本发明涉及丹参丹酚酸类化合在制药中的应用。

丹参丹酚酸类化合物是从常用中药丹参中提取分离的，该类化合物溶 于水。丹参及同属植物类丹酚酸类化合物的结构为：  4：R1＝Y；R2＝CH2COOH；R3＝H 6：R1＝Y；R2＝R3＝H14：R1＝Y；R2＝H；R3＝Gluc.

用现代技术研制的多种丹参制剂可用于治疗冠心病、慢性肝肾功能疾 病、感染性疾病、皮肤科疾病、血液病、II型糖尿病等；现有技术中报道， 丹参丹酚酸类化合物具有抗心、脑缺血作用和抑制动物白内障等作用，并 己广泛应用于临床。

本发明的目的在于提供丹参丹酚酸类化合物，特别是丹参总丹酚酸 (SAS)和其中的丹酚酸A(SalA)、丹酚酸B(SalB)的新的用途，即在 制药中的新应用。

为了完成本发明之发明目的，实际上，本发明涉及丹参总丹酚酸(SAS) 在制备抗血栓类药物中的应用；

本发明还涉及丹参总丹酚酸(SAS)在制备抗血小板聚集药物中的应 用；

本发明还涉及丹参丹酚酸类化合物在制备抗神经细胞凋亡药物中的 应用；

本发明还涉及丹酚酸A(SalA)、丹酚酸B(SalB)及其合成衍生物在 制备抑制哺乳动物艾滋病毒SIVmac感染类药物中的应用。应用时丹酚酸 A(SalA)或丹酚酸B(SalB)及其合成衍生物的浓度应在(10-6-10-9mol/L) 之间。

本发明的物质可以采用下述文献报道的方法获得：

：

1.黎莲娘，谭锐，陈未名“丹酚酸A，从中药丹参根中提取的一 种新的缩酚酸类化合物”，《药用植物》1984；50：227-228。

2.刘雨，张均田“丹酚酸的自由基清除作用“《中国药学杂志》 1994；3(1)：43-49。

经过研究表明，丹酚酸特别是丹酚酸A和B的抗氧化作用明显强于 VITE、VITC、甘露醇和银杏提取物(Egb761)，是目前已知的抗氧化作用 最强的天然成分。

用本发明的丹酚酸与药学上可接受的载体可以制备成各种药剂，它可 以是粉针剂、液体口服液等，采用常规药物制备方法即可制得上述的药剂。

实验结果表明本发明具有以下优点：

1.本发明对已知的丹参丹酚酸类化合物发掘了新的医疗用途，开拓了 一个新的应用领域；

2.由于本发明所使用的丹参丹酚酸类化合物是常用中药丹参的已知天 然分离提取物、提取物的生成物，因此安全无毒，药理作用强，有着很好 的药用前景；

3.本发明的物质提取技术成熟，原料来源广泛，无毒副作用，无特殊 制备工艺要求，制备工艺简单；

4.用本发明的物质制成的药物具有显著的抗血栓、抗血小板凝聚作用， 并且安全可靠，无出血等危险，对缺血皮层的血流量也有明显的改善作用；

5.用低浓度本发明的物质制成的药物，对哺乳动物艾滋病毒有明显的抑 制作用；

6.用本发明的物质制成的药物，有很好的抗神经细胞凋亡作用，并对线 粒体损伤有明显的保护作用。

使用本发明的药物时，建议用量为50～150mg/人天，优选用量为100mg/ 人天。

为了更好地理解本发明的实质，下面将分别用丹参总丹酚酸(SAS)、 丹酚酸A、酚酸B及其合成衍生物的药理实验结果和相关药理结果的附图， 说明其在制药领域中的新用途。

附图简要说明：

图1为实施例1中，8组试验对象大鼠在被注射不同种、不同剂量的 药物后，药物对其脑血栓形成的作用图，即病理检查图；其中A：Sham组， B：模型组，C Sal 3 mg/kg，D：Sal 6 mg/kg，E：Sal 10 mg/kg，F：FD 50 mg/kg，G： FD 200 mg/kg，H：FD 2000mg/kg。

图2为SalA、SalB和SalAA对试管内猴艾滋病毒SIVmac引起的 Hut-78细胞感染阳性率的影响结果，图中○——○代表Sal A；●——● 代表Sal B；△——△代表Sal AA；▲——▲：对照；*、**和***分别代 表p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001(n＝4)

图3为Sal A、SalB和Sal AA对感染SIV mac的Hut-78细胞上清液 中病毒的产生量的影响结果，其中*、**和***分别代表PC0.05和0.01 (n＝4)；

图4为SalB抑制6-OHDA引起的PC12-Bax细胞系细胞凋亡数的影响 的效果图，其中A：正常；B：溶媒；C、D6-OHDA处理的同时加入SalB 0.1和1.0mg/mml。

实施例1 丹参总丹酚酸的抗血栓药理试验及结果

Wista大鼠，体重240-260克，共64只，以12％的水合氯醛麻醉后， 于颅底开一1cm×1cm骨窗，暴露一段大脑中动脉，将吸有50％三氯化铁 溶液10ul的小片定量滤纸(2×2cm)敷在此段大脑中动脉中，30分钟后取下 滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养，术中术后室温严 格控制在24-25℃，于术后30分钟由舌下静脉给药一次，24小时后判断神 经缺失症状，然后断头取脑，测定脑梗塞面积和进行病理学检查以了解血 管内血栓形成情况。

以上试验分8组，即A：假手术组；B：模型组；C：Sal 3mg/kg组；D：Sal 6mg/kg组；E：Sal 10mg/kg组；F：FD 50mg/kg组；G：FD 200mg/kg组；H：FD 2000mg/kg组，各组的具体给药种类、剂量和实验结果见表1、表2和病 理检查结果见图2。

表1：丹酚酸对大鼠中 动脉血栓模型的大鼠神经症状的影响(n＝8，X±s) 组别 剂量(mg/kg)  神经症状评分 假手术组  2.25±1.28*** 模型组  8.50±1.20 丹酚酸  3  7.88±1.13  6  6.638±1.06**  10  4.38±0.92*** 复方丹参注射液  50  8.38±0.92  200  8.25±1.04  2000  8.38±1.06 与模型组比较：**p＜0.01，***P＜0.001 表2：丹酚酸对大脑中动脉血栓模型的大鼠脑梗塞面积的影响(n＝8，X±s) 组别 剂量(mg/kg)  神经症状评分 假手术组  0*** 模型组  13.05±1.16 丹酚酸 3  11.96±0.99 6  7.95±1.10** 10  4.93±0.64*** 复方丹参注射液 50  12.45±0.73 200  11.90±1.16 2000  12.16±1.21 与模型组比较：**p＜0.01，***P＜0.001

于术后30分钟iv观察，可发现注射总丹酚酸6、10mg/kg的两组大鼠， 明显缩小脑梗塞面积和改善行为障碍；在脑组织病理形态学观察中，注射 丹酚酸6、10mg/kg的两组动物大脑中动脉内血栓减少，而注射复方丹参 注射液50、200和2000mg/kg的三组均未显示作用。试验结果表明，丹参 总丹酚酸注射液有明显的抗血栓作用。

实施例2：

实施例2为丹参总丹酚酸对凝血系统功能影响的药理试验。

将昆明种小鼠分为6组，分别尾静脉注射生理盐水、复方丹参注射液 200mg/kg，2000mg/kg，总丹酚酸3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg，半小时后 将小鼠用摘眼球法取血，滴血后载玻璃片上测凝血时间，其余血用3.8％柠 檬酸钠抗凝，测定血小板数，凝血酶原和纤维蛋白原。

如表3至6所示的试验结果表明，总丹酚酸具有明显抗血栓和抗血小 板聚集作用，但对凝血系统的上述指标均无影响，说明总丹酚酸用于抗血 栓、抗血小板聚集很安全，无出血等危险性。

表3：静脉注射丹酚酸对小鼠凝血时间的影响(n＝10) 剂量(mg/kg) 凝血时间(秒±SD)     P     对照     73.4±40.2 复方丹参注射液     200     50.3±17     ＞0.005     2000     48.3±13.7     ＞0.005     丹酸酸     3     65.8±33.6     ＞0.005     6     76.2±30.6     ＞0.005     10     71.1±30.4         ＞0.005 表4：静脉注射总丹酚酸对小鼠血小板计数的影响(n＝5) 剂量(mg/kg) 血小板(109/L±SD)     P     对照     562±142 复方丹参注射液     200     469±91     ＞0.005     2000     422±153     ＞0.005     丹酚酸     3     453±38     ＞0.005     6     518±89     ＞0.005     10     496±25     ＞0.005

表5：静脉注射丹酚酸对小鼠凝血酶原的影响(n＝5) 剂量(mg/kg) 凝血酸原(s±SD)     P     对照     8.3±0.6 复方丹参注射液     200     8.2±0.6     ＞0.05     2000     8.1±0.5     ＞0.05     丹酚酸     3     8.3±0.5     ＞0.05     6     8.4±1.0     ＞0.05     10     8.3±0.6     ＞0.05 表6：静脉注射总丹酚酸对小鼠纤维蛋白原的影响(n＝5) 剂量(mg/kg)   纤维蛋白原(mg/dl±SD)     P     对照     88±19.4   ＞0.05 复方丹参注射液     200     2000     80.2±17.7   ＞0.05     丹酚酸     3     91±14.4   ＞0.05     6     87±20   ＞0.05     10     98.2±7.8   ＞0.05

实施例3：

实施例3为丹参总丹酚酸抗血小板凝聚作用的药理试验。

采用体外和体内实验，研究了总丹酚酸对胶原、ADP和花生四烯酸 (AA)诱导血小板聚集功能的影响。体外给药试验：用1％硅油硅化搅拌 棒、试管、离心管等。

体外试管试验结果见表7，丹酚酸试管内浓度0.123、0.164，0.205、 0.256、0.320mg/ml的五组都可有效抑制胶原ADP和AA诱导的血小板聚 集，复方丹参注射液12.5、25.0、50.0mg/ml也有抑血小板聚集作用。

体内给药试验：将昆明种小鼠分成6组，采用与实施例3相同的检验 方法，各组的给药种类和给药量及结果见表8，从表8的结果可以看出， 总丹酚酸6、10mg/kg的两组可完全抑制胶元诱导的血小板聚集(P＜0.01)， 总丹酚酸10mg/kg的一组可显著抑制ADP诱导的血小板聚集，而复方丹 参注射液200mg/kg和2g/kg的两组对胶原和ADP诱导的血小板聚集无抑 制作用。药理试验结果表明，丹参总丹酚酸有很好的抗血小板凝聚作用。

表7：丹酚酸体外给药对血小板聚集的影响(X±S，N＝3-4)     组别 剂量 mg/m   l  聚集率(％)    胶原▲ 剂量 mg/m   l    聚集率(％)     ADP▲▲   剂量   mg/   ml     聚集率(％)     AA▲▲   对照组   NS  61.0±2.2   NS     66.0±1.6   NS     77.0±5.0   丹酚酸   0.092  56.7±5.5   0.54     62.0±2.8   0.84     85.0±4.0   丹酚酸   0.123  51.3±2.1**   0.78     56.3±         0.6***   1.20     77.0±2.0   丹酚酸   0.164  47.3±6.7*   1.11     55.5±         2.9***   1.72     67.0±1.0   丹酚酸   0.205  36.7±7.0**   1.59     50.3±         1.9***   2.45     53.3±3.8***   丹酚酸   0.256  28.3±   9.3***   2.27     38.3±         9.0***   3.50     37.8±4.9***   丹酚酸   0.320  0±0***   3.27     13.5±         5.0***   5.00     21.3±3.9***   复方丹参   12.5  54.3±2.5*   27.0     62.0±1.4*   50.0     76.0±5.1   复方丹参   25.0  41.5±   3.5***   54.0     54.7±5.9*   100     61.0±1.7**   复方丹参   50.0  0±0***   108.0     40.7±         6.7***

*p＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 VS，对照组▲n＝3 ▲▲n＝4(动物数)复 方丹参；复方丹参注射液。

表8：丹酚酸体内给药对胶原和ADP诱导的血小板聚集的影响(X± S，n＝8)     组别   剂量(mg/kg)                 聚集度(％)     胶原     ADP     对照组     NS     57.8±5.0     63.2±5.1     丹酚酸     3     56.1±3.1     60.6±5.7     丹酚酸     6     0±0***     59.3±4.8     丹酚酸     10     0±0****     47.4±5.9***     复方丹参注射液     200     61.4±3.8     65.1±5.5     复方丹参注射液     2000     55.8±12.4     61.3±8.5

***P＜0.001  VS.对照组

实施例4

实施例4为丹参总丹酚酸对缺血皮层血流量的改善作用的药理试验及 结果。

Wista大鼠，雌雄各半，体重180-200克，用25％乌拉坦ip麻醉，切开 颈正中皮肤，分离右侧颈动脉，在动脉下埋线并打活结，以备结扎。在右 侧眼眶后皮肤作一个1.5cm长的切口，剥离并切除颈肌，暴露颞鳞骨，在 颞鳞骨接缝处开一1.5cm的骨窗，暴露大脑中动脉主干，以备凝闭，切开 颅顶皮肤在右侧颅顶前囟中心后1mm，旁开2mm处开一2.5cm骨窗，以 备插测量电极，分离颈后皮肤，以备插参比电极。实验共分7组，分别是 假手术组、模型组、复方丹参注射液0.2g/kg，2g/kg，丹酚酸3mg/kg，6mg/kg 及10mg/kg，将大鼠固定于立体定位仪，参比电极置于颈部皮下，测量电 极通过颅顶骨窗置于皮层下0.8mn，测定正常血流，然后将大鼠颈总动脉 结扎，并将大脑中动脉凝闭，30分钟后舌下静脉给药，分别于给药后15 分钟及30分钟测定血流，此外，取正常鼠按上法测定脑皮层血流量及丹酚 酸对正常血流量的影响，结果列于表9，结果显示，单侧大脑中动脉凝闭 合并单侧颈总动脉结扎后缺血区皮层血流量明显减少。丹酚酸6mg/kg及 10mg/kg组皮层血流明显恢复(p＜0.05)，但丹酚酸对正常鼠脑皮层血流量无 影响，说明丹酚酸有改善缺血区皮层血流量的作用。

表9：丹酚酸静脉注射对大脑中动脉凝闭合并同侧颈总动脉结扎大鼠 皮层血流量的影响   组别   动物数    (N)   药物剂量   (mg/kg)             血流量(％X±S     结扎     前   给药后15分      钟   给药后30分钟   假手术     8     NS     100   100.8±     10.1**   94.0±12.3**   模型     8     NS     100   47.9±12.1   44.2±10.6   丹酚酸     8     3     100   54.4±12.6   56.4±14.9   丹酚酸     8     6     100   67.1±14.7*   66.8±16.9   丹酚酸     8     10     100   63.7±10.0*   61.5±14.4*   复方丹参     6   0.2g/kg     100   50.7±13.1   44.7±12.1   复方丹参     7   2.0g/kg     100   51.2±15.1   48.9±16.9

实施例5

实施例5为丹酚酸A(SalA)、B(SalB)及乙酰化丹酚酸A(SalAA) 抗恒河猴艾滋病毒(SIVmac)病变的药理试验及结果。

试验用病毒为SIVmac感染的Hut-78细胞，三周后培养上清，用 CEMx-174滴定病毒滴度为1600ccID50(50％细胞感染剂量)，-20℃冻存备 用。本研究观察了丹酚酸A，B及乙酰化丹酚酸A对SIV感染引起Hut-78 阳性细胞率和病毒的产量。低浓度药物(10-6-10-9mol/L)可明显抑制SIVmac 病毒的产生，对细胞病变改善也有一定作用，相反药物浓度过高(3× 10-6-10-5mol/L)对SIV感染有促进作用，具体情况附图3和附图4。

试验结果表明，丹酚酸A、丹酚酸B和乙酰化丹酚酸A在低浓度 (10-6-10-9mol/L)时对恒河猴艾滋病毒(SIVmac)的病变有明显的抑制作用。

实施例6

实施例6为丹参总丹酚酸(SAS)及丹酚酸B(SalB)对神经细胞凋 亡的抑制作用药理试验及结果。

将沙土鼠双侧颈总动脉结扎致脑缺血，3.5～4分钟后恢复血供，至第3 天取出大脑固定，包埋、切片，用TUNEL染色在10×20倍光镜下计数海 马CAI区锥体细胞层1mm长度的细胞凋亡数。

如表10所示，分别使用总丹酚酸(SAS)5mg/kg和10mg/kg于术前 15分钟及术后10分钟iv一次，结果表明对脑缺血再灌注损伤引起的细胞 凋亡的抑制率为24.4～43.6％；再分别使用丹酚酸B(SalB)5mg/kg和 10mg/kg于术前15分钟及术后10分钟iv一次，结果表明对脑缺血再灌注 损伤引起的细胞凋亡的抑制率为29.2～44.8％；

许多因子参与凋亡的发生和发展过程，其中Bax，C-jun，p53等系重要 的促凋亡基因，bcl-2和P35等为重要的抗凋亡基因。研究表明，Bax导致 线粒体膜对某些分子通透性的改变是凋亡的启动因子。为此，我们首次建 立了Bax高表达的PC12细胞株，Western印迹法显示Bax蛋白有高水平的 表达，用神经毒素6-羟基多巴诱导Baxα高表达会引起PC12细胞凋亡， 如图5所示，丹酚酸B0.1和1.0ng.ml能显著降低6-OHDA诱导的PC12-Bax α的凋亡细胞率，使细胞凋亡率从41％下降为19％和14.8％。

试验结果表明，丹参总丹酚酸和丹酚酸B对神经细胞凋亡有明显的抑 制作用。

表10：SAS和SalB对沙鼠脑缺血再灌注海马CA1区锥体细胞凋亡 数目的影响 X±s，n＝5     组别   剂量(mg/kg)   凋亡细胞数/   个·m-1     抑制率/％     对照组     -   151.8±11.9     -     SAS     5，iv   114.8±16.7**     24.4     10，iv   85.6±13.5***     43.6     SalB     5，ip   107.4±13.6***     29.2