一种β-葡聚糖、其提取方法及用途
阅读：495发布：2024-01-29
专利汇可以提供一种β-葡聚糖、其提取方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种β-葡聚糖、其提取方法及用途。具体而言，本发明公开了一种从灰树花子实体中提取得到的下式所示的β-葡聚糖，该β-葡聚糖通过激活免疫系统从而达到抗 肿瘤 作用，有望开发成为一种新的抗肿瘤药物。，下面是一种β-葡聚糖、其提取方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种β-葡聚糖，其结构式为
其中，n为10～20。
2.权利要求1所述的β-葡聚糖的提取方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将灰树花子实体用C1～C6醇浸泡进行脱脂处理；
(2)将脱脂处理后的灰树花子实体用沸水进行提取；
(3)将用沸水提取处理过的灰树花子实体用碱溶液进行提取，得到的提取液用酸中和，对流动水透析，浓缩，用C1～C6醇沉淀；
(4)将步骤(3)中得到的沉淀经DEAE柱层析进行分离，并逐步依次用水，0.08-0.12mol/L和0.18-0.22mol/L的氯化钠溶液进行分段洗脱，其中将用0.18-0.22mol/L的氯化钠溶液洗脱得到的洗脱液经浓缩、透析和干燥得到β-葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的C1～C6醇为乙醇。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的碱为NaOH，其重量百分比浓度为1％-10％。
5.一种药物组合物，其包含治疗有效剂量的权利要求1所述的β-葡聚糖作为有效成分，并且任选含有药学上可接受的载体及辅料。
6.根据权利要求1所述的β-葡聚糖在制备免疫调节剂中的用途。
7.根据权利要求1所述的β-葡聚糖在制备用于通过激活免疫系统来治疗或预防肿瘤或抑制肿瘤生长的药物中的用途。
8.根据权利要求1所述的β-葡聚糖在制备用于通过激活免疫系统来辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述肿瘤为涉及多种组织系统的实体瘤以及血液系统癌症。
10.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述肿瘤为胃癌，肝癌，胰腺癌，卵巢癌，宫颈癌，膀胱癌，前列腺癌，结肠癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病或慢粒性白血病。
一种β-葡聚糖、其提取方法及用途
技术领域
背景技术
[0002] 自从1971年美国总统尼克松签署《国家癌症法》向癌症宣战四十年以来，虽然癌症的研究和防治取得了很大的进步，但目前癌症始终还是一种严重威胁人类健康的主要疾病[1]。根据世界卫生组织WHO的统计，全球每年癌症患者的死亡人数高达六百万，继心血管[2]疾病、传染性和寄生虫病之后位居第三位，并且在2015年将屈居第二 。
[0003] 对于癌症(恶性肿瘤)的治疗，由于传统的放疗和化疗往往会具有常见的骨髓抑制、免疫抑制、白细胞减少等血液系统毒性。而近几年来出现的包括细胞治疗，疫苗治疗，抗体药物治疗等在内的免疫治疗(Immunotherapy)作为继手术、化疗和放疗之后的第四种癌[3]症治疗方式将逐步成为癌症治疗的主要手段 。而其中利用真菌提取的多糖(尤其是β-葡聚糖)作为典型的生物反应调节剂(Biological Response Modifiers，BRM)[4]或者免疫调节剂(Immunomodulator)通过动员机体免疫系统间接达到抗肿瘤的作用越来越受到重视，并且在合并放、化疗来联合治疗肿瘤将更有其临床应用价值。
[0004] 现有的研究表明，多糖尤其是β-葡聚糖，在机体内主要通过结合免疫细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)进而激活信号传导，并最终促进巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞以及CTL细胞的活化和增殖，从而实现对肿瘤细胞的细胞免疫清除。同时多糖还能通过诱导释放细胞因子(如TNF-α)以及激活补体系统而对肿瘤细胞进行体液免疫清除。目前发现的PRRs包括Dectin-1、补体受体3(CR3)、清道夫受体(Sc)、乳糖基神经酰胺受体(LacCer)以及Toll样受体(TLRs)等[5]。
[0005] 灰树花，在日本称为“舞茸(Maitake)”，是一种药、食兼用蕈菌，属担子菌亚门层菌纲目多孔菌科树花菌属。野生的灰树花主要产于日本，在封建社会日本的民间主要由于其极佳的美味而用于烹调食材。直到上世纪八十年代，日本学者才对其中提取的多糖及其免疫调节抗肿瘤的药用价值进行了深入研究[6]。Mizuno等曾经从灰树花的子实体中分离得到29个多糖组分，其中有20个具有抗肿瘤作用[7]，而对灰树花的多糖组分及其抗肿瘤作用研究的最多的主要是有两种：Grifolan(GRN)和MD组分。在20世纪80年代，Ohno等从灰树花的子实体，培养的菌丝体以及液体培养基中分离得到了具有同样结构的每三个单元就连接一[8]
个1,6-β分支的β-(1,3)葡聚糖，命名为Grifolan(GRN) 。体外和体内研究表明GRN具有很强的抗肿瘤作用并且是通过激活补体系统，诱导巨噬细胞产生细胞因子以及合成NO等免疫调节作用来实现的[9]。但是GRN在动物实验中口服给药并没有体现抗肿瘤效果[10]。随后，Namba等通过专有的提取工艺从灰树花中分离得到了一种口服有效的MD组分[11]。MD组分由β-1,3分支的β-1,6葡聚糖，β-1,6分支的β-1,3葡聚糖以及蛋白质组成，糖和蛋白的比例在
80:20～99:1之间。研究表明MD组分通过激活宿主免疫系统实现抗肿瘤作用，它能激活巨噬细胞，树突状细胞以及自然杀伤NK细胞同时诱导Th1主导的反应[12]。另外，MD组分还能通过诱导脐带血细胞以及骨髓细胞产生G-CSF增强生血作用以减少化疗药物阿霉素的副作用[13]以及动员粒细胞治疗环磷酰胺诱导的粒细胞减少症[14]。目前，MD组分在I/II期临床实验的乳腺癌患者身上也体现了免疫效果和抗肿瘤作用[15]。除此之外，也有很多从灰树花中分离得到的组分具有抗高血压，抗糖尿病，抗高胆固醇，以及抗HIV，HBV感染的报道[16]。
个1,6-β分支的β-(1,3)葡聚糖，命名为Grifolan(GRN) 。体外和体内研究表明GRN具有很强的抗肿瘤作用并且是通过激活补体系统，诱导巨噬细胞产生细胞因子以及合成NO等免疫调节作用来实现的[9]。但是GRN在动物实验中口服给药并没有体现抗肿瘤效果[10]。随后，Namba等通过专有的提取工艺从灰树花中分离得到了一种口服有效的MD组分[11]。MD组分由β-1,3分支的β-1,6葡聚糖，β-1,6分支的β-1,3葡聚糖以及蛋白质组成，糖和蛋白的比例在
80:20～99:1之间。研究表明MD组分通过激活宿主免疫系统实现抗肿瘤作用，它能激活巨噬细胞，树突状细胞以及自然杀伤NK细胞同时诱导Th1主导的反应[12]。另外，MD组分还能通过诱导脐带血细胞以及骨髓细胞产生G-CSF增强生血作用以减少化疗药物阿霉素的副作用[13]以及动员粒细胞治疗环磷酰胺诱导的粒细胞减少症[14]。目前，MD组分在I/II期临床实验的乳腺癌患者身上也体现了免疫效果和抗肿瘤作用[15]。除此之外，也有很多从灰树花中分离得到的组分具有抗高血压，抗糖尿病，抗高胆固醇，以及抗HIV，HBV感染的报道[16]。
[0006] 本发明则利用一种简单有效的分离纯化方法，从灰树花子实体中提取获得了一种均一的全新结构的β-葡聚糖(GFPBW2)，并对其免疫调节和抗肿瘤作用进行了研究。
[0007] 主要参考文献：
[0008] 1.Marshall E.Cancer Research and the$90Billion Metaphor.Science,2011,331:1540-1541.
[0009] 2.WHO.The Global Burden of Disease:2004Update.Geneva:World Health Organization,2008.
[0010] 3.Dillman,RO."Cancer immunotherapy."Cancer Biother Radiopharm,2011,26(1):1-64.
[0011] 4.Leung MY,Liu C,Koon JC,Fung KP.Polysaccharide biological response modifiers.Immunology letters,2006,105(2),101-114.
[0012] 5.Chen J,Seviour R.Medicinal importance of fungal beta-(1-->3),(1-->6)-glucans.Mycol Res,2007,111(Pt 6),635-652.
[0013] 6.Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential.Alternative medicine review:a journal of clinical therapeutic,2001,
6(1):48-60.
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[0014] 7.Mizuno T,Ohsawa K,Hagiwara N,Kuboyama R.Fractionation and characterization of antitumor polysaccharides from Maitake,Grifola
frondosa.Agric Biol Chem,1986,50,1679-1688
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[0015] 8.Tada R,Adachi Y,Ishibashi K,Ohno N.An unambiguous structural elucidation of a1,3-beta-D-glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa by solution NMR experiments.Carbohydr Res,2009,344(3),400-404.[0016] 9.Hashimoto T,Ohno N,Adachi Y,Yadomae T.Nitric oxide synthesis in murine peritoneal macrophages by fungal beta-glucans.Biol Pharm Bull,1997,20(9),1006-1009.
[0017] 10.Ohno N,Adachi Y,Suzuki I,Oikawa S,Sato K,Ohsawa M,Yadomae T.Antitumor activity of a beta-1,3-glucan obtained from liquid cultured mycelium of Grifola frondosa.J Pharmacobiodyn,1986,9(10),861-864.
[0018] 11.US Patent No.5,854,404,1998.
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[0022] 15.Deng G,Lin H,Seidman A,Fornier M,D'Andrea G,Wesa K,Yeung S,Cunningham-Rundles S,Vickers AJ,Cassileth B.A phase I/II trial of a polysaccharide extract from Grifola frondosa(Maitake mushroom)in breast cancer patients:immunological effects.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(9),
1215-1221.
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[0023] 16.Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential.Alternative medicine review:a journal of clinical therapeutic,2001,
6(1):48-60.
6(1):48-60.
发明内容
[0024] 本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以灰树花子实体为原料获得了一种新的均一的β-葡聚糖(GFPBW2)，药理实验表明GFPBW2能通过激活原代巨噬细胞释放细胞因子，而体内抗肿瘤实验也进一步表明GFPBW2具有免疫调节功能及相应的抗肿瘤活性。因此GFPBW2有望开发成为一种免疫调节剂作为抗肿瘤药物或者辅佐药物而用于临床。
[0025] 因此，本发明的一个目的在于提供一种从灰树花子实体分离提取出的具有确定化学结构特征的β-葡聚糖(GFPBW2)。
[0026] 本发明的另一个目的是提供该β-葡聚糖的制备方法。
[0027] 根据本发明的又一个目的，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含有效剂量范围的根据本发明的β-葡聚糖作为有效成分，并且其可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。
[0028] 本发明的再一个目的是提供该β-葡聚糖作为免疫调节剂的用途。
[0029] 本发明的再一个目的是提供该β-葡聚糖在制备用于治疗或预防肿瘤或抑制肿瘤生长的药物中的用途。
[0030] 本发明的再一个目的是提供该β-葡聚糖在制备用于辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
[0031] 根据本发明的一个方面，提供了一种β-葡聚糖GFPBW2，其结构为
[0032]
[0033] 其中，n为10～20。所述β-葡聚糖GFPBW2的重均分子量为约16,000～约35,000Da。
[0034] 根据本发明的另一个方面，提供了一种提取根据本发明的β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
[0035] (1)将灰树花子实体用C1～C6醇浸泡进行脱脂处理；
[0036] (2)将脱脂处理后的灰树花子实体用沸水进行提取；
[0038] (4)将步骤(3)中得到的沉淀经柱层析进行分离，以水，约0.08-约0.12mol/L和约0.18-约0.22mol/L的氯化钠溶液进行分段洗脱，其中将用约0.18-约0.22mol/L的氯化钠溶液洗脱得到的洗脱液经浓缩、透析和干燥得到根据本发明的β-葡聚糖。
[0039] 以下将对根据本发明的提取β-葡聚糖的方法进行更详细地描述。
[0041] 在步骤(1)中，对脱脂处理的条件没有特别限制，只要能够去除灰树花子实体中的脂类化合物即可。所述脱脂处理可以在室温下或者在加热条件下进行。对所述脱脂处理的时间没有具体限制，只要能够去除灰树花子实体中的脂类化合物即可，但是可以根据具体脱脂处理的条件确定。当通过在室温下浸泡进行脱脂处理时，优选在3天至5周的范围内。
[0042] 在脱脂处理后，任选可以包括将脱脂处理后的灰树花子实体干燥的步骤。所述干燥可以是风干。在步骤(2)中，所述沸水提取用于去除灰树花子实体中的水溶性多糖。对进行沸水处理的时间和次数没有特殊限制，只要检测提取液测糖含量至糖反应不明显即可。所述沸水提取可以进行1-6次，优选3-5次，每次可以进行2-10小时，优选4-8小时。
[0043] 在步骤(3)中，所述碱溶液提取用于提取灰树花子实体中的碱溶性多糖。对所述碱溶液提取的条件没有具体限制，只要提取出灰树花子实体中的碱溶性多糖即可。所述碱溶液提取可以在0-40℃，优选0-10℃下用碱溶液浸泡1-24小时，优选6-18小时。对所用的碱没有特别限制，只要能够提取灰树花子实体中的碱溶性多糖即可。所述的碱可以是NaOH、KOH、LiOH、BaOH、CaOH2、Na2CO3、K2CO3等，优选为NaOH。碱溶液的重量百分比浓度可以为1％-10％，优选为3％-7％。
[0045] 在步骤(4)对所述干燥的条件没有具体限制，但是优选为冷冻干燥。
[0046] 根据本发明的上述方法优选还包括：在步骤(4)前，将步骤(3)得到的沉淀用C1～C6醇和丙酮依次洗涤并干燥。
[0047] 根据本发明的上述方法优选还包括：在步骤(4)前，将步骤(3)中得到的沉淀用蒸馏水溶解，然后离心除去不溶物的步骤。
[0048] 根据本发明的再一个方面，提供了根据本发明的β-葡聚糖在制备用于治疗或预防肿瘤或抑制肿瘤生长的药物中的用途。所述肿瘤包括涉及多种组织系统的实体瘤，包括胃癌，肝癌，胰腺癌，卵巢癌，宫颈癌，膀胱癌，前列腺癌，结肠癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤等，还包括可能的急性淋巴细胞白血病，慢粒性白血病等血液系统癌症以及其它未特别指出的各种原发、继发性恶性肿瘤以及恶性肿瘤的转移。
[0049] 根据本发明的β-葡聚糖可经口服或不经过口给药。经口服给药时，首先使该类化合物与常规的药用辅剂(如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等)混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式；非经口给药时，可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。
[0050] 根据本发明的又一个方面，提供了一种药物组合物，其包含治疗有效剂量的根据本发明的β-葡聚糖GFPBW2作为有效成分，并且其可进一步含有药学上可接受的载体及辅料。所述药物组合物可以用于治疗或预防肿瘤，或抑制肿瘤生长。附图说明
[0051] 图1是根据本发明制备实施例1的灰树花β-葡聚糖GFPBW2的分离纯化示意图。
[0052] 图2是根据本发明实施例1的β-葡聚糖GFPBW2的红外光谱(IR)图。
[0053] 图3是根据本发明实施例1的β-葡聚糖GFPBW2的13C NMR谱图。
[0054] 图4是根据本发明实施例1的β-葡聚糖GFPBW2的激活巨噬细胞分泌细胞因子的图。
[0055] 图5是根据本发明实施例1的β-葡聚糖GFPBW2的体内免疫调节和抗S-180腹水型肉瘤细胞同种移植瘤活性的图。
具体实施方式
[0056] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
[0057] 仪器：高效凝胶过滤色谱(HPGPC)：
[0058] Agilent 1200Series系统，配置为G1311A Qudra pump，G1329A ALS自动进样器，G1362A示差检测器，G1316A柱温箱，DAD G1315D紫外检测器，Agilent Chemstation控制系统及GPC数据处理软件。两根多糖专用凝胶色谱柱串联：Shodex sugar KS-804和KS-8055 6
(8mm×300mm，磺酸化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物凝胶，排阻极限分别为4×10 和5×10Da)，色谱条件：以10mM的NaOH为流动相，柱温为40℃，流速为每分钟0.8ml，进样量为40μl。
(8mm×300mm，磺酸化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物凝胶，排阻极限分别为4×10 和5×10Da)，色谱条件：以10mM的NaOH为流动相，柱温为40℃，流速为每分钟0.8ml，进样量为40μl。
[0059] LKB恒温系统(瑞典LKB公司)，BSZ-100自动部分收集器和HL-2恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)，Modulyo型冷冻干燥器(英国Edwords公司)，Labconco 18型冷冻干燥器(英国Labconco公司)，日立20PR-52D型高速离心机(日本Hitachi公司)，电热恒温真空干燥箱(上海医疗器械七厂)，Buchi461型旋转蒸发仪，EYELA-N1001型旋转蒸发仪，725N紫外可见分光光度计(上海精科仪器有限公司)。
[0060] 药品和试剂：
[0061] 灰树花子实体购自于上海大山公司。
[0062] DEAE-cellulose购于Whatman公司；透析袋(分子截留为3500Da)和二甲亚砜(DMSO)为Merck公司产品。其他试剂来源与上海国药集团。
[0063] 制备实施例1 灰树花β-葡聚糖GFPBW2的分离纯化
[0064] 如图1所示，灰树花β-葡聚糖GFPBW2的分离纯化过程如下。
[0065] 1、脱脂
[0066] 干燥的灰树花子实体(3公斤)加25L的95％乙醇浸泡2周，每周更换乙醇一次。之后，离心分离，过滤，固体物晾干。
[0067] 2、水提
[0068] 脱脂后的干品用沸水提取，每次加水20升，提取时间为5-6小时，以苯酚硫酸法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显，共计提取4次。合并后获得水提部分。
[0069] 3、碱提
[0070] 水提取结束后的固体残渣于4℃下用5％NaOH浸泡过夜，离心，用约2mol/L的HCl中和至PH约7，出现浑浊，对流动水透析2天，浓缩，加入3倍体积的95％的乙醇醇沉，8000rpm离心收集沉淀，经无水乙醇和丙酮依次洗涤后，于40℃真空干燥，得50g棕黄色固体，为碱提多糖(GFPb，产率为1.6％)。
[0071] 4、纯化
[0072] 取10g碱提多糖GFPb，加入适量蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE-纤维素(氯型)柱层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.1，0.2和0.3mol/L的NaCl溶液洗脱，分别收取各流份，其中从0.2mol/L NaCl溶液洗脱组分中获得β-葡聚糖组分GFPBW2(115mg)。
[0073] 检测分析：
[0074] 经高效凝胶柱层析(HPGPC)分析表明多糖组分GFPBW2的重均分子量为27.3kDa。
[0075] 比旋度[α]D＝-11°(c 2.5H2O)。
[0076] 多糖GFPBW2经糖组成分析为一葡聚糖。
[0077] 如图2所示，红外光谱中，无1730cm-1左右的糖醛酸吸收峰，提示该β-葡聚糖为一中性糖。
[0078] 如图3所示，13C NMR谱中，位于δ103.69ppm的碳信号，提示该多糖的葡萄糖残基为吡喃环型，且糖苷键连接方式为β型。13C NMR谱中，位于103.850ppm的碳信号，提示该多糖的葡萄糖残基为吡喃环型，且糖苷键连接方式为β型。在13C NMR谱的非异头碳区域，位于87ppm左右的C-3取代信号以及69.37ppm左右的C-6取代信号，从该图可以看出C-6取代的比例大于C-3取代。而在δ170ppm附近没有峰出现则进一步说明GFPBW2不含糖醛酸。
[0079] β-葡聚糖GFPBW2中糖残基连接方式的种类以及比例用甲基化分析得到阐明。甲基化方法(Needs法)如下：取干燥多糖样品6～8mg于甲基化反应瓶中，加入2ml干燥DMSO，密塞，室温搅拌15min，使样品完全溶解，加入预先研磨成粉状的NaOH约20mg，继续搅拌10min，然后冰浴约5min，在冰水浴下缓慢滴加约0.3ml碘甲烷，然后在室温下继续搅拌反应30min。减压除去过量的碘甲烷后，溶液对去离子水透析24h(2L×4),透析内页减压浓缩至2～3ml，加入等体积的氯仿萃取。氯仿层保留，丢弃水层。重复3次。用氮气将氯仿吹干，加入少量蒸馏水后冷冻干燥。重复甲基化反应3～4次，取少量样品进行IR光谱检测，当IR谱图中在
3300cm-1左右的O-H振动吸收峰消失时，表明该多糖样品已经完全甲基化；否则表明样品未甲基化完全，还需要继续进行甲基化反应1～2次。结果表明，GFPBW2的葡萄糖残基有四种连接方式，分别为1,3-、1,6-、1,3,6-以及末端连接葡萄糖基，其比例为1:1.5:1:1。
3300cm-1左右的O-H振动吸收峰消失时，表明该多糖样品已经完全甲基化；否则表明样品未甲基化完全，还需要继续进行甲基化反应1～2次。结果表明，GFPBW2的葡萄糖残基有四种连接方式，分别为1,3-、1,6-、1,3,6-以及末端连接葡萄糖基，其比例为1:1.5:1:1。
[0080] 为了阐明该多糖的主链为1,3-还是1,6-葡聚糖，我们进行了Smith降解以及部分酸水解反应。Smith降解后从袋内得到一多糖，HPGPC测量为8000Da，产率为20％，甲基化分析可知，1,6-连接的比例明显下降，为10％，说明该多糖为一1,3-葡聚糖。通过部分酸水解，得到一次级多糖，其重均分子量为17.7KD，且寡糖部分经过液相分析，没有四糖以上的寡糖出现。只有三糖、二糖以及单糖。
[0081] 综上所述，该多糖的结构为：
[0082]
[0083] 药理实验实施例
[0084] 实验实施例1
[0085] 1、小鼠腹腔巨噬细胞的制备
[0086] a)处死ICR小鼠(6～8周，雌性，购自上海斯莱克实验动物中心)，用75％酒精浸泡5min，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上。
[0087] b)剪开小鼠下腹部皮肤，完全暴露腹膜。
[0089] d)用剪刀在腹膜上剪开一个小口，然后迅速用无针头注射器通过开口插入腹腔内吸出细胞悬液。
[0090] e)将细胞悬液200g离心10min(德国Eppendorf公司)，用PBS洗一次，用RPMI1640+10％FBS培养液(美国Gibco公司)重悬细胞，调整浓度至1×106个细胞/ml。
[0091] f)细胞悬液置入培养箱(Serial II，美国Thermo公司)，37℃培养2h后，吸弃上清，用预热RMPI 1640培养基(美国Gibco公司)洗二次，留下贴壁细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90％。
[0092] 2、细胞因子ELISA检测
[0093] 细胞因子检测采用ELISA试剂盒(购自美国R&D公司)，具体方法如下：
[0094] a)捕获抗体1︰180用PBS稀释，加入ELISA板(Costar，美国Corning公司)中，100μl每孔，封板膜封板后，4℃包被过夜。
[0095] b)第二天，用洗涤液(含0.5％Tween-20的PBS)洗涤3次后，用含1％BSA的PBS，100μl每孔，封板膜封板后，室温封闭1h。
[0096] c)洗涤液洗涤3次，加入用稀释液(含0.1％BSA的PBS)稀释的标准准品或者待测样品，100μl每孔，封板膜封板后，室温孵育2h。
[0097] d)洗涤液洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体(稀释液1︰180稀释)，100μl每孔，封板膜封板后，室温孵育2h。
[0098] e)洗涤液洗涤3次，加入HRP-链亲和素(Streptavidin)(1︰200稀释)，100μl每孔，封板膜封板后，室温孵育0.5h。
[0099] f)洗涤3次，加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色底物，100μl每孔，显色10～20min，加入终止液(1M H2SO4)，100μl每孔。
[0100] g)酶标仪(Novostar，德国BMG Labtech公司)检测450nm吸光度(OD450)。
[0101] 将制备实施例1制备的β-葡聚糖GFPBW2配置成不同浓度(0μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml)来处理上述从ICR小鼠分离的腹腔巨噬细胞(1×106个细胞/ml)4小时后，按照上述细胞因子ELISA检测方法检测培养基中细胞因子的水平，其结果列于图4中，其中*表示p<0.05同空白组(0μg/ml)相比具有显著差别。
[0102] 图4表明，GFPBW2能够剂量依赖地诱导小鼠腹腔居留巨噬细胞细胞因子TNFα(图4A)和IL-6(图4B)的分泌。
[0103] 实验实施例2 体内对小鼠S-180移植瘤模型的抗肿瘤作用评价
[0104] a)复苏S-180细胞(购自中国科学院细胞库)，RPMI 1640+10％FBS培养传2代后，收集细胞，用PBS重悬至1-2×106个细胞/0.2ml/鼠，腹腔注射(i.p.)接种ICR或者BALB/c nu/nu小鼠(6～8周，雌性，购自上海斯莱克实验动物中心)。
[0105] b)8-9天后，进行传代。传代时取0.5ml种鼠腹部腹水，放置于冰上，直接用PBS稀释3-6倍后，接种到新的ICR小鼠腹腔。第二代以后，在6-7天的时候传代，三代后可用于实验。
[0106] c)第0天开始实验，处死种鼠后，吸取腹水。经过一定的稀释后(一般为1︰1-1︰4，细胞浓度为1×107～5×107个细胞/ml之间)，接种到小鼠的右侧腋下。
[0107] d)腋下接种24h后，随机分组，每组12只，腹腔注射(i.p.)不同剂量的用生理盐水配制的GFPBW2溶液(0.1，0.4，2mg/kg体重)，同时设溶媒组以及阳性药30mg/kg环磷酰胺(CTX，购自美国Sigma公司)组，每天1次，连续腹腔注射给药10天。
[0108] e)第11天结束实验，处死小鼠，剥去肿瘤，称瘤重。
[0109] 采用制备实施例1制备的β-葡聚糖GFPBW2利用上述体内对小鼠S-180移植瘤模型的抗肿瘤作用评价方法，GFPBW2每天1次腹腔注射给药ICR荷S-180肉瘤小鼠不同剂量(0.1mg/kg、0.4mg/kg、2mg/kg)连续10天，实验结果列于图5中，其中*表示p<0.05，溶媒组相比具有显著差别。**表示p<0.01，具有极其显著差别。
[0110] 如图5中所示，10天后，同单独给溶媒(Vehicle)相比，GFPBW2能够剂量依赖地抑制S-180肉瘤在ICR小鼠皮下的生长(图5A)，却对免疫缺陷的BALB/c nu/nu裸鼠(购自上海斯莱克实验动物中心)移植S-180的生长没有影响(图5B)，这说明GFPBW2通过激活免疫系统来实现抗肿瘤作用的。
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