[0002] 本申请要求2017年2月7日提交的相同标题的美国临时申请序列号62/455,822的优先权，所述申请的整个内容在此引入。
技术领域
[0003] 本
发明涉及13C和/或2H同位素增强的氨溴索(“同位素增强的氨溴索”)及其在
治疗自噬感染中的用途，尤其是
肺的分枝杆菌感染，例如结核病，尤其包括耐药性和多重耐药性结核病，还包括一系列利福平敏感性肺部感染，如由耐甲
氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐
碳青霉烯的鲍曼不动杆菌引起的肺炎，以及吸入性炭疽(由炭疽杆菌引起)。本发明涉及包含同位素增强的氨溴索的药物组合物，该同位素增强的氨溴索单独或与另外的
生物活性剂组合，包括另外的自噬调节剂(促进或抑制自噬的活性剂)，因此可用于对抗自噬介导的
疾病和/或病症)，尤其是在肺中发生的自噬介导的疾病和/或病症，例如，分枝杆菌感染、非分枝杆菌肺感染、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺
纤维化、囊性纤维化、舍格伦病和肺癌(特别是小细胞和非小细胞肺癌)。治疗自噬疾病和/或病症，特别是包括主要发生在患者肺部的自噬疾病或病症的方法是本发明的又一个实施方案。另一个实施方案包括本文另外公开的合成本发明化合物的方法。
[0004] 背景技术和发明概述
[0005] 来自
发明人的未公开数据证明，氨溴索是一种强大的自噬诱导剂。然而，其在人体内的
血浆半衰期仅为3.72小时(1)，这意味着需要每天多次
给药以提供有效浓度。它的主要消除途径是通过葡糖苷酸(2)缀合物的尿排泄，因此预计任何其他因素都不会改变代谢或组织药代动
力学或动力学。
[0006] 经证明，人体微粒体对氨溴索的主要代谢作用是通过cyp3A4介导的氧化使其形成二溴邻氨基苯
甲酸(DBAA)。(3)见图1。因此，氨溴索在治疗自噬介导的疾病和/或病症如结核病(TB)中的任何潜在用途可能会受到许多结核病药物如利福平的cyp3A4诱导性质的极大破坏。或者，与氨溴索一起使用抑制cyp3A4的药物也可能导致大于所需
水平的氨溴索，因为它不再被cyp3A4代谢。因此，不幸的是，氨溴索对cyp3A4的固有敏感性使得其难以在人体中给予以治疗用利福平或其他抗结核药物治疗的例如TB等疾病，或者当给予抑制cyp3A4的化合物时也难以在人体中给予。
[0007] 此外，氨溴索具有肺浓集作用，可增强其对肺结核等肺部疾病的作用。很少会认为肺组织表达显著的cyp3A4，更通常的理解是在肝脏中表达，而且cyp3A4在人肺部中的以下位点中发现，包括支气管腺体、细支气管柱和末端上皮、II型肺泡上皮和肺泡巨噬细胞(4)。因此，即使氨溴索以吸入形式给药，它也会固有且出乎意料地被肺组织cyp3A4代谢成无活性形式，这限制氨溴索的肺暴露水平。
发明内容
[0008] 在一个实施方案中，发明人公开了氨溴索的同位素增强形式(同位素增强的氨溴索1至4-参见
附图1)，其抵抗cyp3A4代谢。该系列化合物可以更好地利用氨溴索，特别是口服或吸入，并且内在地可抵抗由于cyp3A4的存在、诱导或抑制而引起的血浆或肺组织水平的意外改变。
[0009] 根据本发明，提供以下氨溴索的13C和/或2H同位素物。因此，第一实施方案涉及根据以下化学式的同位素标记的化合物:
[0010]
[0011] 或其药学上可接受的盐、立体异构体(包括非对映异构体和/或对映异构体)、
溶剂合物或多晶型物。
[0012] 在另一实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含有效量的至少一种如上所述的同位素标记的氨溴索化合物，以及包含药学上可接受的添加剂、载体和/或赋形剂。上述药物组合物可任选地组合至少一种其它生物活性剂，优选抗癌剂(优选有效治疗肺癌的抗癌剂，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌，如
顺铂、卡铂、紫杉醇(泰素)、
白蛋白-结合的紫杉醇(nab-紫杉醇，Abraxane)、多西紫杉醇(泰索帝)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(诺维本)、伊立替康(Camptosar)、依托泊苷(VP-16)、长春
碱、培美曲塞(Alimta)及其混合物)，或用于治疗分枝杆菌感染，尤其包括结核病感染或其它自噬介导的疾病的药物。在一些实施方案中，所述其它生物活性剂为抗结核病药物，如乙胺丁醇、异烟肼、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平(rifampacin)或其混合物。在其它实施方案中，所述其它生物活性剂为本文另外所述的自噬调节剂。在其它实施方案中，所述其它生物活性剂可包括本文所述的抗结核病药物和/或另外的自噬调节剂。在其它实施方案中，该生物活性剂为或包括利福平(rifampin)，并且其它利福霉素衍生物如利福布汀(rifabutin)、利福昔明(rifamixin)和利福喷汀(rifapentine)为用于非结核性分枝杆菌肺(NTM)感染如
鸟分枝杆菌
复合体(MAC)感染和堪萨斯分枝杆菌感染的
治疗方案中的非常重要的药物。
[0013] 在另一个实施方案中，本发明涉及治疗患者自噬介导的疾病或病症的方法，尤其包括治疗主要
定位于患者肺部的自噬介导的疾病或病症的方法，包括对有需要的患者给予有效量的至少一种同位素标记的氨溴索化合物，最佳地与至少一种另外的生物活性剂组合，该生物活性剂可以包括抗结核药物和/或自噬调节剂。尽管可以使用根据本发明的化合物和任选的药剂治疗任何数量的自噬介导的疾病和/或病症，但在优选的实施方案中，本方法涉及治疗主要存在于患者肺部的疾病。本发明可治疗的肺部的疾病和/或病症包括，例如，分枝杆菌感染(尤其是包括结核病)，但也包括其它感染如结核性和非结核性分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌、鸟型分支杆菌和脓肿分枝杆菌)感染、非分枝杆菌肺感染如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起的肺炎、和吸入性炭疽、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺纤维化、囊性纤维化、舍格伦病和肺癌(小细胞和非小细胞肺癌)。在其它实施方案中，该生物活性剂为利福平和其它利福霉素衍生物如利福布汀、利福昔明和利福喷汀或包括这些药物，它们为用于非结核性分枝杆菌肺(NTM)感染如鸟分枝杆菌复合体(MAC)感染、堪萨斯分枝杆菌感染和脓肿分枝杆菌感染的治疗方案中的非常重要药物。
对于结核病(TB)，标准的“短期”
疗程包括用利福平治疗6个月。在NTM治疗中，甚至需要更长的治疗疗程。对于MAC，仅在痰培养阴性(SCN)12个月后建议停止药物治疗，因此治疗远远超过1年是常见的。对堪萨斯分枝杆菌的推荐治疗也是20个月，其中在达到SCN后进行至少12个月治疗。与大多数细菌性疾病相比，这些是非常长的治疗过程，并且通过本文所述的药剂即利福霉素衍生物如利福平、利福布汀、利福昔明和利福喷汀(优选利福平)的增强作用，可以显著改善它们的治疗并缩短治疗时间。
[0014] 在另一实施方案中，同位素增强的氨溴索可增强利福平和其它利福霉素衍生物如利福布汀、利福昔明和利福喷汀，单独或在其混合物中，用于治疗非分枝杆菌肺感染，如由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌引起的肺炎，和吸入性炭疽，该方法包括向需要其治疗的患者给药有效量的一种或多种上述药剂。
[0015] 在另一实施方案中，本发明涉及改善给药后患者中氨溴索的药代动力学和/或生物利用度的方法，包括向需要的患者给药本文所述的同位素标记的氨溴索化合物。
[0016] 在另一实施方案中，本发明涉及合成同位素标记的氨溴索的方法，该方法包括(如本文图2所示)使所述构型(图2)的4-氨基环己醇与同位素标记的二溴氨基苯甲
醛反应以提供同位素标记的亚胺(图2)，将其进一步还原以提供根据本发明的一种或多种同位素标记的化合物。
[0017] 附图简述
[0018] 图1显示根据本发明的各种同位素标记的氨溴索衍生物。图1所示化合物包括反式-4-[(2-氨基-3,5-二溴苄基)氨基]环己醇(氨溴索)、反式-4-{[(2-氨基-3,5-二溴苄基)2 1
(H1、H1)甲基]氨基]环己醇(同位素增强的氨溴索1)、反式-4-{[(2-氨基-3,5-二溴苄基)(2H2)甲基]氨基]环己醇(同位素增强的氨溴索2)、反式-4-{[(2-氨基-3,5-二溴苄基)(2H2、13C)甲基]氨基]环己醇(同位素增强的氨溴索3)和反式-4-{[(2-氨基-3,5-二溴苄基)(2H1、1H1,13C)甲基]氨基]环己醇(同位素增强的氨溴索4)。同位素氨溴索化合物对Cyp3A4代谢有抗性。该图显示氨溴索和同位素形式1-4以及它们如何抵抗cyp3A4代谢。
[0019] 图2的方案1提供了用于生产根据本发明的同位素标记的氨溴索化合物的合成方案。在该方法中，如所示，使对映异构体富集的1-羟基-4-氨基环己烷与富含同位素的二溴氨基
苯甲醛反应。然后使用同位素标记的还原剂对形成的亚胺进行还原，以提供最终的同位素标记的氨溴索。通过改变在二溴氨基苯甲醛化合物或还原剂中被同位素标记的
原子，可以容易地制备本发明化合物的各种类似物。
[0020] 图3显示了野生型细胞的剂量反应。该图清楚地表明，即使浓度低至6.25μM也对自噬具有阳性效果(t检验相对对照p＝0.025)。数据显示，在0至200μM的氨溴索浓度范围内，较高的氨溴索浓度导致较高的自噬诱导。
[0021] 图4显示了用于产生图3中数据的相同剂量反应测定的结果，但是使用ATG5敲除细胞而不是野生型细胞。该图4中显示的数据证明，即使氨溴索浓度低至6.25μM，自噬也显著增加(t检验相对对照p＝0.0008)。再次观察到明显的剂量反应。
[0022] 图5和6显示了氨溴索对TFEB核转位的诱导以测量氨溴索作为自噬诱导物的活性。两套数据集的S形拟合表明，氨溴索诱导的最大自噬的50％发生在约50μM。在25μM时再次观察显著的增加。与自噬的LC3标记不同，氨溴索的效果总是低于pp242。从所有情况可以明显看出，增加氨溴索水平可增加自噬反应。
[0023] 发明详述
[0024] 应注意，如在本
说明书和所附
权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括多个所限定的物质，除非明确且确定地限于一个物质。因此，例如，提及“化合物”包括两种或更多种不同的化合物。如这里所使用的，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得对所列项目的叙述不排除可以被替换的其他类似项目或可以添加到所列项目中的其他项目。注意，当在说明书中描述范围时，落入该范围内的每个单一整数也包括在该范围内，除非使用该范围的上下文明确地排除该范围内的整数。
[0025] 除非另有说明，本文所用的术语“化合物”或“药剂/药物”是指本文公开的任何具体化合物，尤其包括氨溴索或其衍生物或其它自噬调节剂，并且包括其可用的互变异构体、区域异构体、几何异构体，和在适用的情况下，还可以包括其旋光异构体(例如对映异构体)，以及其药学上可接受的盐。在其上下文中，术语“化合物”通常是指单一化合物，但也可包括其他化合物，例如立体异构体、区域异构体和/或旋光异构体(包括外消旋混合物)以及所公开化合物的特定对映异构体或对映异构体富集的混合物，以及非对映异构体和差向异构体，在适用于上下文的情况下。在上下文中该术语还指化合物的前药形式，其已经过修饰以促进化合物向活性部位的给药和递送。
[0026] 在整个说明书中，术语“患者”或“受试者”在上下文中用于描述动物，通常是
哺乳动物，包括家养的哺乳动物，包括农场动物(狗，猫，
马，
牛，猪，
绵羊，山羊等)，并且优选为人，向其提供了用本发明的方法和组合物进行的治疗，包括
预防性治疗(预防)。为了治疗对于特定动物(例如人类患者)为特定性的那些病症或疾病，术语“患者”是指特定动物，通常是人。
[0027] 除非另有说明，否则本文使用术语“有效”或“药学上有效的”来描述在上下文中用于产生或影响预期结果的化合物或组合物的量，通常在特定治疗的背景下是指在患者或受试者的肺中调节自噬。
[0028] 如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”和“进行治疗”等是指为处于自噬介导的疾病或病症的
风险中或遭受该疾病或病症的患者提供益处的任何行为，除非本文中另外描述。益处可以是治愈疾病或病症，抑制其进展，或改善、减轻或抑制自噬介导的疾病或病症的一种或多种症状。如本文所用，治疗包括预防性治疗和治疗性治疗。
[0029] 如本文所用，术语“自噬介导的疾病或病症”或“自噬介导的肺病”是指由自噬或细胞自我消化的破坏引起并且发生在患者或受试者的肺中的疾病或病症。自噬是牵涉
蛋白质和细胞器降解的细胞途径，并且与人类疾病有很多联系。在许多其他疾病和/或病症中，自噬功能障碍与癌症、神经变性、
微生物感染和衰老相关。尽管自噬作为细胞的保护过程起主要作用，但它也在细胞死亡中起作用。通过自噬介导的疾病和/或病症(其指的是以下事实，即疾病或病症可以自我表现，随待治疗患者或受试者中自噬增加或减少而变化，且治疗需要在患者或受试者中给予自噬的
抑制剂或激动剂)。
[0030] 通过自噬介导的疾病和/或病症(其指的是以下事实，即疾病或病症可以自我表现，随待治疗患者或受试者中自噬增加或减少而变化，且治疗要在患者或受试者中给予自噬的抑制剂或激动剂)包括，例如，癌症、包括癌症转移、溶酶体贮存病(在下文讨论)、神经变性(包括，例如，阿尔茨海默病、
帕金森病、亨廷顿病；其它
共济失调)、免疫应答(T细胞成熟、B细胞和T细胞内稳态、抗衡物损害性
炎症)和慢性炎性疾病(当自噬有
缺陷时可促进过多的细胞因子)，包括，例如，炎性肠病，包括克罗恩病、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化、慢性阻塞性肺疾病/COPD、肺纤维化、囊性纤维化、舍格伦病；高血糖障碍、糖尿病(I和II)，影响脂类代谢胰岛功能和/或结构，过度自噬可导致胰腺β-细胞死亡和相关高血糖障碍，包括严重胰岛素抗性、高胰岛素血症、胰岛素-抗性糖尿病(例如
门登霍尔综合征(Mendenhall Syndrome)、维尔纳综合征(Werner Syndrome)、矮怪病、和脂肪萎缩性糖尿病)和血脂障碍(例如肥胖受试者出现的高脂血症、升高的低
密度脂蛋白(LDL)、降低的高密度脂蛋白(HDL)、和升高的甘油三酯)和代谢综合征、肝疾病(过度自噬去除了细胞实体-内质网)、肾脏疾病(斑
块凋亡、肾小球疾病)、心
血管疾病(尤其包括缺血、中风、压力超负荷和
再灌注期间的并发症)、肌肉退化和萎缩、衰老症状(包括改善或延缓老化相关症状和慢性病的发作或严重程度或
频率，包括肌肉萎缩、虚弱、代谢紊乱、低度炎症、动脉粥样硬化和相关病症，如心脏和神经系统二者的中枢和外周表现，包括中风、年龄-相关的痴呆和散发形式的阿尔茨海默病、癌前状态和精神疾病，包括
抑郁症)，中风和脊髓损伤、动脉硬化、传染病(微生物感染，去除微生物，对微生物产品提供保护性炎症反应，限制微生物对宿主自噬的适应，以增强微生物生长，调节先天免疫)，包括细菌、
真菌、细胞和病毒(包括与传染病相关的继发疾病或病症)，包括AIDS和结核病，等等，发育(包括红细胞分化)，胚胎发生/生育/不育(胚胎植入和终止经胎盘供应营养素后的新生儿存活，在程序性细胞死亡期间去除死细胞)和老化(自噬增加导致受损的细胞器或聚集的大分子的去除，以增强健康和延长生命，但儿童/年轻成人自噬水平的增加可能导致肌肉和器官的萎缩，导致衰老/早衰)。
[0031] 术语“溶酶体贮积症”是指由溶酶体贮积缺陷引起的疾病或病症。当溶酶体发生故障时，通常会发生这些疾病或病症。溶酶体贮积症是由溶酶体功能障碍引起的，通常是由于脂质、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单一酶缺乏所致。溶酶体贮积症(统称)的发生率为约1:5,000-1:10,000。溶酶体通常被称为细胞的回收中心，因为它将不需要的物质加工成细胞可以利用的物质。溶酶体通过高度特异化的酶分解这种不需要的物质。当特定酶以过少的量存在或完全缺失时，通常会触发溶酶体病症。当发生这种情况时，物质会在细胞中积聚。
换句话说，当溶酶体不能正常发挥作用时，应该由其分解和再循环的过量产物储存在细胞中。溶酶体贮积症是遗传性疾病，但这些可以使用如本文所述的自噬调节剂(autostatin)治疗。所有这些疾病都具有共同的生化特征，即所有溶酶体病症都源自溶酶体内物质的异常积累。溶酶体贮积病主要影响在生命早期经常由于这些原因而死亡的儿童，许多在出生后几个月或几年内死亡。许多其他儿童在患有特定疾病的各种症状多年后死于这种疾病。
[0032] 溶酶体贮积病的实例包括，例如，活化剂缺乏/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷过多症、天冬氨酰
葡萄糖胺尿症、胆固醇酯贮存病、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(I型，II型和III型)、GM！神经节苷脂贮积病，包括婴儿、幼儿/青少年和成人/慢性)、亨特综合征(MPS II)、I细胞疾病/粘脂质累积症II、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉伯病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、胡尔勒综合征(HurlerSyndrome)、席耶什综合征(Scheie Syndrome)、胡-席综合征(Hurler-Scheie Syndrome)、圣菲力浦综合征(Sanfilippo Syndrome)、莫尔丘病(Morquio)A型和B型、马-拉病(Maroteaux-Lamy)、斯莱综合征(Sly Syndrome)、粘脂糖症、多
硫酸盐缺乏症、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)、神经元蜡样脂质沉积症、CLN6病、詹-比二世病(Jansky-Bielschowsky disease)、庞佩病(Pompe disease)、致密性成骨不全症、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、欣德勒病(Schindler disease)、泰-萨病(Tay-Sachs)和沃尔曼氏病(Wolman disease)等。
[0033] 在优选方面，同位素标记的氨溴索通常用于治疗自噬-介导的肺疾病，如分枝杆菌感染，包括非结核病和结核病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺纤维化、囊性纤维化、舍格伦病和肺癌(小细胞和非小细胞肺癌)。同位素增强的氨溴索也可增强利福平和其它利福霉素衍生物如利福布汀、利福昔明和利福喷汀，单独或在其混合物中，用于治疗非分枝杆菌肺感染，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌引起的肺炎，和吸入性炭疽。
[0034] 另外的自噬调节剂(其可与同位素标记的氨溴索共同给药)还包括阿司咪唑、大黄酚、依米丁、氯水杨苯胺、奥昔康唑、西布曲明、普罗地芬、
酒石酸二氢麦
角胺、特非那定、三氟丙嗪、胺碘
酮、皂苷、长春碱、丹宁酸、芬替克洛、苹果酸苯噻啶、哌西他嗪、羟苄利明、格列本脲、羟基氯喹、左美丙嗪、美帕曲星、硫戊巴比妥钠、三氯卡班、地芬尼多、水黄皮素、二乙酸丁香三环烷二醇酯、橙花叔醇、氟西汀、土木香脑、去氢枞酸酰胺(dehydroabietamide)、邻苯二甲酸二丁酯、18-氨基松香-8,11,13-三烯
硫酸盐、乙酸鬼臼
树脂、小檗胺、
鱼藤酮、冬凌草甲素A、桑色素、吡咯霉素、橙桑黄酮、栀子色素A、α-倒捻子素、Avocadene、丁基羟基
甲苯、大黄素甲醚、粉防己碱、马拉硫磷、异甘草素、氯福克酚、异利血平、4,4’-二甲氧基黄檀醌和4-甲基瑞香素、及其混合物。可与氨溴索共同给药的其它药剂，包括苄索氯铵、氯硝柳胺、莫能菌素、溴哌利多、左布诺洛尔、去氢异雄甾酮3-乙酸盐、氟苯达唑、舍曲林、他莫昔芬、利舍平、六氯酚、双嘧达莫、哈马林、哌唑嗪、利多氟嗪、硫乙拉嗪、右美沙芬、地昔帕明、甲苯达唑、坎利酮、氯普噻吨、马普替林、高氯环嗪、洛哌丁胺、尼卡地平、右芬氟拉明、尼伐地平、度硫平、比哌立登、地那铵、依托咪酯、托瑞米芬、托莫西汀、氯吉兰、佐替平、β-七叶素、曲地铵、头孢他啶、甲氧基-6-哈梅蓝、美仑孕酮、阿苯达唑、金刚乙胺、氯丙嗪、培高利特、氯哌斯汀、泼尼卡酯、氟哌啶醇、克霉唑、呋喃西林、碘番酸、
萘哌地尔、甲巯咪唑、阿利马嗪、乙氧喹、氯可托龙、多西环素、甲磺酸吡吲哚、多沙唑嗪、地普托品、诺考达唑、东莨菪碱、羟苯甲酮、氯氟舒松、奥昔布宁、咪康唑、氯米帕明、赛庚啶、多塞平、达克罗宁、沙丁胺醇、黄酮哌酯、阿莫沙平、非诺贝特、匹美噻吨或其药学上可接受的盐、可替代的盐及其混合物。这些药剂中的一种或多种可以配制成吸入/肺部剂型，但通常这些药剂通过其他给药途径(即口服，肠胃外等)与氨溴索简单地共同给药。
[0035] 其它可与氨溴索共同给药的药剂包括抗结核病药物，例如乙胺丁醇、异烟肼、乙硫异烟胺、丙酰胺、吡嗪酰胺、利福平、氨基水杨酸、贝达喹啉、利福布汀、利福喷汀、卷曲霉素、环丝氨酸及其混合物。优选使用乙胺丁醇、异烟肼、乙硫异烟胺、丙酰胺、吡嗪酰胺、利福平及其混合物。
[0036] 术语“共同给药”或“组合疗法”用于描述这样的疗法，其中至少两种有效量的活性化合物用于治疗本文中另外描述的自噬介导的疾病或病症，同时或者在本文中进一步定义或本领域普通技术人员可确定的给药或施用方案中。两种化合物可以在同一组合物中给药。尽管术语“共同给药”优选包括同时给患者施用两种活性化合物，但是不必将化合物同时给予患者，并且有效量的个体化合物将同时存在于患者体内。另外，在某些实施方案中，共同给药是指两种化合物在显著不同的时间施用的事实，但两种化合物的作用同时存在。因此，术语“共同给药”包括其中氨溴索与至少一种其它活性剂(包括另一种自噬调节剂)在大约同一时间(同时)施用，或在施用其他生物活性剂之前或之后大约一至几分钟至大约24小时或更长时间施用。其它生物活性剂可以是任何生物活性剂，但通常是另外的自噬介导的化合物，其用于增强同位素标记的氨溴索或其衍生物之一的活性。
[0037] 本发明包括含有药学上可接受的盐的组合物。即，本发明化合物的酸或碱加成盐或其衍生物。可用于制备上述用于本发明的碱化合物的药学上可接受的
酸加成盐的酸是那些形成无毒酸加成盐的酸，即含有药理学上可接受的阴离子的盐，例如
盐酸盐、
氢溴酸盐、
氢碘酸盐、
硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、
磷酸盐、酸式磷酸盐、乙酸盐、乳酸盐、
柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、
琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、
葡萄糖酸盐、
蔗糖酸盐、苯
甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、
对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即，1,1'-亚甲基-二-(2-羟基-3萘甲酸盐)]盐等。
[0038] 药学上可接受的碱加成盐也可用于制备本发明化合物的药学上可接受的盐形式。可用作
试剂制备本发明化合物(其性质为酸性)的药学上可接受的碱盐的化学碱是那些与这些化合物形成无毒碱盐的化学碱。这种无毒碱盐包括但不限于衍生自这些药理学上可接受的阳离子的那些，例如碱金属阳离子(例如
钾和钠)和碱土金属阳离子(例如，
钙和镁)、铵或
水溶性胺加成盐如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)，和低级链烷醇铵和其它药学上可接受的有机胺的碱盐等。
[0039] 如本文所述，除了至少一种同位素标记的氨溴索和任选的生物活性剂(包括自噬调节剂)，药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、添加剂或惰性载体。药学上可接受的赋形剂、添加剂或惰性载体可为选自以下的形式：固体、半固体和液体。药学上可接受的赋形剂或添加剂可选自
淀粉、结晶
纤维素、羟乙酸淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone)、聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrolidone)、乙酸钠、
硬脂酸镁、月桂基硫酸钠、蔗糖、明胶、
硅酸、聚乙二醇、水、醇、丙二醇、
植物油、玉米油、
花生油、
橄榄油、
表面活性剂、
润滑剂、崩解剂、
防腐剂、增味剂、颜料、和其它常规添加剂。药物组合物可通过将活性剂与药学上可接受的赋形剂或添加剂混合而配制。
[0040] 药物组合物可为选自以下的形式：无菌等渗水溶液、丸剂、滴剂、糊剂、霜剂、喷雾剂(包括气雾剂)、胶囊剂、片剂、糖衣片剂、颗粒剂、栓剂、液体、洗剂、悬浮液、乳剂、
软膏、凝胶等。给药途径可选自皮下、静脉内、肠、肠胃外、口服、含服、鼻腔、肌肉内、经皮、透皮、鼻内、气管内、肺内、腹膜内和局部。药物组合物可以是立即释放、持续/控制释放，或立即释放和持续/控制释放的组合，这取决于待递送的化合物，待共同施用的化合物(如果有的话)，以及用药物组合物治疗的疾病和/或病症。药物组合物可以配制成具有不同的隔室或层，以促进与良好药学实践一致的任何类型的有效施用。口服和吸入剂型是优选的，尤其用于治疗主要位于患者肺部的疾病和/或病症。
[0041] 受试者或患者可选自例如人、哺乳动物如家养动物或其他动物。如本文所述，受试者可患有与自噬相关的一种或多种疾病、病症或症状。
[0042] 根据本发明的化合物可以以有效量施用以治疗或降低自噬介导的疾病和/或病症的可能性以及与所述疾病或病症相关的一种或多种症状。本领域普通技术人员通过考虑若干变量可以容易地确定活性成分的有效量，所述变量包括但不限于动物受试者，患者的年龄、性别、体重、疾病或病症的部位、既往病史、其他药物等。
[0043] 例如，可用于治疗人类患者的自噬介导的疾病、病症和/或症状的活性成分的剂量是有效量并且范围可以从低至每天50-100μg或者甚至更低至至少约500mg或更多(高达几克或更多)，其可以以与药物的递送和待治疗的疾病或病症一致的方式施用。在口服给药的情况下，活性剂通常每天给药一至四次或更多次。
透皮贴剂或其他局部给药可以连续给药，一天一次或多次或少于每天一次的频率，这取决于活性物质的吸收和向患者
皮肤的递送。当然，在
肠胃外给药为有利的治疗选择的某些情况下，可以使用肌肉内给药或缓慢静脉滴注来给予活性剂。施用于人类患者的活性成分的量的优选范围为约0.05mg/kg至约25mg/kg，约0.1mg/kg至约10mg/kg，约0.25mg/kg至约7.5mg/kg.，约1.25至约5.7mg/kg。
[0044] 根据本发明的化合物的剂量可以在自噬介导的疾病、病症或症状出现最初迹象时施用。例如，可以施用剂量用于肺功能或心脏功能和/或治疗或降低在炎症相关代谢紊乱或结核病或疾病或病症(包括
疼痛，
高血压，肾衰竭或肺衰竭)期间变得明显的任何一种或多种疾病或病症的可能性。活性成分的剂量可以在诊断之前在相关症状出现最初迹象时施用，但是预料到了疾病或病症或预料到了降低的身体功能或任何一种或多种与自噬介导的疾病或病症相关的其他症状或继发性疾病或病症。
[0045] 在本发明的优选方面，通常通过口服给予患者或受试者同位素标记的氨溴索，或者甚至更经常地通过肺部给药(包括气管内给药)向患者或受试者的肺部施用同位素标记的氨溴索。用于肺部给药的本发明药物组合物通常用作吸入剂。该组合物可以形成干粉吸入剂，吸入性悬浮液，吸入性溶液，胶囊化吸入剂和如下文所述的已知形式的类似吸入剂。这种形式的吸入剂可以通过在使用前将本发明的药物组合物填充到合适的吸入器如计量吸入器、
干粉吸入器、
雾化器瓶、雾化器等中来制备。在上述形式的吸入剂中，粉末吸入剂是优选的，但也可以有效地使用雾化悬浮液和计量吸入器。
[0046] 当本发明的药物组合物以粉末形式使用时，粉末的平均粒径没有特别限制，但考虑到颗粒在肺中的停留，因此优选颗粒落在以下范围内：约0.01至20μm，通常为0.05至约5μm(靶向巨噬细胞和肺上皮细胞)，通常为约0.05至约0.25μm(靶向肺上皮细胞)，通常为约1至3μm(靶向肺巨噬细胞)并且特别是为约1至5μm，更通常为约1至2μm(微米)。尽管对本发明的粉末药物组合物的粒度分布没有特别限制，但优选的是，约25μm或更大尺寸的颗粒占所述颗粒的不超过约5％，且优选占1％或更少，以使进入受试者肺部的递送最大化。
[0047] 本发明粉末形式的药物组合物可以通过例如使用本领域熟知的干燥-微粉化方法、
喷雾干燥方法和标准药学方法来生产。
[0048] 作为实例而非限制，根据干燥-
粉碎方法，粉末形式的药物组合物可以通过干燥含有所述化合物或其与其它活性剂的混合物和赋形剂的水溶液(或水性分散体)来制备，该赋形剂提供在肺组织中的立即释放和将干燥的产品微粒化。更具体地说，在将药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂溶解(或分散)在水性介质中之后，加入并溶解(或分散)有效量的根据本发明的化合物，通过使用均化器等搅拌得到水溶液(或水分散体)。水性介质可以是单独的水或水和低级醇的混合物。可用的低级醇的实例包括甲醇、
乙醇、1-丙醇、2-丙醇和类似的水可混溶性醇。乙醇是特别优选的。在通过鼓风机、冻干等干燥所获得的水溶液(或水分散体)之后，使用喷射磨机、
球磨机或类似装置将所得产物粉碎或微粒
化成细颗粒，得到具有上述平均粒径的粉末。如果需要，可以在任何上述步骤中加入如上所述的添加剂。
[0049] 根据喷雾干燥方法，本发明粉末形式的药物组合物可以通过例如喷雾干燥水溶液(或水分散体)来制备，该水溶液(或水分散体)含有氨溴索和/或一种或多种氨溴索衍生物和任选一种或多种另外的药剂，例如本文所述的另外的自噬调节剂，和/或一种或多种抗结核药物，和用于微粒化的赋形剂、添加剂和/或载体。可以按照上述干燥-微粉化方法的操作制备水溶液(或水分散体)。喷雾干燥过程可以使用已知方法进行，从而得到具有上述平均粒径的球状颗粒形式的粉末状药物组合物。
[0050] 吸入性悬浮液、吸入性溶液、包封的吸入剂等也可以通过以下制备，使用通过干燥-微粉化方法、喷雾干燥方法等制备的粉末形式的药物组合物，或通过使用可以通过肺给药的载体、添加剂或赋形剂和异烟肼、脲或其混合物根据已知的制备方法制备。
[0051] 此外，包含本发明药物组合物的吸入剂优选用作
气溶胶。例如，可以通过将本发明的药物组合物和推进剂填充到气溶胶容器中来制备气溶胶。如果需要，可以加入分散剂、溶剂等。气溶胶可以被制备成两相系统、三相系统和隔膜系统(双容器)。气溶胶可以以粉末、悬浮液、溶液等中的任一种形式使用。
[0052] 可用推进剂的实例包括
液化气推进剂、压缩气体等。可用的液化气推进剂包括，例如，氟化
烃(例如，CFC替代物，例如HCFC-22，HCFC-123，HFC-134a，HFC-227等)，液化石油，二甲醚等。可用的压缩气体包括，例如，可溶性气体(例如二氧化碳，一氧化氮)，不溶性气体(例如氮气)等。
[0053] 分散剂和溶剂可以适当地选自上述添加剂。气溶胶可以通过例如已知的两步法制备，包括制备本发明组合物的步骤和将组合物和推进剂填充和密封到气溶胶容器中的步骤。
[0054] 作为本发明的气溶胶的优选实施方案，可提及以下气溶胶：所用化合物的实例包括单独的同位素标记的化合物或其与本发明的其他化合物或其他抗分枝杆菌药物的混合物。作为推进剂，优选氟化烃如HFC-134a，HFC-227和类似的CFC替代物。可用溶剂的实例包括水、乙醇、2-丙醇等。水和乙醇是特别优选的。特别地，可以使用水与乙醇的重量比在约0:1至10:1的范围内。
[0055] 本发明的气溶胶含有赋形剂，其量的范围为约0.01至约104wt.％(优选约0.1至103wt.％)，推进剂的量为约102至107wt.％(优选约103至106wt.％)，溶剂的量为约0至
106wt.％(优选约10至105wt.％)，分散剂的量为0至103wt.％(优选约0.01至102wt.％)，相对于包含在最终组合物中的本发明化合物的重量。
[0056] 本发明的药物组合物安全有效地用于本发明的治疗方法中。尽管本发明组合物的剂量可以根据以下而改变：所施用的活性物质的类型(例如同位素标记的氨溴索和任选的另外的自噬调节剂和/或抗结核剂如乙胺丁醇、异烟肼、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平、它们的混合物和任选的另外的抗结核病药物)以及待诊断受试者的个性(体型、体重等)，但该组合物以有效治疗任何一种或多种通过自噬介导的肺病的量施用。例如，优选给予所述组合物，使得活性成分(同位素标记的氨溴索和任选的药剂)可以按以下剂量给予成人：至少约0.5-10mg，约1mg至约15mg.，约5mg至约20mg.，至少约25mg，至少约50mg，至少约60mg，至少约75mg.，至少约100mg，至少约150mg，至少约200mg，至少约250mg，至少约300mg，至少约350mg，至少约400mg，至少约500mg，至少约750mg，至少约1000mg，并且每天分一个或多个剂量(高达四次或更多次)给予。
[0057] 本发明的药物组合物的形式如粉末、溶液、悬浮液等可根据待施用的物质的类型适当选择。
[0058] 作为给药途径，使用吸入器通过口直接吸入通常将药物施用于气道，特别是直接给予至肺组织，其中含有的活性物质立即产生效果。此外，该组合物被配制成即刻释放产品、
控释产品或即刻释放产品与控释产品的组合，以便治疗可以立即开始并持续一段时间以保持活性部位具有有效的活性剂浓度。
[0059] 以下内容代表了本发明的优选实施方案:
[0060] 用于吸入的氨溴索颗粒
[0061] 两种主要策略基于粒径
[0062] a)靶向巨噬细胞：在肺部感染的情况下，将氨溴索递送至巨噬细胞是最佳的(例如对于TB)，1-2微米范围内的最小尺寸的氨溴索颗粒是最适合的，因为这可优化吞噬过程。这些1-2微米的颗粒可以进一步用稳定用涂层或用增强巨噬细胞的吞噬作用或募集的涂层涂覆。
[0063] 这些1-2微米的颗粒可以通过雾化或MDI原样递送，或者在用于吸入的干粉的情况下，可以通
过喷雾干燥掺入到其他赋形剂颗粒如亮氨酸颗粒中。
[0064] b)靶向肺上皮细胞：为了治疗肺上皮细胞，可能需要更小的氨溴索颗粒，因为这些细胞的主要摄取途径是内吞作用而不是巨噬细胞的吞噬作用。因此，0.05至0.2微米范围内的氨溴索颗粒是最合适的，但是这些对于肺部递送本身而言太小，因此将其掺入到雾化的水性气溶胶中或掺入到MMAD2-5微米的喷雾干燥的工程化颗粒中。
实施例[0065] 根据本发明化合物的合成根据本文图2中呈现的化学方案进行。实质上，具有所示构型(图2)的1-羟基-4-氨基环己烷与二溴化-氨基-苯甲醛化合物反应，该二溴化-氨基-苯甲醛化合物如图2所示被同位素标记。醛部分上的一个或两个碳和氢取代基可被同位素标记，取决于最终同位素标记的氨溴索中所需的同位素取代。实质上，同位素标记的二溴化-氨基-苯甲醛化合物与1-羟基-4-氨基环己烷缩合，产生同位素标记的亚胺化合物，随后进行亚胺还原(用任选同位素标记的还原剂)，产生同位素标记的氨溴索化合物。
[0066] 剂量反应测试
[0067] 进行氨溴索剂量反应测定，产生的数据显示在附图3-6中。简而言之，首先研究来自野生型和ATG5敲除的骨髓衍生的巨噬细胞，使用已知的自噬诱导物，即pp242和LC3，通过Cellomics将斑点量化为自噬的标志物，并测定自噬对氨溴索的剂量反应，使用pp242诱导的自噬作为100％。野生型细胞的剂量反应显示在图3中：显然，即使低至6.25μM的浓度也对自噬具有阳性效果(t检验相对于对照p＝0.025)。此外，很明显，在0至200μM的氨溴索浓度范围内，较高的氨溴索浓度导致较高的自噬诱导。
[0068] 发明人接下来研究了上述相同的测定，但是在ATG5敲除细胞中进行。数据显示在图4中。同样，即使浓度低至6.25uM的氨溴索也显著增加自噬(t检验相对于对照p＝0.0008)。再次观察到明显的剂量反应。值得注意的是，对氨溴索的反应达到了远高于pp242的水平。对此的一种解释是，氨溴索诱导的自噬增加所针对的靶标与已知的诱导物pp242的靶标不同。
[0069] 本发明人接着研究了如上所述的氨溴索诱导的TFEB核转位。来自2个独立实验的结果分别显示在图5和6中。
[0070] 两套数据集的S形拟合表明，氨溴索诱导的最大自噬的50％发生在约50μM。在25μM时也观察到显著的增加。与自噬的LC3标记不同，氨溴索的效果总是低于pp242。
[0071] 从所进行的测定中可以清楚看出，在所有情况下，增加氨溴索水平可增加自噬反应。
[0072] 参考文献
[0073] 1.Vergin H,Bishop-Freudling G,Miczka M,Nitsche V,Strobel K,Matzkies F.1984.[The pharmacokinetics and bioequivalence of various dosage forms of ambroxol].Arzneimittel-Forschung 35:1591-1595。
[0074] 2.関隆,松村理一郎,公平宏.1977.A Clinico-Pharmacological Study on trans-4-(2-Amino-3,5dibrornobenzylamino)cyclohexanol hydrochloride.臨床薬理8:25-31。
[0075] 3.Ishiguro N,Senda C,Kishimoto W,Sakai K,Funae Y,Igarashi T.2000.Identification of CYP3A4 as the predominant isoform responsible for the metabolism of ambroxol in human liver microsomes.Xenobiotica 30:71-80。
[0076] 4.Anttila S,Hukkanen J,Hakkola J,Stjernvall T,Beaune P,Edwards RJ,Boobis AR,Pelkonen O,Raunio H.1997.Expression and localization of CYP3A4 and CYP3A5 in human lung.American journal of respiratory cell and molecular biology 16:242-249。
