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紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用

阅读：1035发布：2020-07-29

专利汇可以提供紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用方法，提取步骤为取紫薇果实，洗净晾干，测定含水量，烘干并粉碎后过筛；以正己烷为提取剂，利用超声波进行提取、抽滤，旋蒸浓缩，冷冻干燥，即得黄绿色透明紫薇果实BAS。本发明通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计法进行响应面优化实验，对超声波辅助提取紫薇果实BAS的工艺进行优化，筛选出紫薇果实BAS的最优提取工艺，并对其抑菌作用进行了测试。本发明的方法操作方便，易于工业放大。紫薇果实BAS对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有较强的抑菌、杀菌活性，因而可在化妆品、保健品、食品添加剂、空气清新剂等行业得到广泛应用。，下面是紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，取紫薇果实，洗净晾干后，烘干并粉碎，测定含水量，过筛，备用；
步骤2，向步骤1所得紫薇果实粉末中加入与其液料比以mL/g计为8～20倍的正己烷进行超声，超声温度为20℃～60℃，超声波功率为200W～600W的条件下，超声时间为15～
75min，将超声产物进行旋蒸再对所得旋蒸液冷冻干燥，得到紫薇果实抑菌活性物质。
2.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述步骤（2）中向紫薇果实粉末中加入与其液料比11～17mL/g的正己烷；超声温度为40℃～60℃；超声时间为15～45min；超声波功率为400～600W。
3.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述超声温度为49℃。
4.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述液料比为15.5mL/g。
5.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述超声时间为30min。
6.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述超声波功率为471W。
7.根据权利要求1所述的一种紫薇果实中抑菌活性物质的提取工艺，其特征在于，所述烘干温度为35℃，过筛时筛子目数为100目。
8.权利要求1-7任一项所述的提取工艺提取的紫薇果实抑菌活性物质。
9.权利要求8所述的紫薇果实抑菌活性物质在食品、化妆品、日化产品、药品、保健品中的抑菌或杀菌用途。

说明书全文

紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用

技术领域

[0001] 本发明属于提取分离领域，涉及一种抑菌活性物质的提取工艺及其应用，特别是涉及一种紫薇果实中的抑菌活性物质的提取方法，以及该抑菌活性物质的抗菌、抑菌用途。

背景技术

[0002] 紫薇为千屈菜科，紫薇属的落叶灌木或小乔木，树高约7米；树皮呈灰色或灰褐色；树干扭曲，小枝纤细；蒴果为椭圆状球形，成熟后为紫色或黑色，室背开裂。紫薇一般在6-9月开花，9-12月成熟。紫薇能抗寒，生长活力强。紫薇原产亚洲南部，主要分布于亚洲东部、东南部和南部的热带亚热带地区、新几内亚岛、菲律宾以及澳大利亚等地目前全世界约有
55种紫薇,分布于热带和亚热带地区,紫薇在我国栽培历史悠久，根据史书记载，唐代己将紫薇作为观赏花木，距今己有1500多年的历史。紫薇具有树形优美，花色艳丽，花期长，适应性广，抗性强等特点，是观花、观干、观根的优良园林树种。紫薇也是一种抗污性强的观花树种。紫薇是一种集观赏、环境保护及多种药用活性功能于一体的优良花木，相关研究者也对其进行了广泛的研究，但是有关紫薇抑菌活性的研究很少。

发明内容

[0003] 本发明提供一种紫薇果实抑菌活性物质(Bacteriostatic active substances，BAS))提取工艺，以紫薇果实BAS对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌活性大小为评价指标，通过单因素实验和响应面实验设计对超声波辅助紫薇果实BAS的工艺进行优化，并对紫薇果实BAS抑菌作用进行研究。

[0004] 本发明所述的紫薇果实BAS的提取工艺包括以下步骤：

[0005] 步骤1，取紫薇果实，洗净晾干后，烘干并粉碎，测定含水量，过筛，备用；

[0006] 步骤2，向步骤1所得紫薇果实粉末中加入与其液料比以mL/g计为8～20倍的正己烷进行超声，超声温度为20℃～60℃，超声波功率为200W～600W的条件下，超声时间为15～75min，将所得紫薇果实ABS旋蒸液冷冻干燥，得到紫薇果实抑菌活性物质。

[0007] 优选的，所述步骤(2)中向紫薇果实粉末中加入与其液料比11～17mL/g的正己烷；超声温度为40℃～60℃；超声时间为15～45min；超声波功率为400～600W。

[0008] 优选的，所述超声温度为49℃；

[0009] 优选的，所述液料比为15.5mL/g。

[0010] 优选的，所述超声时间为30min。

[0011] 优选的，所述超声波功率为471W。

[0012] 优选的，所述烘干温度为35℃，过筛时筛子目数为100目。

[0013] 本发明所述的提取工艺提取的紫薇果实抑菌活性物质。

[0014] 本发明所述的紫薇果实抑菌活性物质在食品、化妆品、日化产品、药品、保健品中的抑菌或杀菌用途。

[0015] 有益效果：本发明提供了一种紫薇果实抑菌活性物质提取工艺及应用，本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明首次利用超声波辅助提取分离得到紫薇果实BAS，填补了该技术的空白；第二，本发明采用单因素和Box-Behnken中心组合设计法进行响应面优化方法优化紫薇果实BAS提取工艺，确保了提取工艺条件准确可靠，具有安全、经济等特点，适用于大规模生产。附图说明

[0016] 图1为紫薇果实BAS提取工艺的工艺流程图；

[0017] 图2为超声波功率对紫薇果实BAS抑菌效果的影响结果图；

[0018] 图3为提取时间对紫薇果实BAS抑菌效果的影响结果图；

[0019] 图4为提取剂与紫薇果实粉末的液料比对紫薇果实BAS抑菌效果的影响结果图；

[0020] 图5为提取温度对紫薇果实BAS抑菌效果的影响结果图；

[0021] 图6为超声波功率与提取时间交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图；

[0022] 图7为提取时间与提取温度交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图；

[0023] 图8为提取时间与液料比交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图；

[0024] 图9为超声波功率与提取温度交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图；

[0025] 图10为提取温度与液料比交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图；

[0026] 图11为超声波功率与液料比交互作用对紫薇果实BAS抑菌效果影响的响应面和等高线图。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0028] 实施例1：紫薇果实BAS的提取工艺优化

[0029] 步骤1，取10月中旬采集的紫薇果实，用水洗净，在常温下晾干外表水，将其在35℃下烘干并粉碎，过100目筛后备用；

[0030] 步骤2，将步骤1所得紫薇果实粉末中加入与其液料比分别为8mL/g、11mL/g、13mL/g、17mL/g和20mL/g的提取剂，温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，超声波功率为200W、300W、400W、500W、600W的条件下，超声萃取15min、30min、45min、60min、75min，然后用真空抽滤机抽滤，旋蒸浓缩后进行冷冻干燥，得到紫薇果实BAS。

[0031] 步骤3，将步骤2初步优选出的对紫薇果实BAS提取产生影响的各个因素：以正己烷为提取剂，在超声波功率400W，500W，600W，提取温度为40℃、50℃、60℃，液料比为11：1，14：1，17：1的条件下，超声萃取15min、30min、45min。利用这些不同影响因素的3个水平，采用响应面法优化紫薇果实BAS提取工艺条件。

[0032] 步骤4，在单因素实验基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以超声提取时间、超声波功率、提取温度和液料比四个因素为自变量(分别以A、B、C、D表示)，以紫薇果实BAS抑菌活性为响应值设计了四因素三水平共29个实验点的响应面分析实验，其中分为24个析因点和5个中心点。

[0033] 1.响应面实验

[0034] (1)响应面实验具体包括如下几个方面实验：

[0035] X1：超声提取时间(15min～45min)对紫薇果实BAS得率的影响；

[0036] X2：超声波功率(400W～600W)对紫薇果实BAS得率的影响；

[0037] X3：提取温度(40℃～60℃)对紫薇果实BAS得率的影响；

[0038] X4：液料比mL/g(11：1～17：1)对紫薇果实BAS得率的影响。

[0039] (2)响应面实验设计表：

[0040] 表1四因素三水平响应面分析实验设计表

[0041]

[0042] 实验以随机次序进行，将实验所得的紫薇果实BAS抑菌活性用Design-Expert 8.06程序进行分析，并得出回归拟合方程以及方差分析表及响应面分析图。响应面实验设计与结果见表2。

[0043] 表2响应面中心组合工艺优化设计方案及实验结果

[0044]

[0045]

[0046] 表3超声波辅助提取紫薇抑菌活性物质响应面结果回归方差分析表

[0047]

[0048]

[0049] 注：**P＜0.01，差异极其显著；*P＜0.05，差异显著。

[0050] 由表3可知，各因素对紫薇果实BAS抑菌活性的影响次序为：液料比(D)＞超声波功率(C)＞超声提取温度(A)＞超声提取时间(B)。整体模型的Prob>F值小于0.0001，表明该回归模型达到极显著水平；回归模型的相关系数R2＝0.9012(Radj2＝0.8024)，且失拟项不显著(Prob>F值为0.0537，大于0.05)，说明模型与数据之间拟合度较好，因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。同时做出中心组合设计试验所得的6组响应面曲面图，参见后面附图。

[0051] (4)紫薇果实BAS最佳提取条件的预测与检验

[0052] 响应面图形是特定的响应值Y对应的因素A、B、C、D构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的实验方案。

[0053] 在实验范围内，通过Design-Expert.V8.0.6 软件对回归方程分析预测，得出紫薇果实BAS的最优提取工艺条件为：超声波功率为471.32W，超声提取时间为29.84min，液料比为15.45mL/g，超声提取温度为49.41℃，理论最高得率为1.72。

[0054] 为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行试验。考虑到实验的可操作性，将实验条件适度调整为：超声波功率为471W，超声提取时间为30min，液料比为15.5mL/g，超声提取温度为49℃。在此工艺条件下，紫薇果实BAS对金黄色葡萄球菌抑菌圈平均值为1.67±0.04cm，与预测抑菌圈直径的误差为2.9％。说明了回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。因此，基于响应面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实用价值。

[0055] 实施例2：紫薇果实BAS抑菌作用

[0056] 步骤1：紫薇果实BAS制备

[0057] 取紫薇果实干燥粉末2000g，利用实施例1中所得的紫薇果实BAS优化提取工艺(超声波功率471W，超声提取时间为30min，液料比为15.5mL/g，提取温度为49℃)进行紫薇果实BAS制备，BAS提取物旋蒸浓缩并冷冻干燥后得到30.5g黄绿色浸膏，紫薇果实BAS的得率为1.525％。

[0058] 步骤2：紫薇果实BAS抑菌作用

[0059] (1)供试菌种：

[0060] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 26112)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC87394)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)，辣椒炭疽病菌{辣椒刺盘孢[Colletotrichum capsici(syd.)Butl.]}稻瘟病菌[Magnaporthe grisea(hebert)Barr comb.Nov.](2)培养基：

[0061] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂1.5％-2.0％(液体培养基不含琼脂)，水1000mL，pH7.0-7.2(使用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH)。

[0062] 马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200克葡萄糖20克琼脂15～20克，自来水1000毫升，自然pH。

[0063] (3)菌悬液的配制：

[0064] 从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱培养至对数生长期。分别吸取以上培养时间的供试菌液0.5mL，加入无菌水倍比稀释到105-106mL-1，备用。

[0065] (4)供试药物：

[0066] 对照药：头孢拉定；样品：实施步骤1所得的紫薇果实BAS。

[0067] (5)抑菌活性的测定：

[0068] 采用滤纸片法测定抑菌活性。使用打孔器，将定性滤纸制成小圆纸片(d＝6mm)，高压灭菌后备用。无菌条件下，在已灭菌的培养皿中倾入相应菌种的培养基25.00mL，冷却凝固后制成固体平板。将上述接种活化好的各种菌分别取适量初试菌悬液用生理盐水将其稀释成含菌量为106～107CFU/mL的菌悬液备用(其中真菌采用显微镜血球计数板计数，用接种环挑取真菌于无菌生理盐水中，调整稀释均匀后吸取一部分置于血球计数板(16×25规格)中，使得其在显微镜下观测视野中每个中方格中孢子数为14～18个，成为106～107个/ml的孢子菌悬液)。将灭完菌的干燥的滤纸片用镊子夹到各个含菌培养皿上，每个培养皿上呈正三角形放置三片滤纸片，用灭菌枪头吸取25μLABS溶液到滤纸片上，静置10min左右后。细菌于37℃倒置培养24h，真菌于28℃倒置培养48h后观察结果。培养时间到后取出培养皿观察透明抑菌圈，采用十字交叉法用测微尺测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径大小，取其平均值(mm)为测定结果，每项抑菌实验均平行重复3次。以抑菌圈直径的大小来进行抑菌活性强弱的判定，抑菌圈表现得越大，则表明其抗菌活性也就越强。

[0069] (6)实验结果

[0070] 抑菌活性测定结果如表4所示。

[0071] 表4紫薇果实BAS对各种微生物作用的抑菌圈大小(mm)

[0072]

[0073]

[0074] 备注：针对Escherichia coli，Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus三种受试菌的BAS浓度均为5mg/mL，而对两种真菌受试菌使用的BAS浓度为50mg/mL；抑菌圈直径含滤纸片直径6.0mm。

[0075] 由表4可知，实施例1所得的紫薇果实BAS对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌均具有较强的抑菌活性，且紫薇果实BAS对受试真菌的抑菌活性要比对受试抑菌活性要强。

[0076] 步骤3：紫薇果实BAS最低抑菌浓度(MIC)测定

[0077] (1)紫薇果实BAS不同浓度溶液配制：取紫薇果实BAS用1/2体积对半稀释法将它们分别配置成浓度为160mg/mL；80mg/mL；40mg/mL；20mg/mL；10mg/mL；5mg/mL；2.5mg/mL；1.25mg/mL；0.625mg/mL，0mg/mL的溶液备用。

[0078] (2)灭菌：将实验所需要的培养皿、培养基、试管、枪头、蒸馏水、生理盐水经牛皮纸包装好后在121℃湿热灭菌20min，灭完菌将其放置超净工作台紫外灭菌30min。

[0079] (3)接种：在超净工作台上，分别将1mL上述配制的提取物加入装有9mL固体培养基的试管中混合均匀后倒入培养皿中，配制成终浓度为16mg/mL；8mg/mL；4mg/mL；2mg/mL；1mg/mL；0.5mg/mL；0.25mg/mL；0.125mg/mL；0.065mg/mL，0mg/mL的药物平板。取配制好的菌悬液，吸取2μL滴加到不同浓度提取物的平板培养基中，细菌于37℃恒温箱中倒置培养24h，真菌于28℃恒温箱中倒置培养48h后观测结果。

[0080] (4)MIC确定：24h后观察细菌培养基中各浓度药物平板上菌生长的情况，几个浓度梯度中第一次没有出现菌生长的药物平板浓度就是所测的最低抑菌浓度。

[0081] (5)实验结果

[0082] 抑菌活性测定结果如表5所示。

[0083] 表5紫薇果实BAS对各种微生物作用的MIC大小(mg/mL)

[0084]

[0085]

[0086] 通过以上实例可以发现，紫薇果实BAS具有浓郁的香味，同时也具有较好的抗菌、杀菌活性，对于紫薇的研究开发具有重要的实践意义和应用前景。

[0087] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何人员在本发明披露的技术范围内得到的技术方案的简单变化或等效替换均在本发明的保护范围内。

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