具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽
阅读：521发布：2024-02-16
专利汇可以提供具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有抗 肿瘤 和抗血管生成特性的环肽，以及其药学上可接受的盐和包含其的药物组合物。这些环肽被用于制备用于人类和/或 兽医学 治疗 的药物，并且还可以在诊断中使用。这些化合物可以用于检测、监测和/或控制各种各样与 细胞增殖 相关的病症，例如肿瘤学 疾病 和不希望的血管生成。此外，它们可以构成受 控释 放系统和纳米 生物 技术领域中的系统的一部分，要么通过其自装配能 力 ，要么作为其他系统的一部分。，下面是具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽专利的具体信息内容。
1.具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽，其特征在于，该环肽的氨基酸序列包含：
a)其氨基酸序列为下列序列的区段：
1 2 3 4
X-Asn-Thr-X-Arg-Asp-Phe-X-X
其中，
1
X 为从由Ser，Cys，Lys，Asp，Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸；或者为从由四肽、五肽和六肽组成的组中选择的序列，
2
X 为氨基酸Gly或D-Ala，
3
X 为从由Leu、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
4
X 是任选的并且为从由Ser、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸；
b)任选的并且处于在a)中所描述的区段之前的N-末端区段，其氨基酸序列为：
-5 -4 -3 -2 -1
X -Asp-Thr-Val-X -X -X -X
其中，
-1
X 为从由Asn、D-Asp、D-Glu、D-Gln和D-Ala组成的组中选择的氨基酸，并通过肽键而
1 -1
连接至在a)中所描述的区段的残基X，并且所述肽键包含残基X 的主链羰基基团和在a)
1
中所描述的区段的残基X 的主链氨基基团，
-2
X 为从由Phe、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
-3
X 为从由Gly和D-Ala组成的组中选择的氨基酸，
-4
X 为从由Tyr、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
-5
X 为从由Gly和D-Ala组成的组中选择的氨基酸；
c)任选的并且处于在a)中所描述的区段之后的C-末端区段，其氨基酸序列从由+1 +2 +1 +2 +3 +1 +2 +3 +4
Thr-X X 、Thr-X -X -X 和Thr-X -X -X -X 组成的组中选择，
其中，
所述C-末端区段的N-末端残基Thr通过肽键而连接至在a)中所描述的区段，所述肽
4
键包含所述N-末端残基Thr的主链氨基基团和在a)中所描述的区段的残基X 的主链羰基基团，
+1
X 为从由Thr、Gly和Ala组成的组中选择的氨基酸，
+2
X 为从由Ser、Asn、Cys、Lys、Asp、Glu和在侧链中包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
+3
X 为从由Cys、Gln、Arg、Asn、Lys、Asp、Glu和在侧链中包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
+4
X 为从由Gln、Arg、Asn和Lys组成的组中选择的氨基酸；
d)至少一个从由下列键组成的组中选择的共价键：肽键，其包含该肽的N-末端和
1
C-末端的氨基基团和羰基基团，如果在a)中所描述的区段的序列X 为四肽、五肽或六肽的
1 4 -4 3 -2 +2
序列，那么所述肽键是存在的；二硫化物共价键，其包含残基X 和X 或X 和X 或X 和X-2 +3 1 4 -4 3 -2 +2 -2 +3
或X 和X 的侧链巯基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X 和X 为
1 4 -4 3
半胱氨酸或其侧链包含巯基基团的非天然氨基酸；酰胺键，其包含残基X 和X 或X 和X-2 +2 -2 +3 1 4 -4 3
或X 和X 或X 和X 的侧链羰基基团和氨基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或-2 +2 -2 +3
X 和X 或X 和X 为Lys（或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸）和Glu（或Asp或其
1 4 -4 3 -2 +2 -2
侧链包含羰基基团的非天然氨基酸），或者所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X 和+3
X 分别为Glu（或Asp或其侧链包含羰基基团的非天然氨基酸）和Lys（或其侧链包含氨基-2
基团的非天然氨基酸）；和酰胺键，其包含该肽的末端羰基基团和残基X 的侧链氨基基团，+2 -2
如果残基X 为该肽的羧基末端的残基且为氨基酸Asn，并且X 为氨基酸Lys或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸，那么所述酰胺健是存在的。
2.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽包含有在该肽的N-末端和C-末端的
1
氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 为四肽的氨基酸序列，优选地从由(D-Ser)-Pro-Thr-Pro、(D-Ala)-Pro-Thr-Pro和Gly-Pro-Thr-Pro组成的组中选择的序列。
3.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽包含有在该肽的N-末端和C-末
1
端的氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 为五肽的氨基酸序列，优选地从由Arg-Arg-Pro-Asn-Ser、Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser、Lys-Lys-Pro-Asn-Ser 和Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser组成的组中选择的序列。
4.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽包含有在该肽的N-末端和C-末端的
1
氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 为六肽的氨基酸序列，优选地从由Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser和Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser组成的组中选择的序列，其中BmGln为氨基酸L-b-甲基谷氨酰胺，并且NmAsn为氨基酸L-N-甲基天冬酰胺。
5.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽的N-末端共价地连接至乙酰基基团、焦谷氨酸、脂质或聚合物，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且该连接直接地或者通过间隔基团而建立，所述间隔基团优选地为氨基酸Gly。
6.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽的C-末端以酰胺形式存在，或者共价地连接至脂质或聚合物，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且该连接直接地或者通过间隔基团而建立，所述间隔基团优选地为氨基酸Gly。
7.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽包含有在该肽与脂质或聚合物之间的
1 3 4 -2 -4 +2
共价键，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且所述共价键包含残基X、X、X、X 、X 、X 或+3 1 3 4 -2 -4 +2 +3
X 的侧链巯基基团、氨基基团或羧基基团，并且所述残基X、X、X、X 、X 、X 或X 为氨基酸Cys、Lys、Asp、Glu或者其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸。
1 3 4 -2 -4 +2 +3
8.根据权利要求1的环肽，其特征在于，X、X、X、X 、X 、X 或X 从由下列物质组成的组中选择：半胱氨酸、(2R)-2-氨基-3-硫烷基丁酸、(2R)-2-氨基-3-甲基-3-硫烷基丁酸、(2S)-2-氨基-4-硫烷基丁酸、2-氨基-5-硫烷基-戊酸、2-氨基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-4-甲基-3-硫烷基戊酸、2-氨基-3-甲基-4-硫烷基戊酸、2-氨基-3,4-二甲基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-3-乙基-3-硫烷基戊酸、(2R)-2-氨基-3-甲基-3-硫烷基戊酸、(4S)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-5-硫烷基戊酸和(4S)-4-氨基-5-硫烷基戊酸。
1 3 4 -2 -4 +2 +3
9.根据权利要求1的环肽，其特征在于，X、X、X、X 、X 、X 或X 从由下列物质组成的组中选择：氨基酸Lys、2-[双(3-氨基丙基)氨基]乙酸、(2S)-2,5-二氨基戊酸、
2,2-二氨基乙酸、(3S)-3,4-二氨基丁酸、(2R)-2,4-二氨基丁酸、(2S)-2,4-二氨基丁酸、(2S)-2,3-二氨基丙酸、(2R)-2,3-二氨基丙酸、2-[(2-氨基乙基)氨基]乙酸、2-[(3-氨基丙基)氨基]乙酸、2-[(4-氨基丁基)氨基]乙酸、(4S)-4,8-二氨基辛酸、(2S)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸、(2S)-2-氨基-3-[4-(2-氨基乙氧基)苯基]丙酸、2-(哌啶-4-基氨基)乙酸、(2S)-2-氨基-4-[(5R)-2,2-二甲基-1,3- 唑烷-5-基]丁酸、(2S)-2-氨基-6-(甲基氨基)己酸、(2R,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸或(2R,4S)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸、2-(4-氨基哌啶-4-基)乙酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、(2S,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸和咪唑烷-2-羧酸。
1 3 4 -2 -4 +2 +3
10.根据权利要求1的环肽，其特征在于，X、X、X、X 、X 、X 或X 从由下列物质组成的组中选择：氨基酸Glu、Asp、3-[(羧甲基)氨基]丙酸、2-[(羧甲基)氨基]乙酸、
3-[(2-羧乙基)氨基]丙酸、(3R)-3-氨基己二酸、4-氨基庚二酸、4-氨基哌啶-1,4-二羧酸、(2S,4S)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸、2-[(羧甲基)氨基]乙酸、(2S)-2-氨基-6-[(羧甲基)氨基]己酸、3-[(2-羧乙基)氨基]丙酸、(2S)-2-氨基庚二酸、(2S)-2-氨基辛二酸、(2R)-2-氨基-3-[(2-羧乙基)硫烷基]丙酸、(2R)-2-氨基-3-[(羧甲基)硫烷基]丙酸、4-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}丁酸和(2S)-2-氨基-3-[4-(羧基甲氧基)苯基]丙酸。
11.根据权利要求1的环肽，其特征在于，该环肽的氨基酸序列从由在序列表中标识为SEQ ID1-76的序列组成的组中选择。
12.根据前述权利要求中任一项的环肽在制备用于治疗癌症或治疗不希望的细胞增殖的病症的药物或者抗血管生成的药物中的用途。
13.用于治疗癌症、不希望的细胞增殖的病症和不希望的血管生成的方法，其特征在于，向有此需要的个体施用包含有效量的至少一种根据权利要求1-11的肽的药物组合物。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述药物组合物还包含从由非荧光基团、荧光半导体颗粒、顺磁性或超顺磁性试剂和放射性同位素组成的组中选择的试剂。
15.药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1-11的肽和药学上可接受的赋形剂或载体。
16.根据权利要求15的药物组合物，其特征在于，所述肽构成受控释放系统和属于纳米生物技术领域的系统的一部分。
17.根据权利要求16的药物组合物，其中所述受控释放系统可以形成脂质体。
18.根据权利要求16的药物组合物，其中所述受控释放系统可以形成微球体。
19.根据权利要求16的药物组合物，其中所述受控释放系统可以形成具有根据权利要求1至11的肽的自装配结构。
20.根据权利要求15的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含从由半导体颗粒、顺磁性或超顺磁性试剂和放射性同位素组成的组中选择的试剂。
21.用于癌症诊断的化合物，其特征在于，所述化合物包含至少一种根据权利要求
1-11的肽和用于成像的试剂，所述用于成像的试剂从由荧光基团、非荧光基团、荧光半导体颗粒、顺磁性或超顺磁性试剂和放射性同位素组成的组中选择。
22.药物组合，其包含至少一种根据权利要求1-11的肽以及至少一种从由抗癌药物和激素组成的组中选择的治疗试剂。
23.根据权利要求22的组合，其特征在于，所述肽通过共价键而直接缀合至所述治疗试剂。
24.根据权利要求22的组合，其特征在于，所述肽通过偶联元件而缀合至所述治疗试剂。
25.根据权利要求24的组合，其特征在于，所述偶联元件从由氨基酸残基、烃基和经取代的烃基组成的组中选择。
26.药物组合，其包含至少一种根据权利要求1-11的肽和灵菌红素类或其衍生物。
具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽
技术领域
[0002] 癌症是一种以细胞的不受控制的分裂和生长为特征的疾病。所述细胞具有侵袭其所源自的器官、通过血液和淋巴液游走至更远的其他器官并在其中生长的能力。这是一个非常异质的过程，其包括超过200种类型的具有非常不同的演变的癌症。为了形成该疾病，需要各种基因的同时改变。这些特征增加了研究和理解这些恶性病理学状况的复杂性，因此癌症主题是非常广泛的、多学科的，并且涉及众多的研究路线。该疾病在世界范围内是第二大死亡原因，并且预计至2020年将变成为世界上最常见的死亡原因，因为将会超过心血管疾病（FortezaF(2004)Avances médicos de Cuba.40:33）。
[0003] 癌症在经济发达国家中是主要的死亡原因和在发展中国家中是第二主要的死亡 原 因（World Health Organization.The Global Burden of Disease:2004Update.Geneva:World Health Organization;2008）。由于老龄人口增长以及越来越多地采取与癌症形成相关的生活方式（身体缺乏活动、吸烟习惯和饮食的“西方化”），癌症发病率在经济发展中国家中增长。
[0004] 在GLOBOCAN2008中，估计在2008年有1270万癌症患者的发病率和760万的癌症死亡；其中，56%的病例和64%的死亡出现在经济发展中的世界之中（Ferlay J,Shin HR,BrayF,Forman D,Mathers CD,Parkin D.GLOBOCAN2008,Cancer Incidence and Mortality Worldwide:IARC Cancer Base No.10.Lyon,France:International Agency for Research on Cancer；可从http://globocan.iarc.fr.2010.Revisado8/17/2010得到）。
[0005] 癌症的存活率在发展中国家中倾向于更差，这可能是由于迟的诊断与对于适时且正常的治疗的有限获得的组合。虽然已开发了许多细胞毒性药物并且已经就癌症的治疗进行了完善，但仍需要新的生物分子以在未来产生更加有效且选择性的新一代抗癌药物，其将渗入癌症治疗学市场的很大一部分。
[0006] 目前接受的观念是：针对癌症的有效治疗是组合了不同作用原理（例如，对于肿瘤细胞的直接作用和对于肿瘤环境的作用）的那种。它可以如此来取得：通过各自独立地具有这些特性之一的分子的组合，或者通过同时具有这两种特性的分子。在逻辑上，这后一种类型的分子从药理学和经济的角度而言是更有利的。使用血管生成的抑制剂的临床前试验（目的是中断向肿瘤的氧气和营养供应）是非常有希望的，其常常显示出完全的或部分的肿瘤退行，而没有任何对于药物的抗性。迄今为止，临床研究中的主要成就已经使该疾病稳定了一段持续的时间。为此，目前与其他抗肿瘤治疗相组合地，采用了抗血管生成试剂作为辅助疗法。
[0007] 临床研究的结果已显示，血管生成的单个调节物的抑制不足以使该应答持续。存在对于能够阻止以及逆转肿瘤生长的更有效的抗血管生成试剂的需要，以便取得相比于当前的治疗而言存活率和生活质量的显著提高。
[0008] 虽然目前存在的肽是所有目前的治疗学试剂的一小部分，但其潜力通过修饰其结构、药物代谢动力学、生物分布、稳定性和其在临床前情境下的应用的新技术而得到改善。特别地，它们已在癌症的治疗中赢得了重要性，因为存在用于修饰它们并增加其抗癌效力的新的方法（Li,Zhi J.;Cho,Chi H.Current Pharmaceutical Design,16(10),April2010,第1180-1189页）。
[0009] 已进行了各种研究，其中证明了在癌症的诊断和治疗中使用肽的可行性。它们之中的一些处于临床开发的高级阶段，而其他新一代在近年中正在出现，它们具有令人鼓舞的临床前结果。
[0010] 为结合至表皮生长因子受体而设计的裂解肽的细胞毒性活性在各种人癌细胞系上得到了证明。证明了由于该结合而产生的在新的裂解肽中的构象改变增加了其与癌细胞的膜结合的选择性，并且由于所获得的协同作用，显示出肿瘤细胞的选择性破坏。用表皮生长因子受体的裂解肽进行的治疗展示出足够的针对由于K-ras突变而对于酪氨酸激酶抑制剂（TKI）具有抗性的癌细胞的体外细胞毒性活性（Kohno,Masayuki.European Journal of Cancer47(5),第773页,Mar2011）。
[0011] 为了提高基于与寡核苷酸的结合的癌症治疗，常常将其与促进向细胞中的进入的肽相偶联。为此，设计了由与Oct6NLS的N-末端相偶联的谷氨酸肽组成的细胞穿透肽，其已显示出核共定位以及其被胰腺癌和前列腺癌的细胞系的捕获（Lewis,H Dan.BMC Biotechnology,10(1),第79页,Oct2010）。
[0012] 属于组织因子途径抑制蛋白（TFPI）的片段的肽（一种天然存在的抗凝蛋白）在体内模型中阻断肿瘤生长和血管生成。此外，它抑制肿瘤的转移和血管的生长，并且不明显地影响正常血管（HEMBROUGH Todd A.;RUIZ Jose F.;SWERDLOW Bonnie M.;SWARTZ Glenn M.;HAMMERS Hans J.;ZHANG Li;PLUM Stacy M.;WILLIAMS Mark S.;STRICKLAND Dudley K.;PRIBLUDA Victor S.Blood A.2004,vol.103,n°9,第3374-3380页）。
[0013] 开发用于影像检验和治疗不同肿瘤的更具选择性的试剂是癌症诊断和治疗中的当前趋势。所述肽是可以为了与预先确定的分子靶标结合而获得或设计的小的氨基酸序列，并且它们潜在地能够干扰该分子靶标的功能。这些特别的肽可以抑制在癌症形成及其进展中不可缺少的单个信号组分。
[0014] 沙雷氏菌溶素是粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）CMIB4202的主要的细胞外蛋白，并且与该微生物在人中的致病性相关，并且还给其分派了依赖于其催化活性的抗肿瘤特性（Wu Jun,Akaike T,Hayashida K等人,(2001)Japanese J.Cancer Res.92:439-451）。在所述菌株（粘质沙雷氏菌CMIB4202）中，主要的细胞外蛋白为属于沙雷氏菌溶素家族（SERMA）的蛋白p50。已知属于该沙雷氏菌溶素的非催化性C-末端结构域的多肽（称为p25）是体内内皮增殖以及原发性肿瘤生长和转移的强有力的抑制剂（Abrahantes-Pérez MC等人,“Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”.具有国际公开号WO2006/005268的专利申请）。当所述多肽通过重组方法在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达时，其被称为CIGB370r。
[0015] 尽管存在有多种在癌症的治疗中使用的药物，但是由于该疾病的不断增长的发病率，鉴定和获得更强有力的抗肿瘤试剂仍是令人有巨大兴趣的，所述更强有力的抗肿瘤试剂可以对在有此需要的个体中该病理学状况的疗法进行替代或补充。
[0016] 发明描述
[0017] 本发明通过提供具有抗肿瘤和抗血管生成特性的环肽而有助于解决上面提及的问题。在本文中，提出了这些肽化合物的设计和获得，并证明了其在各种癌症动物模型中的效力。
[0018] 令人惊奇地，粘质沙雷氏菌的多肽p25的抗肿瘤活性通过在结构上受约束的肽片段而得到再现，所述片段几乎不暴露在沙雷氏菌溶素的N-和C-末端结构域的界面中，这暗示所述多肽的该区域的结构构象是多肽p25的最小的在功能上具有活性的结构单元，其隐藏在沙雷氏菌溶素中并且可能在沙雷氏菌溶素的自身催化期间或者在肿瘤的蛋白水解环境中被暴露。所给出的数据证明本发明的受约束的肽具有直接的对于肿瘤细胞的细胞毒性活性和抗血管生成活性，并且暗示由感染介导的肿瘤退行的可能机制和新范例。
[0019] 所述肽是真正地柔韧的分子，并如此可以采取不同的结构。一种或多种其可能结构可以具有特定的生物学重要性。为了确定哪些构象是重要的，需要将所述肽限制于单一的构象空间区域，然后确定这是否是其有用的形式。通过检查许多这些构象，可能确定哪一个是生物学上重要的。
[0020] 存在有新的用于产生更精确的合成结构的方法。应当考虑，它们应当保持某种柔韧性。即，如果所设计的结构过于刚性，就不可以采取具有对于其体内生物学活性而言希望的特性的其他结构，其中考虑到轻微柔韧的结构能够实现该调整。用适合于设计合成肽的技术和方法，获得了有价值的关于对于肽的受体、酶的活性位点和多种多样的其他生物学过程而言的必要条件的认识。
[0021] 在生物系统中肽的特性取决于其结构。因此，使用合理的设计以产生有用的肽的能力取决于确定分子结构与生物学活性的特定关系的相应能力。辨识这些关系的能力由各种各样的不确定性决定，无论在生物学试验系统中还是在数据解释中。更复杂的因素是在测定肽本身的三维结构中的困难。许多肽固有地是柔韧的并因此在溶液中采取许多构象。问题在于测定这些构象中的哪个负责所观察到的肽活性，并且许多肽可以在超过一种的构象下是有活性的。构象约束的使用对于阐明这些结构-功能关系是有用的。如果肽被限制于特定的构象或与具有活性构象的家族紧密相关，那么所测得的活性就反映了该结构。尽管完全刚性的分子是不可能的，但是通过产生具有指定的结构基元的类似物，也可以开始将某些生物学活性归因于其构成原因的结构。
[0022] 在本发明中，通过使用以10个氨基酸重叠的具有20个氨基酸的合成肽并检验在体外对于肿瘤细胞的细胞毒性活性（参见实施例2）而得到的p50/p25的序列的功能位点的肽图谱表明，肽Gly255-Ser274（N06P87）是有活性的。尽管如此，该肽的体内活性低于对于蛋白p25所观察到的活性。另外，在与p25相同的重组多肽（CIGB370r）中以及在合成肽N06P87中将区段Gly266-Asp268用三肽Ala-Ala-Ala进行的置换取消了这两种分子的生物学活性，这表明该区段对于抗癌活性来说是必不可少的。该结果还暗示，残基Arg267和Asp268的一个或两个侧链在与受体的相互作用中是必不可少的（还未鉴定），尽管该三重突变对于该肽和在生物学上有活性的蛋白质的构象的负面效应也是可想得到的。在该意义下，如果假定该三肽的在生物学上相关的局部结构与在p50的晶体结构中所采取的相似，那么Gly266被Ala的置换就是高度不利的；因为该残基的主链采取了对于丙氨酸来说禁止的正的扭转角（图14）。另外，实施例2的结果还显示，区段Gly266-Asp268本身的存在对于取得生物学效应来说不是足够的，并且还需要其他残基。如在表2中所观察到的，相应于序列Thr265-Trp284并且以10个残基与线性肽N06P87（Gly255-Ser274）相重叠的合成肽F07P16是无活性的，尽管包含序列Gly266-Asp268。
[0023] 在本发明中，由于区段Gly255-Ser274在蛋白p50的3D结构中的隐蔽特征，将该区段鉴定为负责蛋白p50/p25的抗癌活性的功能位点的一部分是令人惊奇的。区段Gly255-Ser274的大多数氨基酸被全部或部分地隐藏在p50的3D结构的内部，包括残基Thr257、Tyr258、Gly259、Phe260、Thr265、Arg267、Phe269、Leu270和Thr272。转角Arg267-Leu270构成该蛋白质的N-末端结构域与C-末端结构域之间的界面表面的一部分。残基Arg267和Asp268与N-末端结构域的残基Asp98和Arg171分别形成盐桥（各自地，双氢桥）。该界面还包括具有疏水特征的结构域间相互作用，其涉及C-末端结构域的残基Phe269以及N-末端结构域的残基Ala232和Ala233。另外，该位点的隐蔽特征与所观察到的蛋白p25相比于p50而言更大的效能是一致的，因为p25不包含N-末端结构域并且具有区段Gly255-Ser274的更大暴露（参见实施例3，图5，表3）。
[0024] 在本发明中，证明了肽N06P87的构象在其生物学活性中是必不可少的。肽N03P87的构象在其抗肿瘤活性中的重要性得到了实施例4的结果的支持，所述结果显示其活性依赖于其侧翼区域，后者保证了该分子的正确折叠。此外，当通过重组方法表达多肽p25并且在其复性过程中不添加钙时，它不具有生物学活性。因此，相应于没有钙原子的多肽的非折叠制备物是无活性的（钙的结合对于该蛋白质的正确折叠和稳定性来说是必需的）。另外，实施例4显示，在肽N06P87中引入二硫桥（通过在N-末端添加一个半胱氨酸和在C-末端添加另一个半胱氨酸）引起该肽的生物学活性的丧失（表4的肽N06P89，图7）。通过该方式引入的环化减小了在溶液中该肽的可达到的构象空间，然而这是与区段Gly255-Ser274在p50的折叠结构中所采取的构象不相容的。在该蛋白质的晶体结构中区段Gly255-Ser274的氨基末端和羧基末端之间的距离为24.4 （图10E），这与二硫桥的立体化学是不相容的（在相连接的半胱氨酸之间的“α-碳－α-碳”距离不超过7 ）。因此，该修饰预示了N06P87的肽链的结构特性的显著改变。这些结果及其相应的分析暗示，N06P87的活性构象可能与由天然的多肽p25的区段Gly255-Ser274所采取的构象相似。
[0025] 如在实施例2、4和6中所显示的，设计具有多肽p25的生物学活性的肽类似物是可行的。在本发明中，给出了强有力的短和中等长度的（9-25个残基）肽家族的设计，所述肽基于肽N06P87的结构并且通过引入/置换确定的化学基团和/或结构限制进行了修饰（表5），所述化学基团和/或结构限制允许这些肽显示与多肽p25近似或比多肽p25大的效力和效能值。
[0026] 除了其高的效力和效能之外，本发明的短和中等长度的肽作为抗癌试剂还具有各种优点，相比于完整的原始蛋白质而言。通常，分子的大小影响抗癌试剂的药物代谢动力学特性（例如，生物分布）。非常熟知的例子是与抗体相比较的重组单链抗体片段（r-sc-Fv），后者更好地接近对于完整抗体来说很少可接近的组织和肿瘤（Cortez-RetamozoV,Backmann N,Senter PD,Wernery U,De Baetselier P,Muyldermans S,Revets
H;(2004).Cancer Res.64(8):2853-7）。抗体疗法的可及范围在实体肿瘤的治疗中特别受到限制（Stern M,Herrmann R;(2005).Crit Rev Oncol Hematol.54(1):11-29）。通常，实验证据表明，药物代谢动力学特性通过使用更小的配体而得到改善（Reilly R.M.,Sandhu J.,Alvarez-Diez T.M.等人,(1995).Clin.Pharmacokinet.28:126142）。短和中等长度的肽（典型地，1-3kDa）可以部分地避开与基于抗体的抗癌疗法相关的并发症（Ladner R.C.,Sato A.K.,Gorzelany J.,de Souza M.(2004).Drug Discov.Today9:525529）。特别地，这些肽可以显示出更好的肿瘤穿透、更小的非特异性获取，和引发更小的免疫应答。因此，本发明的肽除了为了优化与其受体的相互作用而进行设计之外，还应该保证有效的生物分布。
H;(2004).Cancer Res.64(8):2853-7）。抗体疗法的可及范围在实体肿瘤的治疗中特别受到限制（Stern M,Herrmann R;(2005).Crit Rev Oncol Hematol.54(1):11-29）。通常，实验证据表明，药物代谢动力学特性通过使用更小的配体而得到改善（Reilly R.M.,Sandhu J.,Alvarez-Diez T.M.等人,(1995).Clin.Pharmacokinet.28:126142）。短和中等长度的肽（典型地，1-3kDa）可以部分地避开与基于抗体的抗癌疗法相关的并发症（Ladner R.C.,Sato A.K.,Gorzelany J.,de Souza M.(2004).Drug Discov.Today9:525529）。特别地，这些肽可以显示出更好的肿瘤穿透、更小的非特异性获取，和引发更小的免疫应答。因此，本发明的肽除了为了优化与其受体的相互作用而进行设计之外，还应该保证有效的生物分布。
[0027] 通常地，至多20-25个残基的短和中等长度的肽是低免疫原性的，这不同于异源蛋白质，尤其是微生物的抗原，如p25的情况那样。这样的蛋白质作为治疗性试剂的使用可以在患者体内产生免疫应答，其中引起可以中和该蛋白质的治疗效应的抗体的出现。该效应在需要连续使用所述治疗性试剂的慢性疾病的治疗中是特别重要的。此外，如果该微生物是人的病原体，那么可能发生：一定百分比的人具有预先存在的某一水平的中和抗体，这可能升高所必需的治疗剂量。由于区段Gly255-Ser274的分子表面的很大一部分被牵涉在蛋白p50的N-末端结构域与C-末端结构域之间的界面中并因此隐蔽在该蛋白质的天然结构中，因此肽N06P87是潜在地低抗原性的，即抗-蛋白p50的抗体在识别（中和）肽N06P87方面不是有效的。因此，从该治疗性分子的潜在的抗原性/免疫原性的角度来说，更有利的是使用肽而不是完整的蛋白质，尤其是当所述肽能够引起与天然蛋白质相似的生物学效应时。
[0028] 本发明的强有力的抗癌试剂的设计的一个必不可少的要素在于，所设计的肽是环状的，即包含通过涉及侧链的化学基团和/或氨基末端和羧基末端的基团的共价键而连接的氨基酸。因此，在此设计的肽通过环化而在结构上受到约束，这显著地降低了这些分子的结构柔韧性。通常，肽作为治疗性试剂的使用具有许多缺点。这正是所述肽的固有柔韧性的情况；尤其是，短和中等长度的肽比折叠的蛋白质柔韧得多，因此，它们与蛋白质或其他受体大分子的结合过程常常伴随着构象熵的重大损失。该事实有助于：这些分子通常具有低于蛋白质-蛋白质结合的结合亲和力。所述肽所展示出的更小的亲和力（因此还有其效能）还可能与这样的事实相关，即单独的肽-受体接触表面相比于蛋白质-受体界面而言更小，尤其是当所述肽是该天然蛋白质的区段时。为此原因，通常需要对所述肽进行重新设计和化学修饰以增加与受体结合的亲和力（和因此其效能）。
[0029] 以前已鉴定了称为p25的源自由感染介导的肿瘤退行的多肽，其具有抗血管生成效应和对于肿瘤细胞的直接效应（具有国际公开号WO2006/005268的专利申请）。在本发明中，开发了基于肽的平台，所述肽在结构上模仿多肽p25的活性基元并显示出相比于其所源自的分子而言的优点。细菌来源的多肽限制了癌症治疗的循环数；因为可能产生中和其活性的免疫系统应答，和阻碍慢性疾病例如癌症的长时期治疗。为此，在本发明中，将研究指向这样的领域：通过鉴定多肽p25的在功能上有活性的最小单元（其再现该多肽针对肿瘤的活性，但不在肿瘤学病理学状况或不希望的细胞增殖的长时期治疗期间引起免疫系统的负面应答）而获得对于癌症的治疗有用的源自由感染介导的肿瘤退行的分子。
[0030] 本发明的贡献是，可能开发出具有25个或更少的氨基酸的肽分子，其从结构角度来看模仿了源自由感染介导的肿瘤退行的抗肿瘤蛋白的在功能上有活性的最小单元，并且令人惊奇地，这些小分子不发挥其由免疫系统介导的针对肿瘤的活性，如迄今为止在由感染介导的肿瘤退行的范例中所建立的那样（Paglia P和Guzman CA.Cancer Immunol.Immunother.1998.46:88-92）。此外，本发明的另一个新的方面是，这些小的活性区域不位于所述细菌蛋白质的暴露表面上，但是在所述蛋白质的酶消化后改变其暴露表面。这可以出现在富含金属蛋白酶的肿瘤环境中，其中引起针对肿瘤细胞和针对肿瘤的自身血管生成的强有力的细胞毒性效应，从而有助于归结于由感染介导的肿瘤退行的强有力的抗肿瘤活性，所述由感染介导的肿瘤退行是一个多世纪以来的研究领域，但未实现获得可以被转化为在肿瘤治疗学领域中的新的生物技术产品的对于癌症的治疗有用的分子。在本文件中，证明该假说是正确的；因为本发明的肽在长时期治疗中显示出体外和体内抗肿瘤效力，而没有关于限制其持续治疗的中和抗体的存在的证据。其获得技术是可升级的。这些肽的好处是：
[0031] ●具有对于不同组织学来源的肿瘤细胞的广谱作用；
[0032] ●对于肿瘤血管生成的直接作用和对于肿瘤细胞的直接作用；
[0033] ●其作用机制不依赖于p53；
[0034] ●具有对于从人转移中分离的细胞的细胞毒性效应和其随之产生的抗转移效应；
[0035] ●诱导关于肿瘤细胞的凋亡并且对于被激活而进行增殖的细胞是特异的；
[0036] ●具有抗肿瘤作用，要么通过全身途径，要么通过肿瘤内途径；
[0037] ●降低异种移植肿瘤的生长速度并延长荷瘤动物的存活；
[0038] ●在一组肿瘤中引起完全的肿瘤退行；
[0039] ●在长时间的一段时期内，在动物中反复注射后未出现毒性；
[0040] ●具有相比于其所源自的分子而言更大的分布体积；
[0041] ●其生物分布曲线允许治疗具有不同病理学的恶性肿瘤；
[0042] ●其获得技术是经济的；
[0043] ●其药物开发比通过重组方法获得的分子更可行和快速。
[0044] 本发明的目标为具有抗肿瘤形成和抗血管生成活性的环肽，其特征在于，该环肽的氨基酸序列包含：
[0045] a)其氨基酸序列为下列序列的区段：
[0046] X1-Asn-Thr-X2-Arg-Asp-Phe-X3-X4
[0047] 其中，
[0048] X1为从由Ser，Cys，Lys，Asp，Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸；或者为从由四肽、五肽和六肽组成的组中选择的序列，
[0049] X2为氨基酸Gly或D-Ala，
[0050] X3为从由Leu、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
[0051] X4是任选的并且为从由Ser、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸；
[0052] b)任选的并且处于在a)中所描述的区段之前的N-末端区段，其氨基酸序列为：
[0053] X-5-Asp-Thr-Val-X-4-X-3-X-2-X-1
[0054] 其中，
[0055] X-1为从由Asn、D-Asp、D-Glu、D-Gln和D-Ala组成的组中选择的氨基酸，并通过肽1 -1
键而连接至在a)中所描述的区段的残基X，并且所述肽键包含残基X 的主链羰基基团和
1
在a)中所描述的区段的残基X 的主链氨基基团，
键而连接至在a)中所描述的区段的残基X，并且所述肽键包含残基X 的主链羰基基团和
1
在a)中所描述的区段的残基X 的主链氨基基团，
[0056] X-2为从由Phe、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
[0057] X-3为从由Gly和D-Ala组成的组中选择的氨基酸，
[0058] X-4为从由Tyr、Cys、Lys、Asp、Glu和其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
[0059] X-5为从由Gly和D-Ala组成的组中选择的氨基酸；
[0060] c)任选的并且处于在a)中所描述的区段之后的C-末端区段，其氨基酸序列从由+1 +2 +1 +2 +3 +1 +2 +3 +4Thr-X X 、Thr-X -X -X 和Thr-X -X -X -X 组成的组中选择，
[0061] 其中，
[0062] 所述C-末端区段的N-末端残基Thr通过肽键而连接至在a)中所描述的区段，所4
述肽键包含所述N-末端残基Thr的主链氨基基团和在a)中所描述的区段的残基X 的主链羰基基团，
述肽键包含所述N-末端残基Thr的主链氨基基团和在a)中所描述的区段的残基X 的主链羰基基团，
[0063] X+1为从由Thr、Gly和Ala组成的组中选择的氨基酸，
[0064] X+2为从由Ser、Asn、Cys、Lys、Asp、Glu和在侧链中包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
[0065] X+3为从由Cys、Gln、Arg、Asn、Lys、Asp、Glu和在侧链中包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸组成的组中选择的氨基酸，
[0066] X+4为从由Gln、Arg、Asn和Lys组成的组中选择的氨基酸；
[0067] d)至少一个从由下列键组成的组中选择的共价键：肽键，其包含该肽的N-末端和1
C-末端的氨基基团和羰基基团，如果在a)中所描述的区段的序列X 为四肽、五肽或六肽的
1 4 -4 3 -2 +2
序列，那么所述肽键是存在的；二硫化物共价键，其包含残基X 和X 或X 和X 或X 和X-2 +3 1 4 -4 3 -2 +2 2 +3
或X 和X 的侧链巯基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X- 和X 为
1 4 -4 3
半胱氨酸或其侧链包含巯基基团的非天然氨基酸；酰胺键，其包含残基X 和X 或X 和X-2 +2 -2 +3 1 4 -4 3
或X 和X 或X 和X 的侧链羰基基团和氨基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或
-2 +2 -2 +3
X 和X 或X 和X 为Lys（或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸）和Glu（或Asp或其
1 4 -4 3 -2 +2 -2
侧链包含羰基基团的非天然氨基酸），或者所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X 和+3
X 分别为Glu（或Asp或其侧链包含羰基基团的非天然氨基酸）和Lys（或其侧链包含氨基-2
基团的非天然氨基酸）；和酰胺键，其包含该肽的末端羰基基团和残基X 的侧链氨基基团，+2 -2
如果残基X 为该肽的羧基末端的残基且为氨基酸Asn，并且X 为氨基酸Lys或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸，那么所述酰胺健是存在的。
C-末端的氨基基团和羰基基团，如果在a)中所描述的区段的序列X 为四肽、五肽或六肽的
1 4 -4 3 -2 +2
序列，那么所述肽键是存在的；二硫化物共价键，其包含残基X 和X 或X 和X 或X 和X-2 +3 1 4 -4 3 -2 +2 2 +3
或X 和X 的侧链巯基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X- 和X 为
1 4 -4 3
半胱氨酸或其侧链包含巯基基团的非天然氨基酸；酰胺键，其包含残基X 和X 或X 和X-2 +2 -2 +3 1 4 -4 3
或X 和X 或X 和X 的侧链羰基基团和氨基基团，如果所述残基X 和X 或X 和X 或
-2 +2 -2 +3
X 和X 或X 和X 为Lys（或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸）和Glu（或Asp或其
1 4 -4 3 -2 +2 -2
侧链包含羰基基团的非天然氨基酸），或者所述残基X 和X 或X 和X 或X 和X 或X 和+3
X 分别为Glu（或Asp或其侧链包含羰基基团的非天然氨基酸）和Lys（或其侧链包含氨基-2
基团的非天然氨基酸）；和酰胺键，其包含该肽的末端羰基基团和残基X 的侧链氨基基团，+2 -2
如果残基X 为该肽的羧基末端的残基且为氨基酸Asn，并且X 为氨基酸Lys或其侧链包含氨基基团的非天然氨基酸，那么所述酰胺健是存在的。
[0068] 在本发明的一个实施方案中，所述环肽包含有在该肽的N-末端和C-末端的氨1
基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有四肽的氨基酸序列，优选地从由(D-Ser)-Pro-Thr-Pro、(D-Ala)-Pro-Thr-Pro和Gly-Pro-Thr-Pro组成的组中选择的序列。
基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有四肽的氨基酸序列，优选地从由(D-Ser)-Pro-Thr-Pro、(D-Ala)-Pro-Thr-Pro和Gly-Pro-Thr-Pro组成的组中选择的序列。
[0069] 在本发明的另一个实施方案中，所述环肽包含有在该肽的N-末端和C-末端1
的氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有五肽的氨基酸序列，优选地从由Arg-Arg-Pro-Asn-Ser、Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser、Lys-Lys-Pro-Asn-Ser 和Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser组成的组中选择的序列。
的氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有五肽的氨基酸序列，优选地从由Arg-Arg-Pro-Asn-Ser、Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser、Lys-Lys-Pro-Asn-Ser 和Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser组成的组中选择的序列。
[0070] 在本发明的另外一个实施方案中，所述环肽包含有在该肽的N-末端和C-末端的1
氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有六肽的氨基酸序列，优选地从由Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser和Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser组成的组中选择的序列，其中BmGln为氨基酸L-b-甲基谷氨酰胺，并且NmAsn为氨基酸L-N-甲基天冬酰胺。
氨基基团与羰基基团之间的肽键，并且所述肽的序列X 具有六肽的氨基酸序列，优选地从由Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser、Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser和Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser组成的组中选择的序列，其中BmGln为氨基酸L-b-甲基谷氨酰胺，并且NmAsn为氨基酸L-N-甲基天冬酰胺。
[0071] 在本发明中，所述环肽可以具有这样的其N-末端，该N-末端共价地连接至乙酰基基团、焦谷氨酸、脂质或聚合物，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且该连接可以直接地或者通过间隔基团而建立，所述间隔基团优选地为氨基酸Gly。此外，本发明的环肽可以具有这样的其C-末端，该C-末端以酰胺形式存在，或者共价地连接至脂质或聚合物，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且该连接直接地或者通过间隔基团而建立，所述间隔基团优选地为氨基酸Gly。
[0072] 在本发明的一个实施方案中，所述环肽可以包含有在该肽与脂质或聚合物之间的1 3 4 -2 -4 +2
共价键，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且所述共价键包含残基X、X、X、X 、X 、X 或+3 1 3 4 -2 -4 +2 +3
X 的侧链巯基基团、氨基基团或羧基基团，并且所述残基X、X、X、X 、X 、X 或X 为氨基酸Cys、Lys、Asp、Glu或者其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸。
共价键，所述聚合物优选地为聚乙二醇，并且所述共价键包含残基X、X、X、X 、X 、X 或+3 1 3 4 -2 -4 +2 +3
X 的侧链巯基基团、氨基基团或羧基基团，并且所述残基X、X、X、X 、X 、X 或X 为氨基酸Cys、Lys、Asp、Glu或者其侧链包含巯基官能团、氨基基团或羧基基团的非天然氨基酸。
[0073] 在本发明的一个实施方案中，所述环肽的特征可以在于，X1、X3、X4、X-2、X-4、X+2或+3X 从由下列物质组成的组中选择：半胱氨酸、(2R)-2-氨基-3-硫烷基丁酸、(2R)-2-氨基-3-甲基-3-硫烷基丁酸、(2S)-2-氨基-4-硫烷基丁酸、2-氨基-5-硫烷基-戊酸、
2-氨基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-4-甲基-3-硫烷基戊酸、2-氨基-3-甲基-4-硫烷基戊酸、2-氨基-3,4-二甲基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-3-乙基-3-硫烷基戊酸、(2R)-2-氨基-3-甲基-3-硫烷基戊酸、(4S)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-5-硫烷基戊酸和(4S)-4-氨基-5-硫烷基戊酸。
2-氨基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-4-甲基-3-硫烷基戊酸、2-氨基-3-甲基-4-硫烷基戊酸、2-氨基-3,4-二甲基-3-硫烷基-戊酸、2-氨基-3-乙基-3-硫烷基戊酸、(2R)-2-氨基-3-甲基-3-硫烷基戊酸、(4S)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-2-甲基-5-硫烷基戊酸、(4R)-4-氨基-5-硫烷基戊酸和(4S)-4-氨基-5-硫烷基戊酸。
[0074] 在本发明的另一个实施方案中，所述环肽的特征可以在于，X1、X3、X4、X-2、X-4、+2 +3X 或X 从由下列物质组成的组中选择：氨基酸Lys、2-[双(3-氨基丙基)氨基]乙酸、(2S)-2,5-二氨基戊酸、2,2-二氨基乙酸、(3S)-3,4-二氨基丁酸、(2R)-2,4-二氨基丁酸、(2S)-2,4-二氨基丁酸、(2S)-2,3-二氨基丙酸、(2R)-2,3-二氨基丙酸、2-[(2-氨基乙基)氨基]乙酸、2-[(3-氨基丙基)氨基]乙酸、2-[(4-氨基丁基)氨基]乙酸、(4S)-4,8-二氨基辛酸、(2S)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸、(2S)-2-氨基-3-[4-(2-氨基乙氧基)苯基]丙酸、2-(哌啶-4-基氨基)乙酸、(2S)-2-氨基-4-[(5R)-2,2-二甲基-1,3-
唑烷-5-基]丁酸、(2S)-2-氨基-6-(甲基氨基)己酸、(2R,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸或(2R,4S)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸、2-(4-氨基哌啶-4-基)乙酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、(2S,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸和咪唑烷-2-羧酸。
唑烷-5-基]丁酸、(2S)-2-氨基-6-(甲基氨基)己酸、(2R,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸或(2R,4S)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸、2-(4-氨基哌啶-4-基)乙酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、(2S,4R)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸和咪唑烷-2-羧酸。
[0075] 在本发明的一个实施方案中，所述环肽的特征可以在于，X1、X3、X4、X-2、X-4、X+2或X+3从由下列物质组成的组中选择：氨基酸Glu、Asp、3-[(羧甲基)氨基]丙酸、2-[(羧甲基)氨基]乙酸、3-[(2-羧乙基)氨基]丙酸、(3R)-3-氨基己二酸、4-氨基庚二酸、4-氨基哌啶-1,4-二羧酸、(2S,4S)-4-氨基吡咯烷-2-羧酸、2-[(羧甲基)氨基]乙酸、(2S)-2-氨基-6-[(羧甲基)氨基]己酸、3-[(2-羧乙基)氨基]丙酸、(2S)-2-氨基庚二酸、(2S)-2-氨基辛二酸、(2R)-2-氨基-3-[(2-羧乙基)硫烷基]丙酸、(2R)-2-氨基-3-[(羧甲基)硫烷基]丙酸、4-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}丁酸和(2S)-2-氨基-3-[4-(羧基甲氧基)苯基]丙酸。
[0076] 在本发明的一个特别的实施方案中，所述具有抗肿瘤和抗血管生成效应的环肽具有选自SEQ ID1-76的氨基酸序列。
[0077] 已经提及的环肽在制备用于治疗癌症或治疗不希望的细胞增殖的病症的药物或者抗血管生成的药物中的用途也是本发明的目标。
[0078] 本发明的另一个方面为用于治疗癌症、不希望的细胞增殖的病症和不希望的血管生成的方法，其中向有此需要的个体施用包含有效量的至少一种本发明的环肽的药物组合物。包含至少一种本发明的肽和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物也是本发明的目标。
[0079] 本发明还提供了用于癌症诊断的化合物，所述化合物包含至少一种本发明的肽和用于成像的试剂，所述用于成像的试剂从由荧光基团、非荧光基团、荧光半导体颗粒、顺磁性或超顺磁性试剂和放射性同位素组成的组中选择。
[0080] 本发明的另一个方面为药物组合，其包含至少一种本发明的肽以及至少一种治疗试剂，例如抗癌药物和激素。在本发明的一个实施方案中，在所述组合中，所述肽通过共价键而直接缀合至所述治疗试剂。在另一些情况下，所述肽通过偶联元件而缀合至所述治疗试剂。
[0081] 本发明还包括这样的药物组合，其中将至少一种本发明的肽与灵菌红素或其衍生物相组合。在医学治疗过程中，可以顺次地或同时地向有此需要的个体施用形成这些组合的组成成分。
[0082] 大量的药物应当通过肠胃外途径进行施用，例如：静脉内、肌内或皮下注射，以达到其治疗功效。对于某些治疗学，受控释放载体的使用可以提高药物的效力和患者的满意度。最近已探究了分子自装配，以便改造治疗学的包囊和受控释放的材料。目前，在基于肽和聚合物的自装配材料平台的设计方面存在很大的进步（Monica C.Branco a,b,Joel P.Schneider.Acta Biomaterialia5(2009)817–831）。本发明的一些肽，例如J08P48，具有允许进行自装配的两亲特性，并因此构成治疗性分子的受控释放系统或者纳米技术领域中的系统的一部分。因此，这样的新的制剂也是本发明的目标，所述制剂以脂质体或微球体形式进行包囊，用于作为用于癌症的联合疗法的药物的这些肽的受控释放。以及还有这样的纳米颗粒化复合物，其具有对于诊断-治疗部位的受控导向系统，或者独自特别地发挥这些活性。
[0084] 图1.肽N06P87对于不同组织学来源的肿瘤细胞的细胞毒性活性。A：Colo205细胞；B：HEp-2细胞。采用多肽CIGB370r和顺铂作为抗肿瘤试剂的阳性对照。
[0085] 图2.肽N06P87对于非小细胞肺癌细胞系A549（A）和对于结肠癌细胞系Ls174T（B）的细胞毒性活性。当就A549的增殖来进行评价时，该文库的其他肽没有显示出活性。
[0086] 图3.研究目标文库的各种肽对于人肿瘤细胞M14（A）和Ls174T（B）的活性的评价试验。采用多肽CIGB370r作为这两个试验的阳性对照。
[0087] 图4.肽E07P04对于黑素瘤细胞系M14的细胞毒性活性。采用多肽CIGB370r作为该试验的阳性对照。
[0088] 图5.相比于完整蛋白质（1srp）而言，沙雷氏菌属（Serratia）主要蛋白酶的N-末端（1srpN）和C-末端（1srpC）的表面可接近性的计算。
[0089] 图6.在具有20个氨基酸（aa）的前导肽N06P87侧翼的序列。
[0090] 图7.对于人黑素瘤细胞的细胞毒性活性。前导肽N06P87是能够以50μM的浓度抑制细胞增殖的唯一一个。
[0091] 图8.相比于其所源自的分子而言，衍生自多肽p25的线性肽N06P87的抗肿瘤活性的评价。施用方案（A）；通过肿瘤体积的测量而评价的抗肿瘤效应（B）；和通过经接种的小鼠的存活率而评价的抗肿瘤效应（C）。所使用的模型：植入在NIH无胸腺小鼠中的人结肠癌Ls174T。
[0092] 图9.区段Gly255-Ser274（线性肽N06P87）的功能区域的定义。该肽的主要区段是中心区，其由N-末端和C-末端次要区段来界定。
[0093] 图10.本发明的环肽J08P48s-s、A08P28s-s、A08P25s-s、J08P46s-s和线性肽N06P87（其从蛋白p50的区段Gly255-Ser274开始设计）的模型。所述模型用程序MODELLER来获得，其中使用p50的晶体结构作为原型。在先前通过使用MODIP方法鉴定出的位置处引入二硫桥。A：按照在p50中区段Gly255-Ser274的三维（3D）结构的N06P87（线性肽）的模型；B：肽J08P48s-s的模型；C：肽A08P28s-s的模型；D：肽A08P25s-s的模型；E：肽J08P46s-s的模型，标示出了在该肽的N-末端与C-末端之间的距离。
[0094] 图11.表5的环肽33的结构模型。赖氨酸7与末端羰基基团形成酰胺键。
[0095] 图12.表5的环肽69的结构模型的立体图。主要区段Asn264-Ser271通过六肽连接子Arg-Pro-(dAla)-Gln-Asn-Ser而环化。残基dAla为立体异构体D-Ala。
[0096] 图13.表5的环肽76的结构模型的立体图。主要区段Asn264-Ser271通过五肽连接子Arg-Arg-Pro-Asn-Ser而环化，其残基加了下划线。
[0097] 图14.相应于p50的区段Gly255-Ser274的3D结构的Ramachandran图。
[0098] 图15.在本发明中所设计的环肽的化学结构的总示意图。线条指明了共价键的存在。当连接该肽的两个残基时，线条指明这些残基是环化的，即是共价连接的。位于肽序列上面的线条相应于主链的环化，位于下面的线条显示了相应于涉及至少一个侧链的环化的i i键。如果线条指向残基X，那么意味着该共价键由所述残基X 的侧链产生。如果线条从两个残基之间的连字符开始，那么意味着该共价键分别涉及在该连字符之后和之前的残基的
1 1
氨基基团或羰基基团。指向在X 前面的连字符的线条意味着包含X 的氨基基团的酰胺共
4 +2
价键，在这种情况下，该肽不具有N-末端次要区段。在X 和X 后面的线条指明了分别包
4 +2 4
含X 和X 的羰基基团的共价键，在X 后面的线条还意味着不存在C-末端次要区段，和在+2
X 后面的线条意味着该残基是该肽的羧基末端残基。在括号中，标示出了参与该共价键的基团以及键的类型：酰胺键或二硫桥，还显示了连接肽的优选的序列。肽序列上的阴影区以从N-末端至C-末端的顺序指明了在本发明中所定义的功能区段：(a)N-末端次要区段、(b)主要区段和(c)C-末端次要区段。用三角形P标示了可以通过与聚合物或其他化学基团的共价结合进行修饰的位点，这样的修饰是可行的，如果所考虑的主链的残基或基团不参与环化连接。所述肽可以包含一个或多个环化连接，以及一个或多个用聚合物和/或化-4 -2 1 3 4 +2 +3
学基团进行的修饰。在该图中作为替换位置X 、X 、X、X、X、X 和X 的可能占有者而提及的氨基酸类似物，是其侧链包含氨基基团或羧基基团或巯基基团的氨基酸。
1 1
氨基基团或羰基基团。指向在X 前面的连字符的线条意味着包含X 的氨基基团的酰胺共
4 +2
价键，在这种情况下，该肽不具有N-末端次要区段。在X 和X 后面的线条指明了分别包
4 +2 4
含X 和X 的羰基基团的共价键，在X 后面的线条还意味着不存在C-末端次要区段，和在+2
X 后面的线条意味着该残基是该肽的羧基末端残基。在括号中，标示出了参与该共价键的基团以及键的类型：酰胺键或二硫桥，还显示了连接肽的优选的序列。肽序列上的阴影区以从N-末端至C-末端的顺序指明了在本发明中所定义的功能区段：(a)N-末端次要区段、(b)主要区段和(c)C-末端次要区段。用三角形P标示了可以通过与聚合物或其他化学基团的共价结合进行修饰的位点，这样的修饰是可行的，如果所考虑的主链的残基或基团不参与环化连接。所述肽可以包含一个或多个环化连接，以及一个或多个用聚合物和/或化-4 -2 1 3 4 +2 +3
学基团进行的修饰。在该图中作为替换位置X 、X 、X、X、X、X 和X 的可能占有者而提及的氨基酸类似物，是其侧链包含氨基基团或羧基基团或巯基基团的氨基酸。
[0099] 图16.衍生自多肽p25的经优化的环肽，其提高所治疗的动物的存活率。以80μM的剂量通过肿瘤内（i.t.）途径对携带皮下肿瘤TC-1的动物进行注射。每个组接受不同的肽，或者多肽CIGB-370r或载体。显示了所有组的存活率。
[0100] 图17.衍生自多肽p25的经优化的环肽，其不依赖于施用途径地提高所治疗的动物的存活率。以80μM的剂量通过i.t.或腹膜内（i.p.）途径对携带皮下肿瘤TC-1的动物进行注射。每个组接受不同的肽，或者多肽CIGB-370r或载体。显示了所有组的存活率。
[0101] 图18.肽J08P48s-s对于不同组织来源的人肿瘤细胞系的体外生物学活性。
[0102] 图19.衍生自多肽p25的经优化的环肽超过了用线性肽进行治疗的动物的抗肿瘤活性和存活率，并且其活性与多肽CIGB-370r类似。施用方案（A）；通过肿瘤体积的测量而评价的抗肿瘤效应（B）；和通过经接种的小鼠的存活率而评价的抗肿瘤效应（C）。模型：植入在NIH无胸腺小鼠中的人结肠癌Ls174T。
[0103] 图20.本发明的环肽对于在基质胶（matrigel）中内皮细胞分化的效应。在两种本发明的环肽或载体存在下，在激活条件（10ng/mL EGF,1μg/mL氢化可的松）下培养HMEC细胞。所述肽能够抑制为了其增殖而由经激活的内皮细胞进行的管状结构的形成，这证明了这些肽的抗血管生成活性，而载体允许管状结构的形成。
[0104] 图21.在有利于其自装配的条件下，本发明的环肽的显微照片。实施方案的详细描述/实施例
[0105] 下面的实施例和数据显示了与从线性合成肽文库和属于沙雷氏菌溶素PRZN_SERMA的C-末端的称为p25的多肽的三级结构（Braunagel SC和Benedik MJ(1990).Mol.Gen.Genet.222:446-451）开始获得环肽相关的若干方面和特征，所述称为p25的多肽具有经证明的药物潜力（Abrahantes-Pérez MC等人,“Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”.具有国际公开号WO2006/005268的专利申请）。
[0106] 在接下来所陈述的实施例中，涉及本发明的化合物和/或方法，其中包括衍生自经优化的这些肽和/或其衍生物的分子的用途。与现有技术相比，本发明中所涉及的化合物和方法提供了令人惊奇的且与预期相反的结果。该发明的用处通过这些化合物在制药领域中的用途而得到举例说明。所述化合物相比于该技术领域技术人员所知道的其他化合物而言具有优点。
[0107] 实施例1.衍生自多肽p25的线性肽文库的设计与合成
[0108] 为了鉴定多肽p25（Abrahantes-Pérez MC等人,“Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”.具有国际公开号WO2006/005268的专利申请）的最小的在功能上具有活性的单元以及从该区域开始来产生在癌症治疗中具有比p25本身更好的药理学和药效动力学品质的新分子，设计了以10个氨基酸重叠的具有20个氨基酸（aa）的线性肽。这暗示了包含在10至20个氨基酸的一级序列中的活性区域的鉴定。表1显示了这些肽中的每一个的一级序列，获得过程中的代码，和一旦合成与纯化之后的其质量。所述肽的最终制备物的分子质量通过质谱法来进行验证。
[0109] 表1.从多肽p25的一级序列开始的线性肽文库的设计与合成
[0110]
[0111]
[0112] 通过使用Fmoc/tBu策略，在Fmoc-AM-MBHA树脂上以固相来进行所述肽的 合 成（Barany,G. 和 Merrifield,R.B.J Am Chem Soc.99(1977)7363-7365）。 使用用DIC/HOBt进行活化的方法来偶联氨基酸，并且采用水合茚三酮试验来验证
偶 联 反 应 的 完 成（Kaiser,E.,Colescott,R.L.,Bossinger,C.D.,Cook,P.I.Anal Biochem.34(1970)595-598）。通过用TFA/EDT/H2O/TIS（94%/2.5%/2.5%/1%）溶液进行处理来使所述肽从树脂上分离，用醚进行沉淀，并冻干72小时。通过经用二甲亚砜（DMSO）进行氧化而形成二硫桥来实现环化（Andreu,D.,Albericio,F.,Solé,N.A.,Munson,M.C.,Ferrer,M.和Barany,G.,Pennington,M.W.和Dunn,B.M.(编辑),Peptide Synthesis Protocols,Methods in Molecular Biology,Totowa,NJ,1994,第91-169页），并且通过RP-HPLC进行纯化。在分析型RP-HPLC上独立地分析所收集的级分，并且通过合并具有大于
99%纯度的级分来制作每种肽的最终制备物。
偶 联 反 应 的 完 成（Kaiser,E.,Colescott,R.L.,Bossinger,C.D.,Cook,P.I.Anal Biochem.34(1970)595-598）。通过用TFA/EDT/H2O/TIS（94%/2.5%/2.5%/1%）溶液进行处理来使所述肽从树脂上分离，用醚进行沉淀，并冻干72小时。通过经用二甲亚砜（DMSO）进行氧化而形成二硫桥来实现环化（Andreu,D.,Albericio,F.,Solé,N.A.,Munson,M.C.,Ferrer,M.和Barany,G.,Pennington,M.W.和Dunn,B.M.(编辑),Peptide Synthesis Protocols,Methods in Molecular Biology,Totowa,NJ,1994,第91-169页），并且通过RP-HPLC进行纯化。在分析型RP-HPLC上独立地分析所收集的级分，并且通过合并具有大于
99%纯度的级分来制作每种肽的最终制备物。
[0113] 实施例2.衍生自多肽p25的合成肽文库的一级结构的选择，基于其对于肿瘤细胞的体外细胞毒性活性
[0114] 为了测定衍生自多肽p25的合成肽文库对于人肿瘤细胞的细胞毒性活性，采用了磺基罗丹明B（SRB）方法（Skehan P,Storeng R,Scudiero D等人,(1990)J.Natl.Cancer Inst.82:1107-1112；Monks A,Scudiero D,Skehan P等人,(1991).J Natl Cancer Inst.83:757-66；Tesei A,Ulivi P,Fabbri F等人,(2005).J Transl Med.3:7）。用与实验样品相等的载体体积来培养阴性对照细胞。用相比于阴性对照细胞而言的存活细胞百分比来产生“x-y”曲线（剂量-应答），并估计下列参数：50%生长抑制（GI50）、总生长抑制（TGI）或引起50%细胞死亡的浓度（LC50）（Boyd MR,Paull KD和Rubinstein LR(1992)“Data display and analysis strategies for the NCI Disease Oriented In-Vitro Antitumor Drug Screen,Cytotoxic Anticancer Drugs:Models and Concept for Drug Discovery and Development”(Baleriote FA,Corbett TH和Baker LH编辑)第11-34页,Kluwer Academia Publishers,Boston）。考虑具有细胞毒性活性的肽，即至少在所有在该研究中所使用的细胞系之一中能够以剂量依赖性方式抑制50%的细胞增殖并且其GI50值小于100μM的那些肽。所使用的人肿瘤细胞系为：HEp-2（喉癌）、A549（肺上皮腺癌）、M14（黑素瘤）、Colo205（结肠腺癌）、Ls174T（结肠腺癌）、LnCAP（前列腺癌）、PC-3（前列腺癌）、H125（非小细胞肺腺癌）。在表2中显示了该肽筛选的结果。该表显示了所设计的肽的一级序列，在其获得过程中的代码，和其对于人肿瘤细胞的细胞毒性能力。
[0115] 表2.通过SRB方法，基于在体外对于人肿瘤细胞的细胞毒性活性
[0116] 来进行的肽筛选
[0117]氨基酸序列 代码 体外细胞毒性活性
SYWSETNTGGDNGGHYAAAP-酰胺 D06P91 -
DNGGHYAAAPLLDDIAAIQH-酰胺 E07P01 -
LLDDIAAIQHLYGANPSTRT-酰胺 E07P05 -
LYGANPSTRTGDTVYGFNSN-酰胺 E07P06 -
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-酰胺 J07P73/N06P87* +/+
TGRDFLSTTSNSQKVIFAAW-酰胺 F07P16 -
NSQKVIFAAWDAGGNDTFDF-酰胺 M07P38 -
DAGGNDTFDFSGYTANQRIN-酰胺 M07P39 -
SGYTANQRINLNEKSFSDVG-酰胺 A07P42 -
LNEKSFSDVGGLKGNVSIAA-酰胺 A07P47 -
GLKGNVSIAAGVTIENAIGG-酰胺 A07P44 -
GVTIENAIGGSGNDVIVGNA-酰胺 A07P45 -
SGNDVIVGNAANNVLKGGAG-酰胺 Y07P48 -
ANNVLKGGAGNDVLFGGGGA-酰胺 A07P43 -
NDVLFGGGGADELWGGAGKD-酰胺 A07P46 -
DELWGGAGKDIFVFSAASDS-酰胺 O07P102 -
IFVFSAASDSAPGASDWIRD-酰胺 O07P103 -
APGASDWIRDFQKGIDKIDL-酰胺 O07P104 -
FQKGIDKIDLSFFNKEANSS-酰胺 O07P105 -
SFFNKEANSSDFIHFVDHFS-酰胺 O07P106 -
DFIHFVDHFSGTAGEALLSY-酰胺 O07P107 -
GTAGEALLSYNASSNVTDLS-酰胺 O07P108 -
NASSNVTDLSVNIGGHQAPD-酰胺 E02P04 +
VNIGGHQAPDFLVKIVGQVD-酰胺 E07P02 -
FLVKIVGQVDVATDFIV-酰胺 E07P03 -
DVATDFIV-酰胺 U07P78 -
SYWSETNTGGDNGGHYAAAP-酰胺 D06P91 -
DNGGHYAAAPLLDDIAAIQH-酰胺 E07P01 -
LLDDIAAIQHLYGANPSTRT-酰胺 E07P05 -
LYGANPSTRTGDTVYGFNSN-酰胺 E07P06 -
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-酰胺 J07P73/N06P87* +/+
TGRDFLSTTSNSQKVIFAAW-酰胺 F07P16 -
NSQKVIFAAWDAGGNDTFDF-酰胺 M07P38 -
DAGGNDTFDFSGYTANQRIN-酰胺 M07P39 -
SGYTANQRINLNEKSFSDVG-酰胺 A07P42 -
LNEKSFSDVGGLKGNVSIAA-酰胺 A07P47 -
GLKGNVSIAAGVTIENAIGG-酰胺 A07P44 -
GVTIENAIGGSGNDVIVGNA-酰胺 A07P45 -
SGNDVIVGNAANNVLKGGAG-酰胺 Y07P48 -
ANNVLKGGAGNDVLFGGGGA-酰胺 A07P43 -
NDVLFGGGGADELWGGAGKD-酰胺 A07P46 -
DELWGGAGKDIFVFSAASDS-酰胺 O07P102 -
IFVFSAASDSAPGASDWIRD-酰胺 O07P103 -
APGASDWIRDFQKGIDKIDL-酰胺 O07P104 -
FQKGIDKIDLSFFNKEANSS-酰胺 O07P105 -
SFFNKEANSSDFIHFVDHFS-酰胺 O07P106 -
DFIHFVDHFSGTAGEALLSY-酰胺 O07P107 -
GTAGEALLSYNASSNVTDLS-酰胺 O07P108 -
NASSNVTDLSVNIGGHQAPD-酰胺 E02P04 +
VNIGGHQAPDFLVKIVGQVD-酰胺 E07P02 -
FLVKIVGQVDVATDFIV-酰胺 E07P03 -
DVATDFIV-酰胺 U07P78 -
[0118] 符号“+”表明存在细胞毒性活性，和符号“-”表明不存在细胞毒性活性，按照在实施例2的正文中所确立的标准。*该肽被合成了两次，目的是保证所获得的结果的可重复性。
[0119] 肽GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-酰胺（代码N06P87/J07P73）对于数种肿瘤细胞系的结果是阳性的（+），而肽NASSNVTDLSVNIGGHQAPD-酰胺（代码E02P04）仅对于人黑素瘤M14显示出活性。其余的肽被认为是阴性的（-）。
[0120] 在图1和2中，显示了肽N06P87抑制不同组织学来源的肿瘤细胞（细胞系Colo205、HEp-2、A549和Ls174T）的增殖的潜力。在所有情况下，GI50低于100μM。在喉癌HEp-2的情况下，还采用了两个批次的顺铂作为该试验的阳性对照。这是用于喉癌治疗的商业上可得的第一线产品。再次证明了其对于该类型的病理学状况的有用性以及该试验的有效性。
[0121] 在图3中，显示了表1的文库的数种肽对于人肿瘤细胞系M14和Ls174T的效应的评价结果。这组肽不能够抑制所评价的细胞系的细胞增殖。
[0122] 除了包含在肽N06P87中的区域外，由E07P04所编码的具有20个氨基酸的区域（表1）也显示出细胞毒性活性，但仅对于M14细胞系，并且其GI50不低于100μM，这在图4中可观察到。
[0123] 总结了对于肿瘤细胞具有细胞毒性活性的所有肽调查结果的表2证明了，肽GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-酰胺（其包含沙雷氏菌溶素PRZN_SERMA这一蛋白质的C-末端结构域的区域Gly255-Ser274并且属于多肽p25的N-末端区域）对于不同组织学来源的肿瘤细胞系是有活性的，从而再现了其所源自的p25分子的广谱细胞毒性作用。这暗示，可以将该肽视为多肽p25的在结构上具有活性的最小区域，以用于其随后的优化，以便为了针对癌症的药理学目的来使用它们。实施例3.移除N-末端结构域对于蛋白p50的残基的溶剂暴露的影响
[0124] 已经知道，当通过自催化、用溴化氰进行的化学消化来从所述蛋白质的N-末端区域上分离出时，或者当在大肠杆菌中表达时，沙雷氏菌溶素（例如，沙雷氏菌溶素PRZN_SERMA）的C-末端区域对于肿瘤细胞具有更大的细胞毒性活性（具有国际公开号WO2006/005268的专利申请）。这暗示，当从N-末端结构域上分离出时，沙雷氏菌溶素的C-末端区域的在功能上具有活性的最小单元增加了其对于肿瘤细胞的可接近性。因此，决定鉴定出当完整蛋白质的N-末端结构域与C–末端结构域被分开时增加其溶剂可接近性表面的该蛋白质的残基，并确证区段Gly255-Ser274（肽N06P87）是否包含这样的残基。为了证实该假说，对于沙雷氏菌属主要蛋白酶的N-末端和C-末端的表面可接近性进行了计算（Hamada K,Hata Y,Katsuya Y,Hiramatsu H,Fujiwara T,Katsube Y.(1996)J.Biochem.119:844-851）。
[0125] 鉴定出了当沙雷氏菌属蛋白酶的蛋白水解消化产生N-末端结构域和C-末端结构域这两个分子时，在N-末端结构域和C-末端结构域之内转变为可接近的氨
基酸区域。残基的可接近性表面的计算用程序DSSP（Kabsch W,Sander C.1983.
Biopolymers22:2577-2637）来进行。残基的可接近性值以埃 来表示。图5显示，可接近性值的主要差异与位于沙雷氏菌属主要蛋白酶的N-末端蛋白水解结构域的C-末端区域中的氨基酸（Gln210、Phe211、Asn226、His229、Leu236、Ile239、Ser251）和位于沙雷氏菌属主要蛋白酶的C–末端非蛋白水解结构域的N-末端区域中的氨基酸（Thr252、Phe269、Ile280、Trp284、Arg302和Phe310）相对应。表3给出了显示出最显著的可接近性值的改变的残基。
基酸区域。残基的可接近性表面的计算用程序DSSP（Kabsch W,Sander C.1983.
Biopolymers22:2577-2637）来进行。残基的可接近性值以埃 来表示。图5显示，可接近性值的主要差异与位于沙雷氏菌属主要蛋白酶的N-末端蛋白水解结构域的C-末端区域中的氨基酸（Gln210、Phe211、Asn226、His229、Leu236、Ile239、Ser251）和位于沙雷氏菌属主要蛋白酶的C–末端非蛋白水解结构域的N-末端区域中的氨基酸（Thr252、Phe269、Ile280、Trp284、Arg302和Phe310）相对应。表3给出了显示出最显著的可接近性值的改变的残基。
[0126] 表3.显示出最显著的可接近性值的改变的氨基酸（aa）残基
[0127]
[0128]
[0129] 相比于完整蛋白质（1rp）而言，沙雷氏菌属主要蛋白酶的N-末端（1srpN）和C-末端（1srpC）的表面可接近性的计算。残基按照暴露差异的值进行排序（“次序”栏）。显示了64个具有最高的暴露增加的残基。
[0130] Asp98和Arg267以及Asp225和Lys317建立了两个在N-末端结构域和C-末端结构域之间的氢桥。此外，这些残基显示出78.2 的可接近性值的平均差异。关于沙雷氏菌属主要蛋白酶的N-末端蛋白水解结构域和关于沙雷氏菌属主要蛋白酶的C-末端非蛋白水解结构域的可接近性值的平均差异分别为5.1±15.4 和7.1±20.1 其他重大的位置相应于：Ile22、Asn32、Gln94和Arg171。就所知道的，这些残基不与任何生物学功能相关。
[0131] 相反地，无论是位于N-末端蛋白水解结构域的α-螺旋E中的活性位点残基（His176、Glu177和His180），还是包括在锌结合基元HEXXHXXGXXH中的Gly183和His186，都不改变其可接近值。这些数据与这样的实验结果相一致，所述实验结果有效地证明，属于沙雷氏菌溶素家族的蛋白p50的细胞毒性活性并不归因于其蛋白水解活性，而是归因于其非蛋白水解的C-末端区域，后者显著地增加其在从蛋白水解结构域上分离出后的溶剂可接近性。另外，区段Gly255-Ser274（肽N06P87）包含有在具有最高的暴露增加的残基（表3）之中的（尤其是在前十四个值之中的）三个残基（Arg267、Asp268和Phe269），因而支持了该区段的明显作用，即作为与抗肿瘤活性相关的p25的在结构上有功能的区域的一部分。
[0132] 实施例4.对于肽N06P87的区段Gly255-Ser274的修饰
[0133] 实施例1中显示的肽文库包含从多肽p25的N-末端开始的以10个氨基酸重叠的具有20个氨基酸的区段。施行该设计，目的是鉴定出具有与该调查的目标细胞毒性活性相关的具有10个氨基酸的线性区域。然而，包含在肽N06P87中的重叠的10个氨基酸在其他背景（图6：肽E07P06和F07P16）中不呈现出细胞毒性活性（表2）。这暗示，包含在区域Gly255-Ser274（肽N06P87）中的具有20个氨基酸的区段对于下列来说是必不可少的：建立该肽与肿瘤细胞的相互作用基元的正确暴露或者处于活性位点侧翼的合适的次级相互作用点，从而增加其与其潜在受体的亲和力和/或特异性。从该标准出发，设计并合成了具有修饰的肽，以便评价其对于针对肿瘤细胞的细胞毒性活性的可能影响和进行肽N06P87的部分表征以为了其后来的优化。这些修饰包括在肽N06P87的C-末端处的酰胺基团被羧基基团替代，以及肽N06P87通过在该肽的两个末端处插入半胱氨酸进行环化。所获得的肽及其分子质量显示在表4中。
[0134] 表4.对于具有20个氨基酸的前导肽N06P87的修饰
[0135]
[0136] 图7显示，肽N06P89（其通过位于N-末端和C-末端处的半胱氨酸进行环化）不能够抑制人黑素瘤肿瘤细胞M14的增殖。这暗示，对于模仿该区域在关于多肽p25所假定的结构中呈现的三级结构的合理性来说，施行通过肽N06P87的序列的其他位点的约束是必不可少的。在该图中还显示，封闭C-末端（例如：酰胺基团或其他修饰）对于获得目的肽区域的细胞毒性能力来说是必不可少的。
[0137] 实施例5.前导肽的制剂不增加其细胞毒性活性
[0138] 进行研究以便评价在前导肽的数种肠胃外制剂中缓冲液、pH和添加剂的条件对于针对肿瘤细胞的细胞毒性活性的影响。在所评价的缓冲液之中包括有：甘氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐和包括宽范围pH（从酸性至非常碱性）的其他缓冲液。还评价了在其用于肠胃外制剂的用途范围内的各种不同的添加剂，例如：甘氨酸、蔗糖、右旋糖酐、谷氨酸钠、山梨醇、环糊精、PEG、EDTA、非离子型去污剂等等。用这些添加剂配制的肽N06P87不增加其对于不同组织学来源的肿瘤细胞的细胞毒性活性。
[0139] 实施例6.线性肽N06P87的体内活性
[0140] 为了评价相比于多肽CIGB-370r而言，线性区段Gly255-Ser274（肽N06P87）对于人来源的肿瘤模型的潜力，使用了在无胸腺的NIH小鼠中的结肠癌Ls174T模型。通过皮下途径施用人肿瘤细胞，通过肿瘤内途径施用目的分子或载体（100μL）。在13天后，当肿瘤已建立起来并且是可触摸到的时候，开始目的分子的施用方案（图8A）。以分阶段递减的剂量施用肽N06P87：两次每48小时施用600μM，然后，4次每48小时施用330μM，和最后，4次每72小时施用90μM。在4周期间每周一次施用多肽CIGB-370r。
[0141] 在治疗开始35天后，在用肽N06P87和载体进行治疗的组之间在肿瘤体积方面存在显著的差异（p<0.001）（图8B）。此外，当采用具有Bonferroni事后检验的单向方差分析时，在用多肽CIGB-370r和载体进行治疗的组之间也存在非常显著的差异（p<0.0001）。在用所述两种生物分子进行治疗的组之间也存在非常显著的差异（p<0.0001）。
[0142] 图8C显示了用这些生物分子或用载体进行治疗的动物的存活率。相比于接受载体的组而言，所述两种生物分子都能够显著地（时序（Logrank）检验：p<0.05）增加所治疗的动物的存活率。然而，对于肽N06P87的情况，比率“T/C”（其中T为受到治疗的动物的平均存活率，和C为仅接受载体的动物的平均存活率）为117%。这表明，该线性肽作为潜在地可用于人癌症治疗的分子是无效的，因为比率“T/C”小于120%。在肽CIGB-370r的情况下，比率“T/C”为142%，因此它具有对于潜在地可用于人癌症治疗的分子所希望的行为。
[0143] 当在第35天（其中所有动物仍活着的最后一天）关于肿瘤体积来计算比率“T/C”时，该肽也不是有效的，因为其为72%，而对于多肽CIGB-370r的情况，为35%。在该情况下，当T/C<40-50%时，被认为是具有显著活性的化合物（Marie Suggitt和Michael C.Bibby.50Years of Preclinical Anticancer Drug Screening:Empirical toTarget-Driven Approaches Clinical Cancer Research.2005.第11卷,971-981）。这表明，为了其以后的治疗用途，应当优化所选择的肽序列，以便取得与多肽CIGB-370r相似的平均存活率。
[0144] 实施例7.肽N06P87的功能性残基/区域的定义
[0145] 实施例2和4中所呈现的实验结果连同蛋白p50的三维结构的分析（实施例3和“发明描述”这一节）一起使得能够在肽N06P87的化学结构中定义出三个不同的区段或区域，按照在其结构-功能关系中的影响：a)主要结合区域（中央环），b)C-末端次要结合区域，和c)N-末端次要结合和/或结构支持区域。这示意性地显示在图9中。
[0146] 中央环包含有在生物学活性方面必不可少的区段Gly266-Asp268，以及相比于在p50中增加其在p25中的暴露的残基Phe269和Leu270。C-末端区域是采取了在蛋白p50中的伸展构象的环。该区段的残基看起来还参与了与受体的相互作用，如实施例4所显示的，其中肽N06P87的（C-）末端的酰胺基团被羧基基团替代，从而导致生物学活性的丧失。所述修饰意味着新的局部负电荷的引入，以及该肽的氢桥供体基团的丧失。据推测，该区域还发挥结构作用：a)Leu270与Phe269、Tyr259以及中央环的Arg267的脂族侧链建立疏水相互作用；b)Thr272与N-末端区域的Phe261建立疏水接触；和c)Ser271与中央环的残基形成三个氢桥，Ser271的氨基基团是Arg267的羰基基团的氢桥供体，并且Ser271的侧链的OG基团还是Arg267的羰基的供体和Thr265的侧链的OH基团的接纳体。N-末端区段发挥结构作用：残基Asp256（羰基基团）和Val258（氨基基团）与残基Asn264的ND2和OD1侧链原子的主链氢桥，残基Val258的羰基基团（接纳体）及Asn264的供体氨基（主链），和Ser263的OG原子。
[0147] 实施例8.结构约束、环化、侧链连接和/或非天然氨基酸的引入
[0148] 本发明的强有力的抗癌试剂的设计的一个必不可少的要素在于，所设计的肽是环状的，即包含通过涉及侧链的化学基团和/或氨基末端和羧基末端的基团的共价键而连接的氨基酸。因此，在此设计的肽通过环化而在结构上受到约束，这显著地降低了这些分子的结构柔韧性。通常，肽作为治疗性试剂的使用具有许多缺点。这正是所述肽的固有柔韧性的情况；尤其是，短和中等长度的肽比折叠的蛋白质柔韧得多，因此，它们与蛋白质或其他受体大分子的结合过程常常伴随着构象熵的重大损失。该事实有助于：这些分子通常具有低于蛋白质-蛋白质结合的结合亲和力。所述肽所展示出的更小的亲和力（因此还有其效能）还可能与这样的事实相关，即单独的肽-受体接触表面相比于蛋白质-受体界面而言更小，尤其是当所述肽是该天然蛋白质的区段时。为此原因，通常需要对所述肽进行重新设计和化学修饰以增加与受体结合的亲和力（和因此其效能）。
[0149] 在本发明中，优选地以下列方式来引入所述肽的环化：a)通过在氨基酸Lys和Asp/Glu的侧链之间（表5的肽5-16、19-22、40-43）或者在Lys的侧链和末端羧基基团之间（肽32）的酰胺键，和b)通过引入二硫桥（肽1-4、17-18、23-31、33-39、44-50）。表5显示了代表性肽的序列。
[0150] 表5.与线性肽N06P87类似的环肽的设计
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] *，如果没有特别指明某一修饰，C-末端是酰胺化的，而N-末端是游离的；-，共价键，(a)如果连字符出现在序列的末端，那么意味着该末端基团通过共价键合至取代基或聚合物而被修饰，(b)两个连字符，一个在N-末端处和另一个在C-末端处，这意味着该肽通过在末端残基的主链的氨基基团和羧基基团之间形成酰胺键而成环，和(c)在序列中间的连字符是肽键；k，其侧链形成分子内酰胺键的赖氨酸残基；d，其侧链形成分子内酰胺键的天冬氨酸残基；e，其侧链形成分子内酰胺键的谷氨酸残基；-co-，通过分子内酰胺键而共价连接至赖氨酸侧链的末端羧基末端；dA，立体异构体D-丙氨酸；dQ，立体异构体D-谷氨酰胺；dS，立体异构体D-丝氨酸；(PEG)-和-(PEG)，分别为通过末端氨基末端和末端羧基末端进行的聚乙二醇化；pGlu，焦谷氨酸；X3X4和Z1Z2，二肽；BmQ，L-b-甲基谷氨酰胺（在β碳处甲基化的L-谷氨酰胺）；NmN，N-甲基化的天冬酰胺。
[0155] 任选地，所述肽的环化可以涉及非天然氨基酸，代替已经提及的残基Lys、Asp/Glu和Cys（表6和7）。
[0156] 表6.可能在侧链的环化中与残基Lys和Asp/Glu类似地进行使用的和/或用于通过将聚合物共价连接至侧链来进行所述肽的化学修饰的
[0157] 特殊氨基酸
[0158]
[0159]
[0160] 表7.可能在通过二硫桥键合而实现的所述肽的环化中与半胱氨酸类似地进行使用的和/或用于通过将聚合物连接至侧链来进行
[0161] 所述肽的化学修饰的特殊氨基酸
[0162]
[0163]
[0164] 在所有情况下，在所设计的肽的结构中引入的结构约束必须与该分子的在生物学上具有活性的构象相容。因此，本发明的环化设计既包括该序列上的将会取代/引入通过侧链进行连接的氨基酸的潜在位置（替换位置）的选择，也包括待引入的氨基酸（连接残基）的类型的选择。相应于该肽的替换位置的残基间距离必须与所选择的连接残基的立体化学性质相容。在例如引入二硫桥的特定情况下，不将在活性构象下其α-碳之间的距离大于7 或小于3.8 的那些残基考虑作为潜在的替换位置（Vardhan S.Dani,C.Ramakrishnan和Raghavan Varadarajan.Protein Engineering,第16卷,第3期,第187-193页,2003）。类似地，β-碳之间的距离在3.6 和4.7 之间的位置被认为是优选的。替换位置的立体化学描述符，例如α-碳原子和β-碳原子的位置，应当允许一旦建立了残基之间的共价键，连接残基的侧链的扭转角可以采取有利的值，这是存在有利的非共价相互作用（范德华）的指示。
[0165] 为了设计本发明的通过二硫桥（借助于半胱氨酸）进行环化的肽，遵循下列步骤：a)选择可以被通过二硫桥进行连接的半胱氨酸取代的肽N06P87的潜在的替换位置对，b)建立经修饰的肽的三维结构的模型/使所述模型的能量最小化，和c)评价所述模型的能量和/或立体化学品质参数。肽N06P87的关于半胱氨酸的替换位置通过使用程序MODIP来选择（Vardhan S.Dani,C.Ramakrishnan和Raghavan Varadarajan.Protein Engineering,第16卷,第3期,第187-193页,2003），所述程序为了设计蛋白质中的二硫桥而开发的。该方法给潜在的二硫桥指派得分，其中使用经验能量函数，后者取决于在α-碳原子和β-碳原子之间的原子间距离以及扭转角χ1、χ2、χSS、χ1’和χ2’的值（R.Sowdhamini,N.Srinivasan,B.Shoichet,D.V.Santi,C.Ramakrishnan 和 P.Balaram(1989).Prot.Engng.,3,95-103）。取决于对于潜在的二硫桥所计算的能量值，MODIP指派品质等级A（理想的立体化学）、B（合适的几何学，但具有立体化学扭曲）或C（对于允许形成二硫桥来说足够邻近的位点），其中A表示最高品质，和C表示最差品质。所设计的肽的3D结构模型通过使用分子建模软件来获得，并且（优选地）可以通过核磁共振来在实验上进行测定。在本发明中，使用程序MODELLER（Sali A,Blundell TL,1993,J Mol Biol,234:779-815）和WHATIF（Vriend G,1990,J Mol Graph.8(1):52-6,29）用于所述肽的建模。
[0166] 作为关于该分析的开始点，获取了p50的晶体结构－文件PDB1SRP。如在“发明描述”这一节中所讨论的，实验数据暗示，肽N06P87的在生物学上具有活性的构象与在蛋白p50/p25中由片段Gly255-Ser274所采取的构象相似。表8显示了在该区段中潜在的替换位置的预测结果。
[0167] 表8.用MODIP预测在肽N06P87中关于通过二硫桥
[0168] 进行连接的半胱氨酸的替换位置
[0169]
[0170] *，对于通过取代Thr19→Gly进行修饰的肽N06P87的模型所进行的预测；§，所预测的二硫桥的立体化学品质的等级，A最高，C最差。
[0171] 替换位置对2-4是从天然结构开始预测的并且具有品质等级A和B，而替换位置对1需要残基T19的轻微构象改变并且如此预测的桥具有较差的品质。因此，本发明包括这样的肽，其包含取代T19→G或T19→A，以便有助于采取具有二硫桥形成的有利构象。被Gly取代使得能够增加局部的柔韧性，从而促进有利于桥形成的在羧基末端区域中的结构改变。被Ala取代是足够的，考虑到该残基采取螺旋型构象的有利倾向，如按照对于表5的肽4的结构所获得的模型（该模型的 （phi-psi）扭转角为-69、-38）而对于残基19所预测的那样。与取代T19→G相比，引入Ala的特征在于在折叠和/或与受体结合的过程中该肽的构型熵的更小损失。图10显示了从表8的MODIP预测开始进行设计的一组环肽的模型。
[0172] 相同的用于设计二硫桥的替换位置对于设计其连接残基形成酰胺键（如氨基酸Lys和Asp/Glu）的环肽也是可行的。由于将连接残基的α-碳相连接的原子数目在该情况下比在二硫桥中存在的更多，所以决定了在所述肽的设计中其的引入的立体化学限制是不太严格的并因此用MODIP预测的替换位置作为首要方法也是足够的。在选择了确定的一对连接残基后，对所得的肽进行建模并且在能量方面进行评价（和/或按照立体化学参数对品质进行评价）。遵循类似的方案，设计了表5的环肽33，其包含有在赖氨酸7与末端羰基基团之间的酰胺键（图11）。
[0173] 在本发明中另一个优选的环化方法在于，在所述肽的N-末端和C-末端的氨基基团和羰基基团之间引入共价键。肽键的立体化学限制使得需要引入氨基酸连接子，其促进采取与所述肽的生物学活性相容的结构。例如，当在p25/p50的3D结构中，在将要连接的”锚”残基的α-碳之间的距离（dCA-CA）相比于在肽单元的CA之间存在的3.9 的距离而言更大时，所必需的连接子残基（Ncon）的数目就会更大。如果没有在两个锚残基之间引入足够数目的连接子残基以满足相应的距离限制，那么必定意味着该肽不能采取通过实验所观察到的构象，这很可能负面地影响生物学活性。连接子残基的设计按照下列方案来进行：
[0174] I.选择肽N06P87的将进行连接的残基：3D结构中的邻近残基,优选地不包括在主要结合区段或主要区段中的残基。
[0175] II.鉴定所必需的连接子残基的最小数目：Ncon>dCA-CA/3.9。
[0176] III.选择锚残基：N06P87的将进行连接的残基和与之相邻的残基，在两个末端都选择2-3个残基。
[0177] IV.在蛋白质3D结构的非丰余数据库中寻找具有N个残基的区段（Ncon+4>N>Ncon+6），从而使得所述片段的末端的2-3个残基的主链的结构与锚残基的结构相似。
[0178] V.选择连接子区段的序列和结构：选择在段落IV中最经常观察到的连接子区段的结构，并且计算在每个位置处每个氨基酸的优选参数，即氨基酸出现的次数与按照数据库中氨基酸的相对丰度而预期的值之间的关系。在每个位置处，选择具有最高优选参数的氨基酸（一个或数个）。允许根据最高优选参数值的标准来修饰与连接子区段毗邻的残基。在具有正的扭转角的位置的情况下，允许引入D-立体异构体。也是可行的是，引入其他非天然氨基酸（例如β-氨基酸和N-甲基化的氨基酸），目的是增加所述残基采取与所需结构相符的主链构象的结构倾向。
[0179] 由于这些肽通过在N-末端与C-末端之间的酰胺键而环化，因而序列的环状排列构成相同的肽。在本发明的一个示例中，所述肽是基于对于N06P87所定义的主要结合区段来进行设计的，并且所述区段通过通用序列为Z1Z2X3X4（或者分别为X3X4和Z1Z2，表5的肽64）的四肽（两个二肽）进行连接。这些肽包含总共11个氨基酸。本发明的连接子的序列还可以在其残基采取正的扭转角的那些位置处包括D-氨基酸（表5的肽65和66）。四肽连接子的序列优选地（尽管不是唯独地）为dSer-Pro-Thr-Pro（表5的肽65，dS是立体异构体D-Ser），尽管也可以为Gly-Pro-Thr-Pro（表5的肽71）或dAla-Pro-Thr-Pro（表5的肽70，dAla是立体异构体D-Ala）。
[0180] 在另一个示例中，本发明的肽由相应于通过四肽进行连接的p50的区段Asn262-Ser271的序列组成。所得到的肽包含14个残基。四肽连接子的优选序列
可以（尽管不是唯独地）为Thr-Pro-Gly-Gln（表5的肽72），备选地（尽管不是唯独地）为Arg-Pro-(dAla)-Gln（肽69，参见图12）或Arg-Pro-Gly-Gln（表5的肽73），或Thr-Pro-(dAla)-Gln（表5的肽68）。因此，这些肽的序列可以被描述为通过六肽连接子进行环化的区段Asn264-Ser271，所述六肽连接子的氨基酸序列优选地为：(Thr或Arg)-Pro-(Gly或dAla)-Gln-Asn-Ser。备选地，该六肽连接子的第4个和第5个残基分别可以是氨基酸BmGln和NmAsn，其中BmGln和NmAsn为氨基酸L-b-甲基谷氨酰胺（在β-碳处进行甲基化的L-谷氨酰胺）和L-n-甲基天冬酰胺（N-甲基化的L-天冬酰胺）。β-甲基化的氨基酸具有更大的采取伸展构象（β结构类型）的倾向，而N-甲基化的氨基酸具有更大的采取聚脯氨酸构象的倾向，这些是在根据关于连接子区段的设计所描述的方案（第I-V点）而获得的肽结构模型中由第4个和第5个残基所采取的构象。
可以（尽管不是唯独地）为Thr-Pro-Gly-Gln（表5的肽72），备选地（尽管不是唯独地）为Arg-Pro-(dAla)-Gln（肽69，参见图12）或Arg-Pro-Gly-Gln（表5的肽73），或Thr-Pro-(dAla)-Gln（表5的肽68）。因此，这些肽的序列可以被描述为通过六肽连接子进行环化的区段Asn264-Ser271，所述六肽连接子的氨基酸序列优选地为：(Thr或Arg)-Pro-(Gly或dAla)-Gln-Asn-Ser。备选地，该六肽连接子的第4个和第5个残基分别可以是氨基酸BmGln和NmAsn，其中BmGln和NmAsn为氨基酸L-b-甲基谷氨酰胺（在β-碳处进行甲基化的L-谷氨酰胺）和L-n-甲基天冬酰胺（N-甲基化的L-天冬酰胺）。β-甲基化的氨基酸具有更大的采取伸展构象（β结构类型）的倾向，而N-甲基化的氨基酸具有更大的采取聚脯氨酸构象的倾向，这些是在根据关于连接子区段的设计所描述的方案（第I-V点）而获得的肽结构模型中由第4个和第5个残基所采取的构象。
[0181] 本发明的另一个示例在于其序列相应于通过三肽进行连接的p50的区段Asn262-Ser271（或类似地，通过五肽进行连接的区段Asn264-Ser271）的肽。三肽连接子优选地（尽管不是唯独地）具有序列(Arg或Lys)-(Arg或Lys)-Pro（表5的肽76-77，图13），相应的五肽连接子具有序列(Arg或Lys)-(Arg或Lys)-Pro-Asn-Ser。
[0182] 实施例9.立体异构体
[0183] 为了增加所述肽的结构稳定性以及因此亲和力/效能，在本发明中所考虑的修饰为将N06P87的原始序列的天然L-氨基酸用其立体异构体（D-氨基酸，D-aa）置换。由于D-氨基酸有利地采取了正的扭转角，所以N06P87的待置换的候选残基为在天然蛋白质的结构中（和/或在所述肽的结构模型中）采取此类扭转角的那些。图14显示了相应于p50的区段Gly255-Ser274的3D结构的Ramachandran图。通过利用Rooman和Wodak的Ramachandran图的区域定义（Rooman MJ,Kocher JP,Wodak SJ.1991.J Mol Biol.221(3):961-79），残基N8和G12位于区域L（具有左手旋转的螺旋区域）中并且G6位于伸展构象区域E中（G6的和ψ的值对于其余的L-氨基酸来说也是禁止的）。因此，将N8、G12和G6置换为D-Ala是有利的，考虑到该残基采取主链的所述构象和/或减少与折叠/结合相关的构型熵损失的倾向。由于当残基L-Glu、L-Gln和L-Asp构成蛋白质的环的一部分时这些残基具有高的采取螺旋构象（右手旋转的）的倾向（Swindells MB,MacArthur MW,Thornton JM.1995.Nat Struct Biol.2(7):596-603），所以类似地，D-Glu、D-Gln和D-Asp有利于采取左手旋转的螺旋构象（如残基N8的位置的情况那样）。肽17、23、25、27-31、45-51（表5）包含1至3个按照所陈述的标准设计的D-氨基酸。在本发明的肽的结构中引入D-氨基酸还对于构象并因此对于亲和力具有有利的影响，此外还通过提高在体内对蛋白水解的抗性而对于所述肽的药物代谢动力学特性正面地作出贡献，由于下述两个基本原因：a)直接效应，因为血清的内切蛋白酶消化立体有择底物，和b)所述肽的更小的柔韧性使得它们对于蛋白水解消化较不易感。
[0184] 实施例10.末端的封闭和/或与聚合物的缀合
[0185] 所述肽的特征为具有较短的体内半衰期（较小的大小，肾排出），更大的柔韧性还意味着更大的对于蛋白水解的易感性和因此更低的生物利用率。因此，可以建议在所述肽中引入化学修饰以改善体内生物利用率。本发明包括用聚乙二醇（PEG）链共价修饰的肽的设计，优选地通过所述肽的末端的修饰，例如侧链的修饰（尽管不排除其他修饰）。在表5中（肽62和63）显示了本发明的经聚乙二醇化的肽的例子。因此，本发明的经聚乙二醇化的肽具有更好的蛋白水解抗性谱、更少的肾滤过、更小的与抗体相互作用和其活性被中和的可能性、更低的抗原性和免疫原性。
[0186] 聚乙二醇化增加小分子的循环时间，小肽是被快速排泄的，在经放射 性 标 记的 情 况 下 常 常 被 描 述 为 具 有 肾 毒 性（Blumenthal R.D.,Sharkey R.M.,Goldenberg D.M.,Goldenberg D.M. 编 辑 .Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies,295-314,CRC Press Boca Raton,FL1995）。聚乙二醇化已被用于修饰蛋白质药物，例如干扰素和抗体。本发明包括通过设计多聚体结构来呈递所述肽，其中使用在肽-受体结合中允许更大亲和力的线性或支化的PEG。
[0187] 聚乙二醇化增加肽的表观分子大小，从而降低肾滤过的速度（KnaufM.J.,Bell D.P.,Hirtzer P.,Luo Z.P.,Young J.D.,Katre N.V.J.Biol.
Chem.,263:15064-15070,1988；Behr T.M.,Goldenberg D.M.,Becker W.Eur.J.Nucl.Med.,25:201-212,1998）。本发明的肽优选地用将分子大小增加至等于或大于50kDa的值的PEG来进行修饰，以便急剧地降低该分子的肾小球滤过。
Chem.,263:15064-15070,1988；Behr T.M.,Goldenberg D.M.,Becker W.Eur.J.Nucl.Med.,25:201-212,1998）。本发明的肽优选地用将分子大小增加至等于或大于50kDa的值的PEG来进行修饰，以便急剧地降低该分子的肾小球滤过。
[0188] 除了增加循环时间外，聚乙二醇化还降低治疗性分子的抗原性和对于蛋白水解 的 敏 感 性（Delgado C.,Francis G.E.,Fischer D.Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,9:249-304,1992），诱导其溶解性和血管通透性的增加（Francis G.E.,Delgado C.,Fisher D.,Malik F.,Agrawal A.K.J.Drug Target.,3:321-340,1996），这是对于抗肿瘤形成药物有利的特性。
[0189] 在血液、肾脏和肝脏中存在数种外肽酶（Werle M,Bernkop-Schnrch A.Amino Acids.2006年6月,30(4):351-67），因此在所述肽的N-末端和C-末端处的修饰可以显著地增加其蛋白水解稳定性。N-乙酰化是本发明中推荐的一种修饰，以及还有在N-末端处引入焦谷氨酸，或D-立体异构体氨基酸，等等。
[0190] 本发明的肽大部分是C-酰胺化的（在C-末端处的酰胺），这为其提供了更大的对于羧肽酶的抗性。
[0191] N-末端和/或C-末端的修饰也可以是聚乙二醇化，其除了与大小的增加和抗原性/免疫原性的降低有关的特性外，还通过修饰所述末端而增加对于蛋白酶（特别是外肽酶）的抗性。此外，PEG的添加通过蛋白水解酶类的立体位阻而引起对于总的蛋白水解（内切和外切）的抗性的增加。为此目的，所使用的PEG可以是线性的或支化的。
[0192] 对于所述肽的针对经由外肽酶的蛋白水解的保护作用也借助于下列方式来取得：通过在前面所描述的N-末端和C-末端之间的共价键的形成（表5的肽64-66、68-69）或者借助于末端与侧链的共价键合（表5的肽32-33）来进行环化。还通过将末端氨基酸置换为D-氨基酸（表5的肽67）来增加对于外肽酶的抗性。
[0193] 作为关于用PEG进行修饰的备选方案，还可能的是与N-乙酰神经氨酸（唾液酸）相缀合，该聚合物天然地出现，是非常亲水的，可生物降解的，在人中不具有受体，可以增加对于蛋白酶的抗性（血浆稳定性）和半衰期（Gregoriadis G,Fernandes A,Mital M,McCormack B(2000)Cell Mol Life Sci57:1964-1969；Fernandes Al,Gregoriadis G(1997)Biochim Biophys Acta1341:26-34）。
[0194] 本发明的肽的另一种可以接受的修饰为将N-末端置换为脂肪酸，或者脂化（表5的肽52-53）。该策略增加了所述肽对于经由外肽酶的蛋白水解的抗性，并且促进所述肽与膜的相互作用。取决于脂质的性质，可以有利于与确定的膜结构区域的相互作用，从而促进所述肽在富含所述肽的药理学作用的靶受体的结构区域中的积累。脂化还有利于具有更好的药物代谢动力学和药效动力学特性的超分子结构（胶束、聚集体、颗粒、囊泡）的形成。
[0195] 实施例11.本发明的肽的化学结构的描述
[0196] 图15显示了本发明的肽的化学结构的总表达式。该设计首先基于在实施例7中所定义的主要区段。一般地，将肽序列Asn264-Leu270暴露在不同的结构背景中，所有结构背景均包括不同程度的约束，通过涉及所述肽的主链和/或侧链的环化。所述环化通过不同化学性质的键来实现：酰胺键或二硫键，但小心地选择被环状侧链的的残基所占据的替换位置和所述侧链本身，以再现在本发明中鉴定出的蛋白p50/p25的功能位点的结构和形貌学（topography）。一个特别的解决方案在于主链的环化，其通过选择锚位点和连接子序列（其具有高度的采取与主要区段的结构相容的构象的结构倾向）来实现。可选地，也可以利用次要区段，基本上作为环状侧链的替换位置的支持。此外，按照p50/p25的功能位点的形貌学，次要区段可以提供额外的与潜在受体的接触表面。一个例子是在C-末端次要区段+3 +4的位置X 和X 处包含携带正电荷的残基和/或氢桥供体。所述肽可以包含一个或多个在图15中所显示的环，尽管为了在表5中显示，作为举例仅包含了单环。本发明的肽可以包括其侧链包含氨基、羧基或巯基的非天然或特殊的氨基酸，目的是占据替换位置以用于环化或其他化学修饰。还可以在多肽链的采取正的扭转角的位置处包含D-氨基酸立体异构体，无论是主要区段的位置还是次要区段的位置。另外，本发明的肽可以通过与聚合物（例如PEG和/或其他化学基团）共价结合来进行修饰。这些修饰可以在末端处和/或在替换位置的侧链处进行，只要它们没有被经环化的侧链占据。
[0197] 表5的肽1、2、3和4（在其合成和纯化过程中分别将它们编码为：A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s和J08P48s-s）构成了涵盖本发明的肽的基本方面的实施实例，包括：不同的大小，具有或没有次要区段，以及基本的替换位置。选择这些肽用于证明其在体内肿瘤模型中的效应：p25的具有细胞毒性活性的隐蔽肽片段的结构模拟产生了具有20个或更少的氨基酸的分子，其达到了再现p25的抗肿瘤活性，有利地用于在癌症治疗中使用。
[0198] 实施例12.在同种同基因的和异种移植的肿瘤模型中经优化的环肽的抗肿瘤活性的评价
[0199] 为了评价本发明的新的环肽家族（其模拟了p25的活性区域的结构）的抗肿瘤活性，选择4种模型肽，它们包含该家族的不同的环化和插入变体。这些模型肽是表5的肽1、2、3和4（为了活性测试分别将它们编码为：A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s）。作为阳性对照组，采用用多肽CIGB370r进行治疗的组。
[0200] 体重 为 大约22g的 6-8周龄 的 雌性C57BL/6 小鼠 由国 家 实验 动 物生 产 中 心（Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio（CENPALAB）,Habana,Cuba）提供，并且在遗传工程与生物技术中心（Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología，CIGB）的Bioterio中在无病原体的条件下进行维持。所述实验按照对于正确使用和照料实验动物的建议来进行。在每种情况下，测量肿瘤体积[通过公
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式：体积=ax(b/2)，其中a是肿瘤的宽度和b是肿瘤的长度]，并且评价动物的存活率。通过时序检验来比较这些组的存活率。通过程序GraphPad Prism4.0（GraphPad Software,San Diego,CA,USA）来获得统计学参数。
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式：体积=ax(b/2)，其中a是肿瘤的宽度和b是肿瘤的长度]，并且评价动物的存活率。通过时序检验来比较这些组的存活率。通过程序GraphPad Prism4.0（GraphPad Software,San Diego,CA,USA）来获得统计学参数。
[0201] 在右胁处通过皮下途径（s.c.）用50000个TC-1细胞对C57BL/6小鼠进行注射。当肿瘤变成可检测时，随机化并形成用研究目标肽进行治疗的组，从而评价不同的施用途径。荷瘤动物接受6次隔日的用80μM所考虑的肽进行的施用，或者仅接受作为对照的载体。在每个组中，使用5只小鼠。所述动物在无病原体的条件下进行维持，并且按照良好的使用实验动物的工作实践来实施所述操作程序。
[0202] 所有治疗组的存活率在统计学上不同于接受载体的组。图16显示了3个区组：1)具有最高存活率的区组，其是用肽J08P48s-s和用CIGB-370r进行治疗的组，它们之间不存在显著差异；2)具有中等存活率的区组，其包括用肽A08P28s-s、A08P25s-s和J08P46s-s进行治疗的组，它们之间不存在显著差异，并且其不同于区组1；和3)阴性对照组。这些结果证明，在本发明中所描述的新的肽家族（其由在该模型中所评价的肽来代表）能够显著地提高经治疗的动物的存活率，直至达到用其所源自的多肽时所描述的活性。
[0203] 除了肿瘤内途径外，在该TC-1模型中还评价了所述肽的其他施用途径，例如腹膜内途径。图17显示，以所述两种施用途径，环肽例如肽J08P48s-s均再现了在该模型中对于多肽CIGB-370r所观察到的效应。这证明了本发明的环肽对于治疗远端实体肿瘤的功效。
[0204] 用图19的施用剂量和施用方案，对于在NIH无胸腺小鼠中的人结肠癌Ls174T模型，相比于多肽CIGB370r而言，比较了线性区段Gly255-Ser274（肽N06P87）与两种本发明的模型环肽的效应。在13天后，当肿瘤已建立起来并且是可触摸到的时候，开始所述生物分子的施用方案（图19A）。以分阶段递减的剂量施用所述肽：两次每48小时施用600μM，然后，4次每48小时施用330μM，和最后，4次每72小时施用90μM。在4周期间每周一次施用多肽CIGB-370r。
[0205] 在该情况下，与线性肽不同，在图19中所显示的环肽能够显著地（时序检验：p<0.05）提高经治疗的动物的存活率，相比于接受载体的组和相比于线性肽N06P87而言。
关于平均肿瘤体积的T/C的值（图19B），对于A08P25s-s、J08P48s-s、CIGB-370r和N06P87分别为：35%、35%、37%和72%。关于平均存活率的T/C的值（图19C），对于A08P25s-s、J08P48s-s、CIGB-370r和N06P87分别为：144%、161%、142%和117%。这些结果证明，模拟p25的抗肿瘤活性位点的三维结构的本发明的环肽对于开发抗肿瘤形成疗法是有用的。相比于原始蛋白质而言，本发明的肽在其药物代谢动力学和药效动力学特性方面具有优点。
关于平均肿瘤体积的T/C的值（图19B），对于A08P25s-s、J08P48s-s、CIGB-370r和N06P87分别为：35%、35%、37%和72%。关于平均存活率的T/C的值（图19C），对于A08P25s-s、J08P48s-s、CIGB-370r和N06P87分别为：144%、161%、142%和117%。这些结果证明，模拟p25的抗肿瘤活性位点的三维结构的本发明的环肽对于开发抗肿瘤形成疗法是有用的。相比于原始蛋白质而言，本发明的肽在其药物代谢动力学和药效动力学特性方面具有优点。
[0206] 实施例13.本发明的环肽对于不同组织学来源的人肿瘤细胞系的广谱作用[0207] 使用磺基罗丹明B方法（Skehan P,Storeng R,Scudiero D等人,(1990)“New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening”.J.Natl.Cancer Inst.82:1107-1112），在数种具有不同组织学来源的人肿瘤细胞系上评价了本发明的肽。作为例子，图18显示了对于所评价的细胞系具有广谱作用的肽，其中显示出剂量-应答效应。这证明，这些新分子对于治疗不同组织学来源的恶性肿瘤是有用的，所述恶性肿瘤尤其是例如：喉癌（HEp-2）、小细胞肺癌（H82）、非小细胞肺癌（H125）、宫颈癌（HeLa，Caski）和神经胶质瘤（U87）。实施例14.在基质胶（matrigel）中管状结构的形成的抑制
[0208] 目前，国际科学界已充分确立，组合是癌症治疗的关键，尤其是当将对于肿瘤细胞的直接作用（抑制其增殖或引起其死亡）与对于肿瘤环境的作用（抑制血管生成）相组合时。为此，通过在基质胶上由衍生自微脉管系统的人内皮细胞（HMEC）形成内皮索的方法（Crum R,Szabo S,Folkman J.(1985).Science.230:1375-8），评价了本发明的肽的抗血管生成活性。图20显示了本发明的环肽依赖于所使用的浓度而抑制管状结构形成的能力，从而证明了其抗血管生成活性。
[0209] 实施例15.具有自装配特性的肽结构，基于源自粘质沙雷氏菌的环肽
[0210] 本发明的肽具有由于在所述肽的表面上疏水性和亲水性斑片的隔离而提供的两亲特征。基本的疏水性斑片由在蛋白p50的3D结构中邻近的残基Tyr259、Phe269和Leu270的侧链形成。该表面的其余部分基本上由极性的或带电荷的残基形成。所述肽的该两亲特征使得它们具有形成纳米级和/或微米级的超分子聚集体的倾向，如在图21的照片中所显示的。所述肽的聚集还可以通过形成涉及主链和侧链区段的分子间氢桥来介导。本发明的肽的N-末端和C-末端次要区段的伸展结构在给定的配制条件下可以有利于聚集类型，用于在癌症治疗（例如联合疗法）中以及在纳米生物技术和受控释放系统的领域中的新应用（Monica C.Branco,Joel P.Schneider.Acta Biomaterialia5(2009)817-831）。
[0211] 实施例16.与灵菌红素相组合的抗肿瘤和抗血管生成的环肽具有对于肿瘤细胞的协同细胞毒性效应
[0212] 将 分 离 自 粘 质 沙 雷 氏 菌CMIB4202 的 灵 菌 红 素（Abrahantes-Pérez MC,Reyes-González J,Véliz Ríos G等人,(2006)Cytotoxic proteins combined with prodigiosin obtained from Serratia marcescens have both broad and selective cytotoxic activity on tumor cells.J Chemother.18:172-81）与本发明的环肽相组合，通过合适的配制或者通过共价键，要么通过化学合成直接地，要么通过单一分子之间的化学反应。环肽例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s增强了灵菌红素对于所评价的不同的人肿瘤细胞系（例如A549、A375、PC-3、U87等等）的细胞毒性活性，通过SRB方法（Skehan P,Storeng R,Scudiero D等人,(1990)“New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening”.J.Natl.Cancer Inst.82:1107-1112），具有在nM范围内的GI50；并且以至少一个数量级降低了由于灵菌红素对于原代成纤维细胞的作用而产生的细胞毒性活性。这暗示，这两种分子的作用机制是不同的，并且可以相组合而具有对于癌症治疗有利的结果。
[0213] 实施例17.用聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）家族的聚合物包囊的抗肿瘤和抗血管生成的环肽的药物组合物的获得
[0214] 为了修饰本发明的肽的药物代谢动力学和生物分布，按照对于每种特殊情况所希望的肿瘤学治疗适应症，探究了将这些环肽用聚合物包囊在PLGA微球体中。为此通过将1g聚合物溶解在二氯甲烷中而制备了10%（w/v）的乳酸与乙醇酸（50:50）的共聚物的溶液。向1ml的聚合物溶液添加200μl的以20至40mg/ml的浓度包含至少一种本发明的肽（例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s）的水溶液。将该混合物用探头超声波进行超声处理30秒。将所得到的乳状液倾倒入40ml的1%聚乙烯醇中，并且通过在Ultraturrax T8均化器中以14000rpm搅拌两相而获得第二种乳状液（w/o/w）。将该双重乳状液倾倒入
140ml的0.1%聚乙烯醇30000-70000中，并且在均化器中以300rpm搅拌1小时以蒸发掉二氯甲烷。最后，通过过滤来收集微球体，用每次50ml蒸馏水洗涤5次，并且在冻干器中通过冷冻-脱水来进行干燥。将干的微球体储存于4℃，直至其使用的时候。
140ml的0.1%聚乙烯醇30000-70000中，并且在均化器中以300rpm搅拌1小时以蒸发掉二氯甲烷。最后，通过过滤来收集微球体，用每次50ml蒸馏水洗涤5次，并且在冻干器中通过冷冻-脱水来进行干燥。将干的微球体储存于4℃，直至其使用的时候。
[0215] 以与所描述的相似的方式获得具有赋形剂的环肽例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s的微球体，但在内水相中添加Pluronic F-127（10mg）和NaCl（0.5mg）。在携带人黑素瘤A375类型肿瘤的无胸腺小鼠中，在邻近肿瘤的区域中以皮下方3
式施用这两种类型的微球体。当肿瘤达到大于200mm 的体积时，进行单次施用，达到了与用多次施用（三次/周，在四周期间）而获得的结果相似的结果，其中对于肿瘤体积和存活率分别具有T/C<10%和T/C>170%。
式施用这两种类型的微球体。当肿瘤达到大于200mm 的体积时，进行单次施用，达到了与用多次施用（三次/周，在四周期间）而获得的结果相似的结果，其中对于肿瘤体积和存活率分别具有T/C<10%和T/C>170%。
[0216] 实施例18.负载有抗肿瘤和抗血管生成的环肽的常规脂质体的获得
[0217] 在50mL的圆底烧瓶中，将浓度为10mg/mL的磷脂酰胆碱溶解在无水乙醇中。通过在环境温度下旋转蒸发直至在容器的壁上形成干的层来使脂质干燥。为了将至少一种在本发明中所描述的环肽，例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s，包囊在脂质体中，通过用包含至少一种前述肽的缓冲溶液进行均质化来使所述干的脂质层水化。为了减小脂质体的大小，使负载有所提及的肽的脂质体的制备物经历数次通过具有平均直径为100nm的孔的聚碳酸酯膜的挤出步骤，直至脂质体的平均大小为大约100nm。
[0218] 为了将包囊在脂质体中的肽与未经包囊的肽分开，将悬浮液在4℃下以100000×g离心40分钟。将上清液转移到干净的管中，并且用pH7.2的磷酸盐缓冲盐水重悬浮沉淀物。在相同条件下再次重复离心，并且将上清液转移到干净的管中并与第一次离心的上清液相混合。将沉淀物（负载有本发明的环肽的脂质体）重悬浮在pH7.2的磷酸盐缓冲盐水中。将该最终制备物储存于4℃直至其使用。向携带肿瘤TC-1的小鼠以单剂量施用负载有至少一种本发明的肽的脂质体，并且以此再现了用多次施用而取得的抗肿瘤效应的结果（显示在实施例12中）。实施例19.具有结合金属离子和将药物导向特定组织的能力的抗肿瘤和抗血管生成的环肽
[0219] 本发明的肽的氨基酸组成具有结合金属离子（例如，射电金属和顺磁金属）以用作药物而不影响其生物学特性的能力。
[0220] 可以通过不同的物理化学过程由在前面实施例中所指出的位点产生肽-金属离子复合物。在射电金属之中，可以包括元素Tc、Re、Au、Ag、Pd、As、Cu、Hg和Ru的同位素。金属离子与肽之间的反应产物是这两个分子之间的复合物，其在携带肿瘤TC-1的动物（C57BL/6小鼠）模型中被证明特异地导向不同组织学来源的肿瘤和转移。可以将这些复合物以非常特异的方式用于癌症的诊断和治疗，其中使被正常器官和组织的摄取最小化。
[0221] 在本发明的肽与放射性同位素的复合物（用于癌症的诊断和治疗）的情况下，可以99 131
分别使用诸如Tc 和I 的放射性同位素。本发明的与金属相结合的肽可以直接用于进行施用，或者可以与其他转运分子相缀合。
分别使用诸如Tc 和I 的放射性同位素。本发明的与金属相结合的肽可以直接用于进行施用，或者可以与其他转运分子相缀合。
[0222] 为了将本发明的肽直接导向肿瘤并在肿瘤中取得相比于正常器官和组织而言更大的积累，按照实施例8合成了由与聚乙二醇共价连接的肽（例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s）所形成的复合物。然后，将其与铁氧化物纳米颗粒一起进行配制，从而产生主要由下列组成的纳米颗粒化磁性运载体复合物：本发明的抗肿瘤环肽、聚合物分3
子和铁氧化物纳米颗粒。当肿瘤体积大于200mm 时，将该复合物以静脉内方式（通过小鼠的尾）施用给携带皮下肿瘤TC-1（位于动物的右胁处）的C57BL/6小鼠。向肿瘤区域局部地施加外磁场，并且该复合物通过血液循环进行输送并集中在肿瘤中（Lübbe AS,Bergemann C,Alexiou C.Targeting tumors with magnetic drugs.PagéM, 编 辑 .Cancer drug discovery and development:tumor targeting in cancer therapy.Totowa NJ:Humana Press Inc,2003.第379-88页）。作为阳性对照组，使用与在实施例12中所显示的相似的施用方案和剂量；和作为阴性对照组，使用没有抗肿瘤肽存在的载体。用携带抗肿瘤肽的纳米颗粒化磁性运载体进行治疗的组的抗肿瘤效应经证明在比阳性对照短的时间内减小了肿瘤体积（p<0.05），并且存活率比其余的组显著地更高（p<0.05），这些证明了该技术在本发明的环肽的治疗效果中的潜力，这归因于其在肿瘤中集中更大量的治疗性分子的能力。
子和铁氧化物纳米颗粒。当肿瘤体积大于200mm 时，将该复合物以静脉内方式（通过小鼠的尾）施用给携带皮下肿瘤TC-1（位于动物的右胁处）的C57BL/6小鼠。向肿瘤区域局部地施加外磁场，并且该复合物通过血液循环进行输送并集中在肿瘤中（Lübbe AS,Bergemann C,Alexiou C.Targeting tumors with magnetic drugs.PagéM, 编 辑 .Cancer drug discovery and development:tumor targeting in cancer therapy.Totowa NJ:Humana Press Inc,2003.第379-88页）。作为阳性对照组，使用与在实施例12中所显示的相似的施用方案和剂量；和作为阴性对照组，使用没有抗肿瘤肽存在的载体。用携带抗肿瘤肽的纳米颗粒化磁性运载体进行治疗的组的抗肿瘤效应经证明在比阳性对照短的时间内减小了肿瘤体积（p<0.05），并且存活率比其余的组显著地更高（p<0.05），这些证明了该技术在本发明的环肽的治疗效果中的潜力，这归因于其在肿瘤中集中更大量的治疗性分子的能力。
[0223] 实施例20.抗肿瘤和抗血管生成的环肽与常规的细胞抑制剂的组合的协同效应[0224] 在下列实验条件下，评价了与一组细胞抑制剂各自地相组合的本发明的肽（例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s）的抗肿瘤形成效应的协同作用。在处于200-12.5μM的浓度范围内的上面提及的肽之一存在下，在96-孔平板中培养A549细胞（非小细胞肺癌）。同时，以1至2000nM的浓度范围添加至少一种为该研究而选择的细胞抑制剂（顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、长春新碱、多柔比星、环磷酰胺、丝裂霉素C、伊马替尼、万珂、易瑞沙），并延长温育72小时。在该时间之后，进行通过MTT方法来揭示细胞生存力。最后，在每种情况下测量在570nm处的吸光度，并且绘制各自的剂量-应答曲线。当将这些细胞抑制剂与至少一种本发明的肽同时地相组合时，关于每种细胞抑制剂的降低50%细胞增殖的剂量值（IC50）下降了一或两个数量级。这些试验的结果证明了由本发明的环肽和在本发明中所提及的细胞抑制剂构成的药物组合的抗肿瘤形成效应的增强。
[0225] 实施例21.在癌症动物模型中药物组合的抗肿瘤效应的增强
[0226] 为了该目的，在6-8周龄的裸鼠（BalBc）的背部区域中通过皮下途径接种5×1063
个A549细胞。在10天之后，当肿瘤是可触摸到的（大约30mm）时候，进行本发明的药物组合的施用。通过下述方式来进行所述组合的成分的施用：采用与实施例12中所显示的相同的施用方案和剂量经腹膜内途径施用至少一种配制在合适载体中的本发明的环肽（例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s），并且同时以相同的治疗频率经腹膜内途径接种1mg/kg/天的细胞抑制剂（例如顺铂、环磷酰胺和丝裂霉素C）。还将所述细胞抑制剂溶解在与所述环肽相同的载体中。最后，测量随时间而变化的肿瘤团块体积以评价体内抗肿瘤形成效应。结果表明，当同时施用这两种成分时，本发明的药物组合产生了表现为肿瘤团块完全消退的抗肿瘤效应的增强。观察到肿瘤生长的抑制和显著的动物存活率的增加，相比于用安慰剂进行治疗的组而言。以这种方式，根据关于癌症的相关且预测性的临床前模型的结果，证明在体内也表现出本发明的药物组合的成分之间的协同相互作用。
个A549细胞。在10天之后，当肿瘤是可触摸到的（大约30mm）时候，进行本发明的药物组合的施用。通过下述方式来进行所述组合的成分的施用：采用与实施例12中所显示的相同的施用方案和剂量经腹膜内途径施用至少一种配制在合适载体中的本发明的环肽（例如A08P25s-s、A08P28s-s、J08P46s-s、J08P48s-s），并且同时以相同的治疗频率经腹膜内途径接种1mg/kg/天的细胞抑制剂（例如顺铂、环磷酰胺和丝裂霉素C）。还将所述细胞抑制剂溶解在与所述环肽相同的载体中。最后，测量随时间而变化的肿瘤团块体积以评价体内抗肿瘤形成效应。结果表明，当同时施用这两种成分时，本发明的药物组合产生了表现为肿瘤团块完全消退的抗肿瘤效应的增强。观察到肿瘤生长的抑制和显著的动物存活率的增加，相比于用安慰剂进行治疗的组而言。以这种方式，根据关于癌症的相关且预测性的临床前模型的结果，证明在体内也表现出本发明的药物组合的成分之间的协同相互作用。
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