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一种复合菌剂及其制备方法和应用

阅读：327发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种复合菌剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及废气净化技术领域，具体涉及一种复合菌剂及其制备方法和应用，包括下列步骤：(A)原始菌液驯化；(B)主要菌种发酵；(C)辅助菌种混合发酵；(D)将主要菌种液和辅助菌种液进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；(E)将微生物菌泥和干燥保护剂进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。本发明的一种复合菌剂的制备方法，在石油污染源地收集菌种进行驯化，将主要菌种进行单一发酵，将菌种进行定向混合发酵，并将单一发酵与混合发酵的菌种液混合、离心得到微生物菌泥，将微生物菌泥与干燥保护剂混合制得石油化工废气治理复合菌剂，制备的生产周期短，制备出的菌剂具有高效的降解能力。，下面是一种复合菌剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化处理，得到驯化菌种；
(B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；
(C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；
(D)将主要菌种液和辅助菌种液进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；
(E)将微生物菌泥和干燥保护剂进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述驯化菌种的浓度
7 7
为6.5×10-9.0×10CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述定向培养基溶液包括定向选择碳源5～10g/L，微生物定向选择剂50～100mg/L，酵母粉1.0～2.0g/L，蛋白胨
5～10g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，NH4Cl 0.5～1.0g/L，KH2PO4 3.0～4.5g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值6.5～7.5。
4.根据权利要求3所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述定向选择碳源为丁烷、丁二烯、对苯二甲酸和环氧乙烷中的一种或两种以上的混合物。
5.根据权利要求3所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸2-4份和制霉菌素1-2份。
6.根据权利要求1所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属10～15份、肠球菌属10～15份、嗜麦芽窄食单胞菌属2～4份、壤霉菌属1～3份、不动杆菌属1～2份、螯台球菌属1～2份，克雷伯氏菌属60～80份。
7.根据权利要求1所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为(2-5)：(0.5-2)。
8.根据权利要求1所述的一种复合菌剂的制备方法，其特征在于：所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为(3-6)：(0.5-2)。
9.一种复合菌剂，其特征在于：由上述权利要求1-8中任一项所述的复合菌剂的制备方法制备而成。
10.一种复合菌剂的应用，其特征在于：将权利要求9所述的复合菌剂放置于风量为
8000-120000m3/h的石油化工废气中进行降解净化。

说明书全文

一种复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及废气净化技术领域，具体涉及一种复合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 石油化工行业在生产过程中会产生大量的废气，化工废气异味很大，而且对人体有着很大的危害。若处理不当，不仅会对周围环境产生很大的影响，还会对化工厂员工和周围居民健康造成极大损害。

[0003] 如今，治理化工废气的方法主要有吸附吸收法、催化氧化法和生物处理法。由于吸附吸收法、催化氧化法等使用物理、化学方法在处理石油烃类废气时不够理想且容易引起二次污染，而石油中含有的绝大部分烃类均可被微生物代谢降解，所以当今世界研究的热点是具有费用低、处理效果好、对环境影响小、无二次污染等优点的生物处理法。

[0004] 石油化工行业废气成分复杂繁多，而且化学性质和化学结构相差很多。单个菌种无法降解处理全行业的多种污染物，复合菌种的使用是未来生物处理废气的必然趋势。进一步地，由于复合菌种含有多个菌种，每个菌种都有独特的代谢特性，如果使用通用培养基(如LB培养基等)进行扩大生产，复合菌种的成分会发生巨大的差异，不再具有原来的高效降解能力，故对于石油化工废气的复合菌种的筛选以及相应的生产工艺研发迫在眉睫。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种复合菌剂的制备方法，在石油污染源地收集菌种进行驯化，将驯化后中的主要菌种进行单一发酵，同时，将驯化后的菌种进行定向混合发酵，并将单一发酵与混合发酵的菌种液混合、离心得到微生物菌泥，将微生物菌泥与干燥保护剂混合制得石油化工废气治理复合菌剂，制备的生产周期短，制备出的菌剂具有高效的降解能力。

[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0007] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0008] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0009] (B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0010] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0011] (D)将主要菌种液和辅助菌种液进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0012] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0013] 本发明的一种复合菌剂的制备方法，在石油污染源地收集菌种进行驯化，将驯化后中的主要菌种进行单一发酵，同时，将驯化后的菌种进行定向混合发酵，并将单一发酵与混合发酵的菌种液混合、离心得到微生物菌泥，将微生物菌泥与干燥保护剂混合制得石油化工废气治理复合菌剂。在石油污染源地进行收集菌种，能够确保菌种的丰富度，将驯化后的主要菌中进行单一发酵，能够大大提高制备出菌剂的降解效率，而且单一发酵能够保证菌种成分不会发生变化，可以实现大批量生产；将驯化后的菌种进行定向混合发酵，既能够使发酵后的混合菌种具有高效的降解能力，也能够使保留驯化菌种中的菌种丰富度，从而提高制备菌剂的降解效率。

[0014] 石油污染源地可以是加油站、修车厂或储油厂等。收集时对土壤和污水进行收集，确保能全面收集到不同的菌种，优选地，对土壤样品和污水样品进行等量混合。石油化工废气如汽油、柴油，以及沥青或工厂生产废渣所产生的废气。驯化时将采得的土壤样品和污水样品等量混合，按8-12％接种量溶于100mL无菌水中(内含玻璃珠15～20颗)，在 25-32℃,120-200rpm环境中震荡培养15-20h后，静置分层，所获上清液即为原始菌液；将原始菌液接种到洗气瓶中，剩余补充磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾4.4g/L、磷酸氢二钾3.4 g/L、氯化铵
0.1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.48g/L和适量微量元素溶液)。设置三级生物反应装置，并进行串联相接。通入石油化工废气，控制进气的总挥发性有机物(TVOCs) 浓度为800-
1200ppm左右，每天测定不同每个装置之间的总挥发性有机物TVOCs含量和组成情况。当生物反应装置的培养基OD600浓度较高时(OD600≥1)，将反应装置用新的无机盐缓冲溶液进行稀释(1：1)。持续运行到装置能实现TVOCs的稳定降解到40-60ppm 以下，即得到驯化菌种。

[0015] 进行单一发酵时，通过梯度稀释和平板涂布的方式，从驯化后的菌种中筛选出复合菌种中的主要菌种克雷伯氏菌属，使用LB溶液(氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， pH＝7)进行活化，并将克雷伯氏菌属接种到主发酵罐中，在32-38℃培养25-30小时，得到主要菌种液，所用培养基溶液为糖蜜1.8-2.2g/L，葡萄糖18-22g/L，NaCl 1.0-2.0g/L， NH4Cl 0.5-1.5g/L，KH2PO4 4.0-5.0g/L，pH值6.8-7.2。

[0016] 进行混合发酵时，在副发酵罐中加入定向培养基溶液，在36～38℃培养20-25小时，得到辅助菌种液。将主要菌种液与辅助菌种液以体积比1-3:0.5-1.5的比例进行混合，充分搅拌，对混合后的菌液进行离心，移取上清液，得到微生物菌泥。将微生物菌泥与干燥保护剂以重量比3-6：0.5-2的比例进行混合搅拌，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。干燥保护剂为草木灰、碳石灰中的一种或两种以上混合物。

[0017] 其中，所述驯化菌种的浓度为6.5×107-9.0×107CFU/mL。驯化使菌种的浓度达到一定的数量，确保菌种的稳定性，同时便于后续菌种的发酵培养。当驯化菌种浓度过低时，容易在混合发酵时，菌种产生大规模变化，导致发酵失败。当驯化菌种浓度过高时，容易导致部分菌种死亡，降低菌种多样性。

[0018] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物(TVOCs)浓度为800-1200ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到40-60ppm。使用具有特定总挥发性有机物(TVOCs)浓度的废气进行驯化，使菌种具有高效降解能力。同时控制总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低特定值时结束驯化，能够确保菌种具有稳定性。

[0019] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源5～10g/L，微生物定向选择剂50～100 mg/L，酵母粉1.0～2.0g/L，蛋白胨5～10g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，NH4Cl 0.5～1.0g/L，KH2PO4 3.0～4.5g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值6.5～7.5。当只使用汽油、柴油和油渣等污染物作为污染物碳源进行培养时，菌种的生长会很慢，周期会很长，所以需要调整培养基来加速菌种的生长。使用本发明的定向培养基溶液能够加快菌种的繁殖培养速度，大大减少培养生产周期，同时，能够使菌种朝着具有高效降解石油化工废气的方向进行变化。
进一步，微生物定向选择剂能够抑制杂质的生长，从而有利于本发明所需菌种的生长繁殖。
使用汽油污染物作为培养基进行培养的时间为28-50天，而且最终产品浓度较低。使用本发明的定向培养基溶液进行培养，产品制备的时间为4-6天，大大提高了培养效率，加快制备周期。

[0020] 其中，所述定向选择碳源为丁烷、丁二烯、对苯二甲酸和环氧乙烷中的一种或两种以上的混合物。定向选择碳源包括下列重量份数的原料：丁烷4-6份、丁二烯1-3份、对苯二甲酸0.5-1.5份和环氧乙烷0.5-1.5份。优选地，丁烷5份、丁二烯2份、对苯二甲酸1 份和环氧乙烷1份。

[0021] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸2-4份和制霉菌素1-2份。在原始菌液的菌种中，主要成分为革兰氏阳性菌的鞘氨醇杆菌属以及肠球菌属。为了保证复合菌种生产过程中，加入少量的杂菌抑制剂能够抑制真菌以及革兰氏阴性菌的生长，使微生物得到有效的定向选择。

[0022] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属10～15份、肠球菌属 10～15份、嗜麦芽窄食单胞菌属2～4份、壤霉菌属1～3份、不动杆菌属1～2份、螯台球菌属1～2份，所述克雷伯氏菌属的重量份数为60-80份。使用石油污染源地的采集样品进行驯化能够保留多种具有降解石油化工废气的菌种，对石油化工废气具有高效的降解性。经过驯化后的驯化菌种中主要成分为革兰氏阳性菌的鞘氨醇杆菌属、肠球菌属以及克雷伯氏菌属，其中，克雷伯氏菌属对石油化工废气中的成分具有高效的降解能力，同时，经过驯化后的鞘氨醇杆菌属、肠球菌属、嗜麦芽窄食单胞菌属、壤霉菌属、不动杆菌属和螯台球菌属均具有较高的降解能力。

[0023] 其中，所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属、产吲哚金黄杆菌、无色杆菌属、嗜染料菌属、红育菌属、地杆菌属、红球菌属以及芽孢杆菌属。小组分菌属为驯化菌种中重量份数小于0.5份的菌属，其对石油化工废气也具有高效降解能力。

[0024] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为(2-5)：(0.5-2)。将主要菌种液和辅助菌种液按特定的体积比进行混合，能够让主要菌种液的降解能力发挥最大的降解作用，同时，也能够让辅助菌种液中的菌种发挥废气降解能力，能够对具有多种不同成分的废气成分进行高效降解。

[0025] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为(3-6)：(0.5-2)。干燥保护剂能够让微生物菌泥在适宜的环境中对废气进行降解，使菌种具有较高的活性，同时又能保护菌种，避免外界环境对菌种的损害，提高使用寿命。

[0026] 本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂由上述制备方法制备而成。使用上述的制备方法制备而成的复合菌剂对石油化工废气具有全面且高效的降解能力，而且菌种寿命长，有效降解时间长。

[0027] 本发明的再一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种复合菌剂的应用，复合菌剂放置于风量为8000-120000m3/h的石油化工废气中进行降解净化。使用时，将复合菌剂放置于石油化工废气中即可实现对石油化工废气的降解，使用方便，菌剂使用寿命长，降解效果显著。

[0028] 本发明的有益效果：本发明的一种复合菌剂的制备方法，在石油污染源地收集菌种进行驯化，将驯化后中的主要菌种进行单一发酵，同时，将驯化后的菌种进行定向混合发酵，并将单一发酵与混合发酵的菌种液混合、离心得到微生物菌泥，将微生物菌泥与干燥保护剂混合制得石油化工废气治理复合菌剂。在石油污染源地进行收集菌种，能够确保菌种的丰富度，将驯化后的主要菌种进行单一发酵，能够大大提高制备菌剂的降解效率，将驯化后的菌种进行定向混合发酵，既能够使发酵后的混合菌种具有高效的降解能力，也能够保留石油污染源地中的菌种丰富度，从而提高制备菌剂的降解效率。附图说明

[0029]

[0030] 图1是实施例1的驯化菌种接种到发酵罐中加入LB培养基培养后使用高通量测序确定的复合菌种的成分组成表。

[0031] 图2是实施例1单一菌种、实施例1辅助菌种以及实施例1的驯化菌种接种到发酵罐中加入对比例三的培养基中培养分别所得到的时间-微生物含量曲线图。

[0032] 图3是实施例1-5以及对比例一至三所制备出的菌剂产品分别对石油化工废气的性能测试图。

具体实施方式

[0033] 结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。

[0034] 实施例1

[0035] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0036] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0037] (B)主要菌种单一发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0038] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0039] (D)将主要菌种液和辅助菌种液以一定体积比进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0040] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂以一定重量比进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0041] 其中，所述驯化菌种的浓度为6.5×107CFU/mL。

[0042] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物 (TVOCs)浓度为800ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到40ppm。

[0043] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源5g/L，微生物定向选择剂50mg/L，酵母粉1.0g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 0.5g/L，KH2PO4 3.0g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值6.5。

[0044] 其中，所述定向选择碳源包括以下重量份数的组分：丁烷5份、丁二烯2份、对苯二甲酸1份和环氧乙烷1份。

[0045] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸2份和制霉菌素1 份。

[0046] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属10份、肠球菌属10份、嗜麦芽窄食单胞菌属2份、壤霉菌属1份、不动杆菌属1份、螯台球菌属1份，克雷伯氏菌属60份。所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属0.02份、产吲哚金黄杆菌0.05份、无色杆菌属0.02份、嗜染料菌属0.05份、红育菌属
0.02份、地杆菌属0.03份、红球菌属0.03份以及芽孢杆菌属0.01份。

[0047] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为2：0.5。

[0048] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为3：0.5。

[0049] 实施例2

[0050] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0051] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0052] (B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0053] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0054] (D)将主要菌种液和辅助菌种液以一定体积比进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0055] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂以一定重量比进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0056] 其中，所述驯化菌种的浓度为7.2×107CFU/mL。

[0057] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物 (TVOCs)浓度为800ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到40ppm。

[0058] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源5g/L，微生物定向选择剂50mg/L，酵母粉1.0g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 0.5g/L，KH2PO4 3.0g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值6.5。

[0059] 其中，所述定向选择碳源包括以下重量份数的组分：丁烷5份、丁二烯2份、对苯二甲酸1份和环氧乙烷1份。

[0060] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸2份和制霉菌素1 份。

[0061] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属10份、肠球菌属10份、嗜麦芽窄食单胞菌属2份、壤霉菌属1份、不动杆菌属1份、螯台球菌属1份，所述克雷伯氏菌属60份。所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属0.01份、产吲哚金黄杆菌0.05份、无色杆菌属0.05份、嗜染料菌属0.02 份、红育菌属0.02份、地杆菌属0.03份、红球菌属0.03份以及芽孢杆菌属0.01份。

[0062] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为2：0.5。

[0063] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为3：0.5。

[0064] 实施例3

[0065] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0066] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0067] (B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0068] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0069] (D)将主要菌种液和辅助菌种液以一定体积比进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0070] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂以一定重量比进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0071] 其中，所述驯化菌种的浓度为7.6×107CFU/mL。

[0072] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物(TVOCs)浓度为900ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到45ppm。

[0073] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源6g/L，微生物定向选择剂60mg/L，酵母粉6g/L，蛋白胨6g/L，NaCl 1.0g/L，NH4Cl 1.0g/L，KH2PO43.5g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值6.8。

[0074] 其中，所述定向选择碳源包括以下重量份数的组分：丁二烯4份、对苯二甲酸2份和环氧乙烷1份。

[0075] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸2.5份和制霉菌素 1.5份。

[0076] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属11份、肠球菌属11份、嗜麦芽窄食单胞菌属2.5份、壤霉菌属1.5份、不动杆菌属1.5份、螯台球菌属1.5份，克雷伯氏菌属65份。所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属0.02份、产吲哚金黄杆菌0.05份、无色杆菌属0.05份、嗜染料菌属0.02 份、红育菌属0.02份、地杆菌属0.03份、红球菌属0.03份以及芽孢杆菌属0.01份。

[0077] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为2.5：0.75。

[0078] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为3.5：0.75。

[0079] 实施例4

[0080] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0081] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0082] (B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0083] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0084] (D)将主要菌种液和辅助菌种液以一定体积比进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0085] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂以一定重量比进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0086] 其中，所述驯化菌种的浓度为8.3×107CFU/mL。

[0087] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物 (TVOCs)浓度为1100ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到55ppm。

[0088] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源7.5g/L，微生物定向选择剂75mg/L，酵母粉1.75g/L，蛋白胨7.5g/L，NaCl 1.4g/L，NH4Cl 0.75g/L，KH2PO4 4.2g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值7.3。

[0089] 其中，所述定向选择碳源包括以下重量份数的组分：丁烷5份、丁二烯3份和环氧乙烷1份。

[0090] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸3.5份和制霉菌素 1.75份。

[0091] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属14份、肠球菌属14份、嗜麦芽窄食单胞菌属3.5份、壤霉菌属2.7份、不动杆菌属1.7份、螯台球菌属1.7份，所述克雷伯氏菌属的重量份数为75份。所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属0.01份、产吲哚金黄杆菌0.01份、无色杆菌属0.02 份、嗜染料菌属0.02份、红育菌属0.02份、地杆菌属0.02份、红球菌属0.03份以及芽孢杆菌属0.2份。

[0092] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为4.5：1.75。

[0093] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为5.5：1.75。

[0094] 实施例5

[0095] 一种复合菌剂的制备方法，包括下列步骤：

[0096] (A)原始菌液驯化：在石油污染源地收集土壤样品和污水样品混合，并接种于无菌水中培养得原始菌液，往原始菌液中通入石油化工废气进行驯化，得到驯化菌种；

[0097] (B)主要菌种发酵：从驯化菌种中筛选出克雷伯氏菌属，在主发酵罐中加入培养基溶液，并接种筛选出的克雷伯氏菌属，进行发酵培养得到主要菌种液；

[0098] (C)辅助菌种混合发酵：在副发酵罐中加入定向培养基溶液，并接种驯化菌种，进行发酵培养得到辅助菌种液；

[0099] (D)将主要菌种液和辅助菌种液以一定体积比进行搅拌混合，离心处理，移取上层清液，得到微生物菌泥；

[0100] (E)将微生物菌泥和干燥保护剂以一定重量比进行搅拌混合，干燥得到石油化工废气治理复合菌剂。

[0101] 其中，所述驯化菌种的浓度为9.0×107CFU/mL。

[0102] 其中，所述驯化处理具体为：将原始菌液通入石油化工废气，控制总挥发性有机物 (TVOCs)浓度为1200ppm，直至总挥发性有机物(TVOCs)浓度降低到60ppm。

[0103] 其中，所述定向培养基溶液包括定向选择碳源10g/L，微生物定向选择剂100mg/L，酵母粉2.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，KH2PO4 4.5g/L，溶剂为水，定向培养基溶液的pH值7.5。

[0104] 其中，所述定向选择碳源包括以下重量份数的组分：丁烷5份、丁二烯2份、对苯二甲酸1份和环氧乙烷1份。

[0105] 其中，所述微生物定向选择剂包括以下重量份数的组分：萘啶酮酸4份和制霉菌素2 份。

[0106] 其中，所述驯化菌种包括以下重量份数的组分：鞘氨醇杆菌属15份、肠球菌属15份、嗜麦芽窄食单胞菌属4份、壤霉菌属3份、不动杆菌属2份、螯台球菌属2份，克雷伯氏菌属80份。所述驯化菌种还包括重量份数小于0.5份的小组分菌属，所述小组分菌属包括：青枯菌属0.03份、产吲哚金黄杆菌0.05份、无色杆菌属0.02份、嗜染料菌属0.02份、红育菌属
0.02份、地杆菌属0.03份、红球菌属0.03份以及芽孢杆菌属0.1份。

[0107] 其中，所述主要菌种液和辅助菌种液的体积比为5：2。

[0108] 其中，所述微生物菌泥和干燥保护剂的重量比为6：2。

[0109] 性能测试

[0110] 对比例一：

[0111] 将本发实施例1明制备出的驯化菌种通过梯度稀释和平板涂布的方式，筛选出菌种中的主要菌种克雷伯氏菌属，使用LB溶液进行活化，并将克雷伯氏菌属接种到发酵罐中，加入培养基，在36℃培养28小时，得到主要菌种菌液，所用培养基为糖蜜2.0g/L，葡萄糖20g/L， NaCl 1.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，KH2PO4 4.5g/L，pH值7。对主要菌种菌液进行离心，移取上清液，得微生物菌泥。将复合微生物菌泥和干燥保护剂以重量比5:1的比例进行混合，充分搅拌混合，干燥，得到成品菌剂一。

[0112] 对比例二：

[0113] 将本发明实施例1制备出的驯化菌种接种到发酵罐中加入LB培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH值7)对菌液进行离心，移取上清液，得微生物菌泥。将复合微生物菌泥和干燥保护剂以重量比5:1的比例进行混合，充分搅拌混合，干燥，得到成品菌剂二。

[0114] 使用高通量测序的方式，确定石油化工领域废气治理复合菌种的成分组成如图1所示。

[0115] 由图1可以得知，使用常规的LB培养基对驯化菌种进行混合发酵培养后，菌种的种类会发生巨大的变化，产生芽孢杆菌属占大多数的情况，制备出的成品菌剂对石油化工废气的降解效果差。

[0116] 对比例三：

[0117] 将本发明实施例1制备出的驯化菌种接种到发酵罐中，加入培养基(丁烷5.0g/L，丁二烯5.0g/L，对苯二甲酸5.0g/L，环氧乙烷5g/L，NaCl 1.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，KH2PO4 4.5 g/L，微量元素2g/L)，在36℃培养18小时对菌液进行离心，移取上清液，得微生物菌泥。将复合微生物菌泥和干燥保护剂以重量比5:1的比例进行混合，充分搅拌混合，干燥，得到成品菌剂三。

[0118] 在36～38℃培养，在培养过程进行微生物含量测定，并和实施例1中的单一菌种发酵、辅助菌种混合发酵进行对比，结果如图2所示。

[0119] 由图2可以得知，使用本对比例的培养基对驯化后的菌种进行混合培养，得到的混合菌种的浓度为远远小于实施例1的浓度，而且菌种的繁殖速率远远小于实施例1。

[0120] 效果测试

[0121] 将上述实施例1-5、对比例一、对比例二以及对比例三所生产制备得到的菌剂进行性能测试。

[0122] 设置气源：以石油化工行业主要产物如汽油、柴油、沥青，以及工厂生产废渣作为模拟气源，通过气体流量计，控制气体流速，最终控制进气的TVOCs浓度为1000ppm左右。

[0123] 接种：将4g/L相应菌种接种到洗气瓶中，剩余补充磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾4.4 g/L、磷酸氢二钾3.4g/L、氯化铵0.1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.48g/L和适量微量元素溶液)。设置三级生物反应装置，并进行串联相接，气体停留时间约为15秒。装置持续运行1个星期，然后测定气源和出气处的TVOCs含量，得到结果如图3：

[0124] 由图3可以得知，使本发明制备出来的复合菌剂(实施例1-5)对石油化工废气具有高效的降解能力，TVOCs降解率在96.7％以上，降解效果优异。而使用单一的克雷伯氏菌属进行单一发酵对石油化工废气的降解能力只有86.1％，降解效果相对较差；使用常规培养基对混合菌剂进行混合发酵制备出来的菌剂对石油化工废气的降解率只有17.1％，降解效果差；使用比本发明的定向培养基溶液少了微生物定向选择剂的培养基进行混合培养制备出来的菌剂对石油化工废气的降解率只有33.6％，降解效果差。

[0125] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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