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一种用于生物 脱脂剂的细菌培养方法

阅读：82发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及金属除油的技术领域，特别是涉及一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其可以提高芽孢杆菌制备的脱脂剂中的芽孢杆菌的活性，在对金属表面脱脂除油前处理以及作为工业清洗剂的过程中，提高脱脂效果，延长更换间隔，减少更换次数，减少经济损失；包括以下步骤：（1）菌种接种；（2）菌种活化培养；（3）诱变准备；（4）菌种稀释；（5）菌种诱变：（6）菌种发酵培养；（7）一次扩大培养；（8）二次扩大培养。，下面是一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种接种：将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种；
（2）菌种活化培养：将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h；
（3）诱变准备：在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌；
（4）菌种稀释：关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合；
（5）菌种诱变：打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为20-40cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行50-80s的诱变处理：
（6）菌种发酵培养：将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h；
（7）一次扩大培养：将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h；
（8）二次扩大培养：将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，在一定转速下培养48h。
2.如权利要求1所述的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的淀粉培养基为含有2%可溶性淀粉的LB培养基，所述LB培养基是将10g蛋白胨，5g 酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并在121℃下灭菌30min配制而成，并且淀粉培养基的pH为7.0。
3.如权利要求1所述的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其特征在于，所述发酵培养基是将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）2SO4，0.13%的NH4CLO和
0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制而成。
4.如权利要求1所述的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其特征在于，所述步骤（8）中的转速为172r/min。
5.如权利要求1所述的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，其特征在于，所述步骤（8）中的向发酵罐内通气包括在1.33VVm下通气12h和在2.67VVm下通气36h。

说明书全文

一种用于生物 脱脂剂的细菌培养方法

[0001]

技术领域

[0002] 本发明涉及金属除油的技术领域，特别是涉及一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法。

背景技术

[0003] 众所周知，生物脱脂剂是一种主要用于金属表面脱脂除油前处理以及工业清洗剂领域中，是一种集油污清洗和油污降解双重功能为一体的现代环保、高效、专业的表面油污清洗剂，其生物环保的主要成分包括：生物表面活性剂、低温表面活性剂、生物酶、助剂、微生物菌株和微生物营养液等成分构成，生物脱脂剂以其低能耗、低成本、高效率、高环保等优势将成为未来环保油污清洗剂的发展趋向。

[0004] 现有的生物脱脂剂中所使用的微生物菌株主要为芽孢杆菌，芽孢杆菌，是细菌的一科，能形成芽孢，即内生孢子的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等，他们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在与土壤、水、空气以及动物肠道等处，由于芽孢杆菌极其容易获得，同时芽孢杆菌的存在使生物脱脂剂具有良好的脱脂效果，并且不对环境产生恶劣影响，因此具有良好的经济效益。

[0005] 但是现有的芽孢杆菌培养后制备的生物脱脂剂中，芽孢杆菌的活性较低，在对金属表面脱脂除油前处理以及作为工业清洗剂的过程中，其使用效果较差，采用专利号为CN201210561071.X的发明制备出的芽孢杆菌在用于微生物脱脂剂制备时，其微生物脱脂剂在使用过程中发现，其脱脂效果较差，并且需要经常更换，造成不必要的经济损失。

发明内容

[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种可以提高芽孢杆菌制备的脱脂剂中的芽孢杆菌的活性，在对金属表面脱脂除油前处理以及作为工业清洗剂的过程中，提高脱脂效果，延长更换间隔，减少更换次数，减少经济损失的用于生物脱脂剂的细菌培养方法。

[0007] 本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，包括以下步骤：（1）菌种接种：将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种；
（2）菌种活化培养：将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h；
（3）诱变准备：在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌；
（4）菌种稀释：关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合；
（5）菌种诱变：打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为20-40cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行50-80s的诱变处理：
（6）菌种发酵培养：将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h；
（7）一次扩大培养：将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h；
（8）二次扩大培养：将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，在一定转速下培养48h。

[0008] 本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，所述步骤（1）中的淀粉培养基为含有2%可溶性淀粉的LB培养基，所述LB培养基是将10g蛋白胨，5g 酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并在121℃下灭菌30min配制而成，并且淀粉培养基的pH为7.0。

[0009] 本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，所述发酵培养基是将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制而成。

[0010] 本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，所述步骤（8）中的转速为172r/min。

[0011] 本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法，所述步骤（8）中的向发酵罐内通气包括在1.33VVm下通气12h和在2.67VVm下通气36h。

[0012] 与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法培养出的芽孢杆菌在用于生物脱脂剂的制备时，与现有技术相比，其制备出的生物脱脂剂中的芽孢杆菌的活性较高，在对金属表面脱脂除油前处理以及作为工业清洗剂的过程中，由于芽孢杆菌的活性高，其产酶效果、分解油脂的能力均较现有技术有明显的提升，从而可以提高金属板材处理时的脱脂效果，并且由于芽孢杆菌的活性高，其繁殖代数多，有效时间长，从而可以延长更换间隔，减少更换次数，增长使用时间，进而可以减少经济损失。

具体实施方式

[0013] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0014] 实施例1将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为20cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行65s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0015] 实施例2将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为30cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行65s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0016] 实施例3将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为40cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行65s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0017] 实施例4将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为30cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行50s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0018] 实施例5将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为30cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行80s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0019] 对比例1将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在
121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0020] 对比例2将10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl和20g琼脂加入1000ml的蒸馏水中，并向其中加入2%的淀粉，并调节pH至7.0，混合均匀后在121℃下灭菌30min，并冷却后配制成淀粉培养基，将淀粉培养基溶化后，冷却至55℃左右倒入平板中，待淀粉培养基凝固后，在淀粉培养基表面采用划线接种的方法接种芽孢杆菌菌种，将接种芽孢杆菌后的平板培养基倒置放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养24h，在无菌操作台中紫外线灯打开，对无菌操作台进行30min的杀菌，关闭紫外线灯，并在无菌操作台内刮取活化培养后的芽孢杆菌菌种于盛有100ml无菌水的三角瓶内，使用无菌玻璃棒对其进行搅拌，使芽孢杆菌菌种充分与无菌水混合，打开紫外线灯，调整三角瓶与紫外线灯之间的距离为30cm，并通过紫外线对三角瓶内的芽孢杆菌菌种进行180s的诱变处理，将5.6%的豆饼粉，7.2%的玉米粉，0.8%的Na2HPO4,0.4%的（NH4）
2SO4，0.13%的NH4CLO和0.13%的CaCl2混入蒸馏水中，并向其中加入50g的α-淀粉酶，在121℃下灭菌30min配制成发酵培养基，将诱变后的芽孢杆菌菌种接种于10ml的发酵培养基中，并将发酵培养基放于恒温培养箱内，在37±1℃下培养48h，将经过发酵培养后的芽孢杆菌菌种接种于500ml的发酵培养基中进行一次扩大培养，在37±1℃下培养48h，将经过一次扩大培养的芽孢杆菌菌种接种于发酵罐中的2.5L的发酵培养基中进行二次扩大培养，调整培养温度为37±1℃，并向发酵罐内通气，调节转速为172r/min，培养48h，在0-12h时调节通气量为1.33VVm，12-48h时调节通气量为2.67VVm。

[0021] 将上述实施例和对比例中得出的芽孢杆菌与生物表面活性剂、低温表面活性剂、生物酶、助剂和微生物营养液等混合得到微生物脱脂剂，检测器各项指标得到以下结果：菌种死亡率菌种活性脱脂时间更换时间
实施例1 6.8% 7300U/ml 9min 10个月
实施例2 1.5% 10500U/ml 4.5min 15个月
实施例3 1.4% 8500U/ml 5.9min 12个月
实施例4 1.2% 8200U/ml 6.5min 11个月
实施例5 9.0% 6200U/ml 12min 8个月
对比例1 0.2% 5000U/ml 25min 7个月
对比例2 92.1% 1500U/ml 45min 3个月
本发明的一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法培养出的芽孢杆菌在用于生物脱脂剂的制备时，与现有技术相比，其制备出的生物脱脂剂中的芽孢杆菌的活性较高，在对金属表面脱脂除油前处理以及作为工业清洗剂的过程中，由于芽孢杆菌的活性高，其产酶效果、分解油脂的能力均较现有技术有明显的提升，从而可以提高金属板材处理时的脱脂效果，并且由于芽孢杆菌的活性高，其繁殖代数多，有效时间长，从而可以延长更换间隔，减少更换次数，增长使用时间，进而可以减少经济损失。

[0022] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

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一种用于生物脱脂剂的细菌培养方法

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