从来通过内置的磁棒来让磁珠附着在磁棒套的表面。然后，把附着有磁珠的磁棒套插入到含有扩增和逆转录酶的混合试剂的容器中，让磁珠从磁棒套表面分离，例如磁棒取出，通过轻微的震动。从而完成了磁珠和扩征试剂的混合。含有磁珠的容器可以直接进行后续核酸的扩增。这样的操作，可以完全实现自动化，因为试剂提前配合好，油性物质也具有，核酸提取和转移到扩增试剂都可以通过自动化实现。

[0061] 磁棒套的材料

[0062] 一般构成磁棒套的材料2241都为塑料材料，或者热塑性材料。“热塑性”在此处是指热熔性的塑料聚合物，当被加热的时候变成流体，而足够冷的是又可以凝固成玻璃状的物质。这种热塑性可以是高分子量物质的聚合物，它的链与链之间依靠弱的范德华力连接，更强的偶极-偶极相互作用和氢键结合或者芳环的堆积。热塑性材料可以包括另外的成分物质，例如激光敏感物质。热塑性材料的一些例子可以是丙烯腈丁二烯苯乙烯聚合(ABS)丙烯酸的聚合(PMMA)，赛璐珞，醋酸纤维素或纤维素乙酸酯,环稀共聚物(COC)，乙烯-乙烯基醋酸盐(EVA)，乙烯-乙烯醇(EVOH)，氟塑料(PTFE,带有FEP,PFA,CTFE,ECTFE,ETFE)，离聚物或离子交联聚合物,丙烯酸/PVC，合金，液晶聚合物(LCP)，聚乙烯(POM或乙缩醛),聚乙烯(丙烯酸),聚丙烯腈(PAN或丙烯腈)，聚酰胺(PA)，聚酰胺-酰亚胺(PAI)，聚芳醚酮(PAEK或酮),聚丁二烯(PBD),聚乙烯(PB)，聚乙烯对苯二酸盐(PBT),聚已酸内酯(PCL),聚三氟氯乙烯(PCTFE),聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET),乙烯对苯二酸酯(PCT),聚碳酸酯(PC),聚羟基脂肪酸(PHAs),聚酮(PK),聚酯，聚乙烯(PE)，聚醚醚酮(PEEK),聚醚酮酮(PEKK),聚醚酰亚胺(PEI),聚醚砜(PES),聚乙烯氯(PEC)，聚酰亚胺(PI),聚乳酸(PLA),聚甲基戊烯(PMP),氧化聚苯(PPO),硫化聚苯(PPS)，聚邻苯二甲酰胺(PPA),聚丙烯(PP),聚苯乙烯(PS),聚砜(PSU),聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT),聚氨酯(PU),聚醋酸乙烯酯(PVA),聚氯乙烯(PVC),聚偏二氯乙烯(PVDC)和聚苯乙烯-丙烯腈(SAN)。

[0063] “弹性材料”在这里是指一类具有粘弹性的聚合物，构成聚合体的单体主要是由碳元素，氢元素，氧和/或硫元素构成。弹性材料可以是一些存在高于玻璃态转换温度之上的非晶态聚合物，这样大部分的运动变成了可能。在周围合适的环境温度下，他们可以相对的柔软和可变形的。一些弹性材料的例子可以是天然的橡胶(NR)，合成的聚异戊二烯(IR)，异丁(烯)橡胶(copolymer of异丁烯和橡胶基质的聚合，IIR)，聚丁二烯(BR),苯乙烯-丁二烯橡胶(聚苯乙烯和聚丁二烯的共聚物,SBR)，丁腈橡胶(聚丁二烯和丙乙腈的共聚物,NBR),氢化的丁腈橡胶(HNBR),氯丁二烯橡胶(CR),氯丁橡胶,EPM(乙烯丙烯橡胶,乙烯和丙烯的共聚物),环氧氯丙烷橡胶(ECO),聚丙烯酸橡胶(ACM,ABR),硅树脂橡胶(SI,Q,VMQ)，氟硅橡胶(FVMQ),氟橡胶(FKM,和FEPM)氟橡胶,全氟醚橡胶(FFKM)，特科福禄(Tecnoflon)PFR,聚醚块酰胺(PEBA),精细高分子工程有限公司(Perlast)，伊利斯通(Elastron)、氯磺化聚乙烯(CSM),EVA,弹性人造橡胶(TPE),弹性石蜡(TPO),节枝的弹性蛋白,弹性蛋白橡胶或聚硫橡胶。

[0064] 在另一些方式中，用于这种用途或方法的塑料材料可以是有机聚合物，这些聚合物选自于聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚环稀的聚合体。

[0065] “聚乙烯”在这里是指这类聚合物主要由乙烯单体构成的长链组成。聚乙烯材料可以因不同的密度或分支而存在不同的形式。一些聚乙烯的例子如超高分子量聚乙烯(UHMWPE)，例如分子量在大约3.1-5.67百万，密度在大约0.930–0.935g/cm3的聚乙烯；低分子量聚乙烯(ULMWPE or PE-WAX)；超高分子量聚乙烯(UHMWPE)；高密度的聚乙烯(HDPE)，例如密度在大于或等于0.941g/cm3的高密度的聚乙烯，横向连接的聚乙烯(PEX or XLPE)，例如含有与聚合结构连接的横向连接基团的介质-高密度聚乙烯，例如介质密度聚乙烯(MDPE)，例如具有0.926–0.940g/cm3密度的聚乙烯，线性的低密度聚乙烯(LLDPE)，例如具有0.915–0.925g/cm3密度的聚乙烯，它具有实质线性的结构并具有大量的短的分支，通常他们是有乙烯通过短链alpha-石蜡；共聚合形成。低密度聚乙烯(LDPE)，例如具有0.910–0.940g/cm3的密度的聚乙烯，它具有程度很高的短链，同时具有长的分支链；密度非常低的聚乙烯(VLDPE)，例如密度在0.880–0.915g/cm3的聚乙烯，它实质是由具有高水平的短链分支的线性聚合物，通常他们是由乙烯通过短链a-石蜡共聚合形成。

[0066] 本文所用的“聚丙烯”是指由单体丙烯单元组成的热塑性聚合物。聚丙烯的例子包括聚丙烯均聚物，无规共聚聚丙烯，嵌段共聚聚丙烯。丙烯也可以包括聚丙烯和乙烯或聚单元的单元组成的聚丙烯衍生物。

[0067] “聚苯乙烯”在这里指的是由芳族单体的苯乙烯的芳族聚合物。等规聚苯乙烯的例子包括聚苯乙烯，无规则聚苯乙烯和间规聚苯乙烯等。

[0068] 本文所用的“聚碳酸酯”是指含有碳酸酯基团的热塑性聚合物。聚碳酸酯可以衍生自双酚A和碳酰氯光气，酯化双酚A和碳酸二苯酯的组合。在一个实施例中，聚碳酸酯材料是透明的。

[0069] 本发明的“环稀“用于此是指包含一个或多个碳原子组成的封闭环，但没有芳香族，的烯烃或烃。环稀可以是，例如单体烯烃，如，环丙烯，环丁烯，环戊烯，环己烯，环庚烯，1,3-环己二烯，1,4-环己二烯或1,5-环辛二烯。

[0070] 在一个特定的实施例中，本发明的材料可以是哪些适合用于生产光学仪器的材料，例如镜头，眼镜，太阳镜，隐形眼镜等。这样的材料具有高折射率，例如具有高折射率的塑料材料。适用于制造光学仪器的塑料材料包括，例如，聚碳酸酯塑料，如聚碳酸烷基乙二醇酯(PADC)或CR-39或它们的衍生物。

[0071] 进一步的塑料材料可以为本领域一般技术人员从教科书中知晓的一些材料，例如可以是来自于从阿道夫·弗兰克“>公司>Kompendium”，沃格尔，第6版，2006年，被纳入其全部内容(Adolf Franck"Kunststoff-Kompendium",Vogel,6th ed.,2006)

[0072] 在另一实施例的材料，例如塑料材料制成，可以是上面提到的材料的任意组合或并列的组合。

[0073] 核酸的扩增

[0074] 用本发明的方法提出的核酸物质可以用于多种核酸的扩增方法。这些方法就是利用磁珠直接和核酸扩增必要的试剂混合，然后进行扩增，例如采用等温扩增和PCR扩增。等温方法扩增就是添加等温扩增所必要的试剂，吸附在磁珠上的核酸作为模板。如果采用PCR扩增就是添加PCR扩增所需要的必要试剂，吸附在磁珠上的核酸作为模板进行扩增。

[0075] 已知各种等位核酸扩增技术，包括例如重组酶聚合酶扩增(RPA)、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的RNA扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温多重置换扩增、解链酶依赖性扩增、单引物等温扩增、环解链酶依赖性扩增以及切口和延长扩增反应(参见US 2009/0017453)。聚合酶链反应是最广泛已知的方法，但区别在于其需要使用热循环以引起核酸链分离。这些扩增方法和其它扩增方法论述于以下中：例如，凡尼思(VanNess)等人，美国科学院院报(PNAS)2003，第100卷，第8期，第4504至4509页；谭(Tan)等人，分析化学(Anal.Chem.)2005，77，7984-7992；利泽德(Lizard)等人，自然生物技术(Nature Biotech.)1998，6，1197-1202；纳富(Notomi)等人，核酸研究(NAR)
2000，28，12，e63；和克恩(Kurn)等人，临床化学杂志(Clin.Chem.)2005，51:10，1973-1981。
有关这些常用扩增技术的其它参考文献包括例如美国专利第7,112,423号、第5,455,166号、第5,712,124号、第5,744,311号、第5,916,779号、第5,556,751号、第5,733,733号、第5,
834,202号、第5,354,668号、第5,591,609号、第5,614,389号、第5,942,391号；和美国专利公开案第US20030082590号、第US20030138800号、第US20040058378号和第US20060154286号。所有上述文件都以引用方式并入本文中。

[0076] RPA是一种例示性等温核酸扩增方法。RPA采用称作重组酶的酶，其能够使寡核苷酸引物与双螺旋DNA中的同源序列成对。以此方式，DNA合成涉及试样DNA中的界定点。如果存在靶序列，则使用两种基因特异性引物开始指数式扩增反应。反应快速进展且在20到40分钟内从数个靶拷贝特异性扩增到可检测水平。RPA方法揭示于(例如)US 7,270,981、US 7,399,590、US 7,777,958、US 7,435,561、US 2009/0029421和PCT/US2010/037611中，所有案件都以引用方式并入本文中。

[0077] RPA反应含有蛋白质与所需用以支持系统的重组元件的活性的其它因子以及支持从与互补底物成对的寡核苷酸的3'末端DNA合成的因子的掺合物。重组系统的关键蛋白组份是重组酶自身，其可源自原核、病毒或真核来源。另外，然而，需要单链DNA结合蛋白质以在各种在反应中进行的交换交易期间使核酸稳定。由于许多底物的特征仍为部分双螺旋，所以特别需要具有链置换特征的聚合酶。在反应能够从痕量水平的核酸扩增的一些实施例中，可使用包括使用拥挤试剂(例如，聚乙二醇)和负载蛋白的活体外条件。已报告包含噬菌体T4UvsX重组酶、噬菌体T4UvsY负载试剂、噬菌体T4gp32和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)聚合酶I大片段的例示性系统。

[0078] 可以溶液和/或干燥(例如，冻干)形式提供等温扩增反应的组份。在以干燥形式提供一种或一种以上组份时，还可使用再悬浮或重构缓冲液。

[0079] 基于扩增反应的特定类型，反应混合物可含有缓冲液、盐、核苷酸和进行反应必需的其它组份。可在适合于反应的特定温度下培育反应混合物。在一些实施例中，将维度维持于80℃或以下，例如，70℃或以下、60℃或以下、50℃或以下、40℃或以下、37℃或以下或30℃或以下。在一些实施例中，将反应混合物维持于室温下。在一些实施例中，在整个反应时间内将混合物的摄氏温标温度改变小于25％(例如，小于20％、小于15％、小于10％或小于5％)和/或在整个反应时间内将混合物的温度改变小于15℃(例如，小于10℃、小于5℃、小于2℃或小于1℃)。

[0080] 核酸的扩增也可以是任意其它的PCR方法，例如实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

[0081] 核酸的检测

[0082] 检测扩增产物通常包括使用经标记探针，其足够互补且与对应于靶核酸的扩增产物杂交。因此，可通过使与扩增产物互补的经标记探针(例如荧光标记探针)杂交来检测扩增产物的存在性、量和/或特性。在一些实施例中，目标靶核酸序列的检测包括组合使用等温扩增方法和经标记探针，以便实时测量产物。在另一实施例中，目标扩增靶核酸序列的检测包括将扩增靶核酸转移到固体载体(例如膜)，和用与扩增靶核酸序列互补的探针(例如经标记探针)探测膜。在又一实施例中，目标扩增靶核酸序列的检测包括将经标记扩增靶核酸与探针杂交，所述探针以具有可寻址位置的预定阵列排列且与扩增靶核酸互补。通常，扩增反应中利用一种或一种以上引物。靶核酸的扩增涉及使靶核酸与一种或一种以上引物接触，所述引物能够使靶核酸杂交并引导靶核酸扩增。在一些实施例中，使试样与一对引物接触，所述引物包括均与靶核酸杂交的正向和反向引物。实时扩增监测反应期间发射的荧光作为与终点检测相反的扩增子产生的指示物。可在一些系统中观察反应的实时进展。通常，实时方法涉及荧光报告子的检测。通常，荧光报告子的信号与反应中扩增产物的量成正比例增加。通过记录每一循环时荧光发射的量，可监测指数期期间的扩增反应，其中扩增产物的量的首次显著增加与靶模板的初始量相关。核酸靶标的起始拷贝数越高，就越快观察到荧光显著增加。

[0083] 在一些实施例中，荧光标记的探针取决于试样的荧光共振能量转移(FRET)或荧光发射波长变化，其作为实时检测DNA探针与扩增靶核酸杂交的方法。例如，在不同探针(例如，使用HybProbes)上的荧光标记间或在相同探针(例如，使用分子信标或探针)上的荧光团与非荧光猝灭剂间发生的FRET可辨别与目标DNA序列特异性杂交且以此方式可检测试样中靶核酸的存在性和/或量的探针。在一些实施例中，用于辨别扩增产物的荧光标记的DNA探针具有光谱差异发射波长，由此可在同一反应管内(例如在多工反应中)对其加以区分。例如，多重反应容许同时检测两种或两种以上靶核酸、甚至另一核酸(例如对照核酸)的扩增产物。

[0084] 在一些实施例中，利用同位素或非同位素标记以可检测方式标记对靶核酸具有特异性的探针；在替代实施例中，标记扩增靶核酸。探针可检测为靶核酸物质(例如靶核酸物质的扩增产物)的指示物。非同位素标记可(例如)包含荧光或发光分子、或酶、辅因子、酶底物或半抗原。可将探针与RNA、DNA的单链或双链制剂或二者的混合物一起培育，并测定杂交。在一些实例中，杂交导致(例如)经标记探针的可检测的信号变化，例如信号增加或减少。因此，检测杂交包含检测杂交期间或之后的经标记探针的信号相对于杂交之前的标记的信号的变化。

[0085] 在一些方法中，可使用试纸条(flow strip)检测扩增产物。在一些实施例中，一种可检测标记产生颜色且第二标记是由固定抗体识别的表位。含有两种标记的产物将附接到固定抗体且在固定抗体的位置处产生颜色。基于此检测方法的分析可为(例如)可施加到整个等温扩增反应的试纸条(浸量尺)。阳性扩增将在试纸条上产生带，作为靶核酸物质扩增的指示物，而阴性扩增将不产生任何彩色带。在一些实施例中，可使用本文所揭示的方法对靶核酸的量(例如，拷贝数)进行近似定量。例如，可在平行反应中使已知量的靶核酸扩增且可比较从试样获得的扩增产物的量与在平行反应中获得的扩增产物的量。在一些实施例中，可在多重平行反应中使若干已知量的靶核酸扩增且可比较从试样获得的扩增产物的量与在平行反应中获得的扩增产物的量。假定试样中的靶核酸与平行反应中的靶核酸以类似方式可为反应组份所利用，那么可使用所述方法对试样中的靶核酸的量进行近似定量。

[0086] 本文所揭示方法的反应组份可以用于检测靶核酸的试剂盒的形式供应。在所述试剂盒中，适当量的一种或一种以上反应组份提供于一个或一个以上容器中或固持在衬底上。还可提供对靶核酸具有特异性的核酸探针和/或引物。例如，反应组份、核酸探针和/或引物可悬浮于水溶液中或呈冷冻干燥或冻干粉末、丸粒或珠粒形式。供应所述组份等的容器可为能够保持所供应形式的任何常规容器，例如，微量离心管、安瓿瓶，或小瓶或综合测试装置，例如微流体装置、侧向流动或其它类似装置。试剂盒可包括经标记或未经标记的核酸探针，以用于检测靶核酸。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括在本文所述方法(例如，使用粗基质而不进行核酸提取和/或纯化的方法)中使用所述组份的说明书。

[0087] 在一些应用中，一种或一种以上反应组份可以预先测量的一次使用量提供于个别、通常一次性管或等效容器中。利用所述布置，可向个别管中添加待测试靶核酸的存在性的试样并直接实施扩增。试剂盒中供应的组份的量可为任何适当量，且可取决于产品所针对的目标市场。用于测定适当量的一般指南可参见音尼斯(Innis)等人、萨姆布鲁克(Sambrook)等人和奥苏伯尔(Ausubel)等人。

具体实施方式

[0088] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例提供的方案为优选方案，是作为本领域的一般技术人员按照本发明的精髓来理解如何实现本发明的方案，但不作为对本申请的限定，本申请的范围体现在权利要求中。

[0089] 说明：在以下实施例子中所用的PCR扩增仪器为Bio-RAD CFX96或ABI 7500。

[0090] 实施例1：对于咽拭子的样本的核酸的提取。

[0091] 本发明方法应用于乙流(RNA的提取)临床样本的实时荧光定量PCR检测(1)、配置成分为1MNaCl、0.01％Triton-X和0.001MKCl的裂解液100ml，按照磁珠和裂解液1:200的体积比加0.5ul(0.005毫克，浓度为0.00005毫克/ml)磁珠(其中，磁珠为无菌水溶解的500nm直径，磁核Fe3O4，壳层为氧化硅的羟基超顺磁性磁珠，磁珠浓度为10mg/ml，购买自英芮诚生生化科技有限公司)到上述配好的裂解液中混匀，取4个相同的专用PCR管，每管分装80ul配置好的混有磁珠的裂解液。当然，在这里，磁珠可以是其它体积，0.2-5ul，或者0.2-3ul，或者0.1-2ul；或者，这里的裂解液可以不含任何盐的纯水和磁珠溶液混合。

[0092] 提供4个PCR扩增管(如图4所示的中的PCR的样式)，该管中提前分装有试剂，具体成分为下表所示，然后再每一管PCR管(20)中的分布如下，首先在PCR的底部0.5ul(200U/ul)单位的逆转录酶(RNA反转录为c-DNA)21，然后，再该试剂上分装冷冻为胶状的花生油23，然后再花生油上滴加24.5ul的反应液22，最终盖上PCT的盖子，从而形成扩增核酸的试剂(具体成分见表1)，并冷冻放置备用(结构示意图如图5所示)。

[0093] 在本例子中，为了扩增乙型流感，在试管中添加如下试剂：0.5ul(200U/ul)单位的逆转录酶(RNA反转录为c-DNA)和24.5ul的反应液(所述反应液包含浓度为30nmol/L的乙流的上下引物、30nmol/L乙流的探针、水和商业的一步法RT-QPCR试剂盒(TAKARA的货号为RR064A的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)，其中，引物和探针为本发明人自己设计：上游引物探针如下：GAGTCTTATCCCAATTTG(SEQ.1)；下游引物探针如下：GTGGAATAGTATGTTATCA(SEQ.2)；探针序列如下：HEX-AAGAGCACCGATTATCACCAG-TAMRA(SEQ.3)，其中所述探针的5’端连接有HEX荧光基因，3’端连接有TAMRA淬灭基团)，封盖后涡旋振荡摇匀30s，确保磁珠和PCR反应混合均匀；其中扩增试剂的成分如下表1。

[0094] 提供磁棒套，磁棒套的管套的大小可以插入到PCR管中，磁棒套中具有磁铁(如图1所示)。

[0095] (2)、从绍兴疾控中心提供的2例乙流阳性和2例乙流阴性咽拭子四个样本中(四个样本为友康提供的(购买自友康恒业生物科技(北京)有限公司，病毒采样管，货号MT0301-1)病毒采样管采集的咽拭子或鼻拭子样本，采样的咽拭子或鼻拭子放入到3ml的友康公司提供的病毒运输液的采样管中)均取20ul分别加入到步骤(1)中的四个PCR管中分别作为1号样本、2号样本、3号样本和4号样本，盖好管盖；这样，每个试管的总体积为100ul。这里的病毒运输液可以是生理盐水，或者一些缓冲液，PBS缓冲液。四个样本中，已经确认的有2个样本为阳性，2个样本为阴性。

[0096] (3)、将步骤(2)中的四个PCR管放入在95℃中加热5min后室温放置10min；

[0097] (4)、将步骤(3)中的四个PCR管放入到磁珠架上静置2min，这个时候，提前取出PCR扩增试剂的PCR的管子在室温下或者25-30摄氏度的温度下恢复融化，从而，让底部0.5ul(200U/ul)单位的逆转录酶和上层的24.5ul的反应液混合在一起，花生油融化后覆盖在表层(如图6所示)。让磁棒套缓慢插入到带有扩征试剂的PCR管中，如图7所示，然后抽出，这样就在磁棒套上覆盖了一层花生油，然后分别放入带有样本和磁珠的4个PCR管中进行吸附磁珠。这里插入到带有花生油的PCR和插入到混合有磁珠和样本的PCR，都可以通过机器自动插入和自动抽取出磁棒套。

[0098] 这样，当需要扩增RNA的时候，就不需要通过临时把反转酶和扩增试剂混合，而仅仅需要把本发明的PCR管进行复温，从而让隔离的反转酶和扩增试剂自动临时混合在一起，因为花生油在低温下位胶装，融化后为液体状，从而因为密度的问题，漂浮在顶层(图7)，这样当插入磁棒套的时候，可以覆盖一层油性物质。当然，吸附有磁珠(磁铁吸引磁珠或者比表面能双重作用)的磁棒套再次插入到PCR扩增管中，当磁性消失的时候，磁珠容易进入到扩增试剂中。

[0099] (5)、然后，把磁棒套插入到4个带有扩增试剂的PCR管中，取出磁棒，让磁珠加入扩增核酸所必要的试剂的PCR管中国。

[0100] 表1：扩增具体试剂组成表。

[0101]

[0102]

[0103] (6)将步骤(5)中的四个PCR管瞬时离心(1000-3000rmp下离心5-10s)使PCR管中液体都在底部；

[0104] (7)将上述步骤(6)得到的四个PCR管放置在荧光定量PCR扩增仪器(选用的为Bio-RAD CFX96)中进行扩增，45℃，10min；95℃，10min；进行40-45循环的95℃，15S和60℃，45S，在60℃检测荧光信号。

[0105] 实验结果如图9所示，1号、2号、3号和4号曲线分别为1号样本、2号样本、3号样本和4号样本的实验结果，结果表明，按照本实施例的方法进行操作，可以有效准确的检测出乙流的咽拭子样本，1号和2号为阳性，3和4号为阴性，与确认的样本的结果一致。并不会对实验结果有任何的影响。

[0106] 经过我们实验发现，当采用机器进行磁棒套对磁珠的释放的时候，当没有涂覆油性物质的时候，磁珠吸附到磁棒套后，释放磁珠到扩增试剂中的需要振荡时间为2min-5分钟，频率一般为40次/min-80次/min；但是，令人惊讶的发现，当在磁棒套的塑料表面涂覆油性物质的时候，磁珠吸附到磁棒套后，释放磁珠到扩增试剂中的需要振荡时间1min或者20-50秒，频率仅仅需要5-10次/min。一是降低了震荡的时间，显著提高单位时间处理的样本数量，而且震荡的频率降低，减少噪音，而且利于快速进行样本的处理和对反应的不利影响。

[0107] 另外，为了考察涂覆油性物质对于磁珠的吸附能力，我们考察了多种不同的油性物质，并和没有涂覆油性物质吸附的比较，吸附后(提取溶液里核酸物质提前标定为一样的浓度或者含量，让OD值一样)，通过相同的振荡时间1min，频率为20次/min，进行处理，并在电子显微镜下观察留置在侧帮套表面的磁珠的量，结果如下：

[0108] 表2：不同处理下留在侧帮套表面的磁珠数量比较。

[0109]

[0110] 从上表可以明显看出，在磁棒套上覆盖了油性物质的时候，可以显著降低截留在表面的磁珠数量，从而让绝大数磁珠释放，但是没有油性物质的时候，由于本身表面能的原因，会有较大数量的磁珠截留在侧帮套表面。换句话说，有了油性物质的涂覆，对磁棒套表面的光滑度没有过高的要求，当进行精细化检测的时候，当仅仅用于吸附核酸物质的量很少的时候，磁珠的用量也很少，这个时候，涂覆油性物质显得更为重要，效果更为显著。磁珠的释放的多少直接关系到核酸物质的多少问题。

[0111] 实施例2：磁珠一步法检测经过确认阳性或者阴性样本的百日咳杆菌的样本(这个需要这种看下)

[0112] 说明：在以下实施例子中所用的PCR扩增仪器为Bio-RAD CFX96和ABI 7500。提供的试剂如下表：

[0113] 表3：磁珠裂解液的组分和体积比例。

[0114]

[0115] 表4:扩增试剂的组成和具体成分

[0116]

[0117] 表5：荧光定量PCR扩增引物探针

[0118]

[0119] 内标的组成:

[0120] 内标为一段人保守序列(SEQ.10)。序列如下：

[0121] 具体方法如下：

[0122] 一、核酸DNA提取：

[0123] 1.将如表3中的磁珠裂解液取出，振荡摇匀后短暂离心。

[0124] 2.取合适离心管加入混好的磁珠裂解液，混匀。然后用移液枪按照80μL/管，分别加入到PCR八联管中3个孔中，3个用于阳性样本核酸提取。

[0125] 3.在步骤2的PCR管中，分别加入20ul以下样本(表6)：

[0126] 表6：不同类型的阳性样本。

[0127]3个实验样本样本类型
阳性对照合成靶序列质粒
阳性样本 ATCC9430(106CFU/ml)
阳性样本经过确认为阳性标本

[0128] 4.盖好管盖，短暂离心，将八联管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。

[0129] 5.将步骤4离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min。然后取出PCR的含有内标的管子,管子下层含有内标物质,中间为菜籽油封闭的,然后在菜籽油层上有PCR扩增所必须的试剂，在室温下或者25-30摄氏度的温度下恢复融化，从而，让底部的内标物质和扩增试剂混合，菜籽油融化后覆盖在表层。让磁棒套缓慢插入到带有内标物质的扩增试剂的PCR管中，然后抽出，这样就在磁棒套上覆盖了一层菜籽油，然后放入带有样本和磁珠的3个PCR管中进行吸附磁珠。这里插入到带有菜籽油的PCR和插入到混合有磁珠和样本的PCR，都可以通过机器自动插入和自动抽取出磁棒套。

[0130] 6.吸附有磁珠(磁铁吸引磁珠或者比表面能双重作用)的磁棒套再次插入到PCR扩增管中(带有不同的阳性样本)，当磁性消失的时候，磁珠容易进入到扩增试剂中，同时进行相同的振荡时间1min，频率为20次/min。其中，不经过菜籽油涂覆作为对比实验，振荡时间1min5分钟，频率一般为40次/min。然后在ABI7500或者Bio-RAD CFX仪器进行扩增检测。
QPCR程序：45℃10min；

[0131] 95℃10min；

[0132] 95℃15s，60℃45s；40个cycles；

[0133] 60℃收集荧光，荧光通道选择FAM、CY5二个通道进行观察。

[0134] 结果参见图10-13，从图10和11可以看出，磁棒套有油封的荧光扩增曲线中，曲线起始循环数在第28循环就有荧光峰的出现，而且在32个循环的时候，具有明显的荧光峰的出现，相反，没有油性物质的涂覆，在32个循环的时候才开始出现荧光峰，到34循环的时候，才有明显的峰出现(图12和图13)。这也说明，磁棒套被油性物质涂覆的时候，绝大多数吸附的磁珠被释放到扩增试剂中，相反，没有油性物质的涂覆，在磁棒套上仍然吸附有磁珠。磁珠的释放的多少和扩增试剂中的目标核酸物质的量具有正相关。

[0135] 为了进一步验证油性物质涂覆磁棒套的，对磁珠的释放的效果。有油性物质的涂覆和没有油性物质的涂覆，测试的Ct值不一样，结果见下表7。

[0136]

[0137] 我们队Ct值进行了考察，发现出峰的时间的其实位置出现具有逻辑的一致性，具有油性物质涂覆的磁棒套的Ct值为25左右，而没有油性物质涂覆的Ct值为30左右，对于Ct值相差的数值在4-5之间，说明核酸的量相差在30-40倍之间,也就是说,具有油封闭的磁棒套可以让核酸的量升高到30-40倍。

[0138] 本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。

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一种用于磁棒进行磁珠吸附的试剂以及方法

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