一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法及其可循环免疫检测应用
专利汇可以提供一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法及其可循环免疫检测应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种四 氧 化三 铁 /二氧化 钛 / 银 核壳 纳米材料 的制备方法及其直接可循环免疫检测应用，特点是活化三重核壳纳米材料使其与待测 抗原 相结合，利用表面增强 拉曼散射 效应实现待测抗原的直接拉曼检测，在拉曼检测完成后，对上述免疫结合的纳米材料进行紫外光照降解抗原，磁 力 回收表面已无抗原存在的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，并将其用于下一次对待测抗原的检测中，重复这一拉曼检测-催化降解-拉曼检测过程，实现 肿瘤 标志物直接可循环免疫检测，优点是三层 核壳结构 既具有 磁性 分离和拉曼增强的作用，又具有催化降解肿瘤标志物的作用，同时 检测限 低且可检测大分子肿瘤标志物。，下面是一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法及其可循环免疫检测应用专利的具体信息内容。
1.一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将1.35-6.75克六水合三氯化铁、3.6-18.0克醋酸钠和1.0-5.0克聚乙二醇溶于40-
200毫升乙二醇中，超声直至完全溶解后，转移到水热反应釜中，于200℃下反应10小时，离心并用乙醇清洗后收集沉淀，即得到Fe3O4纳米颗粒；
（2）称取50毫克步骤（1）得到的Fe3O4纳米颗粒溶于浓度为0.1毫摩尔每毫升盐酸水溶液中超声15分钟，磁性分离并用去离子水清洗三次；再次磁性分离后，将Fe3O4纳米颗粒溶于
120毫升由乙醇和乙腈按体积比3:1混合而成的混合溶液中，超声使其完全溶解后，向其加入500微升氨水，超声5分钟使其混合均匀；然后在搅拌条件下逐滴加入1-6毫升钛酸四丁酯，反应1.5小时后，磁性分离并用乙醇洗涤三次后，即得到Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（3）取81毫克步骤（2）得到的Fe3O4/TiO2纳米颗粒和75.4毫克氟化铵溶于20.45毫升由乙醇和水按体积比13.5：6.95混合而成的混合溶液中，超声使其充分溶解后，将反应溶液放置于室温下持续搅拌1小时，搅拌速度为180-200转每分钟，搅拌完成后，将反应溶液转移至反应釜中，在180℃下反应24小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并用去离子水洗涤3次，即得到结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（4）取81毫克步骤（3）得到的结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于33.4毫升乙醇中，持续搅拌下逐滴加入25微升3-氨丙基三甲氧基硅氧烷，将反应溶液置于80℃下冷凝回流4小时，待其自然冷却至室温后，磁性分离并用乙醇洗涤三次，即得到氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（5）将1克聚乙烯吡咯烷酮和28毫克步骤（4）得到的氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于
10毫升去离子水中混合均匀后，在机械搅拌下逐滴加入银氨溶液并转移至水热反应釜中，密封后置于120℃下反应11小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并依次用四氢呋喃、乙醇和去离子水洗涤，即得到Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，并置于去离子水中储存待用，
根据权利要求1所述的一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法，其特征在于步骤（5）中所述的银氨溶液制备方法为：取2毫升浓度为0.01-0.08毫克每毫升的硝酸银水溶液，加入过量的氨水直至反应溶液变澄清得到银氨溶液。
2.一种基于权利要求1或2制备方法所得的四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的肿瘤标志物可循环免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将15毫克Fe3O4/TiO2 /Ag核壳纳米材料溶于2毫升二甲基甲酰胺溶液中，然后加入1毫升丁二酸酐的DMF溶液，于70℃下缓慢摇动孵化24小时后，磁性分离并用去离子水洗涤2次，即得到羧基化的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，并溶于1毫升水中，然后加入1毫升EDC/NHS的PBS溶液，于30℃下缓慢摇动孵化1小时后，用去离子水洗涤1次，再将洗涤后的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料溶于1毫升由PBS缓冲液和水按等体积比混合而成的混合溶液中，向其中加入100微克每毫升的肿瘤标志物溶液，于30℃缓慢摇动孵化3.5小时后，用去离子水洗涤一次，磁性分离得到标记有肿瘤标志物的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，利用拉曼光谱仪对其进行光谱测量可检测待测肿瘤标志物的含量；
（2）检测结束后，将标记有肿瘤标志物的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料溶于去离子水中，并将其转移到透明玻璃瓶中，采用小磁铁吸引的方式聚集Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米粒子，采用波长为265纳米的紫外灯进行照射，在光催化作用下直至肿瘤标志物降解完全，然后将催化后的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料重复步骤（1）方法链接新的肿瘤标志物，即可实现对肿瘤标志物的直接可循环免疫检测。
3.根据权利要求3所述的基于四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的肿瘤标志物可循环免疫检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述的丁二酸酐的DMF溶液中丁二酸酐的浓度为10.3毫克每毫升；所述的EDC/NHS的PBS溶液中EDC的浓度为10毫克每毫升，NHS的浓度为
10毫克每毫升。
4.根据权利要求3所述的基于四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的肿瘤标志物可循环免疫检测方法，其特征在于：所述的肿瘤标志物包括前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白AFP、免疫球蛋IGg、糖类抗原CA199和癌胚抗原CEA。
一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法及其
可循环免疫检测应用
技术领域
背景技术
发明内容
200毫升乙二醇中，超声直至完全溶解后，转移到水热反应釜中，于200℃下反应10小时，离心并用乙醇清洗后收集沉淀，即得到Fe3O4纳米颗粒；
（2）称取50毫克步骤（1）得到的Fe3O4纳米颗粒溶于浓度为0.1毫摩尔每毫升盐酸水溶液中超声15分钟，磁性分离并用去离子水清洗三次；再次磁性分离后，将Fe3O4纳米颗粒溶于
120毫升由乙醇和乙腈按体积比3:1混合而成的混合溶液中，超声使其完全溶解后，向其加入500微升氨水，超声5分钟使其混合均匀；然后在搅拌条件下逐滴加入1-6毫升钛酸四丁酯，反应1.5小时后，磁性分离并用乙醇洗涤三次后，即得到Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（3）取81毫克步骤（2）得到的Fe3O4/TiO2纳米颗粒和75.4毫克氟化铵溶于20.45毫升由乙醇和水按体积比13.5：6.95混合而成的混合溶液中，超声使其充分溶解后，将反应溶液放置于室温下持续搅拌1小时，搅拌速度为180-200转每分钟，搅拌完成后，将反应溶液转移至反应釜中，在180℃下反应24小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并用去离子水洗涤3次，即得到结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（4）取81毫克步骤（3）得到的结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于33.4毫升乙醇中，持续搅拌下逐滴加入25微升3-氨丙基三甲氧基硅氧烷，将反应溶液置于80℃下冷凝回流4小时，待其自然冷却至室温后，磁性分离并用乙醇洗涤三次，即得到氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（5）将1克聚乙烯吡咯烷酮（分子量5800克每摩尔）和28毫克步骤（4）得到的氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于10毫升去离子水中混合均匀后，在机械搅拌下逐滴加入银氨溶液并转移至水热反应釜中，密封后置于120℃下反应11小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并依次用四氢呋喃、乙醇和去离子水洗涤，即得到Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，并置于去离子水中储存待用，其中银氨溶液制备方法为：取2毫升浓度为0.01-0.08毫克每毫升的硝酸银水溶液，加入过量的氨水直至反应溶液变澄清得到银氨溶液。
（2）检测结束后，将标记有肿瘤标志物的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料溶于去离子水中，并将其转移到透明玻璃瓶中，采用小磁铁吸引的方式聚集Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米粒子，采用波长为265纳米的紫外灯进行照射，在光催化作用下直至肿瘤标志物降解完全，然后将催化后的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料重复步骤（1）方法链接新的肿瘤标志物，即可实现对肿瘤标志物的直接可循环免疫检测。
TiO2中间壳层具有良好的光催化活性，其机理为在紫外光照下，由于光子的能量大于TiO2禁带宽度，其价带上的电子（e-）吸收光子能量被激发到导带上，同时在价带上留下空穴（h+）。
当TiO2存在表面缺陷或者合适的俘获剂时，电子和空穴的复合得到抑制，就会在TiO2表面发生氧化-还原反应。价带空穴是良好的氧化剂，能够与TiO2表面吸附的H2O分子或反应溶液中溶解的OH-结合形成氧化性很活波的羟基自由基（•OH）。而导带电子是良好的还原剂，通过与TiO2表面吸附的或反应溶液中溶解的O2进行一系列中间反应，最终也可以形成氧化性很活波的羟基自由基（•OH）和超氧离子自由基（•O2-）。羟基自由基（•OH）和超氧离子自由基（•O2-）能够把各种有机物（包括前列腺特异性抗原PSA这种单链糖蛋白）氧化成CO2、H2O等无机小分子，而且因为他们的氧化能力强，能够确保氧化反应一般不停留在中间步骤，不产生中间产物。Ag壳层由大量密布的Ag纳米颗粒组成，当有外界光照时，其表面电子会被激发形成局域表面等离激元共振，当Ag纳米颗粒周围有TiO2存在时，这些激发的电子一部分可以通过电荷传递过程到达TiO2导带之中，导带之中增多的电子会显著促进TiO2对肿瘤标志物的催化降解能力。在催化降解后，通过适当清洗，Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料还能被回收利用，重新与新的待测抗原结合进行检测，实现一种循环免疫检测。同时，通过水热法一步包覆的Ag壳层相比于其他方法如静电吸附法合成的Ag颗粒，在氨基化的TiO2表面吸附更为紧密而均匀。有利于对Ag和TiO2之间的电荷传递过程的促进效果，进而显著增强TiO2的光催化活性，实现肿瘤标志物这类大分子的催化降解。并且，其表面电子在激发光作用下共振引起的局域电磁场可以显著增强肿瘤标志物的特异性拉曼信号。Ag拉曼散射截面较大，增强拉曼散射效率较高，有利于实现肿瘤标志物的高灵敏度高特异性的表面增强拉曼散射基直接免疫检测，避免了间接探测需要引入额外的拉曼分子，操作步骤较繁琐的缺点。总之，Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，既具有磁性分离的功能、催化降解肿瘤标志物的作用、又具有增强肿瘤标志物拉曼信号的作用，是一种新颖的多功能纳米材料。通过设计合成这种新颖的三重核壳结构，特别是在反应过程中通过系统地调节反应条件，控制Fe3O4的直径、TiO2的中间层厚度和Ag壳层的密集度，我们能够综合利用上述三种材料各自的优势，实现肿瘤标志物的高灵敏度高特异性直接可循环免疫检测。
附图说明
图3为本发明实施例1中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料的扫描电子显微镜照片；
图4为采用静电吸附法将Ag颗粒包于本实施例1制备的Fe3O4/TiO2核壳纳米材料外表面形成的Fe3O4/TiO2/Ag三重核壳纳米材料的扫描电子显微镜照片；
图5为分别采用本发明实施例1中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料和静电吸附法制备的Fe3O4/TiO2/Ag三重核壳纳米材料对小分子4-巯基苯甲酸（0.01毫摩尔每毫升）进行催化的结果；
图6为本发明实施例1中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA（10微克每毫升）的进行免疫检测并催化的结果；
图7为采用静电吸附法制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA（10微克每毫升）的进行免疫检测并催化的结果；
图8为本发明实施例1中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA的直接可循环免疫检测结果；
图9为本发明实施例1中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA的直接可循环免疫中拉曼谱中频移为1264 cm-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图；
图10为本发明实施例2中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA的直接可循环免疫中拉曼谱中频移为1264 cm-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图；
图11为本发明实施例3中制备的Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料对前列腺特异性抗原PSA的直接可循环免疫中拉曼谱中频移为1264 cm-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图。
具体实施方式
1、Fe3O4/TiO2/Ag三重核壳纳米材料的制备
（1）将3.5克六水合三氯化铁、10.8克醋酸钠和3克聚乙二醇溶于120毫升乙二醇中，超声直至完全溶解后，转移到水热反应釜中，于200℃下反应10小时，离心并用乙醇清洗后收集沉淀，即得到Fe3O4纳米颗粒；
（2）称取50毫克步骤（1）得到的Fe3O4纳米颗粒溶于浓度为0.1毫摩尔每毫升盐酸水溶液中超声15分钟，磁性分离并用去离子水清洗三次；再次磁性分离后，将Fe3O4纳米颗粒溶于
120毫升由乙醇和乙腈按体积比3:1混合而成的混合溶液中，超声使其完全溶解后，向其加入500微升氨水，超声5分钟使其混合均匀；然后在搅拌条件下逐滴加入3毫升钛酸四丁酯并反应1.5小时，反应结束后，磁性分离并用乙醇洗涤三次后，即得到Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（3）取81毫克步骤（2）得到的Fe3O4/TiO2纳米颗粒和75.4毫克氟化铵溶于20.45毫升由乙醇和水按体积比13.5：6.95混合而成的混合溶液中，超声使其充分溶解后，将反应溶液放置于室温下持续搅拌1小时，搅拌速度为180-200转每分钟，搅拌完成后，将反应溶液转移至反应釜中，在180℃下反应24小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并用去离子水洗涤3次，即得到结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（4）取81毫克步骤（3）得到的结晶化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于33.4毫升乙醇中，持续搅拌下逐滴加入25微升3-氨丙基三甲氧基硅氧烷，将反应溶液置于80℃下冷凝回流4小时，待其自然冷却至室温后，磁性分离并用乙醇洗涤三次，即得到氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒；
（5）将1克聚乙烯吡咯烷酮（分子量5800克每摩尔）和28毫克步骤（4）得到的氨基化的Fe3O4/TiO2纳米颗粒溶于10毫升去离子水中混合均匀后，在机械搅拌下逐滴加入银氨溶液并转移至水热反应釜中，密封后置于120℃下反应11小时，待反应釜自然冷却至室温后，磁性分离并依次用四氢呋喃、乙醇和去离子水洗涤，即得到Fe3O4/TiO2/Ag核壳纳米材料，并置于去离子水中储存待用，其中银氨溶液制备方法为：取2毫升浓度为0.01-0.08毫克每毫升的硝酸银水溶液，加入过量的氨水直至反应溶液变澄清得到银氨溶液。
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