技术领域

本发明涉及一种新型的纳米修饰生物传感器及其制备方法，属于生物传感器 技术和纳米生物检测技术领域。

                        背景技术

生物传感器能快速、准确和方便地测量血液、食品和发酵工业中葡萄糖、乳 酸等含量而受到业内人士的关注。但是，目前已有的生物传感器普遍存在着灵敏 度不高、抗干扰性差和稳定性低及制造成本高的缺陷。例如中国专利申请“血液 乳酸电化学传感器”(申请号03128815.4)是由设有血样测量工作区的基板、基 板上依次覆有的工作电极和参比电极组成。基板(血样测量工作区范围内部)还覆 有能够与乳酸反应，并产生电子传递的酶试剂反应膜。酶试剂反应膜含有乳酸氧 化酶、电子传递体、稳定剂和能使血样快速渗透到反应膜内部与酶进行反应的亲 水高分子物质。由于电子传递体采用了铁氰酸根，但铁氰酸根水溶性好，易流失， 使得传感器的稳定性能受影响。从而测量结果的可信度被降低了。中国专利申请 “全血葡萄糖生物传感器”(申请号03129434.0)和“全血乳酸生物传感器”(申 请号03129433.2)提出了反应层由羧甲基纤维素CMC、修饰碳纳米管(作为电子 第二中介体)，铁氰化钾、乳酸氧化酶或葡萄糖氧化酶(作为电子第一中介体的 试剂)、稳定剂、缓冲液制备成的生物传感器，可用来测定血液中的乳酸、葡萄 糖的含量。引入的电子第二中介体，碳纳米管提高了传感器的响应灵敏性，克服 了铁氰酸根流失造成稳定性差的缺陷。但是由于反应层是依次叠加在设有毛细孔 的腔体内，因此它们的用酶量较高，使得传感器的成本提高。

                        发明内容

本发明的目的是提供一种成本低廉、灵敏度高、抗干扰性好和稳定性高的纳 米修饰生物传感器。本发明的另一个目的是公开其制备方法。

为了实现上述目的，本发明是这样进行的：传感器包括工作电极、对电极和 参比电极及溶液进、出口。其特点是：工作电极由聚四氟乙烯板和贯穿该板的碳 电极组成，碳电极底端设有引线，顶端修饰有酶试剂反应膜，酶试剂反应膜由核 壳型的中性红掺杂的二氧化硅(NR-SiO2)纳米粒子和生物活性酶组成。工作电 极上面依次设有薄层检测池和对电极，并通过螺钉将工作电极、薄层检测池和对 电极固为一体。对电极由聚四氟乙烯板和贯穿该板的不锈钢电极以及对电极引线 组成。薄层检测池是一片中间挖成通孔的聚四氟乙烯膜，池底是修饰有酶试剂反 应膜的碳电极，池顶部是对电极上的不锈钢电极与两侧对称开设的液体进口孔和 出口孔。液体进口孔直接与溶液进口管连接。液体出口孔通过接管与套管连接， 套管内装有参比电极，套管一侧设有溶液出口管。

在碳电极上修饰的酶试剂反应膜中的生物活性酶可按不同检测内容，选择葡 萄糖氧化酶(GOD)、乳酸氧化酶(LOD)、L-谷氨酸氧化酶(L-GLOD)或黄嘌呤 氧化酶(XOD)。

本发明的纳米生物传感器制备方法的特点是在碳电极上修饰的酶试剂反应 膜是先采用反相微乳液法制成核壳型NR-SiO2纳米粒子，然后将核壳型NR-SiO2 纳米粒子修饰在碳电极顶端，形成纳米NR-SiO2层，再将生物活性酶和牛血清白 蛋白及其戊二醛交联后修饰在纳米NR-SiO2层上，自然干燥后制得。

具体步骤如下：

先将7.5mL的环己烷、1.8mL正己醇和1.77mL聚乙二醇辛基苯基醚(OP) 混合均匀搅拌，然后缓慢加入300-400μL中性红水溶液，室温下均匀搅拌30-60 min，然后缓慢地加入60-100μL的正硅酸四乙酯和浓度为30％体积比的30-60 μL氨水，室温下继续充分搅拌反应12-24小时，形成纳米粒子尺寸为20-100nm 的呈三维二氧化硅网状结构的NR-SiO2纳米粒子；接着将上述NR-SiO2纳米粒子 修饰在碳电极顶端上，再将生物活性酶和牛血清白蛋白及戊二醛交联后修饰在纳 米NR-SiO2层上，自然干燥后制得。

在碳电极上修饰了酶试剂反应膜后，还可以涂敷一层1％的Nafion甲醇溶 液，形成一层抗阴离子干扰的Nafion膜，增强抗干扰性能。

本发明具有如下优点和效果：

1.由于本发明的工作电极上的碳电极顶端修饰的酶试剂反应膜是用核壳型 NR-SiO2纳米粒子进行修饰的，其核NR具有良好的导电性，且对生物活性酶具有 催化作用，使其催化电流增大了3-9倍(不同生物活性酶，其催化效果的提高也 不同)。因此本发明的传感器的安培响应值是无纳米修饰的传感器的3-9倍。

2.由于本发明采用的NR-SiO2纳米粒子尺寸为20-100nm，同时，该纳米粒 子的壳层SiO2具有良好的生物兼容性和生物亲和性，且呈三维网状结构，有效 防止了核NR电子传递体的泄漏，显著提高了核NR电子传递体的稳定性。因此保 证了本发明的传感器的稳定性。

3.由于本发明的生物传感器采用了薄层检测池，因此检测时所需样品量少。

4.由于本发明采用了NR-SiO2纳米粒子，因此除了灵敏度和稳定性得到提 高外，其线性范围宽，可达到4个数量级以上，将最低检测线降低到了2.0×107 mol·L1，可直接检测含微量葡萄糖、乳酸等的溶液，例如脑渗析液等。

5.由于制备本发明的生物传感器只需0.4个活力单位的葡萄糖氧化酶、0.2 个活力单位的乳酸氧化酶、0.04个活力单位的L-谷氨酸氧化酶和0.05个活力单 位的次黄嘌呤氧化酶。而通常，如专利申请号03129433.2和03129434.0乳酸和 葡萄糖传感器需1-2个活力单位的生物活性酶。因此制造成本低廉。

6.由于本发明的碳电极上修饰的酶试剂反应膜用的核壳型NR-SiO2纳米粒 子的制备采用了反相微乳液法，因此工艺简单，操作方便，成本低，颗粒均匀且 粒径小，而且每次制备的纳米粒子粒径分布较窄。

                        附图说明

图1为本发明的生物传感器的剖视图；

图2为本发明的生物传感器的对电极的俯视图；

图3为本发明的生物传感器的薄层检测池的俯视图；

图4为本发明的生物传感器的工作电极的俯视图；

图5为按本发明方法所制得的NR-SiO2纳米粒子的TEM图；

图6为本发明方法修饰酶试剂反应膜的流程示意图；

其中图1：固定圈1、溶液出口管2、参比电极3、对电极引线4、溶液进口 管5、溶液进口孔6、对电极7、薄层检测池8、工作电极9、碳电极引线10、螺 钉11、定位孔12、溶液出口孔13、接管14、套管15。

图2：溶液进口孔13、溶液出口孔6、4个定位孔12、聚四氟乙烯板17、不 锈钢电极16。

图3：4个定位孔12、通孔18、聚四氟乙烯膜19。

图4：4个定位孔12、聚四氟乙烯板17、修饰了酶试剂反应膜的碳电极20。

                        具体实施方式

请参阅图1、2、3、4。传感器包括工作电极9、对电极7和参比电极3及溶 液进、出口管5和2构成。参比电极3为饱和甘汞电极。其特点是，工作电极9 由聚四氟乙烯板(又称绝缘性Teflon基材)17和贯穿该板17的碳电极20组成， 碳电极20底端设有引线10，顶端修饰有酶试剂反应膜，酶试剂反应膜由核壳型 中性红掺杂的二氧化硅纳米粒子和生物活性酶组成。工作电极9上面依次设有薄 层检测池8和对电极7，各自的厚度分别为：12mm、0.15mm和12mm，并且四 周均开有4个定位孔12，通过螺钉11穿入定位孔12将工作电极9、薄层检测池 8和对电极7三者固为一体。对电极7由聚四氟乙烯板17和贯穿该板17的不锈 钢电极16以及对电极引线4组成。薄层检测池8是一片中间挖成直径为8mm 的通孔18的聚四氟乙烯膜19，池底是修饰有酶试剂反应膜的碳电极20，池顶部 是对电极7上的不锈钢电极16与两侧对称开设的液体进口孔6和出口孔13，由 此形成体积为9.66μL薄层检测池8。液体进口孔6直接与溶液进口管5连接。 液体出口孔13通过固接在对电极7上的接管14与套管15螺纹连接。套管15 内装有参比电极3，套管15一侧设有溶液出口管2。检测样品时，可通过微管道 与传感器外部的流动注射仪的微进样器连接。打开溶液进、出口管5和2，则待 测液体是流动相，若关闭溶液进、出口管，待测液体是非流动相的。启动与工作 电极9、对电极7和参比电极3连接的电分析仪，可检测到血液或脑渗析液或其 他溶液中的葡萄糖或乳酸或L-谷氨酸或次黄嘌呤的浓度变化的安培信号，按照 相应的工作曲线，就能得到其含量。

本发明的碳电极20上修饰的酶试剂反应膜的生物活性酶是按不同检测内 容，选择相应的葡萄糖氧化酶(GOD，from Aspergillus niger，EC 1.1.3.4.150 000units/g)、乳酸氧化酶(LOD，from Pediococcus species，37U/mg)、L -谷氨酸氧化酶(L-GLOD，EC 1.4.3.11，from Streptomyces sp.，10.8U/mg) 或黄嘌呤氧化酶(XOD，EC 1.1.3.22，Grade I from Buttermilk，1U(mg Protein)-1，34.7mg Protein mL-1)。这些酶均可市售购得。

本发明的中性红掺杂的二氧化硅纳米生物传感器制备方法，其特点是碳电极 20上修饰酶试剂反应膜的步骤是先采用反相微乳液法制成核壳型NR-SiO2纳米 粒子，然后将核壳型NR-SiO2纳米粒子修饰在碳电极20顶端，形成纳米NR-SiO2 层，再将生物活性酶和牛血清白蛋白(BSA)及其戊二醛交联后修饰在纳米NR-SiO2 层上，自然干燥后制得。还可以在上述自然干燥后制得的酶试剂反应膜端面上再 涂敷一层1％的Nafion甲醇溶液，形成一层抗阴离子干扰的Nafion膜，可进一 步增强本发明传感器的抗干扰性能。

下面4个实施例是四种不同酶试剂反应膜的制备方法。

实施例1用于检测葡萄糖含量的本发明的葡萄糖传感器的制备方法。

先采用反相微乳液法，将7.5mL环己烷，1.8mL正己醇和1.77mL聚乙二 醇辛基苯基醚(OP)混合均匀搅拌30min，表面活性剂OP可换成TritonX-100 等，维持水和表面活性剂的摩尔比(W＝10)。然后缓慢加入400μL 1×10’mol·L1 的中性红水溶液，室温下均匀搅拌反应30min，形成稳定的油包水体系。再向 该体系中缓慢地加入60-100μL正硅酸四乙酯(TEOS)和浓度为30％体积比的 30-60μL氨水(NH3·H2O)，室温下继续充分搅拌反应24h。维持水和TEOS的 摩尔比(W＝10)。在油包水的微乳液合成的核壳纳米颗粒过程中，在氨水的催 化下，TEOS逐渐水解，并发生缩聚反应，形成二氧化硅的网状结果，其整个过 程的方程式如下：

水解反应： Si(OC4H9)4+H2O→(C4H9O)3Si-OH+C4H9OH

缩聚反应

成核反应：

反应完成后，向体系中加入15mL丙酮，使纳米颗粒从油包水的体系中分离 沉淀出来，然后离心分离，在离心管底部可以看到有浅棕红色的沉淀形成。弃去 上层清夜，用无水乙醇和水分别洗涤沉淀数次，充分除去表面活性剂OP和纳米 颗粒表面上吸附的中性红获得核壳型NR-SiO2纳米粒子。经TEM表征，此时的 NR-SiO2的粒径为50±4nm。请参阅图5。将上述的纳米颗粒用2mL pH 6.9的 磷酸缓冲溶液(PBS)分散后进行下一步表面修饰。

请参阅图6，将核壳型NR-SiO2纳米粒子修饰在碳电极20上，形成纳米 NR-SiO2层，再将生物活性酶和BSA及戊二醛交联后修饰在纳米NR-SiO2层上。在 室温条件下置于阴暗处自然晾干，得到工作电极9。生物活性酶和BSA及戊二醛 交联工艺如下：先将10mg BSA和0.1mg的GOD溶解于100μL 0.1mol·L (pH 6.9)的磷酸缓冲溶液中配制成酶溶液。然后将25％的戊二醛与磷酸缓冲 液以1∶4的体积比混合配制成5％的戊二醛溶液。取出20μL戊二醛溶液与酶 溶液，迅速混合，制成混合酶溶液。吸取1μL该溶液滴涂在修饰了NR-SiO2层 的碳电极20上，制成碳电极上修饰的酶试剂反应膜。也可以最后在酶试剂反应 膜表面涂敷1μL 1％的Nafion甲醇溶液，自然晾干，使本发明的传感器增强 了抗干扰性能。

上述方法制成的NR-SiO2纳米修饰的葡萄糖传感器，其电流响应值是相同条 件下无纳米修饰时制备的传感器的5倍。经测试，该传感器的线性范围为1.0× 10-6~1.0×10-2mol·L-1，最低检测限达5.0×107mol·L1，相关系数(r)为 0.9979。将该葡萄糖传感器保存在4℃的PBS中，在1个月内表现出良好的稳 定性和重复性。

实施例2检测乳酸的传感器的制备方法。

在制备NR-SiO2纳米粒子时，改变1×10-2mol·L-1的中性红水溶液的量为 300μL，其他制备及处理过程同实施例1。经TEM表征，此时的NR-SiO2的粒径 为20±4nm(参阅图5)。

生物活性酶和BSA及戊二醛交联方法，除了将10mg BSA和0.4mg LOD溶 解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸缓冲溶液中配制成酶溶液不同于实 施例1外，其余制备步骤与实施例1相同。修饰过程也同实施例1。

经测试，该NR-SiO2纳米修饰生物传感器对乳酸的电流响应值是相同条件下 无纳米修饰时制备的传感器的2.3倍。经测试，该传感器的线性范围为1.0×101 ~1.0×10-2mol·L-1，最低检测限达5.0×107mol·L-1，相关系数(r)为0.9978。 将该乳酸传感器保存在4℃的PBS中，在20天内表现出良好的稳定性和重复性。

实施例3L-谷氨酸传感器的制备

在制备NR-SiO2纳米粒子时，改变搅拌反应时间为12h，其他制备及处理过 程同实施例1。经TEM表征，此时的NR-SiO2的粒径为40±5nm。

生物活性酶和BSA及戊二醛交联工艺，除了将10mg BSA和0.2mg L-GOD 溶解于100μL 0.1mol·L-1(pH6.9)的磷酸缓冲溶液中配制成酶溶液，是与 实施例1不同的，其余工艺均与实施例1相同。经测试，该NR-SiO2纳米修饰生 物阵列传感器对谷氨酸的电流响应值是相同条件下无纳米修饰时制备的传感器 的8.3倍。经测试，该传感器的线性范围为5.0×107~1.0×102mol·L1，最 低检测限达2.0×10-7mol·L-1，相关系数(r)为0.9982。将该谷氨酸传感器保 存在4℃的PBS中，在15天内表现出良好的稳定性和重复性。

实施例4次黄嘌呤传感器的制备

在制备NR-SiO2纳米粒子时，搅拌反应时间24h，其他同实施例1。然后， 再向该体系中缓慢地加入100-150μL TEOS和60-100μLNH3·H2O，其他制备及 处理过程同实施例1。经TEM表征，此时的NR-SiO2的粒径为100±5nm。

生物活性酶和BSA及戊二醛交联工艺，除了将10mg BSA和5μLXOD溶 解于100μL 0.1mol·L-1(pH 6.9)的磷酸缓冲溶液中配制成酶溶液，是与实 施例1不同的，其余工艺均与实施例1相同。其它修饰过程也同实施例1。经测 试，该NR-SiO2纳米修饰生物阵列传感器对次黄嘌呤的电流响应值是相同条件下 无纳米修饰时制备的传感器的4倍。经测试，该传感器的线性范围为5.0×107~ 1.0×103mol·L-1，最低检测限达2.0×10-7mol·L-1，相关系数(r)为0.9973。 将该次黄嘌呤传感器保存在4℃的PBS中，在40天内表现出良好的稳定性和重 复性。