一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用
专利汇可以提供一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种检测过 氧 亚 硝酸 根离子的 荧光 探针： 。本发明所述的荧光探针具有高特异性，在进行相应过氧亚硝酸根离子的检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内过氧亚硝酸根离子的实时测定，具有广阔的应用前景。本发明所述的检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射 光谱 特性，通过绘制标准曲线进行细胞内过氧亚硝酸根离子的测定，可以实现对细胞内过氧亚硝酸根离子的快速准确检测的目的。，下面是一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：
式（I）。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）β-氨基丙酸和对甲苯磺酰氯在NaOH溶液中反应，反应结束后加入盐酸溶液，析出沉淀过滤、洗涤、减压蒸馏获得化合物1： ；
（2）4-二乙氨基酮酸与间羟基苯基哌嗪在CH3COOF中回流反应，反应结束后分离提纯，得到化合物2： ；
（3）在氮气保护下，化合物1、化合物2、EDC、HOBT和DIEA在DMF中反应，反应结束后分离提纯得到化合物3： ；
（4）化合物3与水合肼在无水乙醇中反应，反应结束后分离提纯得到荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述β-氨基丙酸和对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1.2-1.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述纯化步骤为：将沉淀冷水洗涤后，干燥，然后以二氯甲烷溶解，以体积比为5:1的石油醚:乙酸乙酯为淋洗液过柱层析。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离提纯步骤为：将反应混合物浓缩，浓缩液以体积比为5:1的CH2Cl2:MeOH为淋洗液过柱层析。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述分离提纯步骤为：将反应混合物浓缩，浓缩液以体积比为15:1的CH2Cl2:MeOH为淋洗液过柱层析。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述分离提纯步骤为：将反应混合物浓缩，浓缩液以体积比为20:1的CH2Cl2:MeOH过柱层析。
8.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测溶液、细胞中过氧亚硝酸根离子中的应用。
一种检测过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
发明内容
（2）4-二乙氨基酮酸与间羟基苯基哌嗪在CH3COOF中回流反应，反应结束后分离提纯，得到化合物2： ；
（3）在氮气保护下，化合物1、化合物2、EDC、HOBT和DIEA在DMF中反应，反应结束后分离提纯得到化合物3： ；
（4）化合物3与水合肼在无水乙醇中反应，反应结束后分离提纯得到荧光探针。
附图说明
图3是荧光探针的1H NMR图谱；
图4是荧光探针在不同浓度过氧亚硝酸根离子下的荧光光谱及线性关系数据；
图5是荧光探针对过氧亚硝酸根离子的影响时间；
图6是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱及与过氧亚硝酸根离子时间响应光谱；
图7是用不同浓度的探针处理HepG2细胞8小时的细胞活性图；
图8是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
3.4 mL），然后加入对甲苯磺酰氯（1.83 g, 9.6 mmol），反应混合物在35℃下搅拌。加入1M的NaOH的水溶液，使pH值保持在9，待碱完全消耗后，在35℃下搅拌一小时，过滤除去未反应的对甲苯磺酰氯，在0℃条件下，用5 M的HCl水溶液酸化反应混合物，使pH=2，析出的白色沉淀通过过滤、冷水洗涤、二氯甲烷溶剂溶解，过柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯=5:1)，即为化合物1，其1H NMR图谱如图1：
；
（2）将4-二乙氨基酮酸（940 mg, 3 mmol），间羟基苯基哌嗪（534.7 mg, 3 mmol），溶于
5 mL CH3COOF中，于90℃加热回流反应12 h，将反应混合物真空浓缩，并通过柱层析纯化（CH2Cl2:MeOH=5:1v/v）得到红色粉末，即为化合物2，其1H NMR图谱如图2：
；
（3）将化合物1（243.3 mg, 1 mmol），化合物2（456.6 mg, 1 mmol），EDC（383.4 mg, 2 mmol），HOBT（67.6 mg, 0.5 mmol）溶于2 mL DMF中，搅拌10 min后加入200 µL DIEA，在氮气保护下于室温搅拌5 h，分别用水和饱和NaCl萃取除去DMF，将反应混合物真空浓缩，并通过柱层析纯化（CH2Cl2:MeOH=15:1v/v）得到粉红色粉末，即为化合物3，其1H NMR图谱如图3：
；
（4）将化合物3（234.2 mg, 0.3 mmol），水合肼（150.2 mg, 3 mmol）溶于10 mL无水乙醇中，于90℃下加热回流反应2 h，将反应混合物真空浓缩，并通过柱层析纯化（CH2Cl2:MeOH=20:1v/v）得到白色粉末，即为荧光探针，其1H NMR图谱如图4：
。
探针能够对浓度为5-200 μM的过氧亚硝酸根离子作出响应；分析581 nm处的荧光强度与5-
50 μM过氧亚硝酸根离子浓度的线性关系，如图4（B）所示：该浓度范围内，荧光强度与过氧亚硝酸根离子浓度线性关系良好，线性回归方程为y=24.34x-42.64，R=0.9961。
540 nm），共检测10min；计算各体系中荧光强度；评估该探针对过氧亚硝酸根离子的响应速度，如图5所示：加入ONOO-之后响应时间小于5 s，说明探针对ONOO-响应非常迅速。
14. OCl-；15. CO32-；16. SO32-；17. ONOO-。可见，本发明的探针仅对氧亚硝酸根离子有响应，抗干扰能力强。
加入荧光探针培养30min后再分别加入100 μM和200 μM ONOO 溶液，在培养箱中培养30 min，之后用PBS缓冲液冲洗培养细胞3次，进行荧光成像（λex=561 nm），结果见图8：HepG2细胞显示相对较弱的荧光，当加入ONOO-溶液后，红色荧光增强，而且荧光强度随ONOO-浓度的增加而增加。
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