技术领域
[0001] 本
发明属于新型功能
纳米材料、免疫分析和光电化学传感器领域，提供了一种基于多级纳米氧化锌微球复合材料的光电化学β-
淀粉样蛋白传感器的制备方法及应用。
背景技术
[0002] 阿兹海默症AD是一种常见的中枢神经系统退行性
疾病，会给老年人
生活质量、医疗保健和社会保障带来严峻的挑战。老年斑是AD的一个主要的病理特征，其主要由具有神经毒性和血管毒性的β-淀粉样蛋白Aβ聚集形成。Aβ在AD形成和发展
进程中起至关重要的作用。在正常情况下，细胞产生的Aβ几乎不表现出神经毒性，在异常或病理状态下，Aβ可以形成具有神经毒性的
纤维状聚集物，引发Tau蛋白异常磷
酸化、突触丢失、
炎症反应等一系列变化，最终导致AD的发生。因此，对Aβ的早期诊断非常重要。
[0003] 目前检测Aβ的方法有固态
核磁共振检测法、
蛋白质免疫印迹法等，但这些方法具有灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐的缺点，为了克服这些缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，选择性好，操作快速简便的光电化学免疫分析方法，此方法具有时时在线检测，仪器操作便捷，特异性高，检测范围宽等优点，在小分子与蛋白质检测领域应用前景广阔。
[0004] 本发明成功构建了在可见
光激发下检测Aβ的光电化学传感器。该光电化学传感器以ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS为基底材料，其具有优良的
导电性。
氨基化聚苯乙烯微球负载硫化
铜纳米粒子PS@CuS作为二抗标记物，抑制了光生
电子的转移，极大地降低光
电流信号。该光电化学传感器具有低成本、高灵敏、特异性好、检测快速、制备过程简单等优点，在可见光区域实现了实现对Aβ的超灵敏检测，有效克服了传统Aβ检测方法的不足。
发明内容
[0005] 本发明的目的之一是通过
水热合成法合成多级纳米氧化锌微球。
[0006] 本发明的目的之二是将合成的多级纳米氧化锌微球用三联吡啶钌敏化，通过原位生长法修饰铈掺杂硫化镉纳米微粒，从而制备出ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS复合材料。
[0007] 本发明的目的之三是成功合成氨基化聚苯乙烯微球负载硫化铜纳米粒子PS@CuS，以此作为二抗标记物，构建夹心型光电化学传感器。
[0008] 本发明的目的之四是提供了一种ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS复合材料为
基础的光电化学传感器的制备方法及应用，实现了对β-淀粉样蛋白的超灵敏检测。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 1. 一种基于多级纳米氧化锌微球复合材料的光电化学β-淀粉样蛋白传感器的制备方法，所述的多级纳米氧化锌微球复合材料为三联吡啶钌Ru(bpy)32+和铈掺杂硫化镉Ce-CdS共敏化的多级纳米氧化锌微球ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS，所述的光电化学β-淀粉样蛋白2+
传感器由ITO工作
电极、ZnO/Ru(bpy)3 /Ce-CdS、β-淀粉样蛋白
抗体、
牛血清
白蛋白、β-淀粉样蛋白
抗原以及氨基化聚苯乙烯微球负载硫化铜纳米粒子的二抗孵化物PS@CuS-Ab2组成；
[0011] 其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：
[0012] 一、ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS的制备；
[0013] 二、PS@CuS的制备；
[0014] 三、PS@CuS-Ab2的制备；
[0015] 四、光电化学β-淀粉样蛋白传感器的制备；
[0016] 其中，步骤一制备ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS的具体步骤为：
[0017] （1）将2 4 mmol七水合
硫酸锌、8 15 mmol尿素以及0.4 0.8 mmol
柠檬酸三~ ~ ~钠溶于40 80 mL去离子水中，磁
力搅拌30 40 min，形成均一的中性溶液，将
混合液置~ ~
于100 mL聚四氟乙烯高压反应釜中120℃反应6 h，将沉淀物离心洗涤，置于
真空干燥箱干燥10 12 h，将所得的固体置于
马弗炉中300℃下
煅烧2 h，最终制得多级纳米氧化锌微~
球，将其置于超纯水中，制得ZnO悬浮液；
[0018] （2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用洗洁精、丙
酮、
乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的ZnO悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/ZnO电极；
[0019] （3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 6 µL、浓度为0.03 mol/L的Ru(bpy)32+~溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 6 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应20 ~
~ 40 min，超纯水冲洗，继而修饰4 ~ 6 µL、0.005 mol/L的Ce(NO3)3，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，最后修饰4 ~ 6 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应20 ~ 40 min，超纯水冲洗，制得ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极；
[0020] 其中，步骤二制备二抗标记物PS@CuS的具体步骤为：
[0021] 将50 60 mg氯化铜与70 90 mg柠檬酸三钠溶于320 400 mL超纯水中，加入~ ~ ~0.9 ~ 1.2 mL、4 mg/mL Na2S，磁力搅拌5 ~ 10 min，将混合液加热至90℃，再连续搅拌15
30 min，将制得的CuS
量子点置于4℃
冰箱保存；取100 200 μL的氨基化聚苯乙烯微球~ ~
PS分散至50 100 mL制得的CuS量子点溶液中，所得的混合液置于120℃下加热15 30 ~ ~
min，再离心洗涤，将沉淀物分散于超纯水中，由此制得PS@CuS悬浊液；
[0022] 其中，步骤三制备PS@CuS-Ab2的具体步骤为：
[0023] 取100 200 µL步骤二制备的PS@CuS悬浊液分散至0.5 1 mL新配置的1-乙基-~ ~3-(3-二甲基氨丙基)-
碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，即EDC/NHS溶液中，然后在室温下振荡30 ~ 40 min，再加入1 ~ 2 mL、1 µg/mL的二抗Ab2溶液，在4℃下恒温振荡孵化10 ~ 12 h，然后加入0.5 1 mL、0.1%的BSA溶液，经过1 1.5 h室温振荡孵化后离心去掉上清液，~ ~
将所得的沉淀物分散于1 ~ 2 mL去离子水中，制得PS@CuS-Ab2，将其置于4℃冰箱中冷藏；
[0024] 所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1×10-2 -3mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2×10 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺；
[0025] 其中，步骤四制备光电化学β-淀粉样蛋白传感器的具体步骤为：
[0026] （a）在步骤一中得到的ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极表面修饰4 ~ 6 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸反应30 40 min，干燥后用超纯水冲洗，继续滴加4 6 μL的EDC/NHS，~ ~反应20 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
~
[0027] （b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 6 µL、1 µg/mL的β-淀粉样蛋白抗体，反~应20 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
~
[0028] （c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 6 µL、1 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极~表面上非特异性活性位点，反应20 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
~
[0029] （d）利用抗原抗体的特异性结合，在步骤（c）中得到的电极表面修饰4 6 µL不同~浓度的β-淀粉样蛋白抗原，反应20 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
~
[0030] （e）在步骤（d）中所得的电极表面修饰4 ~ 6 µL的PS@CuS-Ab2，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即得光电化学β-淀粉样蛋白传感器。
[0031] 2.所制备的光电化学β-淀粉样蛋白传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
[0032] a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液；
[0033] b.
工作电极修饰：将所制备的光电化学β-淀粉样蛋白传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液分别滴涂到工作电极表面；
[0034] c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置
电压为0 V，运行时间100 s，激发
光源为
LED灯；检测对不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液的光电流强度记为Ii，Ii与β-淀粉样蛋白标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制Ii - logc工作曲线；
[0035] d. β-淀粉样蛋白的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的β-淀粉样蛋白标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中β-淀粉样蛋白的含量；
[0036] 所述的PBS缓冲溶液为10 mL 15 mL、pH为5.0 8.0的含0.1 mol/L
抗坏血酸的~ ~
磷酸盐缓冲溶液。
[0037] 本发明的有益成果
[0038] （1）本发明利用水热合成的方法，合成了多级纳米氧化锌微球，其具有分级
片层结构，
比表面积较大，大大的增加了氧化锌的负载能力；
[0039] （2）本发明成功将合成的多级纳米氧化锌微球用三联吡啶钌敏化，增强其对可见光的吸收，随后，原位生长铈掺杂的硫化镉,得到光
电信号显著增强且稳定的多级纳米氧化锌微球为基础的ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS复合材料，以ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS作为基底材料，其优异的光电化学活性有效的促进了电子转移，降低电子空穴对的复合，从而提高光电转化效率，有利于对β-淀粉样蛋白的超灵敏检测；
[0040] （3）本发明成功合成PS@CuS，PS微球球形度高，尺寸较均匀，单分散性能良好，成功负载硫化铜纳米颗粒，增强了传感器的
稳定性，以PS@CuS作为二抗标记物，其良好的绝缘性阻碍了光生电子的转移，而且PS@CuS与ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS间对可见光的吸收竞争也会有效地降低光电流信号，这双重抑制作用有效地提高了传感器的灵敏度，降低了传感器的
检测限；
[0041] （4）本发明成功构建了一种基于ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS复合材料的光电化学传感器，其操作简单、信号响应范围宽、检测限低，实现了对β-淀粉样蛋白的高灵敏检测。
具体实施方式
[0042] 现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
[0043]
实施例1制备ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS的具体步骤为：
[0044] （1）将2 mmol七水合硫酸锌、8 mmol尿素以及0.4 mmol柠檬酸三钠溶于43 mL去离子水中，磁力搅拌30 min，形成均一的中性溶液，将混合液置于100 mL聚四氟乙烯高压反应釜中120℃反应6 h，将沉淀物离心洗涤，置于真空干燥箱干燥10 h，将所得的固体置于马弗炉中300℃下煅烧2 h，最终制得多级纳米氧化锌微球，将其置于超纯水中，制得ZnO悬浮液；
[0045] （2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的ZnO悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/ZnO电极；
[0046] （3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰4 µL、浓度为0.03 mol/L的Ru(bpy)32+溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰4 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应20 40 ~min，超纯水冲洗，继而修饰4 µL、0.005 mol/L的Ce(NO3)3，室温下反应20 min，超纯水冲洗，最后修饰4 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应30 min，超纯水冲洗，制得ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极；
[0047] 实施例2 制备ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS的具体步骤为：
[0048] （1）将3 mmol七水合硫酸锌、12 mmol尿素以及0.6 mmol柠檬酸三钠溶于64 mL去离子水中，磁力搅拌30 min，形成均一的中性溶液，将混合液置于100 mL聚四氟乙烯高压反应釜中120℃反应6 h，将沉淀物离心洗涤，置于真空干燥箱干燥12 h，将所得的固体置于马弗炉中300℃下煅烧2 h，最终制得多级纳米氧化锌微球，将其置于超纯水中，制得ZnO悬浮液；
[0049] （2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的ZnO悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/ZnO电极；
[0050] （3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰5 µL、浓度为0.03 mol/L的Ru(bpy)32+溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰5 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应30 min，超纯水冲洗，继而修饰5 µL、0.005 mol/L的Ce(NO3)3，室温下反应20 min，超纯水冲洗，最后修饰5 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应30 min，超纯水冲洗，制得ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极；
[0051] 实施例3 制备ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS的具体步骤为：
[0052] （1）将3.75 mmol七水合硫酸锌、15 mmol尿素以及0.75 mmol柠檬酸三钠溶于80 mL去离子水中，磁力搅拌40 min，形成均一的中性溶液，将混合液置于100 mL聚四氟乙烯高压反应釜中120℃反应6 h，将沉淀物离心洗涤，置于真空干燥箱干燥12 h，将所得的固体置于马弗炉中300℃下煅烧2 h，最终制得多级纳米氧化锌微球，将其置于超纯水中，制得ZnO悬浮液；
[0053] （2）将ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干后，将10 µL的ZnO悬浮液修饰到ITO电极上，室温下晾干，得到ITO/ZnO电极；
[0054] （3）在步骤（2）中得到的电极表面修饰6 µL、浓度为0.03 mol/L的Ru(bpy)32+溶液，室温下晾干；在电极表面进一步修饰6 µL、0.08 mol/L的Cd(NO3)2，室温下反应30 min，超纯水冲洗，继而修饰6 µL、0.005 mol/L的Ce(NO3)3，室温下反应20 min，超纯水冲洗，最后修饰6 µL、0.1 mol/L的Na2S，室温下反应30 min，超纯水冲洗，制得ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极；
[0055] 实施例4 制备PS@CuS-Ab2的具体步骤为：
[0056] 将50 mg氯化铜与74 mg柠檬酸三钠溶于324 mL超纯水中，加入0.9 mL、4 mg/mL Na2S，磁力搅拌5 min，将混合液加热至90℃，连续搅拌15 min，将所得CuS量子点置于4℃保存；取100 μL的氨基化聚苯乙烯微球PS分散至50 mL所制备的CuS量子点溶液中，所得的混合液置于120℃下加热15 min，离心洗涤，将沉淀物分散于超纯水中，由此制得PS@CuS悬浊液；取100 µL PS@CuS悬浊液分散至0.9 mL 新配置的EDC/NHS溶液中，然后在室温下振荡30 min，加入0.9 mL、1 µg/mL的二抗Ab2溶液，在4℃下恒温振荡孵化10 h，然后加入0.9 mL、0.1%的BSA溶液，经过1 h室温振荡孵化后离心去掉上清液，将所得的沉淀物分散于1 mL去离子水中，制得PS@CuS-Ab2，将其置于4℃冰箱中冷藏；
[0057] 实施例5 制备PS@CuS-Ab2的具体步骤为：
[0058] 将54 mg氯化铜与80 mg柠檬酸三钠溶于350 mL超纯水中，加入1 mL、4 mg/mL Na2S，磁力搅拌8 min，将混合液加热至90℃，连续搅拌20 min，将所得CuS量子点置于4℃保存；取200 μL的氨基化聚苯乙烯微球PS分散至100 mL所制备的CuS量子点溶液中，所得的混合液置于120℃下加热15 min，离心洗涤，将沉淀物分散于超纯水中，由此制得PS@CuS悬浊液；取100 µL PS@CuS悬浊液分散至1 mL 新配置的EDC/NHS溶液中，然后在室温下振荡30 min，加入1 mL、1 µg/mL的二抗Ab2溶液，在4℃下恒温振荡孵化10 h，然后加入1 mL、0.1%的BSA溶液，经过1 h室温振荡孵化后离心去掉上清液，将所得的沉淀物分散于2 mL去离子水中，制得PS@CuS-Ab2，将其置于4℃冰箱中冷藏；
[0059] 实施例6 制备PS@CuS-Ab2的具体步骤为：
[0060] 将60 mg氯化铜与89 mg柠檬酸三钠溶于389 mL超纯水中，加入1.1 mL、4 mg/mL Na2S，磁力搅拌10 min，将混合液加热至90℃，连续搅拌30 min，将所得CuS量子点置于4℃保存；取200 μL的氨基化聚苯乙烯微球PS分散至100 mL所制备的CuS量子点溶液中，所得的混合液置于120℃下加热30 min，离心洗涤，将沉淀物分散于超纯水中，由此制得PS@CuS悬浊液；取200 µL PS@CuS悬浊液分散至1.1 mL 新配置的EDC/NHS溶液中，然后在室温下振荡40 min，加入1.1 mL、1 µg/mL的二抗Ab2溶液，在4℃下恒温振荡孵化12 h，然后加入1.1 mL、0.1%的BSA溶液，经过1.5 h室温振荡孵化后离心去掉上清液，将所得的沉淀物分散于2 mL去离子水中，制得PS@CuS-Ab2，将其置于4℃冰箱中冷藏；
[0061] 实施例7 制备光电化学β-淀粉样蛋白传感器的具体步骤为：
[0062] （a）在步骤一中得到的ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极表面修饰4 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸反应30 min，干燥后用超纯水冲洗，继续滴加 4 μL的EDC/NHS，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0063] （b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰4 µL、1 µg/mL的β-淀粉样蛋白抗体，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0064] （c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰4 µL、1 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0065] （d）利用抗原抗体的特异性结合，在步骤（c）中得到的电极表面修饰4 µL不同浓度的β-淀粉样蛋白抗原，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0066] （e）在步骤（d）中所得的电极表面修饰4 µL的PS@CuS-Ab2，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即得光电化学β-淀粉样蛋白传感器。
[0067] 实施例8 制备光电化学β-淀粉样蛋白传感器的具体步骤为：
[0068] （a）在步骤一中得到的ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极表面修饰5 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸反应30 min，干燥后用超纯水冲洗，继续滴加5 μL的EDC/NHS，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0069] （b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰5 µL、1 µg/mL的β-淀粉样蛋白抗体，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0070] （c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰5 µL、1 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0071] （d）利用抗原抗体的特异性结合，在步骤（c）中得到的电极表面修饰5 µL不同浓度的β-淀粉样蛋白抗原，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0072] （e）在步骤（d）中所得的电极表面修饰5 µL的PS@CuS-Ab2，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即得光电化学β-淀粉样蛋白传感器。
[0073] 实施例9 制备光电化学β-淀粉样蛋白传感器的具体步骤为：
[0074] （a）在步骤一中得到的ITO/ZnO/Ru(bpy)32+/Ce-CdS电极表面修饰6 µL、0.1 mol/L的巯基乙酸反应40 min，干燥后用超纯水冲洗，继续滴加6 μL的EDC/NHS，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0075] （b）在步骤（a）中得到的电极表面修饰6 µL、1 µg/mL的β-淀粉样蛋白抗体，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0076] （c）在步骤（b）中得到的电极表面修饰6 µL、1 %牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0077] （d）利用抗原抗体的特异性结合，在步骤（c）中得到的电极表面修饰6 µL不同浓度的β-淀粉样蛋白抗原，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；
[0078] （e）在步骤（d）中所得的电极表面修饰6 µL的PS@CuS-Ab2，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干，即得光电化学β-淀粉样蛋白传感器；
[0079] 实施例10 所制备的光电化学β-淀粉样蛋白传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
[0080] a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液；
[0081] b. 工作电极修饰：将所制备的光电化学β-淀粉样蛋白传感器作为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液分别滴涂到工作电极表面；
[0082] c. 工作曲线绘制：以饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系，在PBS缓冲溶液中进行测试；采用i-t测试手段对分析物进行检测，设置电压为0 V，运行时间100 s，激发光源为LED灯；检测对不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液产生的光电流强度，绘制工作曲线；含有不同浓度的β-淀粉样蛋白标准溶液的光电流强度记为Ii，Ii与β-淀粉样蛋白标准溶液浓度c的对数之间成线性关系，绘制Ii - logc工作曲线；
[0083] d. β-淀粉样蛋白的检测：用待测的人体血清样品代替步骤b中的β-淀粉样蛋白标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光电流强度I和工作曲线，得到待测样品中β-淀粉样蛋白的含量；
[0084] 所述的PBS缓冲溶液为10 mL 15 mL、pH为5.0 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的~ ~磷酸盐缓冲溶液。
