一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法专利检索-丹酚酸酸，碱，盐，酸酐和碱专利检索查询-专利查询网

一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法

阅读：769发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种丹参多酚酸提取物指纹图谱的建立及有关成分的含量测定方法，包括如下步骤：步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。，下面是一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及含量测定方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；
步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；
步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定；
其中，步骤1的具体步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称定对照品丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B，加超纯水溶解，定容至丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM终浓度分别为200-500μg/ml，迷迭香酸、紫草酸终浓度分别为300-600μg/mL，丹酚酸B终浓度为500-1500μg/mL，即得；
(2)供试品溶液的制备：分别精密称定10-50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水，溶解后过滤，稀释成浓度为1mg/mL-5mg/mL的溶液；
(3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液1-5μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：UPLC C18柱；
流动相：溶剂A：水，含0.1％-0.5％甲酸；溶剂B：乙腈，含1％-5％甲醇；
梯度洗脱：
0-3min,12-18％B；3-15min,18％B；15-17min,18-20％B；17-25min,20％B；25-28min,
20-23％B；28-35min,23％B；35-40min,23-40％B；40-45min,40-95％B；45-50min,95％B；
温度：30-40℃；
流速：0.2-0.3ml/min；
色谱图光谱采集范围：190～400nm；
其中，步骤3的具体步骤如下：
(1)供试品溶液制备：取丹参多酚酸提取物，精密称定，加初始流动相溶解并定容至终浓度为0.6-1.2mg/mL，摇匀，即得；
(2)混合对照品溶液制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为100-150μg/mL，紫草酸质量浓度为100-150μg/mL，丹酚酸B质量浓度为1.0-2.5mg/mL的混合对照品溶液；
(3)精密吸取供试品溶液1-5μL，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：HPLC C18柱；
流动相：A相：水，含0.3％～0.6％的甲酸；B相：乙腈，含2％～4％的甲醇和0.3％～
0.6％的甲酸；
梯度洗脱：0～40min，20％B；40～50min，20-70％B；
流速：0.9-1.1mL/min；
柱温：30℃-35℃；
检测波长：288nm；
其中，步骤(1)、(2)中所述初始流动相，是指80％A流动相和20％B流动相的混合溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，
色谱柱优选：UPLC C18柱；
流动相优选：
溶剂A：水，含0.2％甲酸；溶剂B：乙腈，含3％甲醇；或
溶剂A：水，含0.1％甲酸；溶剂B：乙腈，含2％甲醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中的质谱条件如下：
四级杆-飞行时间质谱采用(-)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；
扫描范围：m/z100-1200；
碰撞能量：6eV；
MSE梯度裂解能：20-40eV。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，
流动相优选：
A相：水，含0.5％的甲酸；B相：乙腈，含2％的甲醇和0.5％的甲酸；或
A相：水，含0.3％的甲酸；B相：乙腈，含3％的甲醇和0.3％的甲酸；
流速优选1mL/min；
柱温优选30℃。
5.如权利要求1～4任一所述的方法，其中丹参多酚酸提取物，可根据现有技术中的任一合适方法进行制备，也可以制备成任一制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中丹参多酚酸提取物制备方法为：取丹参饮片，用纯化水煎煮提取三次，每次0.5～1小时，将三次提取液合并，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置
4～8小时，过滤，得澄明药液，将药液用聚酰胺柱层析工艺纯化，上样后用纯化水冲洗，以碳酸氢钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用盐酸溶液调节至酸性，采用大孔树脂柱层析工艺纯化药液，上样后用纯化水冲洗，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，所得浓缩液冷藏12～24小时后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5.3～
6.0，冷冻干燥，即得。
7.如权利要求5所述的方法，其中丹参多酚酸提取物为注射剂，其制备方法为：取重量比为1:0.1～0.5的丹参多酚酸提取物及甘露醇，分别加入10～20倍重量体积比的注射用水溶解；将上述两种溶液混合均匀后加入药用炭，加热搅拌，过滤，药液降温后进行超滤，将滤液调节pH值至5.5～6.0，加注射用水定容，搅拌均匀，将上述药液微孔滤膜过滤后灌装至西林瓶中，冷冻干燥，即得注射用丹参多酚酸。

说明书全文

一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种中药提取物的检测方法，特别涉及一种丹参多酚酸提取物指纹图谱的建立及有关成分的含量测定方法背景技术：

[0002] 丹参为唇形科鼠尾草属植物。又名：紫丹参、红根、血参、大红袍等。丹参以根供药用，味苦，性微寒。具有活血调经、祛瘀生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功能。用于治疗月经不调、痛经、产后瘀阻腹痛、关节酸痛、神经衰弱失眠、心悸、痈肿疮毒等症。近代医学临床证明，丹参有扩张血管与增进冠状动脉血流量的作用，用来治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心动过速等症，有显著的疗效；还用来治疗慢性肝炎、早期肝硬变等症，亦有良好的效果。

[0003] 丹参中含有两类主要有效成分，即脂溶性丹参酮类和水溶性丹参酚酸类。现代医学认为，丹参酚酸类(salvianolie acids)成分，能够缩小心肌梗死的范围，减轻其病情，对大鼠心肌缺血、再灌注损伤具有保护作用，同时有明显的抑制血小板聚集、抗凝、溶纤及降低血脂、抗动脉粥样硬化的作用，具有较大的临床药用价值。该类化合物主要有丹酚酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸等，其中丹酚酸B是丹参水溶性成分中的主要药效成分。

[0004] 丹参多酚酸注射剂是一种已经上市的产品，其活性物质被称为“丹参多酚酸”。丹参多酚酸的提取制备方法有多种，例如：取丹参饮片，用纯化水煎煮提取三次，每次0.5～1小时，将三次提取液合并，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置4～8小时，过滤，得澄明药液，将药液用聚酰胺柱层析工艺纯化，上样后用纯化水冲洗，以碳酸氢钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用盐酸溶液调节至酸性，采用大孔树脂柱层析工艺纯化药液，上样后用纯化水冲洗，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，所得浓缩液冷藏12～24小时后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5.3～6.0，冷冻干燥，即得。之后再将丹参多酚酸提取物与辅料进行混合制备成各种制剂。例如，与甘露醇溶液进行混合，并调pH至5.5～6.0，定容后冷冻干燥，制备丹参多酚酸注射剂。

[0005] 作为丹参多酚酸注射剂的活性成分，目前丹参多酚酸提取物和制剂的质量标准现状来看，质控项目很不全面，普遍采用紫外-可见分光光度法来测定多酚酸的含量。该法是以丹酚酸B为对照计算多酚酸的含量，专属性和准确度差。且对于成分复杂的中药制剂，仅以一种成分控制含量指标，在缺乏整体性的同时，对于复杂成分的指认也并不充足。

[0006] 因此，针对上述复杂成分指认不充分以及定量不准确等缺陷。本发明开发了UPLC色谱指纹图谱的方法，利用液质进行峰指认，从而确定了23个紫外检测共有的指纹峰。并且同时对于指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分建立了HPLC含量测定方法。

[0007] 本发明是以全面表征中药制剂的质量为目标，提供了一种采用UPLC-PDA法(超高效液相多波长可见紫外检测法)，建立了丹参多酚酸提取物的数字化定量指纹图谱，并以二级系统指纹定量法鉴定了多批丹参多酚酸提取物样品的一致性与稳定性，共检出化学成分39个，结合多级质谱信息及对照品，鉴定丹参酚酸类化合物23个。考虑到UPLC应用到大规模检测的成本及HPLC的广泛应用性，又以HPLC-VWD法(高效液相色谱可变波长检测法)同时测定三个指标性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。在确保准确性、有效性的同时，又兼顾了成本节约原则，更适合应用于扩大化生产，完善了现有的注射用丹参多酚酸的质控标准。
发明内容：

[0008] 本发明提供一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及含量测定方法，其特征在于，步骤如下：

[0009] 步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；

[0010] 步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；

[0011] 步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。

[0012] 进一步的，步骤1的具体步骤如下：

[0013] (1)对照品溶液的制备：精密称定对照品丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B，加超纯水溶解，定容至丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM终浓度分别为200-500μg/ml，迷迭香酸、紫草酸终浓度分别为300-600μg/ml，丹酚酸B终浓度为500-1500μg/ml即得；

[0014] (2)供试品溶液的制备：分别精密称定10-50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水，溶解后过滤膜，稀释成浓度为1mg/mL-5mg/mL的溶液；

[0015] (3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液1-5μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得；

[0016] 其中，色谱条件如下：

[0017] 色谱柱：UPLC C18柱或T3柱；

[0018] 流动相：溶剂A：水，含0.1％-0.5％甲酸；溶剂B：乙腈，含1％-5％甲醇；

[0019] 梯度洗脱：

[0020] 0-3min,12-18％B；3-15min,18％B；15-17min,18-20％B；17-25min,20％B；25-28min,20-23％B；28-35min,23％B；35-40min,23-40％B；40-45min,40-95％B；45-50min,
95％B；

[0021] 温度：30-40℃；

[0022] 流速：0.2-0.3ml/min；

[0023] 色谱图光谱采集范围：190～400nm。

[0024] 优选的，步骤1中，

[0025] 色谱柱优选：UPLC C18柱；

[0026] 流动相优选：

[0027] 溶剂A：水，含0.2％甲酸；溶剂B：乙腈，含3％甲醇；或

[0028] 溶剂A：水，含0.1％甲酸；溶剂B：乙腈，含2％甲醇。

[0029] 本发明的UPLC的色谱条件是经过筛选获得的：

[0030] 1、色谱柱的选择

[0031] 本发明对比了目前广泛使用的三种不同厂牌色谱柱：(A)Fortis C181.7μm，2.1x 50mm；(B)Agilent Eclipse Plus C18，1.8μm，2.1x 150mm；(C)Waters HSS T3C18，1.7μm，
2.1x 150mm。从三种柱子的液相对比谱图中可以看出，待分析成分在A型色谱柱上出峰时间较晚，且分离效果不好，考虑到扩大生产的成本及最终成分指认结果的准确性，排除色谱柱A；而后对比丹参多酚酸样品在色谱柱B及色谱柱C中的图谱，可以明显看到色谱柱B较C分离效果更好，且B图中的色谱峰数明显多于C图，有利于成分研究的全面性。后经反复实验，发现Eclipse对于极性较大的酚酸类成分分离效果比较好，因此本发明优化选用了Eclipse Plus C18色谱柱。色谱图见图1。

[0032] 2、洗脱梯度的筛选：

[0033] (1)采用溶剂A：水，含0.1％甲酸，溶剂B：乙腈，进行系统优化，结果显示极性较大的色谱与邻近杂质难以分离。记录如下：

[0034] (A)0-3min:12-20％B,3-10min:20-22％B,10-22min:22％B,22-27min:22-35％B,27-29min:35％-50％B；

[0035] (B)0-3min:12-18％B,3-10min:18-22％B,10-12min:22％B,12-22min,22-25％B；22-27min:25-35％B,27-29min:35％-50％B；

[0036] (C)0-2min:12-18％B,2-5min:18-22％B,5-15min:22-25％B,15-20min:25-45％B,20-25min:45％-95％B.

[0037] 色谱图见图2。

[0038] (2)将流动相优化为溶剂A：水，含0.2％甲酸，溶剂B：乙腈，含2％甲醇，对分离细节改善明显，5-10分钟得到分离。进一步优化，高极性酚酸在18％有机相等度洗脱中得到分离(图3，13min)。记录如下：

[0039] (A)0-3min:12-18％B,3-10min:18-20％B,10-20min:20％B；

[0040] (B)0-3min:12-17％B,3-20min:17％B,20-23min:17-20％B；

[0041] (C)0-3min:12-18％B,3-15min:18％B,15-17min:18-20％B,17-25min:20％B.[0042] 色谱图见图3、图4(图3放大图)。

[0043] 3、方法学考察

[0044] (1)精密度试验

[0045] 取供试品溶液(批号20130202)，连续进样6次，以紫草酸为参照，分别对共有峰相对保留时间和相对峰面积进行考察。各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5％，相对峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器精密度良好。

[0046] (2)重复性实验

[0047] 取样品(批号20130202)6份，按上述步骤1中方法制备供试品溶液，并进行检测，以紫草酸为参照分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5％，相对峰面积的RSD均小于3.5％，表明本方法重复性良好。

[0048] (3)稳定性试验

[0049] 取供试品溶液(批号为130301)，分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，以紫草酸为参照，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。

[0050] 结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5％，相对峰面积的RSD均小于3.0％。表明供试品溶液在室温24h内稳定。

[0051] 丹参多酚酸提取物样品UPLC色谱图(280nm)参见图5。

[0052] 利用本发明步骤1的方法可对多批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分析，并对各样品的23个共有峰紫外光谱进行对比分析，从而对多批丹参多酚酸提取物样品的一致性与稳定性进行鉴定。

[0053] 对于不同批次指纹图谱相似度的对比分析，可采用市面上售卖的多种软件进行。

[0054] 本发明优选采用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件对结果信号进行二级定量指纹图谱分析，确定了对照指纹图谱，并以此为参照计算各批次指纹图谱的相似度，得到多批样品的最终指纹图谱质量结果。

[0055] 系统指纹定量法客观、准确地定量描述各化学物质对复方制剂化学指纹的贡献大小。把丹参多酚酸提取物UPLC指纹看作一个整体，用宏定性相似度(Sm)从整体监测丹参多酚酸提取物的化学指纹数量和分布比例；用宏定量相似度

[0056] (Pm)监测丹参多酚酸提取物化学指纹整体含量情况；用样品指纹均化性变动系数(α)相对偏差的绝对值限定丹参多酚酸提取物UPLC指纹比例变异范围，其中Sm、Pm和α按公式方法计算。

[0057]

[0058]

[0059]

[0060] 表1系统指纹定量法划分中药质量等级标准

[0061]

[0062] 采用表1中所示的系统指纹定量法标准，以Sm、Pm和α共同鉴定中药质量等级，通过上述等级划分，并以低于质量V级为不合格，对多批样品的一致性与稳定性进行鉴定，从而对质量进行评价。

[0063] 进一步的，步骤2中的质谱条件如下：

[0064] 四级杆-飞行时间质谱(qTOF)采用(-)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；

[0065] 扫描范围：m/z100-1200；

[0066] 碰撞能量：6eV；

[0067] MSE梯度裂解能：20-40eV。

[0068] 从丹参多酚酸提取物总离子流图可以看出(图6)，其各成分峰在负离子条件下均有较高的响应，并与紫外色谱图对应。

[0069] 根据飞行时间质谱测得的精确相对分子质量，应用高分辨质谱数据分析(例如MassLynx质谱分析软件)计算可能的分子组成(误差＜5×100-6)，并结合离子阱质谱仪的各个成分峰的二级质谱碎片信息和丹参已知化合物的文献报道，对色谱峰进行分析，从供试品中鉴定23个可确证的化合物。见下表。

[0070] 表2丹参多酚酸提取物化学成分鉴定列表

[0071]

[0072]

[0073]

[0074] 进一步的，步骤3中所述三种指标性成分分别为迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B。

[0075] 采用高效液相色谱可变波长检测法对三种指标性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量进行测定的具体步骤如下：

[0076] (1)供试品溶液制备：取丹参多酚酸提取物，精密称定，加初始流动相溶解并定容至终浓度为0.6-1.2mg/mL，摇匀，即得；

[0077] (2)混合对照品溶液制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为100-150μg/mL，紫草酸质量浓度为100-150μg/mL，丹酚酸B质量浓度为1.0-2.5mg/mL的混合对照品溶液；

[0078] (3)精密吸取供试品溶液1-5μL，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量；

[0079] 其中，色谱条件如下：

[0080] 色谱柱：HPLC C18柱；

[0081] 流动相：A相：水，含0.3％～0.6％的甲酸；B相：乙腈，含2％～4％的甲醇和0.3％～0.6％的甲酸；

[0082] 梯度洗脱：0～40min，20％B；40～50min，20-70％B；

[0083] 流速：0.9-1.1mL/min；

[0084] 柱温：30℃-35℃；

[0085] 检测波长：288nm。

[0086] 其中步骤(1)、(2)中所述初始流动相，是指80％A流动相和20％B流动相的混合溶液。

[0087] 优选的，步骤3中，

[0088] 流动相优选：

[0089] A相：水，含0.5％的甲酸；B相：乙腈，含2％的甲醇和0.5％的甲酸；或[0090] A相：水，含0.3％的甲酸；B相：乙腈，含3％的甲醇和0.3％的甲酸；

[0091] 流速优选1mL/min；

[0092] 柱温优选30℃。

[0093] 本发明的HPLC色谱条件是经过摸索得到的：

[0094] 1、流动相的选择：

[0095] 在进行流动相的摸索时，考察了不同比例的乙腈-水，甲醇-水，乙腈-三氟乙酸水，乙腈-磷酸水，乙腈-甲酸水以及乙腈-甲醇-三氟乙酸水，乙腈-甲醇-甲酸水，最终发现，以A相：水(含0.3％～0.6％的甲酸)；B相：乙腈(含2％～4％的甲醇和0.3％～0.6％的甲酸)梯度洗脱时目标峰分离效果较好，尤以A相：水(含0.5％的甲酸)；B相：乙腈(含3％的甲醇和0.5％的甲酸)分离效果最好，主要表现为迷迭香酸与左右两边的微量物质可以达到基线分离，图谱见图7所示。

[0096] 在本发明的HPLC色谱条件下，供试品溶液中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的色谱峰与其他组分峰均可得到较好的分离。如图8所示。

[0097] 2、DAD检测器采集波长的选择：

[0098] 丹酚酸B的最大吸收在288nm左右，紫草酸的最大吸收则在250nm。对比250，280，330，360nm下的对照品谱图，选择280nm作为典型指纹图谱的吸收波长，330nm用于条件优化过程中分离度的对比。不同检测波长对丹参多酚酸混合对照品分离的液相色谱图见图9。

[0099] 3、线性关系考察

[0100] (1)分别精密量取混合对照品溶液0.4、1、2、4、8、10ml置10mL量瓶中，用初始流动相定容至刻度，摇匀，得到系列标准溶液。

[0101] (2)分别进样10μL，记录峰面积A，以峰面积A对质量浓度C(μg·L-1)进行线性回归，绘制标准曲线。

[0102] 迷迭香酸线性回归方程A＝23.787C-0.1082，R2＝1.0000，线性范围4.82～120.50μg·L-1；

[0103] 紫草酸线性回归方程A＝15.580C-1.8253，R2＝1.0000，线性范围4.84～121.10μg·L-1；

[0104] 丹酚酸B线性回归方程A＝12.963C-5.4623，R2＝1.0000，线性范围60.80～1520.00μg·L-1。

[0105] 4、方法学考察

[0106] (1)精密度试验

[0107] 精密吸取供试品溶液按上述HPLC色谱条件连续进样6次，进样量10μL，测定迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的峰面积。

[0108] 测得迷迭香酸峰面积的RSD 0.44％；紫草酸峰面积的RSD 0.30％；丹酚酸B峰面积的RSD 0.29％。

[0109] 结果表明仪器的精密度良好。

[0110] (2)重复性试验

[0111] 分别精密称取提取物样品6份，按给定供试品制备方法和HPLC色谱条件进行测定，记录峰面积，分别计算各测定成分的含量。

[0112] 测得迷迭香酸含量的RSD 0.86％；紫草酸含量的RSD 0.70％；丹酚酸B含量的RSD 0.61％。

[0113] 结果表明方法的精密度良好。

[0114] (3)中间精密度试验

[0115] 取同一批丹参多酚酸，按给定供试品制备方法制备供试品溶液，分别由不同人员在同一台仪器，同一人员在不同天数进样测定，计算不同人员、不同天数各测定成分含量的RSD。

[0116] 由同一人员在三天中测得迷迭香酸含量的RSD 0.34％；紫草酸含量的RSD0.74％；丹酚酸B含量的RSD 0.37％；

[0117] 由三个人员在同一台仪器测得迷迭香酸含量的RSD 0.68％；紫草酸含量的RSD 1.14％；丹酚酸B含量的RSD 0.86％。

[0118] (4)稳定性试验

[0119] 取新配制的混合对照品及供试品溶液，分别在0，3.5，7，10.5，14，18，24h按前述色谱条件进行色谱分析。

[0120] 测得混合对照品中迷迭香酸峰面积的RSD 1.14％；紫草酸峰面积的RSD 1.09％；丹酚酸B峰面积的RSD 1.17％。

[0121] 供试品中迷迭香酸峰面积的RSD 0.52％；紫草酸峰面积的RSD 0.70％；丹酚酸B峰面积的RSD 0.47％。

[0122] 结果表明对照品及样品在24h内稳定性均良好。

[0123] (5)加样回收率试验

[0124] 按给定供试品制备方法制备供试品溶液，精密量取5ml于10ml容量瓶，分别精密加入混合对照品溶液适量，配成浓度为70％、100％、130％的溶液，每个浓度3份，共9份，然后用初始流动相定容，作为低、中、高三个浓度的供试品溶液，计算回收率和RSD值。

[0125] 结果迷迭香酸的平均回收率为100.88％，RSD 0.80％；紫草酸的平均回收率为103.03％，RSD 0.99％；丹酚酸B的平均回收率为101.92％，RSD 1.16％。见表4-6。

[0126] 表3.迷迭香酸加样回收率

[0127]

[0128] 表4.紫草酸加样回收率

[0129]

[0130]

[0131] 表5.紫草酸加样回收率

[0132]

[0133] 本发明所述的丹参多酚酸提取物，可根据现有技术中的任一合适方法进行制备，也可以为任一的丹参多酚酸的制剂。

[0134] 优选的，本发明所述的丹参多酚酸提取物制备方法为：取丹参饮片，用纯化水煎煮提取三次，每次0.5～1小时，将三次提取液合并，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置4～8小时，过滤，得澄明药液，将药液用聚酰胺柱层析工艺纯化，上样后用纯化水冲洗，以碳酸氢钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用盐酸溶液调节至酸性，采用大孔树脂柱层析工艺纯化药液，上样后用纯化水冲洗，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，所得浓缩液冷藏12～24小时后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5.3～6.0，冷冻干燥，即得。

[0135] 丹参多酚酸提取物也可为注射剂，其制备方法为：取重量比为1:0.1～0.5的丹参多酚酸提取物及甘露醇，分别加入10～20倍重量体积比的注射用水溶解；将上述两种溶液混合均匀后加入药用炭，加热搅拌，过滤，药液降温后进行超滤，将滤液调节pH值至5.5～6.0，加注射用水定容，搅拌均匀，将上述药液微孔滤膜过滤后灌装至西林瓶中，冷冻干燥，即得注射用丹参多酚酸。

[0136] 目前，丹参多酚酸提取物、制剂(例如注射剂)的质量标准中对于指纹图谱研究十分不完善，考虑到中药制剂的特殊性及临床安全性，单纯以几种成分的含量来表征制剂质量是不全面的。此次建立UPLC色谱指纹图谱方法，结合液质进行峰指认，确定了23个紫外检测共有指纹峰，充分表征了中药制剂的整体性和复杂性，同时考虑到制剂中含有紫外吸收较弱的成分，在检测器选择上选择了 288和330两种紫外检测波长。在数据处理上，本发明选择了孙国祥教授等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，该软件与中国药典委发布的指纹图谱软件相比，优势明显，可以反映出制剂批次间的一致性及稳定性。本研究对于丹参多酚酸提取物、制剂药效物质基础研究、质量控制及其临床用药具有一定的指导意义。

[0137] 本发明通过UPLC指纹图谱定性+特定起效成分(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B为已知成分中含量较大的三个成分，且结构明确，其中丹酚酸B为注射用丹参多酚酸中主要活性成分，具有抗血小板凝集，抗血栓，抗脑微粒体脂质过氧化和清除自由基的作用)定量的方式，从整体和关键组分两方面共同实现质控标准的提升。相比于现有技术，不仅全面而特定定量的确定了产品的质量可控性，而且由于UPLC技术的引入，大大缩短了现有的普遍采用HPLC技术的测定时间，使得全产品指纹图谱的复杂性表征得以实现。同时，对于具体的特定指证成分选用与HPLC相结合的组合测定方式，也在充分保证产品质量，定性产品性能之外兼顾了测定成本的节约。检测结果具有很好的重现性和稳定性，且利于工业产业推广，适合作为产品质控标准大规模实施。附图说明

[0138] 图1不同色谱柱对丹参多酚酸提取物分离的液相色谱图

[0139] 图2不同洗脱梯度对丹参多酚酸提取物样品分离的液相色谱图(检测波长330nm；图注为ACN比例)

[0140] 图3不同洗脱梯度对丹参多酚酸提取物样品分离的液相色谱图(检测波长330nm；图注为有机相比例)

[0141] 图4不同洗脱梯度对丹参多酚酸提取物样品分离的液相色谱图(图3局部放大，检测波长330nm)

[0142] 图5丹参多酚酸提取物样品UPLC色谱图(280nm)

[0143] 图6丹参多酚酸提取物样品qTOF-MS总离子流图

[0144] 图7最终色谱条件下对丹参多酚酸提取物的分离色谱图(288nm)

[0145] 图8对照品与丹参多酚酸样品HPLC色谱图(1.迷迭香酸；2.紫草酸；3.丹酚酸B)[0146] 图9不同检测波长对丹参多酚酸混合对照品分离的液相色谱图(自上而下，依次是(A)250nm；(B)280nm；(C)330nm；(D)360nm.)

[0147] 图10 21批丹参多酚酸提取物的UPLC/MS紫外谱图重叠图(280nm)

[0148] 图11 3批丹参多酚酸提取物含量测定HPLC叠加图

具体实施方式

[0149] 实施例1

[0150] 步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；

[0151] (1)仪器与试药：Waters UPLC system,串联Xevo G2qTOF质谱仪。丹参多酚酸提取物由天士力之骄药业有限公司提供。乙腈和甲醇为色谱纯(默克公司)、甲酸为色谱纯(sigma)、超纯水。对照品丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸均购自中国食品药品检定研究院，紫草酸(天津马克生物技术)、丹酚酸D(天津一方科技有限公司)、丹酚酸A(南通飞宇)、丹酚酸-LM(天士力公司制备)。

[0152] (2)对照品溶液的制备：

[0153] 分别称取丹酚酸B对照品约5mg；迷迭香酸、紫草酸对照品各约3mg；丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM对照品各约2mg，于5mL容量瓶，以超纯水定容，摇匀，过微孔滤膜(0.22μm)，取续滤液，即得。

[0154] (3)供试品溶液的制备：分别精密称定21批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水，定溶至10ml容量瓶中，溶解后过0.22μm滤膜，稀释成浓度为1mg/mL的溶液；

[0155] (4)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液2μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得；

[0156] 其中，色谱条件如下：

[0157] 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18,1.8μm,2.1x 150mm；

[0158] 流动相：溶剂A：水，含0.2％甲酸；溶剂B：乙腈，含3％甲醇；

[0159] 梯度洗脱：

[0160] 0-3min,12-18％B；3-15min,18％B；15-17min,18-20％B；17-25min,20％B；25-28min,20-23％B；28-35min,23％B；35-40min,23-40％B；40-45min,40-95％B；45-50min,
95％B；

[0161] 温度：30℃；

[0162] 流速：0.2ml/min；

[0163] 色谱图光谱采集范围：190～400nm。

[0164] 步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；

[0165] 质谱条件如下：

[0166] qTOF采用(-)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；

[0167] 扫描范围：m/z100-1200；

[0168] 碰撞能量：6eV；

[0169] MSE梯度裂解能：20-40eV；

[0170] 用上述色谱条件对21批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分析。对各样品的23个共有峰紫外光谱图进行对比分析。所得紫外谱图如图10所示。

[0171] 利用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件计算各批次指纹图谱的相似度。

[0172] 采用表1中所示的系统指纹定量法标准，对21批样品进行质量评价。结果见表6：

[0173] 表6.计算中药系统指纹定量法第2级评价结果

[0174]Para. Sm P2％ α Grade 质量
S1 0.966 63.8 0.015 Ⅵ 一般
S2 0.443 2.1 1.243 Ⅷ 劣
S3 0.957 45.3 0.038 Ⅷ 劣
S4 0.969 70 0.031 Ⅵ 一般
S5 0.965 62.2 0.039 Ⅵ 一般
S6 0.987 65 0.012 Ⅵ 一般
S7 0.982 64 0.035 Ⅵ 一般
S8 0.955 98.7 0.009 Ⅰ 极好
S9 0.944 96.4 0.015 Ⅱ 很好
S10 0.986 100.6 0.021 Ⅰ 极好
S11 0.992 104.3 0.007 Ⅰ 极好
S12 0.994 107.9 0.011 Ⅱ 很好
S13 0.992 109.3 0.019 Ⅱ 很好
S14 0.969 106.9 0.019 Ⅱ 很好
S15 0.991 103.7 0.006 Ⅰ 极好

[0175] S16 0.992 106.3 0 Ⅱ 很好S17 0.986 104.3 0.015 Ⅰ 极好
S18 0.994 94.3 0.012 Ⅱ 很好
S19 0.988 106.9 0.001 Ⅱ 很好
S20 0.973 94.3 0.031 Ⅱ 很好
S21 0.979 94.8 0.005 Ⅱ 很好

[0176] 结果分析：S1-S7批次质量不合格，与这七批为生产批次较早的过期产品相吻合，表明该方法能较好的鉴定出药品质量，很好的区分出质量差异较大，生产批次较早的过期产品，可用于对生产药品的质量进行检验。

[0177] 步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。

[0178] (1)仪器和试药：Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent Technologies,Germany)，配有四元泵、自动进样器、柱温箱以及VWD检测器；METTLER TOLEDO 电子天平(XS型)；5批丹参多酚酸(天津天士力之骄药业有限公司提供)；丹酚酸B对照品(USP，纯度95％，批号：F0M013)；迷迭香酸对照品(USP，纯度99.4％，批号：F0M076)；紫草酸对照品(天津天士力中药所提供，纯度95.37％，批号：12092801)；甲醇(色谱纯，Merck)；乙腈(色谱纯,Merck)；超纯水；甲酸(试剂级，Sigma-Aldrich)。

[0179] (2)供试品溶液的制备：精密称取3批丹参多酚酸提取物各15mg，加初始流动相溶解并定容到25mL，摇匀，即得。

[0180] (3)混合对照品溶液的制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为120.50μg/mL，紫草酸质量浓度为121.10μg/mL，丹酚酸B质量浓度为1520.00μg/mL的混合对照品溶液。

[0181] (4)精密吸取供试品溶液2μL，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量；

[0182] 其中，色谱条件如下：

[0183] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm,5μm)；

[0184] 流动相：A相：水，含0.5％的甲酸；B相：含2％的甲醇和0.5％的甲酸；

[0185] 梯度洗脱：0～40min，20％B；40～50min，20-70％B；

[0186] 流速：1mL·min-1；

[0187] 柱温：30℃；

[0188] 检测波长288nm；

[0189] 测定结果见表7，HPLC叠加图见图11。

[0190] 表7.3批丹参多酚酸提取物中各成分含量

[0191]

[0192] 实施例2

[0193] 步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；

[0194] (1)对照品溶液的制备：

[0195] 分别称取丹酚酸B对照品约2.5mg；迷迭香酸、紫草酸对照品各约1.5mg；丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM对照品各约1mg，于5mL容量瓶，以超纯水定容，摇匀，过微孔滤膜(0.22μm)，取续滤液，即得。

[0196] (2)供试品溶液的制备：分别精密称定10批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水，定溶至10ml容量瓶中，溶解后过0.22μm滤膜，稀释成浓度为5mg/mL的溶液；

[0197] (3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液1μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得；

[0198] 其中，色谱条件如下：

[0199] 色谱柱：Waters HSS T3C18，1.7μm，2.1x 150mm；

[0200] 流动相：溶剂A：水，含0.1％甲酸；溶剂B：乙腈，含2％甲醇；

[0201] 梯度洗脱：

[0202] 0-3min,12-18％B；3-15min,18％B；15-17min,18-20％B；17-25min,20％B；25-28min,20-23％B；28-35min,23％B；35-40min,23-40％B；40-45min,40-95％ B；45-50min,
95％B；

[0203] 温度：40℃；

[0204] 流速：0.3ml/min；

[0205] 色谱图光谱采集范围：190～400nm。

[0206] 步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；

[0207] 质谱条件如下：

[0208] qTOF采用(-)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；

[0209] 扫描范围：m/z100-1200；

[0210] 碰撞能量：6eV；

[0211] MSE梯度裂解能：20-40eV；

[0212] 用上述色谱条件对10批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分析。对各样品的23个共有峰紫外光谱图进行对比分析。

[0213] 利用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件计算各批次指纹图谱的相似度。

[0214] 采用表1中所示的系统指纹定量法标准，对10批样品进行质量评价。

[0215] 步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。

[0216] (1)供试品溶液的制备：精密称取丹参多酚酸提取物，加初始流动相溶解并定容到1.2mg/mL，摇匀，即得。

[0217] (2)混合对照品溶液的制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为100μg/ml，紫草酸质量浓度为150μg/ml，丹酚酸B质量浓度为1.0mg/ml的混合对照品溶液。

[0218] (4)精密吸取供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量；

[0219] 其中，色谱条件如下：

[0220] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm,5μm)；

[0221] 流动相：A相：水，含0.3％的甲酸；B相：含3％的甲醇和0.3％的甲酸；

[0222] 梯度洗脱：0～40min，20％B；40～50min，20-70％B；

[0223] 流速：0.9mL/min；

[0224] 柱温：35℃；

[0225] 检测波长288nm；

[0226] 实施例3

[0227] 步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；

[0228] (1)对照品溶液的制备：

[0229] 分别称取丹酚酸B对照品约7.5mg；迷迭香酸、紫草酸对照品各约2mg；丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM对照品各约2.5mg，于5mL容量瓶，以超纯水定容，摇匀，过微孔滤膜(0.22μm)，取续滤液，即得。

[0230] (2)供试品溶液的制备：分别精密称定50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水，定溶至10ml容量瓶中，溶解后过0.22μm滤膜，稀释成浓度为3mg/mL的溶液；

[0231] (3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液5μL，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，即得；

[0232] 其中，色谱条件如下：

[0233] 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18,1.8μm,2.1x 150mm；

[0234] 流动相：溶剂A：水，含0.5％甲酸；溶剂B：乙腈，含5％甲醇；

[0235] 梯度洗脱：

[0236] 0-3min,12-18％B；3-15min,18％B；15-17min,18-20％B；17-25min,20％B；25-28min,20-23％B；28-35min,23％B；35-40min,23-40％B；40-45min,40-95％B；45-50min,
95％B；

[0237] 温度：35℃；

[0238] 流速：0.2ml/min；

[0239] 色谱图光谱采集范围：190～400nm。

[0240] 步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；

[0241] 质谱条件如下：

[0242] qTOF采用(-)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；

[0243] 扫描范围：m/z100-1200；

[0244] 碰撞能量：6eV；

[0245] MSE梯度裂解能：20-40eV；

[0246] 用上述色谱条件对50批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分析。对各样品的23个共有峰紫外光谱图进行对比分析。

[0247] 利用“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件计算各批次指纹图谱的相似度。

[0248] 采用表1中所示的系统指纹定量法标准，对50批样品进行质量评价。

[0249] 步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。

[0250] (1)供试品溶液的制备：精密称取丹参多酚酸提取物，加初始流动相溶解并定容到1.0mg/mL，摇匀，即得。

[0251] (2)混合对照品溶液的制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为150μg/ml，紫草酸质量浓度为100μg/ml，丹酚酸B质量浓度为2.5mg/ml的混合对照品溶液。

[0252] (4)精密吸取供试品溶液1μL，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量；

[0253] 其中，色谱条件如下：

[0254] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm,5μm)；

[0255] 流动相：A相：水，含0.6％的甲酸；B相：含4％的甲醇和0.6％的甲酸；

[0256] 梯度洗脱：0～40min，20％B；40～50min，20-70％B；

[0257] 流速：1.1mL/min；

[0258] 柱温：30℃；

[0259] 检测波长288nm。

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