技术领域
[0001] 本
发明涉及生物靶向抗菌材料技术领域，特别涉及一种生物靶向抗菌DspB 固定酶及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 生物被膜是
微生物为适应环境，提高自身生存
力而形成的特殊膜层结构。而由细菌细胞以及细菌分泌的包裹着细菌的胞外基质组成的生物被膜，可以保护细菌不被宿主免疫系统识别和清除，而抗生素类药物由于生物被膜的阻碍无法
接触到致病菌，也达不到预期的杀菌效果。形成
生物膜几乎是所有细菌的能力。
[0003] DspB酶作为糖苷
水解酶家族20蛋白，其催化降解聚β-(1,6)-N-乙酰
葡萄糖胺(poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine,PNAG)的β-(1,6)糖苷键，而GH20家族其他
蛋白质能水解N-乙酰
氨基葡萄糖残基之间的β-(1,4)糖苷键。生物被膜中的细菌是包被于自身合成的细胞外多糖基质中，而这些基质主要成分是由β-(1,6)糖苷键连接而成的PNAG，因此，可以被DspB降解生物被膜而形成游离状态的细胞，方便
机体免疫系统的识别以及抗生素的渗透与扩散。
[0004] 目前，现有的糖苷水解酶(DspB)普遍存在以下两个问题：一是蛋白酶普遍在较长时间内不能保持持续稳定的活性，二是β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(DspB)制备方法复杂繁琐、周期长、产量低。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明旨在提出一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，以解决现有糖苷水解酶
稳定性和活性较低的问题。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0007] 一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)
磁性纳米材料的制备：将
铁盐与亚铁盐反应，得到具有超
顺磁性的Fe3O4
纳米粒子后，再加入正
硅酸四乙酯反应，生成具有
核壳结构的磁性纳米材料A；
[0009] 2)磁性纳米材料的修饰：对所述磁性纳米材料A进行末端
醛基修饰，或末端聚多巴胺修饰，或末端羧基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B；
[0010] 3)糖苷水解酶的固定：将所述磁性纳米材料B重悬于用
磷酸缓冲盐溶液稀释的糖苷水解酶酶液中，进行迈克尔加成反应，得到生物靶向抗菌DspB固定酶。
[0011] 可选地，所述步骤1)中所述铁盐与所述亚铁盐的摩尔比为(1.5～2.5)∶1。
[0012] 可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端醛基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：
[0013] 向所述磁性纳米材料A中加入硅烷
偶联剂，在80℃下回流冷凝4-8h，进行氨基化修饰反应，待所述氨基化修饰反应结束后，加入戊二醛，于40℃下搅拌 10-24h，进行醛基修饰反应，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B。
[0014] 可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端聚多巴胺修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：
[0015] 在pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，将所述磁性纳米材料A与多巴胺混合后，于25℃水浴下搅拌10-18h，进行聚多巴胺修饰反应，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B。
[0016] 可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端羧基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：
[0017] 向所述磁性纳米材料A中加入硅烷偶联剂，在80℃下回流冷凝4-8h，进行氨基化修饰反应，待所述氨基化修饰反应结束后，加入二甲基亚砜和丁二酸酐，于25℃下搅拌18-24h，进行羧基修饰反应，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B。
[0018] 可选地，所述硅烷偶联剂为N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲
氧基硅烷，或为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
[0019] 可选地，所述步骤3)中所述迈克尔加成反应的反应
温度为25℃，反应时间为1-8h。
[0020] 本发明的第二目的在于提供一种生物靶向抗菌DspB固定酶，该生物靶向抗菌DspB固定酶由上述生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法制得。
[0021] 本发明的第三目的在于提供一种上述生物靶向抗菌DspB固定酶在生物抗菌中的应用，该应用，包括以下步骤：
[0022] 将生物靶向抗菌DspB固定酶加入至已接种菌液，且过夜培养的96孔聚苯乙烯微量滴定板中，其中，生物靶向抗菌DspB固定酶和96孔聚苯乙烯微量滴定板中菌液体积比为0.01～0.5U∶200μL，两者混合后，进行生物被膜水解反应。
[0023] 可选地，所述生物被膜水解反应的反应温度为37℃，反应时间为10-60min。
[0024] 相对于
现有技术，本发明所述的生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法具有以下优势：
[0025] 1、本发明的生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法利用戊二醛，或多巴胺，或丁二酸酐对磁性纳米材料进行末端修饰，然后，通过迈克尔加成反应使DspB 共价固定到末端醛基修饰、末端聚多巴胺修饰和末端羧基修饰的MNPs颗粒表面，使得所制的生物靶向抗菌DspB固定酶具有良好的分散性、稳定性、磁响应性和酶活性，且其具备的磁响应性使其易于富集和分离，或进行定向移动
定位，从而使其可在外加
磁场下使DspB酶在目标局部形成相对较高的浓度，进而大大提高其药效，且保证其具有较高的循环使用效率。
[0026] 2、本发明的制备方法简单，工艺步骤较少，从原料到合成目标产物仅需几个小时。
附图说明
[0027] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性
实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0028] 图1为本发明实施例1的纳米材料B的磁响应照片；
[0029] 图2为本发明实施例2的纳米材料B的磁响应照片；
[0030] 图3为本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B以及中间物质的红外图谱；
[0031] 图4为本发明本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B以及中间物质的XRD图；
[0032] 图5为本发明本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B以及中间物质的Zeta电位图；
[0033] 图6为本发明实施例1的MNPs-DspB固定酶的抗生物被膜肉眼-显微对比图。
具体实施方式
[0034] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0035] 下面将结合附图和实施例来详细说明本发明。
[0036] 实施例1
[0037] 一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，包括以下步骤：
[0038] 1)磁性纳米材料的制备：称取2.33g FeCl3·6H2O和1.9g Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O，共同溶于50ml除氧去离子水中，并于60℃搅拌过程中，快速加入NH3·H2O调节pH至9-
12，密闭反应30min，然后，于80℃下陈化 0.5-2.0h，得到具有
超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，且为了提高所制Fe3O4纳米粒子的纯度，进而提高后期反应效率，将制备的Fe3O4纳米粒子磁分离后洗涤至中性；
[0039] 取200mg Fe3O4纳米粒子悬浮在40mL去离子水和160mL无水
乙醇中，超声分散后加入6mL浓
氨水，于25℃机械搅拌下，将100-1000μL正
硅酸四乙酯(TEOS)缓慢加入，搅拌反应15-24h，得到具有核壳结构的磁性纳米材料A (Fe3O4-SiO2)，该磁性纳米材料A中
二氧化硅包裹着Fe3O4纳米粒子形成核壳结构，且为了提高所制磁性纳米材料A的纯度，进而提高后期反应效率，将制备的磁性纳米材料A先用乙醇洗涤，再用去离子水洗多次；
[0040] 2)磁性纳米材料的修饰：取0.5g磁性纳米材料A溶于40mL无水乙醇中，并超声分散，在机械搅拌下，缓慢加入1mLγ-氨丙基三乙氧基硅烷后，在80℃下回流冷凝4-8h，进行氨基化修饰反应，得到氨基修饰的纳米材料(Fe3O4-SiO2-APTES)；
[0041] 取100mg氨基修饰的纳米材料，于40mL pH为7.0的磷酸缓冲盐溶液(PBS 缓冲液)和10mL 25％的戊二醛混合重悬后，于40℃下搅拌反应10-24h，以使醛基修饰反应充分进行，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B (Fe3O4-SiO2-APTES-GA)，该磁性纳米材料B的末端修饰有醛基，可与糖苷水解酶产生迈克尔加成反应，使DspB共价固定到磁性纳米材料B上，且为了提高所制磁性纳米材料B的纯度，进而提高后期反应效率，将制得的磁性纳米材料B用去离子水洗涤多次；
[0042] 3)糖苷水解酶的固定：取1-20mg磁性纳米材料B，
吸附除水，用1mL pH 为6.0-8.0的PBS缓冲液洗涤多次，并超声分散10min，然后，除去洗涤液，加入2-10mL用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)稀释的糖苷水解酶酶液(DspB溶液)，使磁性纳米材料B重悬于用PBS缓冲液稀释的DspB溶液中，在25℃下摇床孵育4-8h，进行迈克尔加成反应，得到生物靶向抗菌DspB固定酶(MNPs-DspB固定酶)，且为了提高反应物纯度，在迈克尔加成反应后，需除去酶液，并用pH为5.0-6.0的PBS缓冲液洗涤多次。
[0043] 实施例2
[0044] 本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中磁性纳米材料的修饰采用多巴胺进行聚多巴胺修饰。
[0045] 本实施例中磁性纳米材料的修饰，具体包括：
[0046] 将0.121g Tris-base溶于100mL去离子水，利用
盐酸调节pH至8.5，得到Tris-HCl缓冲液；
[0047] 向Tris-HCl缓冲液中加入0.1-1.0g多巴胺，取200mg磁性纳米材料A吸附除上清后，加入到Tris-HCl缓冲液中，超声分散10-30min，于水浴25℃下搅拌反应10-18h，进行聚多巴胺修饰反应，待聚多巴胺修饰反应结束后，磁吸附除水，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，该磁性纳米材料B的末端修饰有聚多巴胺(Fe3O4-SiO2-PDA)，且为了提高所制磁性纳米材料B的纯度，进而提高后期反应效率，将制得的磁性纳米材料B用去离子水洗涤多次。
[0048] 采用本实施例的磁性纳米材料B固定糖苷水解酶的步骤同实施例1。
[0049] 实施例3
[0050] 本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中磁性纳米材料的修饰采用丁二酸酐进行羧基修饰。
[0051] 本实施例中磁性纳米材料的修饰，具体包括：
[0052] 取100mg磁性纳米材料A溶于无水乙醇中，并超声分散，在机械搅拌下，缓慢滴加0.1-10mLγ-氨丙基三乙氧基硅，然后，在80℃下回流冷凝4-8h，进行氨基化修饰反应，得到氨基修饰的纳米材料(Fe3O4-SiO2-APTES)；
[0053] 取100mg氨基修饰的纳米材料，用无水乙醇润洗多次后，每次超声震荡 10-30min，悬浮在适量无水乙醇中；
[0054] 称取2.0-5.0g丁二酸酐，溶于适量的二甲基亚砜(DMSO)中，然后，在剧烈搅拌下，将分散在乙醇中的氨基修饰的纳米材料与溶解在DMSO中的丁二酸酐混合，并于25℃下搅拌反应18-24h，以使羧基修饰反应充分进行，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，该磁性纳米材料B的末端修饰有羧基，且为了提高所制磁性纳米材料B的纯度，进而提高后期反应效率，将制得的磁性纳米材料B先用乙醇洗涤，再用去离子水洗涤。
[0055] 采用本实施例的磁性纳米材料B固定糖苷水解酶，包括：
[0056] 将1-10mg磁性纳米材料B经33mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液(EDC与NHS等量)震荡活化后，即于室温下，将磁性纳米材料B在EDC和NHS混合溶液中摇床孵育1-4h后，加入1-10mL用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)稀释的糖苷水解酶酶液(DspB溶液)，使磁性纳米材料B重悬于用PBS缓冲液稀释的DspB溶液中，于25℃下摇床孵育1-8h，进行迈克尔加成反应，得到生物靶向抗菌DspB 固定酶(MNPs-DspB固定酶)，且为了提高反应物纯度，在迈克尔加成反应后，需除去酶液，并用pH为5.0-6.0的PBS缓冲液洗涤多次。
[0057] 将本发明实施例1-3的生物靶向抗菌DspB固定酶用于生物抗菌，该应用具体包括以下步骤：
[0058] 将生物靶向抗菌DspB固定酶加入已接种菌液，过夜培养的96孔聚苯乙烯微量滴定板中，其中，生物靶向抗菌DspB固定酶和96孔聚苯乙烯微量滴定板中菌液体积为0.01～0.5U∶200μL，两者混合后，于37℃下摇床振动10-60min，进行生物被膜水解反应。
[0059] 以本发明实施例1和实施例2为例，对本发明的生物靶向抗菌DspB固定酶的磁响应效应和分散性进行测试。测试结果分别如图1和图2所示。其中，具体测试方法为：取3mL浓度为10mg/mL的磁性纳米材料B水溶液至玻璃皿中，在玻璃皿外部一侧紧贴放置一
块磁铁。
[0060] 由图1和2可知，本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B分散液在20秒内由浑浊变澄清，说明该
磁珠的磁响应性良好，移去磁铁后再次打散溶液，纳米颗粒再次分散，重力沉降不明显，这表明其在水中的分散性良好且稳定。
[0061] 对本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B进行红外测试，测试结果如图3所示。
[0062] 由图3可知，582.4cm-1处是Fe-O的特征吸收峰，证明磁珠的
内核依旧是Fe3O4，具有磁响应效应；Fe3O4纳米粒子中，472.0cm-1处是Si-O-Si的弯曲振动吸收峰，805.6cm-1和1097.3cm-1处分别是Si-O-Si的对称和不对称伸缩振动吸收峰，953.6cm-1处是Si-OH的弯曲振动吸收峰，说明SiO2已经包裹成功，因为其他磁珠以纳米Fe3O4为内核，所以其具有相同的吸收峰；实施例1 的磁性纳米材料B中，1719.7cm-1处有一悬挂的醛基吸收峰，证明成功在磁-1
珠上面修饰上了醛基；实施例2的磁性纳米材料B中，1617.5cm 处是苯环上C＝C 的伸缩振动吸收峰，证明磁珠上修饰上了聚多巴胺。
[0063] 对本发明实施例1和实施例2的磁性纳米材料B进行XRD测试，测试结果如图4所示，其中，图4中I为Fe3O4纳米粒子，II为磁性纳米材料A，III为氨基修饰的磁性纳米材料，IV为醛基修饰的磁性纳米材料B(实施例1)，V为多巴胺修饰的磁性纳米材料B(实施例2)。
[0064] 由图4可知，在各磁珠样品的XRD谱图中，分别在2θ＝30.7°、36.2°、43.9°、 57.6°和63.4°处出现了对应(220)、(311)、(400)、(440)、(511)晶面的5个特征衍射峰，这些衍射峰与Fe3O4 MNPs的特征峰
位置和相对强度相一致，与
尖晶石结构的Fe3O4标准卡片(PDF#75-0449)能很好的匹配，说明各种修饰基团的引入没有影响Fe3O4-MNPs的
晶体结构，内核仍为Fe3O4-MNPs，同时也说明末端修饰没有降低磁性材料的磁靶向性能。
[0065] 因Zeta电位能够用来表征胶体分散体系的稳定性：纳米颗粒粒径越小，Zeta 电位绝对值越高，纳米粒间相互斥力也越大，不易发生聚集，纳米载药系统就会越稳定，因此，以本发明实施例1和实施例2为例，采用pH为7.0、浓度为 0.01M的KCl作为
溶剂，采用Zeta电位分析仪测定各中间产物表面的Zeta电势，以对本发明的生物靶向抗菌DspB固定酶在水溶液的分散性和稳定性进行测试，结果如表1和图5所示。其中，图5中F为四氧化三铁Zeta电势，F-SiO2为二氧化硅包裹着Fe3O4粒子的磁性纳米材料A，F-NH2为氨基修饰的磁性纳米材料，F-GA为醛基修饰的磁性纳米材料B(实施例1)，F-PDA为多巴胺修饰的磁性纳米材料B(实施例2)。
[0066] 表1
[0067]
[0068] 由表1和图5可知，Fe3O4在水溶液中的等电点在7.0以下，所以在pH＝7.0 时带负电，Zeta电位值为-20.5mV；二氧化硅磁珠表面带有硅羟基，具有负电性，对其进行氨基化修饰后呈正电性，在偶联戊二醛之后由于醛基的作用表面又呈现负电性，聚多巴胺修饰磁珠由于带有酚羟基而呈现负电性，醛基磁珠与多巴胺磁珠的Zeta电位均在-20mV以下，说明其具有良好的稳定性。
[0069] 将本发明的生物靶向抗菌DspB固定酶(MNPs-DspB固定酶)用于生物抗菌材料，以对本发明的生物靶向抗菌DspB固定酶的抗菌性能进行测试。测试结果如图6和表2所示。
[0070] 其具体测试方法为：
[0071] 接种菌液，过夜培养；用LB培养基调节OD600(
石英比色皿，1cm光程)至0.05，记录下稀释倍数，在超净
工作台中稀释菌液(金黄色葡萄球菌和
铜绿假单胞菌用TSB培养基，大肠杆菌用M9培养基)，每孔内加入适量稀释后菌液(96孔板200μL，24孔板1mL)；将板在37℃下静置孵育适当时间(大肠杆菌24h，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌48h)；向每孔中加入不同活性梯度的酶溶液(MNPs-DspB固定酶)100μL，并于37℃、100rpm条件下反应1h，倒去
混合液，经PBS缓冲液洗涤、固定、干燥、0.1％-1％的结晶紫
染色、PBS缓冲液洗涤后，加入95％乙醇或乙酸溶解，通过测595nm的吸光度与未处理的对比，测其生物抗菌效果。
[0072] 因结晶紫溶液溶出的
颜色越浅，生物被膜水解程度越大，被膜所束缚的结晶紫越少，与之相应的
显微镜观察生物被膜的水解程度，因此，由图6可知，包裹细菌群落的生物被膜都有一定程度上的破坏，这说明MNPs-DspB固定酶对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌的生物被膜都有水解能力和抗菌性。
[0073] 由表2可知，利用分光光度计测其在595nm处的吸光度，与完整未被水解的生物被膜相比，DspB固定酶和未处理的DspB酶都有一定的水解能力，但酶活力没有未处理的DspB酶高，这也说明DspB固定酶在获得糍靶向能力的同时酶活力也相应降低，但从数据上看，酶活力降低并不显著，这说明DspB固定酶在很大程度上维持DspB的酶活力，MNPs-DspB固定酶对生物被膜有水解能力，这也说明DspB固定酶有生物抗菌的能力。
[0074] 表2
[0075]
[0076] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
