催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因及其编码产物与应用
阅读：706发布：2020-05-12
专利汇可以提供催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因及其编码产物与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了催化香 树脂 醇C-28位 氧 化的CYP450基因IaAO2，编码一种催化香树脂醇C-28位氧化的蛋白，在工程菌株中诱导表达能够催化α-香树脂醇与β-香树脂醇分别氧化为 熊果酸 和 齐墩果酸 。其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示； 氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了其表达载体，宿主菌，在制备三萜类化合物、制备催化五环三萜C-28位氧化化合物、制备催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇氧化化合物中的应用。本发明还公开了基于基因IaAO2的序列特征进行同源基因改造的方法及其获得的新基因tIaAO1。本发明提供的IaAO2基因，与同源基因相比具有更短的核苷酸序列，可以通过利用该基因构建转基因 生物 ，合成具有重要经济价值的五环三萜类化合物，具有很好的应用前景。，下面是催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因及其编码产物与应用专利的具体信息内容。
1.催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因IaAO2，其特征在于：核苷酸序列如下1)-5)任一种所示：
1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
2)编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或
3)与SEQ ID No.1的互补序列能够进行杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的蛋白质仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能；或
4)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少具有75％或以上同源性的核苷酸序列；或
5)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的核苷酸序列变体，且该核苷酸序列变体所编码的蛋白仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能或活性。
2.一种催化香树脂醇C-28位氧化的蛋白，其特征在于：氨基酸序列为1)或2)任一种所示：
1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列；或
2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能或活性的蛋白变体。
3.一种用于扩增催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因IaAO2的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的上游引物序列IaAO2F如SEQ ID No.3所示；下游引物序列IaAO2R如SEQ ID No.4所示。
4.含有权利要求1所述的核苷酸序列的表达载体。
5.含有权利要求1所述的核苷酸序列的宿主菌。
6.权利要求1所述的核苷酸序列在制备三萜类化合物中的应用。
7.权利要求1所述的核苷酸序列在制备催化五环三萜C-28位氧化的化合物中的应用。
8.权利要求1所述的核苷酸序列在制备催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇氧化的化合物中的应用。
9.基于权利要求1所述的核苷酸序列特征，进行同源基因5’-端截短的基因改造方法，所述基因改造方法为在序列比对基础上，通过但不限于DNA限制性内切酶或PCR，获得5’-端截短的新基因。
10.通过同源基因5’-端截短的基因改造方法得到的基因tIaAO1，其特征在于：
tIaAO1基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其编码氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
其特异性引物序列为：上游引物tIaAO1F如SEQ ID No.7所示；下游引物tIaAO1R如SEQ ID No.8所示。
催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因及其编码产物与应用
技术领域
背景技术
[0002] 细胞色素P450单加氧酶(CYP450)是一类在自然界中广泛存在，具有氧化功能的亚铁血红素蛋白酶家族，参与微生物、动物、植物体内各种代谢反应。在植物中，CYP450在萜类、黄酮类、生物碱类、植物激素等多种物质的生物合成中都发挥重要的生理功能。在三萜皂苷的生物合成途径下游，CYP450起着对三萜骨架的修饰作用，丰富了结构多样性，是植物体内含有种类繁多的三萜类化合物的因素之一。因此，CYP450的鉴定是揭示三萜生物合成机制的关键。
[0003] 岗梅(Ilex asprella)是一种岭南特色的中药材，其主要有效成分为三萜及三萜皂苷，而且大部分为熊果烷型(α-香树脂醇衍生物)，少数为齐墩果烷型(β-香树脂醇衍生物)。三萜类化合物虽然在植物中广泛存在，但人们对其具体的生物合成途径了解还不十分全面，三萜化合物的生物合成过程可大致分为前体形成、骨架构建以及骨架修饰三个环节。
[0004] 三萜类化合物的生物合成起始于萜类共同的前体物IPP(isopentenyl pyrophosphate)和DMAPP(dimethylallyl diphosphate)，它们经过一系列的酶催化反应可以生成2,3-氧化鲨烯(2,3-oxidosqualene)。2,3-氧化鲨烯在不同的2,3-氧化鲨烯环化酶OSCs的环化作用下，如羽扇豆醇合酶(lupeol synthase)、达玛烯二醇合酶(dammarenediol synthase)、香树脂合酶(amyrin synthase)等，生成不同类型的三萜骨架。三萜骨架再经过CYP450的氧化、糖基转移酶UGT糖基化等后修饰过程，最终形成种类众多的三萜皂苷。
[0005] 虽然，目前已鉴定的三萜骨架氧化修饰相关的CYP450数目较多，但尚未有任何报道公开过能够催化香树脂醇C-28位氧化的天然短序列细胞色素P450酶基因编码的蛋白。
发明内容
[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种催化香树脂醇C-28位氧化的特殊细胞色素P450基因IaAO2，其编码的蛋白在酿酒酵母工程菌株中经诱导表达能够催化α-香树脂醇(α-amyrin)与β-香树脂醇(β-amyrin)分别氧化为熊果酸和齐墩果酸，与同源基因相比其具有更短的核苷酸序列。
[0007] 本发明的另一个目的是提供上述催化香树脂醇C-28位氧化的特殊细胞色素P450基因IaAO2编码的蛋白质及其应用。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种同源基因5’-端截短的基因改造方法及其得到的基因tIaAO1。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 本发明提供的催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因IaAO2，核苷酸序列如下1)-5)任一种所示：
[0011] 1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
[0012] 2)编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或
[0013] 3)与SEQ ID No.1的互补序列能够进行杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列所编码的蛋白质仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能；或
[0014] 4)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少具有75％或以上同源性的核苷酸序列；或
[0015] 5)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的核苷酸序列变体，且该核苷酸序列变体所编码的蛋白仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能或活性。
[0016] 本发明提供一种催化香树脂醇C-28位氧化的蛋白，氨基酸序列为1)或2)任一种所示：
[0017] 1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列；或
[0018] 2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有催化香树脂醇C-28位氧化的功能或活性的蛋白变体。
[0019] 本发明提供一种用于扩增催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因IaAO2的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如SEQ ID No.3所示；下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
[0020] 本发明提供含有如上所述的核苷酸序列的表达载体。
[0021] 进一步地，所述表达载体包括但不限于pET，pESC，pYES-DEST；所述表达载体由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，通过但不限于DNA连接酶或同源重组方式插入载体。
[0022] 本发明提供含有如上所述的核苷酸序列的宿主菌。
[0023] 进一步地，该宿主菌的制备方法如下：
[0024] 将SEQ ID No.1基因克隆到真核表达载体，构建带有IaAO2基因的重组表达载体；将重组表达载体转入能够生产α-香树脂醇与β-香树脂醇的工程菌获得重组酵母。
[0025] 更进一步地，所使用的真核表达载体包括但不限于pESC，pYES-DEST；真核表达载体为pESC-TRP。
[0026] 更进一步地，SEQ ID No.1基因为克隆到真核表达载体pESC-TRP的限制性内切酶BamH I和Xho I位点间。
[0027] 更进一步地，所使用的工程菌株包括但不限于Saccharomyces cerevisiae；工程菌株为酿酒酵母工程菌株WAT11tfAX。
[0028] 本发明提供如上所述的核苷酸序列在制备三萜类化合物中的应用。
[0029] 本发明提供如上所述的核苷酸序列在制备催化五环三萜C-28位氧化化合物中的应用。
[0030] 本发明提供如上所述的核苷酸序列在制备催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇氧化化合物中的应用。
[0031] 本发明提供基于如上所述的核苷酸序列特征，进行同源基因5’-端截短的基因改造方法。
[0032] 进一步地，所述的基因改造方法为在序列比对基础上，通过但不限于DNA限制性内切酶或PCR，获得5’-端截短的新基因。
[0033] 本发明提供通过同源基因5’-端截短的基因改造方法得到的基因tIaAO1；
[0034] tIaAO1基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0035] 特异性引物序列为：上游引物tIaAO1F如SEQ ID No.7所示；下游引物tIaAO1R如SEQ ID No.8所示。
[0036] 进一步地，新基因tIaAO1的制备方法如下：
[0037] 将目标基因与SEQ ID No.1基因进行序列比对，确定重叠序列；设计特异性引物，进行PCR扩增获得5’-端截短的新基因。
[0038] 更进一步地，通过但不限于PCR扩增、限制性内切酶酶切、人工合成方法，获得5’-端截短的新基因。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0040] 本发明提供了一个能够催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因，该基因为首次从岗梅中克隆得到，编码的蛋白能够催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇分别氧化为熊果酸和齐墩果酸。其与目前已鉴定的植物中催化香树脂醇C-28位氧化的的同源CYP450基因相比，具有更短的核苷酸序列。
[0042] 图1为香树脂醇结构式及原子编号；
[0043] 图2为重组酵母代谢产物GC-MS分析；图中：
[0044] A为重组酵母代谢产物总离子流图；
[0045] B为齐墩果酸、熊果酸标准品和重组酵母代谢产物Peak 3、Peak 4质谱图。
具体实施方式
[0046] 本发明公开一种催化香树脂醇C-28位氧化的CYP450基因及其编码产物与应用。该基因为首次从岗梅中克隆得到，编码的蛋白能够催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇分别氧化为熊果酸和齐墩果酸。
[0047] 本发明涉及在岗梅转录组数据筛选参与岗梅三萜类化合物代谢途径相关的CYP450基因。克隆基因并利用在酿酒酵母体内进行异源表达的方法对该基因的编码蛋白进行功能活性分析，涉及岗梅主要活性成分三萜类化合物生物合成途径中CYP450基因及其编码产物与应用。
[0048] 本实验室前期克隆并鉴定了一个多功能香树脂合酶基因IaAS1，并获得了一株能够稳定高产α-香树脂醇(α-amyrin)和β-香树脂醇(β-amyrin)的酵母工程菌WAT11tfAX，本发明涉及的是一个能够催化五环三萜α-香树脂醇和β-香树脂醇分别生成熊果酸和齐墩果酸的关键细胞色素P450酶基因，将其命名为IaAO2。在本发明被公布之前，尚未有任何报道公开过本专利申请中涉及的IaAO2基因及其编码的氨基酸序列。与目前已鉴定的植物中催化香树脂醇C-28位氧化的同源CYP450基因如拟南芥中的CYP716A1、CYP716A2，葡萄中的CYP716A15、CYP716A17，罗勒中的CYP716A75等相比，IaAO2基因具有更短的核苷酸序列，是一个催化香树脂醇C-28位氧化的特殊CYP450基因。
[0049] α-香树脂醇、β-香树脂醇、熊果酸和齐墩果酸的结构式及原子编号如图1所示。
[0050] 本发明所提供的IaAO2基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，由1239个碱基组成，所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID No.2的氨基酸残基序列，由412个氨基酸残基组成。
[0051] 本发明提供的一种与催化香树脂醇C-28位氧化的特殊细胞色素P450基因：IaAO2，它是下列核苷酸序列之一：
[0053] 2)与序列表SEQ ID No.1中限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
[0054] 本发明提供的由上述基因IaAO2编码的蛋白质，具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代且具有SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。
[0055] 含有本发明基因IaAO2的表达载体宿主菌和使用该基因在生产三萜类化合物中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0056] 将SEQ ID No.1基因克隆到真核表达载体pESC-TRP的限制性内切酶BamH I和Xho I位点间，构建带有IaAO2基因的重组表达载体pESC-TRP-IaAO2；将重组表达载体转入能够生产α-香树脂醇与β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌株WAT11tfAX(WAT11,trp1::PGAP1-Sct HMGR1-TCYC1，ura3::PGAP1-ScERG20-TCYC1，leu2::PGAP1-SeACSL641P-TCYC1，his3::PTEF1-IaAS1-TCYC1)获得重组酵母，用半乳糖诱导蛋白表达。重组酵母培养后收集菌体，提取其代谢产物，硅烷化后用GC-MS进行检测。GC-MS分析结果表明，IaAO2蛋白能够将底物α-香树脂醇和β-香树脂醇分别氧化为熊果酸和齐墩果酸。
[0057] 研究结果表明，本发明涉及的具有细胞色素P450基因特征结构域的基因IaAO2与岗梅三萜类化合物生物合成密切相关，在重组酵母细胞内发现该基因编码的蛋白具有五环三萜香树脂醇C-28位氧化功能。
[0058] 本发明提供的IaAO2基因，与同源基因相比具有更短的核苷酸序列，可以通过利用该基因构建转基因生物，合成具有重要经济价值的五环三萜类化合物，具有很好的应用前景。
[0059] 本发明还包括将基于IaAO2基因序列特征，进行同源基因5’-端截短改造方法。
[0060] 现结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
[0061] 实施例1岗梅IaAO2基因的克隆
[0062] 用植物RNA提取试剂盒(Magen)提取岗梅嫩叶总RNA，用反转录试剂盒(全式金)反转录得到cDNA，根据转录组数据设计特异性的引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳表明约在1200bp处出现特异片段，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Magen)回收目标片段，克隆至pEASY载体(全式金)中，鉴定阳性克隆并进行测序验证，用于重组表达载体的构建。
[0063] 1、酵母表达载体的构建
[0064] 通过设计带有BamH I和Xho I酶切位点的引物，利用PCR的方法，将克隆到的IaAO2基因插入到酵母表达载体pESC-TRP(Stratagene)的BamH I和Xho I酶切位点之间，获得重组质粒pESC-TRP-IaAO2，并进行测序验证。
[0065] IaAO2基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0066] 特异性引物序列为：上游引物IaAO2F如SEQ ID No.3所示；下游引物IaAO2R如SEQ ID No.4所示。
[0067] 2、诱导表达
[0068] 用醋酸锂转化法将重组质粒pESC-TRP-IaAO2转化至酿酒酵母WAT11tfAX(WAT11,trp1::PGAP1-SctHMGR1-TCYC1，ura3::PGAP1-ScERG20-TCYC1，leu2::PGAP1-Se ACSL641P-TCYC1，his3::PTEF1-IaAS1-TCYC1)中，获得重组酵母。将阳性重组子接种于15mL SC-T液体培养基(含葡萄糖)中，30℃，225rpm培养36h后，换为SC-T无糖培养基继续培养4h，之后吸取一定量的酵母菌液转移至100mL SC-T液体培养基中(含半乳糖)，使起始菌液的OD600值为0.1，进行诱导培养，用半乳糖诱导蛋白表达。
[0069] 实施例2同源基因IaAO1及5’-端截短的新基因tIaAO1
[0070] 本实验室前期从药用植物岗梅中克隆并鉴定了另一个香树脂醇C-28位氧化酶基因IaAO1，并构建了一个酿酒酵母表达载体pESC-TRP-IaAO1。比较IaAO2与同源基因IaAO1的序列，后者比前者在5’-端多出了一段核苷酸片段。根据IaAO2、IaAO1的重叠序列，设计特异性的引物，以pESC-TRP-IaAO1为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳表明约在1200bp处出现特异片段，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Magen)回收目标片段，克隆至pEASY载体(全式金)中，鉴定阳性克隆并进行测序验证，用于重组表达载体的构建。
[0071] 1、DNA序列比对
[0072] 比较IaAO2与同源基因IaAO1的序列，确认部分序列重叠，此外IaAO1 5’-端多出了一段198bp的核苷酸片段。
[0073] 2、酵母表达载体的构建
[0074] 根据两个基因重叠的序列，设计带有BamH I和Xho I酶切位点的引物，利用PCR的方法，将克隆到的截短基因tIaAO1基因插入到酵母表达载体pESC-TRP(Stratagene)的BamH I和Xho I酶切位点之间，获得重组质粒pESC-TRP-tIaAO1，并进行测序验证。
[0075] tIaAO1基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0076] 特异性引物序列为：上游引物tIaAO1F如SEQ ID No.7所示；下游引物tIaAO1R如SEQ ID No.8所示。
[0077] 3、诱导表达
[0078] 用醋酸锂转化法将重组质粒pESC-TRP-tIaAO1转化至酿酒酵母WAT11tfAX(WAT11,trp1::PGAP1-SctHMGR1-TCYC1，ura3::PGAP1-ScERG20-TCYC1，leu2::PGAP1-Se ACSL641P-TCYC1，his3::PTEF1-IaAS1-TCYC1)中，获得重组酵母。将阳性重组子接种于15mL SC-T液体培养基(含葡萄糖)中，30℃，225rpm培养36h后，换为SC-T无糖培养基继续培养4h，之后吸取一定量的酵母菌液转移至100mL SC-T液体培养基中(含半乳糖)，使起始菌液的OD600值为0.1，进行诱导培养，用半乳糖诱导蛋白表达。
[0079] 以下为效果验证试验例内容。
[0080] 试验例1 IaAO2基因的真核表达及功能分析
[0081] IaAO2蛋白的功能鉴定：
[0082] 收集培养7天的酵母菌体，加入提取液(40％KOH:无水乙醇＝1:1)，加热回流提取代谢产物，提取液用等体积的正己烷萃取3次，分取正己烷层，挥干，残渣经BSTFA硅烷化试剂衍生化后用GC-MS进行检测。
[0083] GC-MS仪器为7890B-5977B(Agilent)，气相条件为进样口温度为250℃；进样量1μL，不分流；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent，USA)；柱温箱升温程序150℃起始，保持1min，以10℃/min升至300℃，保持20min；载气为He，柱流量0.7mL/min。质谱条件：EI离子源，电子能量70eV，离子扫描范围50-600m/z，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，GC-MS连接口温度280℃，化合物检索的谱库为NIST14.L。
[0084] GC-MS分析结果见图2，分析结果表明，转化有pESC-TRP空载的酵母菌体代谢产物，在保留时间为13.8min时出现α-amyrin的色谱峰(Peak 1)；转化有IaAO2基因的重组酵母代谢产物中，除了在保留时间为13.8min时出现底物α-amyrin的色谱峰(Peak 1)外，在保留时间为15.7min、16.2min、17.0min和17.3min出现了四个新的色谱峰Peak 2、Peak 3、Peak 4和Peak 5，通过谱库检索，四个新的化合物初步确认分别为熊果醇(匹配度94％)、齐墩果酸(匹配度93％)、熊果酸(匹配度95％)和熊果醛(匹配度99％)，且Peak 3和Peak 4的保留时间分别与齐墩果酸和熊果酸标准品的保留时间基本一致，质谱离子碎片也与标准品一致。可以判定IaAO2基因是一个三萜C-28位氧化酶基因，其编码的蛋白能够将底物α-amyrin和β-amyrin分别氧化为熊果酸和齐墩果酸。
[0085] 试验例2 5’-端截短获得的tIaAO1基因的真核表达及功能分析
[0086] 5’-端截短获得的tIaAO1蛋白的功能鉴定：
[0087] 收集酵母菌体，加入提取液(40％KOH:无水乙醇＝1:1)，加热回流提取代谢产物，提取液用等体积的正己烷萃取3次，分取正己烷层，挥干，残渣经BSTFA硅烷化试剂衍生化后用GC-MS进行分析。
[0088] GC-MS仪器为7890B-5977B(Agilent)，气相条件为进样口温度为250℃；进样量1μL，不分流；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent，USA)；柱温箱升温程序150℃起始，保持1min，以10℃/min升至300℃，保持20min；载气为He，柱流量0.7mL/min。质谱条件：EI离子源，电子能量70eV，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，GC-MS连接口温度280℃，化合物检索的谱库为NIST14.L，SIM模式检测，具体定性定量离子如下表1。
[0089] 表1 GC-MS检测相关定性定量离子
[0090]化合物 定量离子(m/z) 定性离子(m/z)
β-香树酯醇 218.2 189.2,203.2
α-香树酯醇 218.2 189.2,203.2
齐墩果酸 203.2 189.2,320.2
熊果酸 203.2 189.2,320.2
β-香树酯醇 218.2 189.2,203.2
α-香树酯醇 218.2 189.2,203.2
齐墩果酸 203.2 189.2,320.2
熊果酸 203.2 189.2,320.2
[0091] 采用Agilent MassHunter Quantitative Analysis定量软件计算混合标品和酵母提取物中α-香树酯醇、β-香树酯醇、熊果酸和齐墩果酸的含量，结果见下表2，显示转化了IaAO1或tIaAO1基因的酿酒酵母均生成了熊果酸和齐墩果酸，说明了基于IaAO2序列截短的tIaAO1基因保留了原有的功能。
[0092] 表2转基因酿酒酵母的含量变化(μg/L)
[0093] 菌株 α-香树酯醇 β-香树酯醇 熊果酸 齐墩果酸WAT11tfAX/pESC-TRP-IaAO1 129.76 24.72 15.97 731.70
WAT11tfAX/pESC-TRP-tIaAO1 272.85 45.63 23.21 421.16
WAT11tfAX/pESC-TRP-tIaAO1 272.85 45.63 23.21 421.16
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